Несса Кэри

Мусорная ДНК. Путешествие в темную материю генома

Nessa Carey

Junk DNA. A Journey Through the Dark Matter of the Genome

Universum

О науке, ее прошлом и настоящем, о великих открытиях, борьбе идей и судьбах тех, кто посвятил свою жизнь поиску научной Истины

Серия основана в 2013 г.

Ведущий редактор серии Ирина Опимах

Перевод с английского Алексей Капанадзе

Художник В. Е. Шкерин

Корректор Т. В. Евко

Компьютерная верстка: В. И. Савельев

Мусорная ДНК. Путешествие в темную материю генома

Электронное издание

© 2015 Nessa Carey

© Лаборатория знаний, 2016

Москва

* * *

Посвящаю Эби Рейнольдс, которая всегда рядом, и Шелдону, которого рада увидеть снова

Несса Кэри, доктор вирусологии из Университета Эдинбурга, в своей увлекательной книге рассказывает о самых последних результатах ученых, пытающихся проникнуть в тайны «темной материи» нашего генома.

Знаете ли вы, что только 2% нашей ДНК содержит код, управляющий производством белков? Но для чего тогда нужны оставшиеся 98%? Многие годы ученые были уверены, что эти 98% — просто генетическая свалка, хлам. Только в последнее время стало ясно: у генетического «мусора» невероятно важные функции. К примеру, в «мусорной» ДНК таятся причины синдрома Дауна и многих других генетических болезней. Здесь спрятаны самые разные регуляторные механизмы и даже управление процессами старения. И более того: оказывается, именно величина мусорной части ДНК отличает человека от других обитателей нашей планеты. У нас этого «хлама» больше!

Благодарности

Мне повезло, что и вторую мою книгу помогает готовить замечательный агент Эндрю Лауни и чудесные издатели. Среди сотрудников Icon Books мне особенно хочется поблагодарить Дункана Хиса, Эндрю Фарлоу и Роберта Шермана, но я не хочу забывать и об их бывших коллегах — Саймоне Флинне и Генри Лорде. Среди сотрудников Columbia University Press я чрезвычайно признательна Патрику Фицджеральду, Бриджет Флэннери-Маккой и Дереку Уоркеру.

Как всегда, мне удалось добыть кое-что приятное и поучительное из не совсем обычных источников. В этом сыграли свою роль Конор Кэри, Финн Кэри и Гэбриэл Кэри, а за пределами нашего генетического клана — Айона Томас-Райт. Огромную поддержку (в том числе и в виде огромного количества печенья) мне оказала моя неизменно терпеливая и вообще необыкновенная свекровь Лайза Доран.

После выхода моей первой книги мне пришлось множество раз выступать перед неспециалистами, и приглашали меня самые разные организации. Их слишком много, чтобы называть всех здесь, но они сами обо всем знают. Я лишь хочу заметить, что для меня такие встречи — великая честь и громадное удовольствие. Все это меня очень вдохновляло и воодушевляло. В общем, спасибо вам всем.

И наконец, спасибо тебе, Эби, той самой Эби, которая великодушно прощает мне, что я, несмотря на все свои обещания, до сих пор так и не пошла заниматься бальными танцами.

О терминах

Когда пишешь о мусорной ДНК, неизбежно сталкиваешься с некоторыми лингвистическими трудностями. Видите ли, сам этот термин — довольно зыбкий. Он все время слегка меняет свое значение. Отчасти это происходит из-за того, что постоянно поступают новые данные, меняющие наши представления о происходящем. Как только удается показать, что некий кусок мусорной ДНК обладает определенной функцией, некоторые ученые тут же заявляют, что это не мусор. Что ж, вполне логично. Однако такой подход грозит разрушением общей перспективы. Иными словами, он мешает нам увидеть, насколько резко изменилось наше понимание генома в последние годы.

Я не стала тратить время, пытаясь связать свитер из этого клубка тумана. Я решила применить самый прямолинейный и твердолобый подход. Все, что не кодирует какой-то белок, будет описываться как мусор. Совсем как в старые времена, то есть во второй половине XX века. Пускай пуристы издают негодующие восклицания. Ничего страшного. Спросите 3 ученых, что они подразумевают под термином «генетический мусор», и они вам, скорее всего, дадут 4 разных ответа. Так что есть смысл начать с чего-нибудь простого.

Кроме того, вначале я буду применять термин «ген» просто к отрезку ДНК, кодирующему какой-то белок. Но имейте в виду: по ходу текста это определение будет эволюционировать.

Кроме того, я решила использовать названия конкретных генов лишь там, где это совершенно необходимо. А если вам хочется узнать остальные названия, можете обратиться к примечаниям и к ссылкам на оригинальные работы в конце книги.

Введение в темную материю генома

Представьте себе напечатанный на бумаге сценарий пьесы, фильма, телевизионного шоу. Любой может прочесть его, как книгу. В этом нет ничего сложного. Но сценарий делается гораздо мощнее, когда на его основе что-то создают. Перед нами уже не просто вереница слов на листке, когда эти слова произносят вслух, а уж тем более — когда их исполняют профессиональные актеры.

Вот и с ДНК, по сути, такая же история. Это, в общем, тоже сценарий, но совершенно необычный. При помощи весьма скудного алфавита, состоящего всего из 4 букв, ДНК ухитряется нести в себе код для самых разных организмов, от бактерий до слонов, от пивных дрожжей до синих китов. Хотя ДНК в пробирке — штука довольно скучная. Ничего она там не делает. ДНК становится куда интереснее, когда клетка или организм использует ее, чтобы, так сказать, поставить пьесу. ДНК обеспечивает код для создания белков, а белки жизненно необходимы для процессов дыхания, питания, избавления от продуктов жизнедеятельности, размножения — и всех прочих функций, характерных для живых существ.

Белки — настолько важная вещь, что в XX веке ученые именно через них давали определение гену. Ген описывали как участок ДНК, кодирующий тот или иной белок.

Возьмем самого знаменитого драматурга всех времен и народов — Шекспира. На волну его текстов не всем легко настроиться, потому что с шекспировских времен английский язык успел довольно сильно измениться. Но все равно мы всегда твердо уверены: Бард писал лишь те слова, которые хотел вложить в уста актеров.

Иными словами, Шекспир не писал чего-то такого:

Нет. В своих знаменитых строках он написал лишь подчеркнутые здесь слова:

To есть «А rose by any other name would smell as sweet»[1].

Но наш ДНК-сценарий не покажется нам таким же благоразумно-компактным, как шекспировская строка. Каждый участок, кодирующий белок, представляет собой, в сущности, целое море бессмысленной чепухи, где плавает одно-единственное осмысленное слово.

Много лет ученые никак не могли объяснить, почему такое количество нашей ДНК не кодирует никаких белков. Эти некодирующие участки пренебрежительно назвали термином «мусорная ДНК». Однако со временем ученые стали приглядываться к мусорной ДНК все внимательнее, причем по целому ряду причин.

Пожалуй, наиболее фундаментальная из них — огромная доля мусорной ДНК в наших клетках. В 2001 году специалисты наконец завершили расшифровку человеческого генома (так называемое секвенирование). Какое же открытие стало для них едва ли не самым сильным потрясением? То, что более 98% ДНК в человеческой клетке относится именно к категории мусорной. Иными словами, эти 98% не кодируют никаких белков! Аналогия с шекспировскими произведениями, которую мы привели выше, на самом-то деле получилась даже упрощенная. По генетическим меркам отношение объема «чепухи» к объему осмысленного текста в человеческом геноме примерно в 4 раза выше, чем в нашем примере: больше 50 букв всякого сора на одну букву осмысленных слов.

Можно предложить и другие сравнения. Представьте, что мы с вами посещаем автомобильный завод, где выпускают, скажем, что-нибудь ужасно сложное вроде «феррари». Мы очень удивимся, если увидим, что на каждых 2 рабочих, которые честно собирают сверкающий красный спорткар, приходится 98 бездельников, которые сидят сложа руки. Это было бы нелепо и смешно. Почему же так происходит в нашем геноме? Разумно ли такое положение вещей? Ну да, именно несовершенства живых существ зачастую служат самыми убедительными доказательствами того, что эти самые существа произошли от какого-то общего предка (пример такого «несовершенства» — аппендикс, который человеку вроде бы не очень-то и нужен). Но не заходим ли мы слишком далеко в наших рассуждениях о подобных «лишних» компонентах организма?

Вот куда более правдоподобный сценарий. На каждых 2 рабочих, собирающих автомобили, приходится 98 сотрудников, делающих все остальное. Благодаря этому идет работа и развивается бизнес. На заводе ведь занимаются не только сборкой машин как таковой. Кто-то должен изыскивать финансирование, вести бухгалтерию, рекламировать товар, следить за выплатой пенсий бывшим сотрудникам, чистить туалеты, продавать произведенные машины и тому подобное. Вероятно, это более удачная модель, описывающая роль «мусора» в нашем геноме. Можно относиться к белкам как к своего рода конечным продуктам, необходимым нам для жизни, но без «мусора» их никогда бы не произвели как полагается. Без «мусора» само их производство не удалось бы как следует скоординировать. Два человека могут соорудить машину, но они не сумеют поддерживать на плаву целую компанию, которая такими машинами торгует, и уж тем более — превратить ее в успешную, процветающую фирму. С другой стороны, нет никакого смысла держать 98 сотрудников для подметания полов и дежурства в салонах продаж, если продавать нечего. Вся организация работает лишь тогда, когда все ее компоненты находятся на своем месте и занимаются своим делом. Точно так же и с нашим геномом.

Секвенирование человеческого генома принесло и еще одно потрясение. Выяснилось, что бесчисленные тонкости человеческой анатомии, физиологии, разума и поведения нельзя объяснить при помощи классической модели, описывающей гены. Если говорить лишь о количестве генов, кодирующих белки, то у человека их примерно столько же (около 20 тысяч), сколько и у какого-нибудь примитивного микроскопического червя. Более того, большинство генов червей имеют прямой генетический эквивалент в геноме человека.

По мере того, как ученые все глубже анализировали, что же отличает человека от других организмов на уровне ДНК, становилось очевиднее, что сами по себе гены тут — не объяснение. И вообще оказалось, что с ростом усложненности организма растет лишь один из генетических параметров — количество участков мусорной ДНК. Иными словами, чем сложнее устроен организм, тем больше в нем процент мусорной ДНК. Лишь сейчас ученые стали по-настоящему исследовать противоречивую идею, согласно которой именно в мусорной ДНК таится ключ к эволюционной сложности и многообразию.

Но если мусорная ДНК так важна, что же она делает? Какова ее роль в клетке, раз уж она не кодирует белки? Сегодня ясно, что мусорная ДНК обладает целым рядом различных функций. Ничего удивительного, ее ведь так много.

Какая-то ее часть образует особые структуры в хромосомах, куда упакована наша с вами ДНК. Этот «мусор» помогает ей не расплетаться (расплетаясь, она может получить повреждения). По мере нашего старения «мусорные» области уменьшаются в размерах и наконец переходят за критический минимум. После этого наш генетический материал становится подверженным всякого рода перестройкам и перегруппировкам, которые могут привести к катастрофическим результатам — к клеточной смерти или раковым процессам.

Другие структурные области мусорной ДНК действуют как своего рода якоря, когда хромосомы в процессе клеточного деления поровну распределяются между различными дочерними клетками. («Дочерняя клетка» — любая клетка, возникающая при делении материнской клетки. Заметьте, это не означает, что материнская или дочерняя клетка — женские.) Есть области, которые служат своего рода изоляторами (они называются инсуляторами): они ограничивают экспрессию генов определенными областями хромосом.

Однако значительная часть нашей мусорной ДНК — не просто какие-то структурные области. Она не кодирует белки, зато кодирует молекулы другого типа — РНК. Обширный класс подобных элементов мусорной ДНК образует в клетке своеобразные фабрики, тем самым помогая вырабатывать белки. А другие разновидности молекул РНК доставляют на эти фабрики сырье для производства белка.

Есть и иные участки мусорной ДНК — генетические помехи, ведущие свое происхождение от геномов вирусов и других микроорганизмов, когда-то встроившихся в человеческие хромосомы. Это своего рода генетические «спящие агенты». Такие остатки давно умерших организмов несут в себе потенциальную угрозу клетке, человеку, а иногда и целой популяции людей. Клетки млекопитающих в ходе эволюции выработали многочисленные механизмы для того, чтобы «затыкать рот» подобным вирусным компонентам, но эти защитные системы могут иногда отказывать или ломаться. Когда такое происходит, последствия могут быть самыми разными. От безобидных (вроде изменения цвета шерсти у определенной генетической линии подопытных мышей) до куда более опасных (например, возникновения рака).

Среди важных функций мусорной ДНК, которые в полной мере осознали только в последние годы, — регуляция экспрессии генов. Иногда это может оказывать весьма сильное и весьма заметное воздействие на человека. Один из фрагментов мусорной ДНК абсолютно необходим для того, чтобы у самок животных происходила нормальная экспрессия генов. Проявления его действия можно увидеть в целом ряде ситуаций. Простенький пример — генетическая регуляция окраски и узоров пестрых кошек. Однако тот же механизм позволяет объяснить, почему у идентичных близнецов женского пола могут неодинаково проявляться симптомы одного и того же наследственного заболевания. Иногда кто-то из таких близнецов страдает острой формой недуга, угрожающего жизни, тогда как другой близнец совершенно здоров.

Тысячи и тысячи участков мусорной ДНК подозреваются в том, что они регулируют биологические сети экспрессии генов. В этом смысле они напоминают указания режиссера, ставящего спектакль. Впрочем, в данном случае указания чрезвычайно сложны и запутанны. Никакая актерская труппа с ними не справилась бы. Забудьте все эти примитивные ремарки типа «Выбегает, преследуемый медведем». Скорее уж они напоминают что-нибудь вроде: «Если вы ставите „Гамлета“ в Ванкувере и „Бурю“ в Перте, в такой-то строке „Макбета“ ударение должно падать на четвертый слог. Если только при этом любительская труппа не ставит „Ричарда III“ в Момбасе, а в Кито не идет дождь».

Ученые сейчас только начинают распутывать тонкие взаимосвязи гигантских сетей мусорной ДНК. Правда, системы, при помощи которых мы пытаемся изучать ее функции, пока еще относительно неразвиты. Поэтому исследователям иногда не так-то просто проверять свои гипотезы экспериментально. И вообще мы занимаемся всем этим сравнительно недавно. Впрочем, порой нужно уметь вовремя отойти от лабораторного стола и от всех этих умных машин, выдающих несметное количество данных. По сути, эксперименты и без того окружают нас на каждом шагу, ведь у природы и эволюции было несколько миллиардов лет на то, чтобы перепробовать всевозможные виды изменений. Даже краткий по геологическим меркам момент, знаменующий появление и распространение нашего собственного вида, предоставил природе время, позволяющее осуществить куда большее количество разнообразных опытов, чем мы, ученые, могли бы мечтать провести. Поэтому на протяжении всей книги мы будем исследовать темноту непознанного при свете факела человеческой генетики.

Как освещать эту темную материю нашего генома? С чего начать? Тут есть много вариантов. Давайте оттолкнемся от одного странного, но неопровержимого факта. Дело в том, что причина некоторых генетических заболеваний — мутации мусорной ДНК. Вероятно, это самая подходящая отправная точка для нашего путешествия в геномную вселенную.

Глава 1. Темная материя, или Отличная материя для размышлений

Иногда жизнь кажется ужасно жестокой. На одну семью порой сваливается целая куча несчастий. Вот, например, родился мальчик, назовем его Дэниэл. Уже при рождении он какой-то хлипкий, к тому же бедняга не способен дышать без посторонней помощи. Благодаря интенсивной терапии Дэниэл выжил, тонус мышц у него улучшился, так что он научился дышать самостоятельно и худо-бедно передвигаться. Но по мере взросления выяснилось, что у него проблемы с обучением, которые будут всю жизнь ему мешать.

Сара, его мать, очень любит мальчика и постоянно о нем заботится. Но вот ей уже 35, и делать это все труднее, потому что у нее появились какие-то странные симптомы. Мышцы у нее порой деревенеют, да до такой степени, что иногда она берет что-то, а разжать пальцы очень трудно. Ей приходится уйти с работы. (Сара — реставратор керамики. Дело это, требующее высокой квалификации, отнимало у Сары по нескольку часов в сутки.) Кроме того, ее мышцы начинают заметно уменьшаться в размерах. Все-таки ей как-то удается справиться с неприятностями. Но в возрасте всего-навсего 42 лет Сара внезапно умирает от сердечной аритмии — катастрофического разрыва в цепи электрических сигналов, заставляющих сердце постоянно биться в нужном ритме.

Заботы о Дэниэле падают на Джанет, мать Сары. Для бабушки мальчика это непросто, и не только из-за проблем внука и душевных страданий, вызванных безвременной смертью дочери. Дело в том, что уже в свои 50 с небольшим Джанет заработала катаракту на обоих глазах, и зрение у нее, прямо скажем, не блестящее.

Может показаться, что семейству просто не повезло: его поразило сочетание не связанных друг с другом недугов. Однако специалисты отметили тут кое-что необычное. Выяснилось, что такой характер болезней — катаракта у старшего члена семьи, одеревенение мышц и сердечные дефекты у дочери, а у внуков вялые мышцы и трудности в обучении, — встречается во многих семьях. Эти семьи живут по всему миру, и их не связывает родство.

Ученые поняли: речь идет о каком-то генетическом заболевании. Они назвали его миотонической дистрофией («миотонической», то есть имеющей отношение к тонусу мышц; «дистрофией», поскольку происходит их истощение). Этот недуг проявляется в каждом поколении той семьи, которую он поражает. Если у кого-то из родителей есть это заболевание, для ребенка вероятность заболеть — в среднем одна вторая. Риску в равной степени подвергаются женщины и мужчины. И те, и другие могут передать этот недуг по наследству — своим детям^1.

Эти наследуемые характеристики весьма типичны для болезней, причина которых — мутации одного гена. Мутация — это изменение в нормальной ДНК-последовательности. Обычно наши клетки наследуют по две копии каждого гена: одну от матери, одну — от отца. Характер наследования при миотонической дистрофии, когда заболевание проявляется в каждом поколении, называется доминантным. При доминантных заболеваниях лишь одна из двух копий гена несет в себе мутацию. Это копия, унаследованная от родителя, пораженного данной болезнью. Мутировавший ген способен вызвать недуг, хотя в клетках содержится и нормальная копия. Мутантный ген как бы «доминирует» над нормальным.

Однако миотоническая дистрофия, как выяснилось, обладает характеристиками, существенно отличающимися от характеристик типичного доминантного заболевания. Начнем с того, что доминантные заболевания обычно не обостряются после передачи детям. Да и почему бы такое могло происходить? Ведь ребенок, пораженный недугом, наследует от родителя то же заболевание, точно такую же мутацию. Кроме того, у страдающих миотонической дистрофией симптомы проявляются во все более раннем возрасте по мере того, как заболевание передается из поколения в поколение. Это также необычно.

Миотоническая дистрофия отличается от «обычной» картины наследственного заболевания еще и тем, что острая форма болезни (как раз та, что у Дэниэла) наблюдается лишь у детей, чья мать страдает этим недугом. Похоже, отцы никогда не передают детям по-настоящему острую форму заболевания.

В начале 1990-х годов несколько различных научных групп выяснили, какое генетическое изменение служит причиной миотонической дистрофии. Заболевание это необычное, и соответствующая мутация тоже весьма необычна. Ген миотонической дистрофии содержит небольшую ДНК-последовательность, которая повторяется множество раз^2. Эта небольшая последовательность состоит из 3 букв генетического алфавита, используемого ДНК (всего в этом алфавите, напомним, 4 буквы). В гене миотонической дистрофии повторяющаяся последовательность состоит из букв Ц, Т и Г (буква А здесь не задействована).

У тех, кто не страдает миотонической дистрофией, имелось бы от 5 до 30 копий такого ЦТГ-мотива, расположенных подряд, одна за другой. Дети наследуют от родителей число таких повторов. Но когда количество повторов увеличивается и превышает примерно 35, последовательность становится слегка неустойчивой, и число повторов может меняться при передаче ребенку по наследству. А когда число копий мотива достигает приблизительно 50, последовательность делается по-настоящему нестабильной. Когда такое происходит, родители могут передать своему отпрыску значительно большее число повторов, нежели то, которым обладают сами. Длина цепочки повторов растет, и симптомы заболевания становятся все более острыми и проявляются во все более раннем возрасте. Вот почему недуг усугубляется от поколения к поколению, как у семейства, с рассказа о котором мы начали главу. Кроме того, стало очевидным, что обычно лишь матери передают по наследству длинные цепочки повторов — те, которые приводят к появлению фенотипа с острой врожденной формой заболевания. (Такое увеличение числа повторов называется экспансией.)

Этот неуклонный рост числа повторов фрагмента ДНК — весьма необычный механизм мутации. Однако само выявление такого роста, вызывающего миотоническую дистрофию, позволило пролить свет на кое-что еще более необычное.

Вязание с помощью ДНК

До недавнего времени мутации в генетических последовательностях считались важным явлением не из-за самих изменений в ДНК, а из-за дальнейших последствий таких изменений. Это чем-то похоже на ошибку в узоре для вязания. Сама по себе ошибка ничего не значит, пока остается на бумаге. Она становится проблемой, лишь когда вы что-нибудь свяжете на основе этих ошибочных указаний и обнаружите, что в вашем свитере дыра или у вашего кардигана 3 рукава — из-за того, что в «код вязания» вкралась погрешность.

Ген (узор для вязания) в конечном счете кодирует белок (свитер). Белки — как раз те молекулы, которые, по общепринятому мнению, делают всю работу в клетках. Они выполняют невероятное количество функций. Взять хотя бы гемоглобин в красных кровяных тельцах: он разносит кислород по нашему телу. Или вот другой белок — инсулин: его вырабатывает поджелудочная железа, и он помогает мышечным клеткам усваивать глюкозу. Тысячи и тысячи белков выполняют функции, необходимые для поддержания жизни. Диапазон этих функций ошеломляет.

Белки конструируются из строительных блоков, именуемых аминокислотами. Мутации обычно изменяют последовательность этих аминокислот. Результаты зависят от того, какая мутация происходит и в какой именно области гена. Аномальный белок может выполнять в клетке не ту функцию, какую надо, или же вовсе утратить способность действовать.

Однако при миотонической дистрофии мутация не меняет аминокислотную последовательность. Мутировавший ген по-прежнему кодирует точно такой же белок. Ученые лишь с большим трудом разобрались, как эта мутация приводит к болезни, ведь с белком при этом ничего страшного не происходит.

Конечно, есть сильное искушение просто отнести мутацию, происходящую при миотонической дистрофии, к категории статистических выбросов, странных исключений, не возникающих в большинстве биологических ситуаций. Тогда можно отложить этот случай в сторонку и забыть о нем. Но случай этот — не единичный.

Синдром ломкой X-хромосомы (синдром Мартина-Белл) — наиболее распространенная форма наследуемой неспособности к обучению (умственной отсталости). Ее симптомы обычно не проявляются у матерей, однако они передают заболевание сыновьям. Иными словами, матери несут в себе мутацию, однако она не затрагивает их самих. Как и в случае с миотонической дистрофией, эту болезнь вызывает увеличение количества повторов трехбуквенной последовательности. Здесь эта последовательность — ЦЦГ. Как и в случае с миотонической дистрофией, такое увеличение не меняет саму аминокислотную последовательность белка, кодируемого геном синдрома ломкой X-хромосомы.

Атаксия Фридрейха — форма прогрессирующей мышечной атрофии. Симптомы обычно появляются в позднем детском или раннем подростковом возрасте. В отличие от миотонической дистрофии, на родителях больного этот недуг обычно не сказывается. Однако и мать, и отец являются его носителями. Каждый родитель несет в себе одну нормальную и одну аномальную копию соответствующего гена. Но если дитя унаследует мутировавшую копию от матери и отца, у ребенка разовьется эта болезнь. Атаксию Фридрейха тоже вызывает увеличение числа повторов трехбуквенной последовательности, в данном случае — ГАА. Опять-таки, это не меняет аминокислотную последовательность белка, кодируемого мутировавшим геном^3.

Эти три генетических заболевания, столь различные по историям болезни семьи, симптомам и характеру наследования недуга, позволили ученым прийти к четкому и определенному выводу: существуют мутации, способные вызывать болезни, не меняя аминокислотную последовательность белков.

Невозможный недуг

А более поразительное открытие сделали несколько лет спустя. Существует еще одно наследуемое дегенеративное заболевание, при котором мышцы лица, плеч и предплечий постепенно слабеют и атрофируются. Поэтому болезнь и назвали плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофией. (Обычно это название сокращают до ПЛЛМД, что и неудивительно.) Как правило, симптомы становятся заметны лишь к тому времени, когда пациенту уже 20 с небольшим. Как и миотоническая дистрофия, это доминантное заболевание. Оно передается ребенку от страдающего этим недугом родителя^4.

Ученые годами искали мутацию, которая служит причиной ПЛЛМД. В конце концов они выяснили, что и здесь дело в повторах одного элемента ДНК-последовательности. Однако этот элемент — не трехбуквенный фрагмент, как в случаях миотонической дистрофии, синдрома ломкой X-хромосомы или атаксии Фридрейха. Речь идет о фрагменте длиной более 3000 букв. Можно назвать его блоком. У тех, кто не страдает ПЛЛМД, число таких блоков, следующих один за другим, составляет от 11 до примерно 100. Но у пациентов с ПЛЛМД количество этих блоков меньше — максимум 10. Такого никто не ожидал. Но больше всего ученых поразило то, что они лишь с большим трудом сумели отыскать ген, расположенный близ участка мутации.

За последнее столетие генетические заболевания позволили нам совершить впечатляющие открытия в биологии. Далеко не всегда очевидно, сколько усилий нужно приложить, чтобы добыть те или иные знания в этой области. Чтобы выявить мутации, о которых мы только что говорили, зачастую требовалось больше 10 лет труда значительного количества специалистов. Тут многое зависело от того, сумеют ли ученые получить доступ в семьи, которые согласятся дать образцы крови и откроют свою фамильную медицинскую историю.

Такого рода анализ долгое время был очень затруднителен во многом из-за того, что ученые при этом обычно искали очень маленькое изменение на очень обширном пространстве: это как искать один определенный желудь в лесу. Процесс значительно упростился с 2001 года, когда был расшифрован геном человека. Геном человека — вся последовательность нуклеотидных оснований ДНК, содержащейся в наших клетках.

Благодаря проекту «Геном человека» мы знаем, как гены располагаются друг относительно друга, а кроме того, теперь нам известны их нуклеотидные последовательности. Не забудем и о колоссальном прогрессе в технологиях, которые применяются для секвенирования (расшифровки) ДНК. Все это позволило быстрее и дешевле отыскивать мутации, которые служат причиной даже самых редких генетических заболеваний.

Однако полная расшифровка генома человека позволила не только с относительной легкостью выявлять мутации, вызывающие болезни, — она коренным образом меняет представления о многих основополагающих идеях, долгие годы господствовавших в биологии.

Исследуя работу наших клеток, почти каждый ученый последних шести десятилетий обращал особое внимание на функции и воздействие белков. Однако как только удалось секвенировать человеческий геном, специалисты оказались перед дилеммой, которая их немало озадачила. Если белки играют такую важную роль решительно во всех жизненных процессах, почему же тогда лишь около 2% нашей ДНК предназначено для кодирования аминокислот, этих кирпичиков для строительства белков? Чем, скажите на милость, занимаются остальные 98% ?

Глава 2. Когда темная материя становится совсем темной

Ученых поразило, что такая огромная доля генома не кодирует никаких белков. Однако больше всего их удивило не само это явление, а его размах. Специалисты уже много лет знали о существовании участков ДНК, не кодирующих белки. Собственно, это стало одним из первых больших сюрпризов после открытия структуры ДНК. Однако тогда вряд ли кто-нибудь представлял, какими важными окажутся эти области ДНК, и вряд ли кто-нибудь ожидал, что они помогут объяснить причины некоторых генетических заболеваний.

Сейчас не помешает чуть подробнее вглядеться в строительные блоки нашего генома. Напомним, ДНК — своего рода алфавит, к тому же весьма простой. В нем всего четыре буквы — А, Г, Т и Ц (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Их называют нуклеотидными основаниями. Этот простенький алфавит несет в себе невероятное количество информации. Человек наследует 3 миллиарда оснований, составляющих наш генетический код, от матери, и аналогичный набор оснований от отца. Представьте себе ДНК как веревочную лестницу, где каждая ступенька — нуклеотидное основание, причем между соседними ступеньками 25 сантиметров. Такая лестница протянулась бы на 75 миллионов километров, то есть приблизительно от Земли до Марса (впрочем, тут многое зависит от того, где эти планеты будут располагаться на своих орбитах в тот момент, когда мы протянем эту воображаемую лестницу).

Еще одно сравнение. Полный корпус произведений Шекспира содержит в себе, по уверениям специалистов, 3 миллиона 695 тысяч 990 букв^1. Представим себе, что все это собрали в один толстенный том. Мы наследуем от матери текст объемом чуть больше 811 таких книг. И столько же — от отца. Это, прямо скажем, немалый объем информации.

Если продолжать аналогию с алфавитом, можно заметить, что алфавит ДНК кодирует лишь трехбуквенные слова. Каждое такое слово соответствует определенной аминокислоте — строительному блоку, из которых конструируются белки. Ген можно представить себе как предложение из таких трехбуквенных слов. Такая фраза кодирует последовательность аминокислот, из которых слагается тот или иной белок. (См. рис. 2.1.)

Рис. 2.1. Связь между геном и белком. Каждая трехбуквенная последовательность в гене кодирует один строительный блок соответствующего белка.

В каждой клетке обычно содержится по две копии каждого гена. Одну копию мы наследуем от матери, одну — от отца. Но хотя в клетке лишь две копии каждого гена, она способна создавать тысячи и тысячи белковых молекул, кодируемых тем или иным геном.

Как клетке это удается? В процесс экспрессии генов встроено два механизма амплификации (увеличения числа копий). Последовательность нуклеотидных оснований в ДНК не служит непосредственным шаблоном для создания белка. Клетка создает копии гена. Эти копии очень похожи на исходный ген ДНК, однако не идентичны ему. Они слегка отличаются от него по химическому составу. Их называют РНК (рибонуклеиновая кислота, тогда как ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота). Еще одно отличие: у РНК вместо основания Т (тимин) — основание У (урацил). ДНК состоит из двух нитей, соединенных парами оснований. Чем-то это похоже на железнодорожные пути. Рельсы удерживаются вместе благодаря тому, что нуклеотидное основание одного рельса связывается с основанием другого, как если бы основания пожимали друг другу руки. Такие рукопожатия подчиняются определенным правилам. Т пожимает руку только А, а Ц — лишь Г. Благодаря этому распределению связей ученые часто описывают ДНК как совокупность нуклеотидных пар. РНК — однонитевая молекула («монорельс»)[2]. Главные отличия между ДНК и РНК показаны на рис. 2.2. Клетка способна быстро сделать тысячи РНК-копий гена ДНК, и это — первая амплификационная стадия экспрессии гена.

Рис. 2.2. Вверху: грубая схема ДНК (молекулы, состоящей из двух нитей). Основания (А, Г, Т и Ц) удерживают две нити вместе, попарно соединяясь. При этом А всегда соединяется только с Т, а Г всегда соединяется только с Ц. Внизу: грубая схема РНК (однонитевой молекулы). Ее «хребет» по химическому составу чуть отличается от ДНК (поэтому полоска закрашена другим цветом). Вместо основания Т у РНК — основание У.

РНК-копии гена уносятся от ДНК в другую часть клетки — цитоплазму. В этой клеточной области молекулы РНК действуют как своего рода шаблоны (матрицы) для аминокислот, которые образуют белок. Каждая молекула РНК может много раз выступать в роли такого шаблона, что и представляет собой вторую стадию амплификации при экспрессии гена. (См. рис. 2.3.)

Можно прибегнуть к аналогии с узором для вязания, которую мы уже использовали в первой главе. Ген ДНК — исходный узор на листе бумаги. Этот узор можно много раз ксерокопировать (сравните с производством РНК). Полученные копии можно послать множеству вязальщиц, каждая из которых может много раз воспроизвести один и тот же узор (сравните с синтезом белка). Простая, но эффективная модель. Такая молекула РНК действует как своего рода посланец. Она несет информацию о генетической последовательности от ДНК к «сборочному цеху», где синтезируются белки. Поэтому она и называется информационной РНК (другое название — матричная РНК).

Рис. 2.3. Единичная копия гена ДНК в ядре клетки используется как шаблон для создания множества копий молекулы информационной РНК. Эти молекулы РНК выводятся за пределы ядра. Затем каждая может играть роль инструкции для производства белка. Каждая молекула информационной РНК способна создавать множество копий одного и того же белка. Таким образом, при создании белка на основе кода ДНК имеют место две стадии амплификации. Для простоты картины здесь показана лишь одна копия данного гена, хотя обычно в клетке их две — по одной от каждого из родителей.

Отсекая бессмыслицу

Вам может показаться, что все это — довольно простые процессы. Однако некоторое время назад ученые обнаружили, что здесь есть некая странность. Большинство генов состоит из фрагментов, которые кодируют аминокислоты белков, и каких-то «лишних» кусков, которые ничего такого не кодируют. Эти куски — словно бессмыслица, вклинившаяся в строй понятных слов. Фрагменты бессмысленного генетического текста назвали интронами.

Когда клетка производит РНК, она вначале копирует все ДНК-буквы гена, в том числе и те его куски, которые не кодируют никаких аминокислот. Но затем клетка удаляет эти некодирующие куски, так что в конечном счете получается информационная РНК, представляющая собой удобную инструкцию для синтеза нужного белка. Этот процесс называется сплайсингом («сращиванием»). Он упрощенно показан на рис. 2.4.

Рис. 2.4. Стадия 1: ДНК копируется в РНК. Стадия 2: РНК обрабатывается так, чтобы соединялись вместе лишь участки, кодирующие аминокислоты (обозначены прямоугольниками с буквами). Мешающие «мусорные» участки выбрасываются из зрелой молекулы информационной РНК.

Как показано на рис. 2.4, белок кодируется модульными блоками информации, что дает клетке массу возможностей по-разному обрабатывать РНК (такая обработка называется процессингом РНК). Клетка может по-разному соединять модули, полученные от молекулы информационной РНК, тем самым создавая целый ряд информационных молекул, кодирующих родственные друг другу, но не идентичные белки. Схематически это показано на рис. 2.5.

Куски бессмысленного текста между участками гена, кодирующими аминокислоты, вначале считали просто какой-то чепухой, ненужным хламом. Отсюда и возникло пренебрежительное название «мусорная ДНК». Такие фрагменты обычно отметали как незначащие. Как уже подчеркивалось, мы будем использовать термин «мусорная ДНК» для обозначения любых фрагментов ДНК, не кодирующих белки.

Рис. 2.5. Молекула РНК может обрабатываться различными путями. В результате могут соединяться друг с другом разные участки, кодирующие аминокислоты[3]. Это позволяет синтезировать на основе одного исходного гена ДНК различные версии белковой молекулы.

Однако теперь-то нам известно, что такие фрагменты могут иметь очень большое значение. Атаксия Фридрейха, заболевание, которое мы описывали в главе 1, вызывается ненормально большим количеством повторов последовательности ГАА в одной из «мусорных» областей ДНК, находящейся между двумя фрагментами, честно кодирующими аминокислоты. Отсюда и возник вполне разумный вопрос: если мутация не затрагивает последовательности, отвечающие за синтез аминокислот, почему же люди, у которых наблюдается такая мутация, страдают от столь разрушительных симптомов?

При атаксии Фридрейха мутация определенного гена происходит в мусорной области между двумя участками, кодирующими аминокислоты. (На рис. 2.5 это была бы область между Б и Л.) В нормальном состоянии такой ген содержит от 5 до 30 повторов ГАА, а у мутантного гена от 70 до 1000 повторяющихся мотивов ГАА^2. Исследователи показали: когда число повторов так сильно превышает норму, клетка перестает вырабатывать информационную РНК, кодируемую данным геном. А поскольку клетки теряют способность производить информационную РНК, они не могут делать и белок. Если вы не рассылаете вязальщицам узоры, солдаты не получают теплых носков.

Собственно, в таких случаях клетки не производят даже длинную, необработанную РНК-копию гена^3. Зона избыточного повтора ГАА действует как своего рода «клейкая» область, которая препятствует нормальному копированию ДНК. Сравните с попыткой ксерокопировать 50-страничный документ, в котором страницы 4-12 склеены вместе. Аппарат просто не сможет нормально обработать эти страницы, и весь процесс копирования документа застопорится. В случае гена атаксии Фридрейха невозможность копирования означает, что не будет РНК, а значит, не будет и белка.

Пока не до конца ясно, почему нехватка белка, кодируемого данным геном, приводит к симптомам данной болезни. Похоже, этот белок участвует в процессах, которые мешают избыточному накоплению железа в частях клетки, вырабатывающих энергию^4. Когда клетке не удается синтезировать соответствующий белок, уровень содержания железа повышается до токсичных значений. По-видимому, некоторые типы клеток более чувствительны к уровню содержания железа. К ним относятся и те, которых затрагивает эта болезнь.

Родственный предыдущему, но все же иной механизм лежит в основе синдрома ломкой X-хромосомы — формы неспособности к обучению (умственной отсталости), с которой мы сталкивались в главе 1. Мутация при синдроме ломкой X-хромосомы — увеличение числа повторов последовательности ЦЦГ. Тут многое напоминает мутацию при атаксии Фридрейха: в нормальной хромосоме число копий этой последовательности обычно от 15 до 65. Но у хромосомы, которая несет в себе мутацию, характеризующую синдром ломкой X-хромосомы, число копий — от примерно 200 до нескольких тысяч5,6. Однако при синдроме ломкой X-хромосомы зона увеличенного числа повторов располагается в иной части гена по сравнению с атаксией Фридрейха — перед первым участком, кодирующим аминокислоты: на рис. 2.5 это соответствует мусорной области слева от блока, обозначенного буквой Б. Когда число «мусорных» повторов становится очень большим, информационная РНК не производится, а значит, на основе данного гена не синтезируется белок^7.

Функция этого белка состоит в том, чтобы разносить по клетке множество различных молекул РНК. Он доставляет их в нужные места, тем самым влияя на то, как эти РНК будут обрабатываться и как они будут синтезировать белки. Без данного белка другие молекулы РНК не регулируются должным образом. В результате нарушается нормальное функционирование клетки^8. По неясным пока причинам нейроны мозга, похоже, особенно чувствительны к такому эффекту. Вот почему при этом заболевании ухудшается обучаемость.

Приведем очередную бытовую аналогию. В Великобритании сравнительно небольшое количество выпавшего снега может парализовать транспортные сети. Снег покрывает шоссе и железнодорожные пути, мешая двигаться автомобилям и поездам. Когда такое происходит, люди не в состоянии вовремя добраться до места работы, что создает всевозможные проблемы. Школы не открываются, товары не доставляются в срок, банки не выдают нужное количество наличности и т.п. Одно исходное событие — снегопад — порождает многообразные последствия, поскольку нарушает работу транспортных систем человеческого общества. Что-то подобное происходит и при синдроме ломкой X-хромосомы. Подобно снегу на автострадах и рельсах, мутация нарушает работу транспортных систем человеческой клетки, что приводит к множеству последствий: наблюдается своего рода «эффект домино».

«Отключение» экспрессии определенного гена — ключевая стадия в патологии атаксии Фридрейха и синдрома ломкой X-хромосомы. Подтверждения этой гипотезы удалось найти, исследуя некоторые крайне редкие проявления обоих заболеваний. У очень небольшого числа пациентов участки мусорных повторов имеют тот же малый размер, что и у большинства здоровых людей. У таких пациентов наблюдаются мутации, меняющие порядок следования участков, кодирующих аминокислоты. Такие изменения аминокислотной последовательности не позволяют клетке вырабатывать белок. Иными словами, неважно, почему белок не экспрессируется, — в любом случае у пациентов наблюдаются симптомы болезни.

И как только вы обзавелись красивой теорией...

Может показаться, что у нас вырисовывается удобный и прямой путь для дальнейших исследований. Можно рассуждать так: эти расширения в мусорных областях важны лишь из-за того, что они создают аномальную ДНК. С этой ДНК клетка обращается неправильно. Результат — нехватка определенных важных белков. Можно предположить, что обычно эти мусорные области не играют особой роли в клетке.

Однако этому выводу кое-что противоречит. «Нормальный» диапазон количества повторов в генах синдрома ломкой X-хромосомы и атаксии Фридрейха обнаруживается по всему миру. Более того, он сохраняется на всем протяжении эволюции человека (является «консервативным»). Если эти области не наделены никаким смыслом, следовало бы ожидать, что со временем они будут случайным образом меняться. Однако такого не происходит. Остается предположить, что эти «нормальные» повторы имеют какую-то функцию.

Но подлинная жемчужина в этой генетической раковине связана с миотонической дистрофией, заболеванием, которое мы описывали в главе 1. Количество повторов при миотонической дистрофии растет по мере того, как недуг передается от поколения к поколению. Родительская хромосома может содержать последовательность ЦТГ, повторенную 100 раз подряд. Но в хромосоме ребенка последовательность ЦТГ может повторяться уже 500 раз подряд! По мере увеличения числа повторов последовательности ЦТГ заболевание становится все острее. Такого бы не происходило, если бы вредоносный рост числа повторов просто отключал близлежащий ген. Все клетки страдающего миотонической дистрофией содержат по две копии данного гена. В одной копии нормальное число повторов, в другой — увеличенное. А значит, одна копия гена должна всегда вырабатывать нормальное количество соответствующего белка. Следовательно, общий уровень выработки белка может упасть максимум на 50%.

Можно выдвинуть такую гипотезу. По мере того, как количество повторов увеличивается, все сильнее падает экспрессия мутантной версии гена. Это могло бы привести к постепенному уменьшению общего количества вырабатываемого белка — от падения на 1% для сравнительно небольшого роста числа повторов до 50%-ного (максимального) падения для значительного роста этого числа. Это, в свою очередь, могло бы привести к различным симптомам. Проблема в том, что других наследуемых генетических заболеваний такого же типа в общем-то нет. Мы просто не наблюдаем никаких других болезней, где весьма незначительные изменения экспрессии генов приводят к такому сильному эффекту (все, у кого число повторов превысило критический уровень, демонстрируют симптомы болезни), причем между пациентами наблюдается весьма тонкая градация симптомов (они становятся более серьезными по мере роста числа повторов).

Имеет смысл посмотреть, где именно в гене миотонической дистрофии происходит этот рост числа повторов. Оказывается, на правом краю, за последней областью, кодирующей аминокислоты. На рис. 2.5 это соответствует горизонтальной линии после прямоугольника с буквой Ь. Получается, всю область, кодирующую аминокислоты, можно скопировать в РНК еще до того, как копирующая аппаратура клетки встретится с вредоносной зоной повторов («расширением», «зоной экспансии»).

Теперь уже очевидно, что эта зона повторов сама копируется в РНК. Зона сохраняется, даже когда длинную РНК обрабатывают для создания из нее информационной РНК. При миотонической дистрофии информационная РНК делает нечто необычное. Она связывает множество белковых молекул, которые имеются в клетке. Чем больше повторов, тем больше белковых молекул связывается. Мутантная информационная РНК при миотонической дистрофии действует как губка, собирающая все больше таких белков. Белки, которые связываются с расширением информационной РНК при миотонической дистрофии, обычно участвуют в процессах регуляции многих других информационных РНК. Они влияют на эффективность доставки молекул информационной РНК в нужные места клетки, а также на то, долго ли эти молекулы информационной РНК просуществуют в клетке и насколько эффективно они будут кодировать белки. Но все эти регуляторы связывает расширение информационной РНК, создаваемой на основе гена миотонической дистрофии, так что они уже не могут выполнять свою обычную работу^9. Этот процесс схематически показан на рис. 2.6.

Рис. 2.6. Вверху: нормальная ситуация. Специфичные белки (показаны как «шевроны») связываются с зоной повторов триплета ЦТГ в информационной РНК миотонической дистрофии (иными словами, той информационной РНК, которая формируется на основе гена, мутирующего при данном заболевании). Множество молекул этих белков доступно для того, чтобы связываться с другими информационными РНК, регулируя их поведение. Внизу: ЦТГ-последовательность, много раз повторенная в мутантной информационной РНК миотонической дистрофии. Она связывает большое количество специфичных белков, и оставшихся не хватает для того, чтобы регулировать другие информационные РНК. Для простоты здесь показано лишь небольшое число повторов. В серьезных случаях оно может достигать нескольких тысяч.

Вот еще одна аналогия. Представьте себе большой город, где каждый полицейский вынужден подавлять массовые выступления на каком-то участке. Тогда не останется сотрудников охраны правопорядка для выполнения обычных полицейских функций. То-то раздолье взломщикам и угонщикам. Похожая история происходит в клетках тех, кто страдает от мутации гена миотонической дистрофии. В этом гене нарастает количество повторов последовательности ЦТГ, что в конечном счете приводит к неправильной регуляции прочих генов клетки.

Дело в том, что зона повторов, увеличиваясь, связывает все большее количество белков. Поэтому нарушается функционирование все большего количества информационной РНК, что затрагивает все больше функций клетки. В конечном счете это приводит к развитию широкого диапазона симптомов у тех, кто страдает генетической мутацией, характерной для миотонической дистрофии. Вот вам и объяснение того, почему пациенты с большим числом повторов страдают от самых разных и серьезных клинических проблем.

Как мы уже видели в случаях атаксии Фридрейха и синдрома ломкой X-хромосомы, нормальные повторяющиеся последовательности (для гена миотонической дистрофии — последовательности триплета ЦТГ) впечатляющим образом сохранялись на протяжении всей эволюции человека. Это еще одно подтверждение того, что они играют важную роль в поддержании здорового состояния и нормального функционирования организма. Для гена миотонической дистрофии подтверждение еще более убедительное — благодаря тем белкам, которые связываются с зоной повторов в информационной РНК. Эти белки также связываются с зонами повторов меньшего размера — как раз такого, которым характеризуются нормальные гены. Просто в зонах меньшего размера не так много таких связываний, как при увеличенном количестве повторов.

Из примера с миотонической дистрофией ясно, что есть какая-то причина, объясняющая, почему молекулы информационной РНК содержат области, не кодирующие белки. Такие области играют важнейшую роль при регулировании того, каким образом информационные РНК используются клетками. Эти области сами как бы создают еще один уровень контроля, осуществляя тонкую настройку количества белков, которые будут вырабатываться на основе генетической матрицы ДНК. Мутацию, приводящую к миотонической дистрофии, идентифицировали почти за десятилетие до публикации генома человека. Тогда никто не ожидал, какой невероятно сложной и изменчивой окажется эта тонкая настройка.

Глава 3. Куда ушли все гены?

26 июня 2001 года было объявлено о завершении первоначального черновика расшифровки человеческого генома. В феврале 2001 года вышли первые статьи, где описывалась эта «черновая» последовательность. Это стало кульминацией долгих лет работы, технологических прорывов, научного соперничества. В основном исследование финансировали американские Национальные институты здравоохранения и британский Wellcome Trust (в общей сложности на эти работы потребовалось примерно 2,7 миллиарда долларов^1). Работу выполнял международный консорциум. Первая порция статей, подробно описывающих полученные результаты, принадлежала перу более чем 2500 авторов из более чем 20 лабораторий по всему миру. Основную часть секвенирования выполняли пять лабораторий (четыре в США и одна в Великобритании). Одновременно частная компания Celera Genomics[4] тоже пыталась секвенировать человеческий геном, поставив дело на коммерческую основу. Однако, ежедневно публикуя получаемые данные, консорциум, получавший государственное финансирование, сумел добиться того, чтобы генетическая последовательность человека стала общественным достоянием^2.

Сообщение о том, что человеческий геном наконец расшифрован (пусть и пока начерно), вызвало огромный шум. Наиболее яркое заявление сделал, пожалуй, тогдашний президент США Билл Клинтон: «Сегодня мы изучаем язык, при помощи которого Бог сотворил жизнь»3. Можно лишь догадываться, что почувствовали некоторые ведущие участники проекта, когда политик заговорил о божественном в эту минуту технологического триумфа. К счастью, ученые обычно отличаются скромностью и застенчивостью, особенно перед телекамерами и в беседах со знаменитостями, так что мало кто выразил по этому поводу громкое недовольство.

Руководителем Wellcome Trust, международной благотворительной организации, вложившей колоссальные суммы в проект «Геном человека», был тогда Майкл Декстер. Он высказался не менее пафосно, хотя и чуть менее теологично, объявив завершение черновой расшифровки генома «выдающимся достижением не только в масштабах нашей жизни, но и в масштабах всей человеческой истории»4.

Возможно, другие открытия по своему значению не менее важны, чем результаты проекта «Геном человека». На ум сразу же приходят огонь, колесо, число 0, алфавит. Не исключено, что у вас есть на примете и другие открытия. Кое-кто может также заметить, что расшифровка человеческого генома пока еще не выполнила всех своих обещаний, особенно касающихся борьбы с заболеваниями. (К примеру, Дэвид Сейнсбери, тогдашний министр науки Великобритании, заявлял: «Теперь мы обрели возможность достигнуть в медицине всего, на что мы только могли надеяться»5.)

Впрочем, большинство ученых уже тогда понимали, что подобные заявления следует воспринимать с изрядной долей скептицизма. Этому их научила история генетики. Возьмем, к примеру, два сравнительно хорошо известных генетических заболевания. Мышечная дистрофия Дюшенна — очень опасный недуг. Страдающие им мальчики постепенно теряют мышечную массу, физически деградируют, утрачивают подвижность и обычно умирают еще в подростковые годы. Муковисцидоз — генетическое заболевание, при котором легкие утрачивают способность очищаться от слизи. Страдающие этим недугом подвергаются большому риску заразиться острыми формами инфекций, угрожающих жизни. Хотя некоторые из больных муковисцидозом в наши дни все-таки доживают примерно до 40 лет, это происходит лишь благодаря интенсивной физиотерапии, ежедневно очищающей их легкие, и колоссальным дозам антибиотиков.

Ген, мутирующий при мышечной дистрофии Дюшенна, выявили в 1987 году, а ген, мутирующий при муковисцидозе, обнаружили в 1989-м. То, что мутации в этих генах являются причиной болезней, установили более чем за 10 лет до завершения расшифровки человеческого генома. Но даже сейчас, после более чем 20 лет усилий специалистов, эффективных методов лечения этих болезней по-прежнему не существует. Понятно, что неизбежен значительный временной разрыв между знанием генетической последовательности человека и созданием методик лечения, позволяющих спасать жизни больных. Особенно велик этот разрыв, когда причиной заболевания становится не один ген, а два и более, или же когда какие-то гены взаимодействуют со средой (а ведь для большинства недугов дело обстоит именно так).

Впрочем, не следует чересчур строго судить политиков за их громкие заявления. Ученые и сами подняли немалую шумиху вокруг своих открытий. Если вы требуете от спонсоров почти 3 миллиарда долларов, вам нужно придумать амбициозный план и разработать убедительную рекламную кампанию. Расшифровка человеческого генома — не самоцель. Однако тем не менее она является важным научным достижением. В сущности, это был инфраструктурный проект, предоставивший человечеству данные, без которых попросту не удалось бы поставить великое множество других вопросов.

Разумеется, геномная последовательность человека — не одна на всех. У разных людей она разная. В 2001 году секвенирование миллиона пар нуклеотидных оснований ДНК обходилось в неполных 5300 долларов. К апрелю 2013-го стоимость такой же процедуры упала до 6 центов. Иными словами, пожелай вы проделать секвенирование вашего собственного генома, в 2001 году вам обошлось бы это в 95 с лишним миллионов долларов, а сегодня с вас потребуют чуть меньше 6 тысяч долларов^6. Более того, одна компания заявляет, что пришла эпоха тысячедолларовых геномов^7. Поскольку стоимость секвенирования так резко упала, ученым теперь гораздо легче исследовать степень вариативности генома между различными людьми. Это дает целый ряд преимуществ. В наши дни специалисты получили возможность выявлять редкие мутации, которые вызывают опасные заболевания, но встречаются лишь у небольшого количества пациентов, зачастую — в генетически изолированных популяциях (например, в общинах амишей (аманитов)[5], проживающих в США^8). Есть возможность секвенировать опухолевые клетки пациентов, чтобы выявить мутации, которые приводят к развитию раковых процессов. В некоторых случаях это позволяет создать специфические методики лечения для борьбы с конкретной формой онкологического заболевания конкретного пациента^9. Исследования в области эволюции человека и миграции людей удалось значительно усовершенствовать именно благодаря анализу ДНК-последовательностей^10.

Дорогой, я куда-то задевала гены

Но тогда, в 2001 году, все это оставалось делом будущего. Пытаясь абстрагироваться от поднявшейся шумихи, ученые размышляли над расшифрованным человеческим геномом и задались простым вопросом: что же делает нас особенными, непохожими на других живых существ? Человек — наиболее сложно устроенный вид из всех обитателей Земли. Никакой другой вид не строит города, не создает произведения искусства, не выращивает злаки, не играет в настольный теннис. Философы могут спорить, делают ли нас такие занятия «лучше» других видов. Но уже сам факт того, что мы способны вести такие споры, указывает на то, что мы устроены значительно сложнее других видов. В этом не может быть никаких сомнений.

В чем же состоит молекулярное объяснение нашей изощренности как организмов? Ученые уже довольно давно более или менее сошлись во мнении, что объяснение таится где-то в наших генах. Ожидалось, что у человека попросту больше генов, кодирующих белки, нежели у более простых организмов — скажем, у червей, мух или кроликов.

К тому времени, когда опубликовали черновую расшифровку человеческого генома, генетики уже завершили секвенирование для целого ряда других организмов. Разумеется, поначалу они сосредоточились на более простых (и меньших по размеру) геномах по сравнению с человеческим. К 2001 году удалось секвенировать геномы сотен вирусов, десятков бактерий, двух простых видов животных, одного гриба и одного растения. Ученые использовали эти данные, чтобы оценить, сколько генов содержится в человеческом геноме. (Для этой оценки применялся и целый ряд других экспериментальных методик и подходов.) Оценки варьировались от «30 тысяч» до «120 тысяч» — среди специалистов царила известная неуверенность касательно данного вопроса. В прессе часто циркулировала цифра «100 тысяч», хотя и эта оценка изначально не считалась определенной. Похоже, большинство исследователей считали разумной величину примерно в 40 тысяч.

Но когда в феврале 2001 года обнародовали черновую расшифровку генома человека, ученые не смогли найти в ней и 40 тысяч генов, кодирующих белки, не говоря уж о 100 тысячах. Исследователи из Celera Genomics идентифицировали 26 тысяч генов, кодирующих белки, и с меньшей уверенностью выявили еще 12 тысяч. Участники международного консорциума идентифицировали 22 тысячи таких генов и предсказали, что в общей сложности их окажется 31 тысяча. В годы после публикации черновика это количество неуклонно сокращалось. Сейчас считается общепринятым фактом, что человеческий геном содержит около 20 тысяч генов, кодирующих белки^11.

Может показаться странным, что ученые не пришли к единому мнению насчет количества генов, едва была опубликована черновая расшифровка генома. Причина — в том, что для идентификации генов необходимо анализировать данные о генетической последовательности, а это не так просто, как кажется. Гены не помечены разными цветами, они не используют особые наборы генетических букв, отличающие их от прочих частей генома. Чтобы выявить ген, кодирующий белок, нужно проанализировать определенные характеристики и объекты: скажем, те последовательности, которые могут кодировать цепочку аминокислот.

Как мы уже видели в главе 2, гены, кодирующие белки, не создаются из одной непрерывной ДНК-последовательности. Они конструируются модульным образом, причем области, кодирующие белки, перемежаются отрезками генетического мусора. Человеческие гены обычно гораздо длиннее генов фруктовых мушек-дрозофил или микроскопического червя C.elegans (эти существа являются весьма распространенными модельными системами в генетических исследованиях). Однако белки человека обычно примерно того же размера, что и аналогичные белки дрозофилы или червя. В человеческих генах велика именно мусорная составляющая, а не те фрагменты, которые кодируют белки. У людей эти мусорные участки зачастую вдесятеро длиннее, чем у более простых организмов. Некоторые из таких участков могут достигать длины в несколько десятков тысяч пар нуклеотидных оснований.

Отсюда возникает серьезная проблема: как отличить сигнал от шума, анализируя гены в генетических последовательностях человека? Даже в пределах одного-единственного гена лишь небольшой участок отвечает за кодирование белка. Этот участок окружен гигантской областью генетического мусора.

Вернемся к исходной проблеме. Почему человек является столь сложно устроенным организмом, если наши гены, кодирующие белки, так похожи на аналогичные гены мух и червей? Отчасти это объясняется сплайсингом — процессом, о котором мы упоминали в главе 2. Человеческие клетки способны создавать большее количество вариантов белков по сравнению с более простыми организмами. Более 60% генов человека умеют создавать такие сплайсинговые вариации. Снова обратимся к рис. 2.5. Клетка человека способна производить белки, обозначенные на этой схеме как БЛЕДНОСТЬ, БЕДНОСТЬ, ЛЕСТЬ, ЕНОТ, ЛЕС, ЛЕНОСТЬ. В различных тканях она вырабатывает эти белки в разных соотношениях. К примеру, белки, которые мы обозначаем как БЛЕДНОСТЬ, ДНО и ЛЕСТЬ, могут в больших количествах синтезироваться в мозгу, тогда как почки могут экспрессировать лишь БЛЕДНОСТЬ и ЛЕНОСТЬ, при этом вырабатывать в 20 раз больше белка ЛЕНОСТЬ, чем белка БЛЕДНОСТЬ. В более простых организмах клетки будут производить лишь БЛЕДНОСТЬ да БЕДНОСТЬ, причем в более или менее фиксированных соотношениях в различных клетках. Сплайсинговая гибкость позволяет человеческим клеткам вырабатывать гораздо более разнообразные белки по сравнению с более простыми организмами.

Ученые, анализировавшие геном человека, предполагали, что могут существовать специфичные для человека гены, кодирующие белки: эти-то гены, мол, и отвечают за сложность нашего устройства, так возвышающую нас над прочей живностью. В человеческом геноме насчитывается около 1300 семейств генов. Почти все эти семейства встречаются во всех ветвях древа жизни, от самых простых организмов до самых сложных. Существует набор из приблизительно ста генных семейств, специфичных для животных, имеющих хребет, но даже они возникли уже на ранних этапах эволюции позвоночных. Эти характерные для позвоночных семейства генов, как правило, участвуют в комплексных процессах: скажем, в работе элементов иммунной системы, запоминающих инфекцию; в изощренных мозговых связях; в тромбообразовании; в передаче сигналов между клетками.

Часть нашего генома, кодирующая белки, словно бы построена из конструктора «Лего» с несметным количеством деталей. Большинство таких наборов (особенно наборы для новичков, эти громадные коробки) содержат ряд строительных блоков, которые являются вариациями на немногочисленные темы: треугольники и квадратики, несколько наклонных элементов, а может быть, еще и несколько арок в придачу. Ну да, они бывают разного цвета, у них разные пропорции и разная толщина, но в целом они похожи. Между тем из них можно соорудить почти все основные структуры, от лесенки из двух блоков до целого жилого комплекса. Лишь когда вам нужно построить что-то совсем-совсем особенное, вроде Звезды Смерти, требуются какие-то весьма необычные элементы, выходящие за рамки стандартов обычного конструктора «Лего».

На протяжении эволюции геномы развивались, но строились из стандартного набора «деталей конструктора». Лишь иногда, крайне редко, они создавали что-то совершенно новое. Так что мы не можем объяснить сложность устройства человека, заявляя, что у нас много необычных генов, кодирующих белки и специфичных лишь для человека. Таких генов у нас, откровенно говоря, немного.

Картина еще больше запутывается, если сравнить размеры человеческого генома с размерами генома других организмов. Посмотрите на рис. 3.1. Легко видеть, что у человека геном гораздо больше, чем у C.elegans, и неизмеримо больше, чем у дрожжей. Однако по относительному количеству генов, кодирующих белки, разница не столь уж велика.

Рис. 3.1. Вверху: площадь круга отражает относительные размеры генома у человека, микроскопического червя и одноклеточных дрожжей. У человека геном гораздо больше, чем у более простых организмов. Внизу: площадь круга отражает относительное количество генов, кодирующих белки, у этих трех видов. Неравенство между человеком и двумя другими существами значительно меньше, чем вверху. А значит, относительно большие размеры человеческого генома невозможно объяснить лишь на основании сравнения количества генов, кодирующих белки.

Эти данные убедительно показали, что геном человека содержит невероятно большое количество ДНК, не кодирующей белки. Собственно, 98% нашего генетического материала не выступает как матрица для создания этих важнейших молекул, которые, как считается, выполняют ключевые функции в клетке и организме в целом. Почему же в нас так много мусора?

Ядовитая рыба и генетические изоляторы

Возможно, это несущественный вопрос и ответ на него не так уж важен. Возможно, сам вопрос поставлен неверно. Возможно, генетический мусор не имеет ни функции, ни биологического значения. Возможно, вообще ошибочно полагать, что если нечто есть, то у него имеются какие-то причины находиться именно там, где оно располагается. Аппендикс человека в общем-то не служит ни для какой полезной цели, это просто рудиментарный орган, доставшийся нам от наших эволюционных предков. Некоторые ученые еще в 2001 году предполагали: то же самое может оказаться верным и для большей части мусорной ДНК человеческого генома.

Такие рассуждения частично основаны на наблюдениях за любопытной рыбой — иглобрюхом (она же — рыба-собака, она же — бурый скалозуб). Иглобрюхи — удивительные создания. Плавают они медленно и неуклюже, поэтому от хищников им не удрать. Встретившись с опасностью, они быстро набирают огромный объем воды и раздуваются в шар (у некоторых видов он даже покрыт колючками). Этого недостаточно для того, чтобы отпугнуть голодного врага? Ну что ж, у иглобрюха имеется токсин в тысячу раз мощнее цианида. Благодаря ему рыба приобрела свою сомнительную славу. В Японии она считается деликатесом (там эту рыбу называют фугу). Однако история этого деликатеса, мягко говоря, довольно противоречива: неправильное приготовление фугу может привести к летальным последствиям для едока.

Генетики с давних пор очень любят иглобрюха — или, во всяком случае, его ДНК. Геном у иглобрюха вида Fugu rubripes считается наиболее компактным среди геномов всех позвоночных. В длину этот геном составляет всего 13% человеческого, однако содержит практически все обычные гены позвоночных^12. Почему геном иглобрюха так мал? Потому что в нем не очень много мусорной ДНК. В годы, когда секвенирование ДНК стоило недешево, иглобрюх принес большую пользу при сравнительных исследованиях геномов разных организмов. А поскольку его геном содержит так мало мусора, оказалось сравнительно легко выявить индивидуальные гены, ибо соотношение сигнал/шум здесь куда удобнее для исследований, чем в геноме человека. Ученые сумели с легкостью идентифицировать гены Fugu rubripes, а затем использовали полученные данные при поиске схожих генов в более «шумных» геномах — таких, как наш с вами.

Поскольку иглобрюх содержит очень мало мусорной ДНК, но при этом является отлично функционирующим и вообще преуспевающим существом, специалисты предположили, что некодирующие области человеческого генома могут быть «просто паразитическими, эгоистичными элементами ДНК, использующими геном в качестве удобного хозяина»13. Впрочем, одно из другого не следует с такой уж логической неизбежностью. Если нечто не имеет ясно различимой функции в каком-то определенном организме, это еще не значит, что оно не играет роли во всех прочих видах живых существ. Эволюция обычно ведет строительство, пользуясь довольно-таки ограниченным набором компонентов (вспомним конструктор «Лего»), а значит, она склонна наделять новыми функциями уже существующие объекты или их части. Таким образом, мусорная ДНК вполне может играть роль (роли) в других организмах, особенно в сравнительно сложных.

Следует также иметь в виду, что клетка, содержащая в себе так много мусорной ДНК, вынуждена расплачиваться за это в функциональном смысле. Каждый человек начинает свою жизнь как яйцеклетка, слившаяся со сперматозоидом. Исходная клетка делится на 2. Из этих 2 получаются 4. Далее процесс продолжается. Взрослый человек состоит примерно из 50-70 триллионов клеток. Такое огромное количество трудно себе представить. Попробуем применить такое сравнение. Стопка из 50 триллионов долларовых купюр, уложенных друг на друга, имела бы высоту, равную полутора расстояниям от Земли до Луны.

Для того, чтобы создать такое количество клеток, требуется минимум 46 циклов деления. Каждый раз, когда клетка делится, ей сначала нужно скопировать всю свою ДНК. Если важно лишь менее 2% всей ДНК, зачем же тогда эволюция поддерживает существование остальных 98%, ведь это, как мы предположили, просто бесполезный мусор, не выполняющий никаких функций? Как мы уже признали, самое убедительное доказательство эволюции видов заключается во всех тех бесполезных вещах, которые мы унаследовали от своих предков (возьмите тот же аппендикс). Однако использование гигантских ресурсов для постоянного воспроизводства 49 «бесполезных» пар нуклеотидных оснований на каждую пару, выполняющую какую-то функцию, кажется некоторым превышением необходимой избыточности.

Одна из первых теорий, пытавшихся объяснить, почему в человеческом геноме столько ДНК, возникла еще до того, как завершили черновую расшифровку генома человека. Ученые уже знали, что значительная часть нашего генома не кодирует белки. И выдвинули изоляционную теорию.

Допустим, у вас есть наручные часы. Не просто абы какие старые часы, а баснословно дорогая штуковина вроде винтажных Patek Phillipe, из тех, что продаются за 1-2 миллиона долларов. А теперь представьте, что рядом бродит большой и очень злобный бабуин со здоровенной дубиной. Вы должны оставить часы в одной из комнат, куда способен проникнуть опасный зверь. Далее вам предоставляется выбор. Вы не можете помешать обезьяне залезть в какую-то из комнат. Но вы можете решить, в каком помещении оставить часы. Выбор у вас такой:

A. Маленькая каморка, где имеется лишь стол, на который вам и придется положить часы.

B. Большая комната, где лежит 50 рулонов листовой изоляции. Длина каждого рулона — 5 метров, толщина — 20 сантиметров. Вы можете спрятать часы в глубине любого из этих 50 рулонов.

Не так-то трудно сообразить, какое помещение выбрать, чтобы максимизировать вероятность того, что часы избегнут повреждений, правда? Изоляционная теория мусорной ДНК исходит из такой же предпосылки. Гены, кодирующие белки, чрезвычайно ценны. Они подвергаются высокому эволюционному давлению, так что у каждого конкретного организма его индивидуальная белковая последовательность обычно — оптимальная для него, самая лучшая, какая только может быть. Мутация в ДНК (изменение какой-то пары нуклеотидных оснований), меняющая, в свою очередь, белковую последовательность, вряд ли сделает этот белок эффективнее. Скорее уж такая мутация помешает белку выполнять свою функцию, воспрепятствует его действию — с печальными последствиями.

Проблема в том, что наш геном постоянно бомбардируют потенциально опасные раздражители из окружающей нас среды. Иногда нам кажется, что это — приметы нашего времени, особенно когда мы думаем о чернобыльской или фукусимской радиации. На самом деле это явление сопровождает человечество на всем протяжении его существования. Ультрафиолетовый компонент солнечного света, канцерогены в пище, радоновое излучение гранитных скал... Наша геномная целостность всегда находилась под угрозой (и находится до сих пор). Иногда такие воздействия не очень существенны. Если ультрафиолетовое облучение вызовет мутацию клетки кожи, а эта мутация приведет к гибели данной клетки, ничего страшного. У нас полно клеток кожи, они постоянно отмирают и заменяются новыми, и потеря одной клетки — не проблема.

А вот если мутация приведет к тому, что какая-то клетка окажется жизнеспособнее своих соседок, это уже шаг к возможному развитию рака. Последствия могут оказаться очень серьезными. Так, в одних только США ежегодно диагностируется свыше 75 тысяч новых случаев меланомы. От соответствующего заболевания в стране умирает около 10 тысяч человек в год^14. При этом слишком долгое пребывание под воздействием ультрафиолетового излучения — один из существенных факторов риска. С эволюционной точки зрения мутации в яйцеклетках или сперматозоидах оказались бы еще зловреднее, поскольку могли бы передаваться потомству.

Если представить себе, что наш геном постоянно подвергается атакам, можно заключить, что изоляционная теория мусорной ДНК обладает явными преимуществами. Ведь если у нас только одна из каждых 50 пар нуклеотидных оснований важна для создания белков, поскольку остальные 49 пар — просто мусор, тогда есть лишь один шанс из 50, что вредоносный раздражитель, который обрушивается на молекулу ДНК, попадет по важному для нас участку.

Картина вполне согласуется с содержанием в нашем геноме такого большого количества мусорной ДНК по сравнению с менее сложными видами — скажем, червем или дрожжами (см. рис. 3.1). Жизненный цикл червей и дрожжей короче нашего. Кроме того, они способны давать большое количество потомства. Соотношение цена/результат для них иное, чем для таких видов, как человек. Людям требуется длительное время для того, чтобы породить потомство, и число потомков у человека невелико. Вероятно, червям и дрожжам незачем прилагать такие большие усилия для защиты генов, кодирующих белки. Даже если несколько их отпрысков будут нести в себе мутации, делающие их менее приспособленными к среде, где они обитают, у большинства потомков наверняка все будет отлично. А вот если вам предоставлено всего несколько попыток передать свой генетический материал следующему поколению, защита этих важных генов, кодирующих белки, с точки зрения эволюции приобретает смысл.

Природа, как мы уже видели, имеет в высшей степени адаптивный характер. Хотя изоляционная теория кажется вполне разумной, все-таки возникают кое-какие вопросы. Действительно ли роль мусорной ДНК сводится лишь к тому, чтобы служить защитой, изоляцией? И откуда вообще взялся весь этот изолирующий материал?

Глава 4. Засидевшиеся гости

Каждый британский школьник знает эту дату — 1066. В тот год Вильгельм Завоеватель вместе со своими войсками вторгся в Англию из Нормандии (сегодня это часть Франции). И это не был просто какой-то мимолетный набег. Захватчики остались в завоеванных землях надолго, перевезли на новые берега свои семейства. Росло их количество, а также их влияние. В конце концов они ассимилировались, став неотъемлемой частью английского политического, культурного, социального и языкового ландшафта.

Каждый американский школьник знает другую дату — 1620. В этом году корабль «Мэйфлауэр» бросил якорь близ полуострова Кейп-Код, положив начало мощнейшей волне миграции из Европы в Северную Америку. Подобно норманнам в Британии полутысячелетием раньше, эти первые поселенцы быстро увеличили свою численность, навсегда изменив североамериканский ландшафт.

Похожее событие произошло с человеческим геномом много тысяч лет назад. В него вторглись чужеродные элементы ДНК. Вскоре их число необычайно возросло. В конце концов они стали стабильными, неотъемлемыми компонентами нашего генетического наследия. Эти чужеродные элементы — своего рода «окаменелости» нашего генома, хранящие в себе летопись прошлого, которую можно сравнивать с аналогичными летописями других видов. Кроме того, эти элементы влияют на функционирование наших генов, кодирующих белки, на наше здоровье и болезни.

Хотя они способны оказывать воздействие на экспрессию генов, кодирующих белки, эти чужеродные элементы сами не кодируют белки. А значит, относятся к категории мусорной ДНК.

После публикации черновой расшифровки человеческого генома ученые с немалым изумлением осознали, насколько широко успели распространиться по нашей ДНК эти генетические гости, явившиеся без приглашения^1. Более 40% генома человека состоит из таких паразитических компонентов. Они называются рассеянными повторяющимися элементами. Их можно разбить на четыре основных класса[6]. Как и показывает их название, это участки ДНК, на которых повторяются определенные последовательности. Впечатляют уже сами цифры: в геноме человека больше 4 миллионов таких рассеянных повторяющихся элементов. Лишь один из классов встречается по всему геному 850 тысяч раз, составляя в общей сложности свыше 20% нашей ДНК.

Большинство из этих последовательностей когда-то в прошлом сумели найти способы увеличивать свою численность в геноме. Часто они подражали действию определенных типов вирусов (похожих на вирус, вызывающий СПИД). Это упрощенно показано на рис. 4.1. Возник особый механизм, благодаря которому находящаяся в клетке ДНК-последовательность может вновь и вновь копироваться и затем встраиваться обратно в геном. Получается цикл, приводящий к тому, что повторяющиеся последовательности увеличивают свою численность быстрее, чем остальные участки генома.

В каком-то смысле эти повторы подвергаются в геноме подобию компьютерной процедуры «скопировать и вставить». Это-то и позволило им распространиться по всем нашим хромосомам.

Вследствие таких процессов непропорционального роста численности в нашем геноме имеется несметное количество этих элементов. Вопрос в том, действительно ли это важно. Оказывают ли эти последовательности какое-то воздействие? Или это просто пассажиры генома, не влияющие на нас ни положительно, ни отрицательно?

Рис. 4.1. Единичный элемент ДНК при копировании порождает множество РНК-копий. В ходе не совсем обычного процесса эти молекулы РНК могут копироваться обратно в ДНК, вновь встраиваясь в геном. Это увеличивает число таких элементов. На ранних этапах эволюции такое могло случаться много раз, но здесь для ясности показан лишь однократный процесс.

К этому вопросу можно подходить по-разному. Большинство повторов — очень старые по эволюционным меркам. Сравнение с другими животными показывает, что основная часть повторов возникла еще до того, как плацентарные отделились от других животных, то есть более 125 миллионов лет назад. По крайней мере в одном классе повторов мы не получали никаких новых вставок в геном с тех пор, как отделились от нечеловекообразных обезьян Старого Света примерно 25 миллионов лет назад. Так что, вероятно, количество повторов в геноме человека (точнее, эволюционных предков человека) невероятно возросло еще в далеком прошлом. После этого цифры не претерпевали значительного роста. Возможно, это означает, что существует какой-то верхний предел количества таких повторов, которое мы в состоянии выдержать. Но они, судя по всему, выводятся из генома очень медленно. Это, в свою очередь, наводит на мысль, что до тех пор, пока количество повторов ниже порогового значения, мы вполне можем с ними уживаться.

Однако, похоже, человеческий геном справляется с такими повторами несколько иначе, чем другие виды. У млекопитающих, как правило, более разнообразный спектр определенных повторов, чем у иных видов. Но у млекопитающих в основе этих повторов лежат очень древние последовательности, которые находились в геноме очень долгое время. В других организмах некоторая доля старых повторов вычищалась, и новые занимали их место. Авторы черновой расшифровки человеческого генома подсчитали, что у дрозофилы нефункциональный компонент ДНК имеет «период полураспада« примерно в 12 миллионов лет. Для млекопитающих этот показатель составляет около 800 миллионов лет.

Но даже среди млекопитающих человек выделяется. Число повторяющихся элементов в эволюционной ветви гоминид и их ближайших предков падало с тех времен, как количество видов млекопитающих стало увеличиваться. С грызунами такого не происходило. Кроме того, основная часть повторов в человеческом геноме больше не подвергается процедуре «скопировать и вставить». В сущности, сейчас повторы активнее у грызунов, чем у приматов.

Возможно, следствием этого является то, что повторы приносят грызунам больше проблем, чем человеку. Если повторы в геноме копируются, они могут затем встраиваться в работоспособные гены, кодирующие белки (или рядом с ними), тем самым мешая нормальной работе этих генов. В некоторых случаях они способны препятствовать экспрессии нужного гена, в других случаях — вызвать усиление его экспрессии. Для мышей встраивание повторяющихся последовательностей в новые области генома приводит к возникновению новых генетических заболеваний с вероятностью, в 60 раз превышающую аналогичную вероятность для человеческих клеток. Для мышей такие процессы становятся причиной 10% всех новых генетических мутаций, тогда как для человека этот показатель составляет одну шестисотую. Похоже, наш геном находится под более строгим контролем, чем у грызунов — наших дальних родичей.

Опасное повторение

Возможно, это даже хорошо. Рассмотрим некоторые последствия, которые приносит грызунам действие мутационного механизма такого типа. Существует генетическая линия мышей, у которых такая мутация приводит к отсутствию хвоста. Проблема сама по себе невеликая, но при этом еще и не развиваются почки, а это уже очень скверно^2. Дело в том, что встраивание повторяющейся последовательности в данном случае приводит к чрезмерной экспрессии одного из близлежащих генов. У другой линии мышей такая вставка отключает один из важных генов, регулирующих центральную нервную систему. В результате животные во время опытов испытывают спазмы, а кроме того, живут всего две недели^3.

К похожему выводу о потенциальном воздействии подобных повторов можно прийти, анализируя противоположное явление, то есть рассматривая области генома, где эти повторы практически никогда не встречаются.

Существует группа генов, именуемая Hox-кластером. Они играют важнейшую роль, ибо управляют развитием сложных многоклеточных организмов. В ходе развития организма гены кластера включаются в определенном порядке, и их экспрессия жестко регулируется. Если порядок включения нарушится, это может привести к тяжелым и далеко идущим последствиям. Важность Hox-кластера впервые показали на примере дрозофил. У мушек с мутациями в этих генах развились необыкновенные свойства. К примеру, на голове у них вместо антенн появляется пара ног (самый известный пример)4.

Подобно мухам, млекопитающие также полагаются на правильную картину экспрессии Hox-генов, нужным образом формирующую строение тела. У человека мутации в Hox-кластере довольно редки — вероятно, благодаря тому, что эти гены играют такую важную роль. Однако ученые показали, что мутация хотя бы в одном Hox-гене приводит к возникновению дефектов конечностей^5.

Hox-кластер — одно из немногих мест человеческого генома, где почти нет рассеянных повторяющихся элементов. Это позволяет предположить, что даже сравнительно безобидные генетические гости способны влиять на экспрессию генов и что эволюция позаботилась о том, чтобы они не очень-то вольничали в определенных областях генома. Удалось выяснить, что Hox-кластер также почти свободен от таких повторов у других приматов и у грызунов.

Наличие в геноме рассеянных повторов может приводить к неожиданным последствиям. Один из необычных классов повторов называется ЭРВ (эндогенными ретровирусами). ВИЧ (вирус иммунодефицита человека, вызывающий СПИД) — как раз пример ретровируса. Генетический материал таких вирусов состоит из РНК, а не из ДНК. Вирусная РНК копируется для образования ДНК, которая затем может встраиваться в геном организма-хозяина. Этот геном воспринимает такую ДНК как свою собственную, производя новые вирусные компоненты и, в конечном счете, новые вирусы.

Давным-давно, на заре нашей эволюционной истории, какие-то ретровирусы прижились в геномах наших эволюционных предков. Многие из них теперь представляют собой «геномные окаменелости». Какие-то части ретровирусных последовательностей оказались утраченными, а значит, эти последовательности уже больше не могли производить вирусные частицы. Однако некоторые по-прежнему содержат в себе все компоненты, необходимые для создания новых вирусов. Обычно клетка держит их под строгим контролем^6. Кроме того, ученые обнаружили, что иммунная система не только борется с вирусами, которые заражают нас, проникая извне. Она играет роль и в контролировании эндогенных вирусов. Генетически модифицированные мыши, которых сознательно лишили определенных компонентов нормальной иммунной системы, испытывают целый ряд проблем из-за того, что эти вирусы, таящиеся в их собственных геномах, вновь активизируются^7.

Возможно, изучение процессов контроля эндогенных ретро-вирусов поможет справиться с одной давней проблемой здравоохранения. Каждый год тысячи людей умирают, не дождавшись органов для пересадки. Дело в том, что доноров вечно не хватает. Так, примерно треть пациентов, чью жизнь удалось бы спасти с помощью пересадки сердца, умирает, так и не получив нужного донорского органа^8.

А если использовать сердца животных? Такой процесс называется ксенотрансплантацией (от греческого слова, означающего «чужеродный»). Для пересадки сердца лучше всего подходит свинья: ее сердце примерно такого же размера и мышечной силы, как и аналогичный орган человека.

Конечно, придется преодолеть массу технических сложностей (не говоря уж об этических: некоторые религиозные группы могут воспротивиться такому использованию свиньи, «нечистого животного»)9. Чтобы справиться с какими-то из этих трудностей, сейчас выращивают генетически модифицированных свиней, которые не вызывают слишком уж активной иммунной реакции, возникающей, когда в сердечно-сосудистую систему человека вводят свиные клетки. Но тут возможна и другая проблема. Геном свиньи, как и геном человека, содержит эндогенные ретровирусы. Однако эндогенные ретровирусы свиньи отличаются от ЭРВ человека. Работы, проведенные еще в конце XX века, показали: некоторые из этих свиных ретровирусов в определенных условиях способны заражать человеческие клетки^10.

Вот один из возможных сценариев, беспокоящий некоторых ученых. Любой пациент, которому пересадят сердце свиньи, будет неизбежно получать препараты, подавляющие иммунитет, чтобы предотвратить отторжение чужеродного органа. Реактивация эндогенных ретровирусов более вероятна как раз в тех случаях, когда иммунитет человека подавлен. Системы человеческого организма в ходе эволюции приобрели способность контролировать эндогенные ретровирусы, которые находились в нашем геноме с тех пор, как человек возник. Однако этих систем может оказаться недостаточно для того, чтобы столь же эффективно контролировать ЭРВ, таящиеся в геноме свиньи. Теоретически это может означать, что эндогенные ретровирусы способны в один прекрасный момент вырваться из пересаженного свиного сердца, атаковать другие клетки реципиента-человека и вторгнуться в них. После чего, быть может, они даже начнут размножаться, захватывая все новые участки организма.

Более поздние исследования позволяют предположить, что этот риск, возможно, преувеличивали ученые прошлого^11, однако речь все равно идет об участке мусорной ДНК, требующем тщательного контроля при ксенотрансплантации (если эта процедура вообще когда-нибудь станет реальностью).

Другие повторяющиеся последовательности, включенные в геном, могут негативно влиять на здоровье более непосредственным образом. В геноме есть области, где большие фрагменты, иногда длиной в сотни тысяч пар нуклеотидных оснований, в ходе эволюции человека сравнительно недавно претерпели удвоение. «Оригинал» и «дубликат» могут в итоге оказаться в очень далеких друг от друга частях генома, даже в разных хромосомах.

Такие области способны вызывать неприятности при формировании яйцеклеток или сперматозоидов. В их формировании есть одна весьма важная стадия, когда хромосомы подвергаются процессу так называемого кроссинговера (перекреста хромосом). Хромосома, наследуемая вами от матери, «спаривается» с аналогичной хромосомой вашего отца, и затем они обмениваются друг с другом фрагментами ДНК. Это один из способов увеличить вариативность генофонда, перемешивая комбинации генов. Если в геноме есть два участка, выглядящие весьма схоже из-за повторяющихся последовательностей, но все же не представляющие собой «настоящую» хромосомную пару, такой кроссинговер может происходить между областями генома, которые не предназначены для обмена генетическим материалом. В результате могут появиться яйцеклетки или сперматозоиды, у которых имеются лишние участки ДНК или не хватает важнейших участков^12.

У тех, кто наследует такие геномные дефекты, могут возникать особого рода заболевания. Одним из примеров является болезнь Шарко-Мари-Тута, при которой наблюдаются дефекты нервов, передающих ощущения и контролирующих двигательные функции^13. Другой пример — синдром Вильямса-Бойрена, который характеризуется отставанием в развитии, относительно небольшим ростом пациента, целым рядом необычных поведенческих черт в сочетании со слабо выраженной неспособностью к обучению и дальнозоркостью^14.

Удвоенные области генома, вызывающие проблемы при кроссинговере, часто содержат множество генов, кодирующих белки. Поэтому неудивительно, что у пациентов, страдающих от последствий аномального перекреста хромосом, зачастую столь сложный набор симптомов. Изменение количества этих многочисленных генов с высокой вероятностью затронет не один физиологический путь, а несколько.

Может показаться странным, что эти удвоенные области сохранились на протяжении эволюции человека, ведь они порождают такие серьезные проблемы. На самом-то деле клетки, формирующие яйцеклетки и сперматозоиды, обычно справляются со своей работой хорошо и не смешивают те части хромосом, которые смешивать не надо. Более этого, удвоения позволяют человеческому геному довольно быстро (по эволюционным меркам) увеличивать количество определенных генов. Это весьма полезная способность. «Запасная» копия может выступать в роли «сырья» для эволюционной адаптации. Несколько изменений в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, могут привести к созданию белка, функция которого отличается от функции белка-«оригинала», хотя и схожа с ней. Вероятно, именно так возникло обширное семейство генов, которые позволяют млекопитающим распознавать широчайший диапазон различных запахов^15. Это еще один пример своеобразной бережливости, присущей геному человека. Наш геном предпочитает приспособить к выполнению новых задач уже существующие гены и белки, а не создавать их с нуля. Геном любит варианты типа «два в одном» или «два по цене одного».

Путь от вины до невиновности лежит через мусорную ДНК

Большинство повторяющихся последовательностей мусорной ДНК, которые мы рассматривали в этой главе, состоят из довольно больших единичных фрагментов. Обычно их длина — не менее сотни пар нуклеотидных оснований, а часто и гораздо больше. Отчасти именно поэтому они занимают такую значительную долю генома. Но существуют другие мусорные повторяющиеся последовательности — из элементов значительно меньших размеров. Их повторяющиеся элементы состоят всего из нескольких пар нуклеотидов. Это так называемые простые повторяющиеся последовательности. Мы уже встречались с их примерами, описывая синдром ломкой X-хромосомы, атаксию Фридрейха и миотоническую дистрофию. Последовательность из трех пар нуклеотидных оснований повторяется неоднократно, достигая максимума у пациентов, страдающих соответствующим заболеванием.

Повторы коротких мотивов занимают в общей сложности примерно 3% генома человека. Такие повторы у разных людей весьма различны. Рассмотрим повтор двух пар нуклеотидных оснований: скажем, ГТ. Допустим, этот повтор занимает определенную позицию в шестой хромосоме. Я мог унаследовать 8 его копий (последовательность ГТГТГТГТГТГТГТГТ) в шестой хромосоме, полученной от матери, и 7 копий в шестой хромосоме, полученной от отца. А вы могли унаследовать 10 копий от вашей матери и 4 — от вашего отца.

Оказывается, эти простые повторы необычайно полезны. Они встречаются по всему геному, сильно различаются у разных людей (для каждой позиции, которую они занимают в геноме). Кроме того, их легко обнаружить с помощью дешевых и чувствительных методов.

Благодаря таким характеристикам подобные повторы теперь применяются при ДНК-идентификации (своего рода «ДНК-дактилоскопии»). В ходе этого процесса образцы крови или биологических тканей можно однозначно привязать к конкретному человеку. Это облегчило процедуру установления отцовства и произвело настоящую революцию в криминалистике. Стало возможным сравнительно легко идентифицировать жертв массовых убийств, осуждать виновных и реабилитировать невиновных, а ведь бывало, что человек, не совершавший преступления, десятилетиями томился в тюрьме. В США более 300 человек удалось освободить после того, как ДНК-анализ засвидетельствовал их невиновность. Около 20% из них на том или ином этапе заключения ожидали смертной казни^16. Кроме того, примерно в половине этих случаев ДНК-улики позволили узнать, кто же на самом деле виновен.

А вы говорите — мусор.

Глава 5. Мы стареем, и у нас все съеживается

Фильм «Поменяться местами» (1983) с Дэном Эйкройдом, Эдди Мёрфи и Джейми Ли Кёртис в год своего выхода наделал много шума, собрав в американском прокате больше 90 миллионов долларов^1. Это комедия с хитро закрученной интригой. В основе сюжета лежит, в сущности, исследование того, как на человека влияют его гены, а как — среда, в которой он находится. Почему человек добивается успеха — благодаря врожденным талантам или же из-за особенностей среды, в которую помещен? Создатели фильма явно склоняются ко второму варианту ответа.

Что-то похожее происходит и в наших геномах. Отдельный ген может играть сравнительно невинную роль. Благодаря ему определенный белок будет вырабатываться со строго определенной скоростью. И одним из важнейших факторов, контролирующих количество синтезируемого белка, является положение гена в хромосоме.

А теперь представим себе, что этот ген перенесли в новое окружение — подобно тому, как герой Дэна Эйкройда оказывается в трущобах, а персонаж Эдди Мёрфи — в богатом особняке. В новой среде наш перемещенный ген окружен новой для него геномной информацией, которая призывает его вырабатывать гораздо более высокие дозы белка. А повышенное содержание белка, в свою очередь, побуждает клетку расти и делиться быстрее, чем обычно. Это может стать началом развития рака. В самом гене ничего плохого нет, он просто в неподходящее время очутился в неподходящем месте.

Причина этого процесса — одновременный разрыв двух хромосом в одной клетке. Когда хромосома разрывается, клеточная «ремонтная аппаратура» тут же находит место разрыва и снова сшивает два куска. Обычно такой ремонт протекает довольно гладко. Но если в одно и то же время разорвутся две хромосомы (или больше), могут возникнуть проблемы. Концы хромосом могут оказаться связанными не так, как нужно (см. рис. 5.1). В результате хороший ген может оказаться в дурном обществе и стать причиной неполадок. Особенно это важно из-за того, что перекроенные таким путем хромосомы передаются всем последующим поколениям этой клетки. Возможно, самый известный пример здесь — разновидность рака крови человека, именуемая лимфомой Бёркитта. Реаранжировка здесь происходит между восьмой и четырнадцатой хромосомой. Это приводит к очень сильной сверхэкспрессии гена[7], что побуждает клетку размножаться самым агрессивным образом^2.

Рис. 5.1. Вверху: одиночная хромосома претерпевает разрыв. Клеточная аппаратура чинит ее. Внизу: две хромосомы разрываются одновременно. Клеточная аппаратура может не суметь разобраться, какой хромосоме принадлежат куски. Хромосомы могут оказаться сшитыми неправильно. Так возникают гибридные хромосомные структуры.

К счастью, разрыв двух хромосом, судя по всему, довольно редко происходит одновременно. Чаще они разрываются с некоторым интервалом во времени. Поэтому клеточная аппаратура для ремонта ДНК научилась в процессе эволюции действовать весьма стремительно. В конце концов, чем быстрее она справится с разрывом, тем ниже вероятность, что в клетке одновременно будут иметь место два разрыва (или больше). Аппаратура для ремонта ДНК приходит в действие, как только клетка обнаруживает, что в ней имеется оторванный кусок ДНК. У клетки есть специальные механизмы, позволяющие ей обнаружить конец такого куска — место разрыва.

Но это порождает целый ряд новых проблем. Наша клетка содержит 46 хромосом, и все они линейны. Иными словами, в каждой нашей клетке всегда есть 92 конца хромосом (ибо у хромосомы два конца). Ремонтная аппаратура должна уметь как-то отличать совершенно нормальные концы хромосом от аномальных, появившихся в результате разрывов.

Шнурки ДНК

Для этого клетки обзавелись особыми структурами на нормальных концах хромосом. Вы носите обувь на шнуровке? Если да, то взгляните-ка на свои шнурки. На каждом конце у них небольшой колпачок из металла или пластмассы — наконечник, который мешает шнурку расплестись и растрепаться. У наших хромосом тоже есть наконечники. Эти штуковины чрезвычайно важны для поддержания целостности генома.

Хромосомные наконечники называются теломерами. Они построены из одной формы мусорной ДНК, много лет известной ученым, и комплексов различных белков. Теломерная ДНК составлена из многократных повторов одной и той же последовательности 6 пар нуклеотидов — ТТАГГГ^3. На концах у каждой хромосомы, содержащейся в пуповинной крови новорожденного, имеется в среднем примерно по 10 тысяч таких нуклеотидных пар^4.

Теломерная ДНК помещена в своего рода каркас из белковых комплексов, помогающих ей поддерживать структурную целостность. Термин «теломера» относится как раз к этой комбинации определенной мусорной ДНК и связанных с ней белков. Еще в 2007 году важность этих белков убедительно продемонстрировали исследователи, ставившие опыты на мышах. Они подавили экспрессию одного из таких белков, полностью деактивировав соответствующий ген, и обнаружили, что получавшиеся при этом мышиные эмбрионы гибнут уже на ранних стадиях развития[8].

Исследуя хромосомы таких генетически модифицированных мышей, ученые обнаружили, что многие хромосомы оказались сшитыми друге другом. Иными словами, они соединились концами. Дело в том, что клеточная аппаратура для ремонта ДНК утратила способность опознавать теломеры. Она сочла, что имеет дело с кучей разорванных хромосом, и выполнила работу, которую выполняет лучше всего, то есть просто сшила их. К сожалению, при этом экспрессия генов пришла в полный хаос. В конце концов функционирование хромосом и самих клеток настолько сильно нарушилось, что это привело к одной из разновидностей клеточного самоубийства[9], полностью остановив развитие организма.

Еще одно свойство теломер представляет большой интерес с точки зрения биологии и человеческого здоровья. Еще в 1960-е годы специалисты изучали, как клетки делятся в лабораторных условиях. Ученые не работали с линиями раковых клеток, поскольку те происходят от клеток, которые стали бессмертными из-за аномальных изменений. Вместо этого они изучали фибробласты — одну из разновидностей клеток, имеющуюся в целом ряде тканей человеческого организма. Фибробласты вырабатывают так называемый внеклеточный матрикс — что-то вроде толстых пастообразных обоев, которые удерживают клетки на месте. Довольно легко сделать биопсию (скажем, кожи) и выделить фибробласты. Они будут расти и делиться, образуя культуру клеток. Таким путем ученые еще довольно давно установили, что клетки в общем-то не могут делиться вечно. Рано или поздно наступает момент, когда они прекращают деление, даже если их по-прежнему снабжают всеми необходимыми питательными веществами и кислородом. Клетки не умирают, они просто перестают размножаться. Это так называемое клеточное старение^5.

Позже ученые выяснили, что теломеры укорачиваются с каждым делением клетки. Всякий раз, когда одна из клеток делится, ДНК, содержащаяся в ней, копируется. Благодаря этому обе дочерние клетки наследуют 46 хромосом материнской клетки. Однако система, копирующая ДНК в хромосомах, не может добраться до самых их концов. Поэтому новые и новые циклы клеточного деления приводят к тому, что теломеры становятся всё короче и короче^6.

Впрочем, это не доказывало, что укорачивание теломер — действительно причина старения клеток. Нельзя было исключить, что подобное воздействие на длину теломер служит своего рода маркером, регулирующим процесс размножения клеток, однако не играет особой роли в изменениях их поведения.

Речь идет об очень важном принципе научных исследований. Во многих ситуациях мы видим корреляцию между какими-то двумя явлениями, но из этого еще не следует, что между ними существует реальная взаимосвязь. Вот один пример. Существует четкая взаимосвязь между развитием рака легких и сосанием леденцов от кашля. Разумеется, из этого не вытекает, что сосание леденцов от кашля вызывает рак легких. Просто для многих людей один из первых симптомов рака легких — постоянный кашель. А человек, страдающий от такого кашля, наверняка будет пытаться облегчить свое положение при помощи леденцов.

Подтверждение того, что укорачивание теломер действительно приводит к клеточному старению, появилось в 1990-е годы. Ученые показали: увеличивая длину теломер в фибробластах, можно добиться того, что клетки перестанут стареть и будут жить практически вечно^7.

Теперь общепризнано, что теломеры действуют как своего рода молекулярные часы, ведущие обратный отсчет по мере нашего взросления. Пока еще не все детали ясны. В этой области биологам непросто вести исследования — по целому ряду причин. Начнем с того, что в любой клетке 92 теломерных участка (по одному на каждый конец каждой хромосомы) имеют неодинаковую длину. Поэтому трудно задать какие-то стандарты длины теломеры, применимые по всей клетке, не говоря уж о стандартах, применимых для всего организма человека^8. Кроме того, при исследовании взаимосвязей теломер и старения очень трудно использовать излюбленное модельное животное ученых — мышь. Дело в том, что у грызунов чрезвычайно длинные теломеры, гораздо длиннее человеческих. Как известно, средняя продолжительность жизни у грызунов гораздо меньше, чем у человека. А значит, длина теломер, по-видимому, не единственный определяющий фактор старения. Однако результаты многолетних исследований говорят: у человека теломеры играют весьма важную роль.

Забота о шнурках

Мы точно знаем одно: наши клетки не сдаются процессу старения без боя. У них есть механизмы, при помощи которых они пытаются дольше сохранять теломеры длинными и нетронутыми. Именно поэтому наши клетки проявляют так называемую теломеразную активность. Теломеразная система добавляет новые ТТАГГГ-мотивы на концы хромосом, по сути, восстанавливая важные участки мусорной ДНК, которые утрачиваются при делении клеток. Теломеразная активность требует двух компонентов. Во-первых, требуется особый фермент (теломераза), который пристраивает необходимые повторяющиеся последовательности к концам хромосом. Во-вторых, требуется кусок РНК, определенная последовательность, которая служит матрицей для фермента, чтобы тот добавлял к хромосомам нужные нуклеотидные основания.

Итак, концевые участки наших хромосом в значительной степени полагаются на мусорную ДНК, геномный материал, не кодирующий белки. Сами по себе теломеры можно счесть генетическим мусором. Чтобы поддерживать их существование, клетка использует ген, который служит для выработки РНК, однако никогда не используется как матрица для синтеза белка. Причем РНК сама по себе — молекула, выполняющая жизненно важные функции в человеческом организме[10],9.

Но если наши клетки снабжены механизмом для поддержания длины теломер (при помощи теломеразной системы), почему же теломеры все-таки постепенно укорачиваются? Почему эта система не работает как надо, что в ней не так?

Возможно, причина коренится в том факте, что существует вообще очень мало биологических систем, способных хорошо работать без контроля. Теломеразная активность в наших клетках подвергается весьма жесткому контролю. Патологическое исключение — раковые клетки. Зачастую они в результате адаптации проявляют высокую теломеразную активность и имеют удлиненные теломеры. Это один из факторов, приводящих к агрессивному росту и чрезмерному размножению клеток многих злокачественных опухолей. Вероятно, наши клеточные системы достигли своего рода эволюционного компромисса. Длина теломер поддерживается на уровне, необходимом для того, чтобы мы прожили достаточно долго и успели размножиться (а дальше уже неважно, если рассуждать с точки зрения эволюции). Однако теломеры не слишком длинны: при чрезмерной их протяженности люди массово умирали бы от рака уже в раннем возрасте.

Базовая длина теломеры для конкретного человека задается на сравнительно раннем этапе его развития, в тот момент, когда происходит так называемый нехарактерный всплеск теломеразной активности^10. Теломеразная активность также высока в зародышевых (половых) клетках, которые порождают яйцеклетки и сперматозоиды^11. Оно и понятно: наше потомство должно унаследовать от нас теломеры приличной длины.

Во многих тканях человеческого организма содержатся так называемые стволовые клетки. При необходимости они производят замену для клеток. Когда требуются новые клетки, стволовая клетка копирует свою ДНК и затем распределяет ее между двумя дочерними клетками. Одна из этих дочерних клеток обычно в ходе своего развития становится полнофункциональной клеткой-заменой, а другая — новой стволовой клеткой, которая точно таким же образом может создавать замены.

Среди наиболее «занятых» разновидностей клеток человеческого организма — тип стволовых клеток, порождающий все клетки крови[11], в том числе красные кровяные тельца (эритроциты) и те клетки, которые борются с инфекцией. Такие стволовые клетки размножаются с невероятной скоростью. Это происходит из-за того, что нам постоянно требуется восполнять запас иммунных клеток, противостоящих инородным патогенам, которые встречаются нам каждый день. Нужно постоянно пополнять и запас красных кровяных телец: их средняя продолжительность жизни невелика — примерно 4 месяца. Человеческий организм каждую секунду вырабатывает примерно по 2 миллиона эритроцитов^12: фантастическая производительность. Для этого требуется чрезвычайно активная популяция стволовых клеток, практически постоянно находящаяся в состоянии деления. Теломеразная активность в этих стволовых клетках повышена, но в конце концов и они страдают от укорачивания теломер13,14. Вот почему пожилые люди сильнее подвержены риску инфекций, чем более молодые взрослые. В сущности, у стариков просто становится всё меньше иммунных клеток. В этом одна из причин, по которым онкологические заболевания так распространены среди пожилых людей. Обычно наша иммунная система хорошо справляется с разрушением аномальных клеток, но эффективность отслеживания нарушений падает по мере уменьшения числа стволовых клеток.

Почему же все-таки длина наших теломер так важна? Это ведь всего-навсего мусорная ДНК. Какая разница, сколько будет копий некодирующего фрагмента ТТАГГГ — несколько тысяч или всего несколько сотен? По-видимому, проблема здесь заключается во взаимосвязи между ДНК теломер и белковыми комплексами, которые соединены с этой ДНК. Если количество повторов теломерной ДНК-последовательности уменьшится, перейдя за критический уровень, конец хромосомы не сможет связываться с достаточным количеством защитных белков. Мы уже видели, к чему приводит нехватка таких белков у мышей: в частности, бедняги могут умирать еще до рождения.

Ну да, это крайний случай. Однако нет никаких сомнений: жизненно необходимо, чтобы теломеры обладали достаточной длиной, позволяющей им связываться с большим количеством защитных белковых комплексов. Мы знаем, что для человека это верно так же, как и для мыши. Оказалось, что существуют люди, унаследовавшие мутации определенных ключевых компонентов систем организма, которые поддерживают нужную длину теломер. Наблюдаемые эффекты не столь разительны, как у генетически модифицированных мышей, но это лишь потому, что эмбрионы, серьезно затронутые такими мутациями, обычно гибнут еще в утробе матери. Однако те мутации, о которых нам известно, приводят к возникновению симптомов заболеваний, связанных с возрастом.

Теломеры и болезни

Речь идет о заболеваниях, причиной которых служат главным образом мутации теломеразного гена, или гена, кодирующего РНК-матрицу, или генов, кодирующих белки, которые защищают теломеры, или гена, который помогает теломеразной системе эффективно работать[12].

В сущности, мутации в любом из этих генов могут приводить к сходным эффектам. Главным образом они мешают клеткам поддерживать свои теломеры в нужном состоянии. Поэтому теломеры у пациентов с такими мутациями укорачиваются быстрее, чем у здоровых людей. Вот почему такие пациенты демонстрируют симптомы преждевременного старения. Такие заболевания называются теломерными синдромами человека^15.

Врожденный дискератоз — редкое генетическое заболевание, поражающее примерно одного человека на миллион. Пациенты страдают от целого ряда проблем. На коже у них в непредсказуемых местах появляются темные пятна. Во рту возникают пятна белого цвета, которые могут приводить к развитию рака ротовой полости. Ногти на руках и на ногах становятся тонкими и хрупкими. А потом отказывают различные органы, и этот процесс кажется необратимым. Он начинается с дисфункции костного мозга и неполадок в легких. Общий риск возникновения онкологических заболеваний у них также повышен.

При исследовании нескольких семейств, которых коснулся этот недуг, ученые выяснили, что причина заболевания — мутации различных генов. В настоящее время выявлено по меньшей мере 8 таких мутантных генов. Вполне возможно, что на самом деле их еще больше^16. Все эти гены обладают одним общим свойством: они участвуют в процессах поддержания нормального существования теломер. А значит, как бы ни искажалась эта область мусорной ДНК, симптомы все равно обычно будут схожи.

Совокупность легочных проблем, возникающих в таких случаях, называют пневмофиброзом. Для пациентов, страдающих этим заболеванием, характерно «короткое дыхание», они много кашляют, поскольку их организм не в состоянии с должной эффективностью выводить углекислый газ из легких и с должной легкостью наполнять их кислородом. Рассматривая их легкие под микроскопом, патологи увидели обширные области, где нормальную ткань заменила воспаленная и фиброзная, напоминающая по своей структуре шрам^17.

Такая клиническая и патологическая картина легких довольно часто наблюдается при респираторных заболеваниях. Это побудило ученых обратиться к изучению проб биологического материала пациентов, страдающих идиопатическим пневмофиброзом. Слово «идиопатический» означает, что для заболевания пока не выявлено очевидной причины. Исследователи проверили, нет ли у этих пациентов дефектов генов, которые обеспечивают синтез веществ, защищающих теломеры. В среднем дефекты соответствующих генов удалось выявить почти у каждого шестого пациента, в семье которого страдали этим заболеванием, но мутаций прежде не обнаруживали18,19. Даже у пациентов, в семье которых, по-видимому, не страдали пневмофиброзом, мутации теломерных генов обнаружились в 1-3% случаев20,21. В США около 100 тысяч человек страдают идиопатическим пневмофиброзом, так что, по самым осторожным оценкам, примерно 15 тысяч из них, вероятно, заработали эту болезнь из-за того, что их организм не мог поддерживать тело-меры в нормальном состоянии.

Дефекты в механизме, который защищает теломеры, могут становиться причиной еще одного заболевания. Речь идет об апластической анемии — болезни, при которой костный мозг перестает вырабатывать достаточное количество клеток крови^22. Это редкий недуг, им страдает примерно 1 человек на полмиллиона. И примерно у 1 из 20 больных наблюдаются мутации фермента теломеразы или соответствующей РНК-матрицы.

У некоторых таких больных могут одновременно наблюдаться и дефекты костного мозга, и дефекты легких, но одна из проблем, как правило, становится клинически очевидной раньше другой. При лечении это может приводить к незапланированным последствиям. Пересадка костного мозга — одна из методик лечения больных апластической анемией. Пациентам дают специальные препараты для профилактики отторжения нового костного мозга их иммунной системой. Некоторые из таких лекарств, как известно, токсичны для легких. Для большинства страдающих апластической анемией это, в общем-то, не проблема. Но для тех, кто имеет дефекты в теломеразной системе, такие медикаменты способны спровоцировать пневмофиброз, который может оказаться летальным^23. Иными словами, лекарство в таких случаях может стать причиной смерти.

Существует не совсем обычная генетическая причина, по которой врачи не всегда понимают, что наблюдаемые у пациента симптомы — часть врожденной проблемы с теломерами. Теломеразный комплекс обычно особенно активен в половых клетках: как мы уже знаем, родители должны передавать своим отпрыскам длинные теломеры. Но в некоторых семьях, где наблюдаются мутации генов, кодирующих теломеразу, или мутации сопутствующего РНК-фактора, это не так. А значит, в таких случаях каждое новое поколение передает потомству всё более короткие теломеры. Поскольку симптомы болезни начинают проявляться, когда длина теломер становится меньше определенного значения, каждое следующее поколение рождается всё ближе и ближе к точке критического укорачивания теломер^21.

Это приводит к довольно-таки серьезным последствиям. К примеру, дедушка обладает сравнительно длинными теломерами, и пневмофиброз у него развивается только в 60 с лишним. У его сына теломеры уже не такие длинные. Симптомы легочных неполадок проявляются у него в 40 с чем-то лет. А вот третье поколение может получить в наследство по-настоящему короткие теломеры. В результате у внуков проявится апластическая анемия уже в детстве.

Поскольку у старшего и среднего поколения соответствующие болезни возникают лишь в сравнительно позднем возрасте, внук может заболеть еще до того, как у его отца и деда проявятся опасные симптомы, и терапевт будет испытывать трудности при выявлении генетического заболевания в данном семействе. К тому же при более острой и менее острой форме болезни симптомы порой различны.

Эта странная картина, когда у старшего поколения симптомы проявляются слабее и в более позднем возрасте, чем у младшего поколения, чем-то напоминает характер наследования миотонической дистрофии, о котором мы говорили в главе 1. Речь идет о весьма необычном генетическом феномене, и поразительно, что в двух его самых ярких и отчетливых проявлениях эффект, в конечном счете, вызван изменением длины фрагмента мусорной ДНК.

Напрашивается вопрос: почему клетки некоторых тканей подвержены укорачиванию теломер больше других? Пока это не совсем ясно, однако появляются некоторые любопытные модели. Вероятно, активно размножающиеся клетки сильнее рискуют получить дефекты, приводящие к укорачиванию теломер. Классический пример — популяция стволовых клеток крови (мы уже обсуждали это выше). Если эти клетки испытывают трудности с поддержанием нужной длины теломер, то популяция стволовых клеток в конце концов истощится.

Похоже, это объяснение вполне подходит для апластической анемии. Но не для пневмофиброза. Ткань легких реплицируется довольно медленно, однако пневмофиброз распространен среди страдающих теломерными дефектами. Возможно, в клетках легких воздействия укороченных теломер сопряжены с другими факторами, влияющими на геном и функционирование клеток. Клетки эти развиваются сравнительно медленно, поэтому и соответствующие процессы идут не так уж быстро. Возможно, именно поэтому легочные симптомы обычно возникают позже, чем те, причиной которых становятся проблемы со стволовыми клетками крови.

Наши легкие при каждом вдохе подвергаются риску воздействия потенциально опасных веществ. Поэтому неудивительно, что они так отчаянно стараются выносить бремя дефектных теломер. Один из наиболее распространенных источников опасных вдыхаемых соединений — табак. Влияние курения на здоровье человека в мировом масштабе колоссально. По оценкам Всемирной организации здравоохранения около 6 миллионов человек ежегодно умирают из-за курения, причем полмиллиона из них — от воздействия курения вторичного^25.

Ученые экспериментально исследовали влияние сигаретного дыма на организм. Они вырастили генетически модифицированных мышей с укороченными теломерами и затем подвергли самых разных мышей воздействию сигаретного дыма^26. Результаты показаны на рис. 5.2. По сути, пневмофиброз развивался лишь у зверьков с укороченными теломерами, подвергавшихся воздействию табачного дыма.

Рис. 5.2. Для возникновения пневмофиброза у мышей требуется одновременное действие двух факторов: генетического дефекта и негативного влияния окружающей среды. У мышей с укороченными теломерами, не подвергающихся воздействию табачного дыма, пневмофиброз не развивается, как и у мышей с нормальными теломерами, которых подвергали воздействию дыма. Однако у мышей с укороченными теломерами, еще и подвергавшихся воздействию дыма, все-таки возникало это заболевание.

Разумеется, курение — не единственный фактор, влияющий на состояние здоровья человека, хотя отказ от курения — вероятно, самое разумное, что вы можете сделать для своего здоровья. Однако главный фактор, влияющий на здоровье жителей богатых стран, — это сам по себе возраст. Но так было не всегда. Нынешним положение вещей стало после того, как мы достигли впечатляющего прогресса — медицинского, фармакологического, социального, технологического — в борьбе с тем, что раньше обеспечивало нам преждевременную могилу, со всеми этими старомодными штуками вроде инфекционных заболеваний, младенческой смертности, недоедания.

Тик-так, говорит теломера

Основным фактором риска развития хронических заболеваний сейчас является старение. Это большая проблема. По оценкам специалистов, к 2025 году на Земле будут проживать свыше 1,2 млрд человек старше 60 лет^27. Заболеваемость онкологическими недугами резко увеличивается после 40 лет. Если вы доживете до 80, у вас с 50%-ной вероятностью разовьется какой-то тип рака. Примерно такова же вероятность развития у вас какого-то сердечно-сосудистого заболевания, если вам больше 65 и вы живете в США^28. Есть и масса других статистических данных, рисующих столь же безотрадную картину. Но зачем нагонять на себя тоску? Все-таки приведу еще один факт: британский Королевский психиатрический колледж объявил, что примерно 3% людей старше 65 лет страдают от клинической депрессии, а у каждого шестого человека такого возраста — симптомы менее острой депрессии, заметные для окружающих^29.

Впрочем, все мы знаем, что два человека одного и того же возраста могут сильно отличаться друг от друга по состоянию здоровья. Стив Джобс, один из основателей компании Apple, умер от рака в 56 лет. Фауджа Сингх пробежал свой первый марафон в 89 лет, а свой последний на данный момент — в 101 год (нет-нет, это был не один и тот же марафон). Мы еще далеко не всё знаем о том, какие факторы контролируют продолжительность жизни. Похоже, это почти всегда некая комбинация генетики, среды и простого везения. Но мы твердо уверены в одном: примитивный подсчет количества прожитых лет дает в таких случаях лишь весьма неполную картину.

Мы начинаем осознавать, что теломеры могут служить довольно сложными молекулярными часами. На скорость укорачивания теломер могут оказывать влияние факторы среды. А значит, теломеры можно использовать не только как хронологические маркеры, но и как вехи здоровых лет, прожитых человеком. Получаемые данные пока носят предварительный характер. Результаты не всегда согласуются друг с другом. Отчасти это происходит из-за того, что регулярное корректное измерение теломер не так-то просто осуществлять (мы уже говорили об этом). Обычно мы измеряем их в клетках, до которых нам легко добраться. Как правило, это белые кровяные тельца (лейкоциты), а это не всегда самый подходящий тип клеток для исследования. Но несмотря на все оговорки, уже сейчас ученые начали получать довольно интригующие данные.

Вернемся к нашему старому врагу — табаку. В рамках одного из исследований проанализировали длину теломер в лейкоцитах более чем 1000 женщин. Обнаружилось, что у курящих теломеры короче, причем скорость их укорачивания увеличивается примерно на 18% за каждый год курения. По подсчетам исследователей, ежедневное выкуривание 20 сигарет в течение 40 лет эквивалентно потере почти 7,5 лет «теломерной жизни»30.

Исследование уровня смертности среди людей старше 60 лет, проведенное в 2003 году, показало, что у обладателей самых коротких теломер уровень смертности выше всего (во всяком случае, так утверждают авторы работы)31. Похоже, основной вклад здесь вносит смертность от сердечно-сосудистых заболеваний. Результаты подтверждает проведенное позже и более масштабное исследование, в ходе которого изучалась другая выборка пожилых людей^32. Исследование представителей сообщества ашкеназов ста лет и старше показало, что более длинные теломеры сопутствуют меньшему проявлению симптомов старческих болезней и более впечатляющим когнитивным функциям по сравнению с людьми столь же преклонного возраста, обладающими более короткими теломерами^33.

Иногда мы забываем, что на состояние здоровья и на продолжительность жизни влияют не только физические факторы. Хронический психологический стресс может оказаться весьма вредным для человека, оказывая негативное воздействие на самые разные системы организма, включая сердечно-сосудистую и иммунную^34. Страдающие от хронического психологического стресса обычно умирают в более раннем возрасте, чем их сверстники, меньше подвергающиеся стрессу. Исследование женщин в возрасте от 20 до 50 лет показало, что у группы страдавших от хронического стресса теломеры короче по сравнению с группой, не испытывавшей такого стресса. Ученые, проводившие эксперимент, подсчитали, что воздействие хронического стресса, по сути, отнимает примерно 10 лет жизни^35.

В гигантском пантеоне глобальных проблем здоровья, которых вообще-то запросто можно избежать, но которые оказывают на человечество колоссальное воздействие, ожирение борется за пальму первенства с курением. Вновь обратившись к данным Всемирной организации здравоохранения, мы обнаружим, что во всем мире из-за ожирения или лишнего веса ежегодно умирает около 3 миллионов человек. Почти четверть случаев сердечно-сосудистых заболеваний можно приписать ожирению или лишнему весу. Для страдающих диабетом второго типа вклад ожирения еще выше (почти половина всех случаев такого диабета обусловлена лишним весом). Для онкологических заболеваний этот показатель составляет, по разным оценкам, от 7 до 41%36. Экономический и социальный эффект такой эпидемии ожирения устрашает.

Недавние исследования показали, что существует довольно тесное взаимодействие между системами наших клеток, пытающимися регулировать энергетические и метаболические флуктуации и как-то реагировать на них, и теми системами, которые поддерживают целостность генома, в том числе и стабильность теломер^37. Поэтому неудивительно, что ученые вовсю анализируют длину теломер в клетках тех, кто страдает ожирением. В статье, авторы которой изучали воздействие курения на длину теломер, кое-что сказано и о воздействии ожирения: они исследовали и это. Как выясняется, укорачивание теломер, связанное с ожирением, выражено еще сильнее, чем при курении, и эквивалентно потере примерно 9 лет жизни^38.

Если все это побудит вас держать собственный вес под контролем, делайте это осторожно. По данным ООН, страной с наибольшей долей людей, которым 100 лет и больше, является Япония^39. Почти наверняка в этом играет роль традиционное японское меню, ибо у японцев, переключившихся на рацион западного типа, нередко развиваются западные же хронические болезни. В основе традиционного японского стола — еда с низким содержанием белков и сравнительно высоким содержанием углеводов. Опыты на крысах показывают, что низкобелковая диета в ранний период жизни может быть одной из причин увеличения продолжительности жизни, а это, в свою очередь, часто связывают с длинными теломерами^40.

Так что если вы подумываете перейти на высокобелковую и низкоуглеводную диету по Аткинсу или Дюкану, обсудите-ка это сначала со своей мусорной ДНК. Подозреваю, что ваши теломеры могут отнестись к этому неодобрительно.

Глава 6. Два — лучшее число на свете

Одна клетка превращается в 2, из 2 получаются 4, из 4 рождается 8. «И так далее, и так далее, и тому подобное», как сказано в фильме «Король и я»1. До тех пор, пока не появятся все 50 с лишним триллионов клеток человеческого организма. Каждый раз, когда человеческая клетка делится, она должна передать обеим дочерним клеткам точно такой же генетический материал, какой она несет в себе сама. Для этого клетка изготавливает точную копию своей ДНК. Появляется дубликат каждой хромосомы. Первоначально эти дубликаты остаются прикрепленными друг к другу, но затем расходятся на противоположные края клетки. Упрощенная схема этого процесса дается на рис. 6.1.

Рис. 6.1. Нормальная клетка содержит по две копии каждой хромосомы: одна копия унаследована от отца, другая — от матери. Перед делением клетки создается точный дубликат каждой хромосомы. Когда клетка делится, эти копии расходятся в разные стороны. В результате возникают две дочерние клетки, содержащие точно такие же хромосомы, что и исходная клетка. Для простоты здесь показана лишь одна пара хромосом, а не все 23 пары, имеющиеся в человеческой клетке. Различная окраска полосок на схеме показывает различное происхождение компонентов пары: она получает по одной хромосоме от каждого из родителей. Здесь отражено лишь деление ядра, хотя оно сопровождается и делением остальных частей клетки.

Есть одно исключение — половые клетки яичников или семенников, порождающие яйцеклетки или сперматозоиды соответственно. Яйцеклетки или сперматозоиды содержат лишь половину количества хромосом, которое имеется во всех других клетках организма. В результате при слиянии яйцеклетки со сперматозоидом в зиготе вновь восстанавливается полное число хромосом, а затем она уже делится, порождая 2 клетки, затем 4 — и так далее, и так далее, и тому подобное.

Такое уполовинивание числа хромосом оказывается возможным благодаря тому, что все наши хромосомы парные. Одну хромосому в каждой паре мы наследуем от матери, одну — от отца. На рис. 6.2 показано, как число хромосом уменьшается вдвое, когда создается яйцеклетка или сперматозоид.

Рис. 6.2. Процесс деления клеток, в ходе которого создаются гаметы (яйцеклетка или сперматозоид), каждая из которых содержит лишь одну хромосому из каждой пары. Вначале процесс выглядит как обычное деление клетки (показанное на рис. 6.1). Однако далее следует второе разделение хромосомных пар, при котором возникают гаметы с половинным числом хромосом. Уже на этой ранней стадии процесса размножения происходит обмен генетическим материалом внутри хромосомных пар. Тем самым увеличивается генетическое разнообразие потомства. (Впрочем, на данной схеме это не показано.).

Если деление клеток пойдет как-то не так, это может привести к очень серьезным последствиям (мы еще увидим это в данной главе). Клеточное деление — исключительно сложный процесс, требующий весьма скоординированной работы сотен различных белков. Кроме того, жизненно необходимо, чтобы клеточное деление протекало гладко и успешно. И поразительно, что немалая часть этого сложного и важного процесса так зависит от одного длинного фрагмента мусорной ДНК, называемого центромерой.

В отличие от теломер, центромера находится не на концевом, а на внутреннем участке хромосомы. В зависимости от конкретной хромосомы она может располагаться примерно в середине или ближе к концу. Ее позиция постоянна — в том смысле, что, к примеру, на человеческой хромосоме 1 она всегда располагается примерно в середине, тогда как на человеческой хромосоме 14 она всегда находится ближе к концу.

Центромеры, в сущности, представляют собой участки для прикрепления набора белков. Эти белки растаскивают разделенные хромосомы на противоположные края клетки. Представьте себе, как Человек-Паук выбрасывает паутину, целясь в предмет, который он хочет заполучить, и затем подтягивает этот предмет к себе. А теперь вообразите себе двух таких существ, только крошечных. Они стоят на двух противоположных краях клетки. Человек-Паук бросает сеть в нужную хромосому, сеть прикрепляется к ней, и затем он подтягивает хромосому к своему краю клетки. Его близнец проделывает то же самое на своем краю с другой хромосомой из данной пары.

Но нашему Человеку-Пауку приходится нелегко. Почти вся поверхность хромосомы покрыта веществом, отталкивающим паутину. Существует лишь один участок, к которому она может прилипнуть. Этот участок и есть центромера. В клетке центромера прикрепляется к длинной цепочке белков, которая оттаскивает хромосому от центра на периферию клетки. Такая цепочка белков называется веретеном деления.

Центромеры неизменно играют важнейшую роль во всех видах живых организмов. Именно к ним прикрепляется веретено деления. Без подобного участка веретено деления не могло бы выполнять свою функцию.

Такая система должна работать как следует, иначе деление пойдет по неверному пути. Это принципиально важный процесс, а значит, следовало бы ожидать, что ДНК-последовательность центромеры остается почти неизменной практически на всем протяжении эволюционного древа. Как ни странно, это совсем не так. Продвинувшись по нему дальше дрожжей[13] и микроскопических червей[14], мы обнаружим, что у различных видов эта ДНК-последовательность весьма различна^2. Собственно, ДНК-последовательность центромер может отличаться даже у двух хромосом одной и той же клетки. Такой уровень разнообразия ДНК-последовательности противоречит интуитивным представлениям, ведь речь идет о неизменном исполнении одной и той же функции. К счастью, мы уже начинаем понимать, каким же образом этот жизненно важный участок мусорной ДНК ухитряется проделывать столь необычный эволюционный трюк.

В человеческих хромосомах центромеры образованы из повторов элемента ДНК-последовательности, длина которого составляет 171 пару нуклеотидных оснований[15]. Эта 171 пара повторяется снова и снова. Общая длина одной центромеры может доходить до 5 миллионов оснований^3. Главное свойство центромеры состоит в том, что она является участком связывания белка CENP-A (Centromeric Protein-A)4. Соответствующий ген (также называемый CENP-A) почти неизменен у всех видов, где он есть (в отличие от ДНК центромеры).

Чтобы разобраться в эволюционном противоречии, которое мы изложили выше, снова прибегнем к аналогии с Человеком-Пауком. Его паутина может связываться с белком CENP-A. Неважно, с чем он соединяется — с куском мяса, кирпичом, картофелиной, лампочкой. Главное, чтобы белок CENP-A хоть с чем-нибудь соединялся. Паутина Спайдермена прикрепляется к этому «чему-нибудь», а затем тянет белок и это «что-нибудь» к нашему супергерою.

Итак, ДНК-последовательность центромеры может очень сильно различаться у разных видов. Отличие колоссальное — от «куска мяса» до «электрической лампочки». Главное, чтобы белок CENP-A оставался таким же. Тогда веретено деления (практически одинаковое у разных видов) прикрепится к нему и растащит хромосомы по разным полюсам делящейся клетки.

CENP-A — не единственный белок, с которым работает центромера. Имеется и множество других. В лаборатории вполне возможно подавить экспрессию белка CENP-A в клетках. В таком случае другие белки, которые должны бы соединяться с центромерой, прекращают это делать5,6. Однако если в ходе эксперимента, наоборот, подавляют экспрессию какого-то из других белков, CENP-A все равно продолжает связываться с центромерой^7. А значит, белок CENP-A — своего рода краеугольный камень всего процесса.

Добившись сверхэкспрессии гена CENP-A в клетках, взятых у дрозофил, ученые обнаружили: хромосомы начали создавать центромеры, расположенные в необычных местах^8. Однако, судя по всему, с человеческими клетками дело обстоит сложнее. Для них сверхэкспрессия CENP-A не приводит к возникновению новых центромер, расположенных аномальным образом^9. Похоже, у человека белок CENP-A необходим, но не достаточен для формирования центромер.

Белок CENP-A необходим для «вербовки» всех прочих белков, требующихся для того, чтобы веретено деления успешно занималось своим делом. Когда клетка активно делится, CENP-A способствует выстраиванию на нужном месте более 40 различных белков. Процесс идет постадийно, подобно добавлению кирпичиков «Лего» в определенном порядке. Сразу же после того, как продублированные хромосомы окажутся растащенными на противоположные края клетки, этот большой комплекс, содержащий множество белков, снова распадается. Весь процесс может занять меньше часа. Мы толком не знаем, что контролирует все его стадии, но какие-то из них управляются чисто физическими свойствами. Обычно ядро окружено мембраной, сквозь которую непросто проникнуть крупным белковым молекулам. Когда клетка готова к пространственному разделению продублированных хромосом, этот барьер временно разрывается, и белки могут присоединиться к хромосоме на том участке, где расположена центромера^10. Представьте себе, что вы переезжаете и вызвали грузчиков. Они готовы заняться вашей мебелью, однако не могут приступить к работе, пока вы не откроете дверь и не впустите их.

Вопрос места

Перед нами по-прежнему маячит сложная концептуальная проблема. ДНК-последовательность центромеры, мягко говоря, не везде одинакова. При этом жизненно важно, чтобы белок CENP-A направлялся в строго определенное место. Откуда же клетка знает, где должна располагаться центромера на каждой хромосоме? Почему на человеческой хромосоме 1 она всегда примерно в середине, а на хромосоме 14 — всегда ближе к концу?

Чтобы разобраться в этом, нужно выстроить более сложный образ ДНК наших клеток. Пресловутая двойная спираль ДНК — картинка, которую знают все. Возможно, она даже символ всей современной биологии. Но эта картинка не дает полного представления о ДНК. Собственно, ДНК — это очень длинная веретенообразная молекула. Если растянуть ДНК одной человеческой клетки в единую линию, длина такой линии составит 2 метра (если вы соедините вместе генетический материал из всех хромосом, содержащихся в клетке). Но эта ДНК как-то должна помещаться в ядре клетки, а его диаметр — всего лишь сотая миллиметра.

Попробуйте-ка запихнуть штуковину, длина которой равна высоте Эвереста, в капсулу размером с мячик для гольфа. Если штуковина — веревка, у вас ничего не получится. А вот если вместо веревки взять волоконце тоньше человеческого волоса, тогда вы, скорее всего, справитесь с задачей.

ДНК человека длинная, но очень тонкая, так что ее вполне можно уместить в ядре клетки. Но тут, как всегда в таких случаях, есть трудность. Мало запихнуть ДНК в небольшой объем. Представьте себе гирлянду с лампочками, которую вы вешаете на новогоднюю елку. Если после праздников вы снимете гирлянду и просто запихнете в коробку, все эти лампочки и провода займут там много места. Кроме того, снова вытащив ее через год, вы почти наверняка обнаружите, что все провода безнадежно перепутались. Чтобы их распутать, уйдет масса времени, и есть немалая вероятность, что вы порвете какие-то провода и разобьете какие-то лампочки. И, конечно, во всей этой мешанине очень непросто добраться до какой-то определенной лампочки.

Но если вы отличаетесь маниакальной аккуратностью, вы закрутите каждую цепочку лампочек вокруг куска картона, а потом уж спрячете гирлянду до следующего Нового года, когда ваша тщательность вознаградится: вы с радостью извлечете гирлянду из удивительно маленькой коробки, куда вы сумели поместить все лампочки и провода. Вы не только сэкономите пространство в шкафу — такой способ позволит вам быстро размотать гирлянду. Провода не запутаются и не лопнут. И вы всегда с легкостью доберетесь до вашей любимой лампочки.

То же самое происходит и в наших клетках. ДНК не хранится в виде неопрятной кучи генетического материала, кое-как набитого в ядро. Напротив, эта молекула обернута вокруг определенных белков. Благодаря этому ДНК не запутывается и не рвется, а кроме того, ее можно аккуратно и в хорошо структурированном виде разместить в небольшом объеме, и клетка при необходимости легко получит доступ к различным участкам ДНК, чтобы включать или выключать отдельные гены.

ДНК в наших клетках обернута вокруг особых белков — гистонов. Упрощенно это показано на рис. 6.3. Восемь гистонов (по 2 белка 4 типов) образуют октамер. ДНК обвивается вокруг него, как скакалка вокруг компактно уложенных 8 теннисных мячей. По всему нашему геному разбросано несметное количество таких октамеров.

CENP-A — близкий родственник гистонов, его аминокислотная последовательность почти такая же, как у них, но есть и важные отличия. Возле центромеры отсутствуют обе копии одного из стандартных гистонов[16]. Вместо них в октамере находится CENP-A (см. рис. 6.4^11). Близ центромеры каждой хромосомы имеются тысячи таких октамеров, содержащих CENP-A.

Рис. 6.3. ДНК (сплошная черная полоса) обернута вокруг наборов из восьми гистонов (в каждом наборе — по два гистона четырех типов).

Рис. 6.4. Слева: стандартный октамер из гистонов, встречающийся в большинстве участков генома. Справа: октамер центромерических участков ДНК. Одну из стандартных пар гистонов здесь заменяет пара специализированных гистонов центромеры — CENP-A (обозначены полосатыми шариками).

CENP-A в этих тысячах октамеров, вокруг которых обвиваются центромеры, дает возможность веретену деления за что-то уцепиться, когда оно пытается растащить хромосомы в разные стороны. Встраивание CENP-A в октамеры приводит, в частности, к тому, что центромерические участки ДНК становятся жестче и прочнее^12. Что проще разломить — кусок желе или длинный леденец? Ясно, что увеличение жесткости облегчает работу веретена деления.

Но мы по-прежнему возвращаемся к одной и той же проблеме. Почему CENP-A встраивается в октамеры близ центромеры, а не в расположенные в других участках ДНК? Дело тут не в самой ДНК-последовательности. Другие области нашего генома также содержат мусорную ДНК, напоминающую ДНК-последовательности центромер, однако CENP-A почему-то к этим областям не прикрепляется^13. CENP-A всегда находится лишь возле центромер. Более того, в каком-то смысле именно присутствие CENP-A позволяет определить, центромера перед нами или нет. Как же человеческие клетки в ходе эволюции сумели использовать изначально нестабильную ситуацию для того, чтобы добиться совершеннейшей генетической стабильности при клеточном делении?

Ответить на этот вопрос поможет идея своего рода самосева. Оказавшись на ДНК, белок CENP-A продолжает контролировать поддержание своего расположения в определенном месте и передачу этого позиционного свойства всем дочерним клеткам^14. Этот процесс не зависит от ДНК-последовательности. Похоже, он зависит от небольших химических модификаций гистонных октамеров.

Гистоны в этих октамерах могут модифицироваться огромным количеством разнообразных способов. Белки представляют собой различные комбинации аминокислот (всего таких аминокислот двадцать), и многие из аминокислот можно модифицировать. Кроме того, сам белок тоже можно модифицировать различнейшими путями. К гистонам это относится точно так же, как и ко всем прочим белкам.

Что касается центромер человека, то здесь октамеры, содержащие CENP-A, не являются абсолютными монополистами. Напротив, такие октамерные блоки чередуются с октамерными блоками, содержащими стандартный гистон (см. рис. 6.5). Стандартные октамеры несут в себе весьма характерную комбинацию химических модификаций. Это, в свою очередь, привлекает другие белки, которые связываются с ними. Функция этих белков отчасти как раз и состоит, по сути, в поддержании существования таких модификаций^15. Благодаря всему этому октамеры, содержащие CENP-A, остаются локализованными на одном и том же участке генома. А значит, они формируются лишь в одном месте хромосомы. Возможно, именно поэтому последовательность мусорной ДНК центромер так отличается у разных видов, хоть и является «географическим каркасом» одного из основополагающих для любой клетки процессов.

Рис. 6.5. Чередование стандартных и CENP-A-содержащих гистонных октамеров близ центромер. Для простоты показаны лишь небольшие группы октамеров, тогда как в клетке их тысячи. Каждый кружок изображает один октамер.

Химические модификации центромеры, кроме того, обеспечивают «молчание» соответствующего участка генома. Хотя недавние исследования позволяют предположить, что в некоторых центромерических областях может происходить слабая экспрессия РНК, пока неясно, имеет ли она какую-либо функциональную значимость. По сути, у ДНК центромер нет никакой реальной функции — это просто генетический мусор, зоны, к которым могут прикрепляться CENP-A и все сопутствующие ему белки, только и всего. Больше клетке от этих последовательностей ничего не требуется. Даже хорошо, что у них нет других функций, ведь их выполнению могло бы мешать связывание октамеров, содержащих CENP-A, с другими генетическими компонентами. Вот почему эта область ДНК так сильно изменилась в ходе эволюции. Штука в том, что конкретный состав ДНК-последовательности в данном случае не очень-то важен.

Из ничего не выйдет ничего

Во всех этих рассуждениях недостает одного звена. Откуда CENP-A знает, к какой области мусорной ДНК цепляться? Мы ведь постоянно хотим выяснить, с чего начинается тот или иной процесс. Но такой ход мысли в данном случае неизбежно заведет нас в тупик. Давайте обратимся к творчеству писателя и либреттиста Оскара Хаммерстайна. Главные герои его знаменитой пьесы «Звуки музыки» капитан фон Трапп и Мария поют: «Из ничего не выйдет ничего. И не надейтесь»16.

Они совершенно правы.

Сама по себе ДНК человека («голая» ДНК) — молекула абсолютно нефункциональная. Иными словами, она ничего не делает. И уж явно не в состоянии управлять производством нового человеческого существа. Ей нужна масса дополнительной информации (например, из гистонов и их модификаций). Кроме того, ей нужно находиться внутри функционирующей клетки. Когда продублированные хромосомы разделяются и затем растаскиваются на противоположные края клетки, каждая из них несет на себе некоторые гистонные октамеры, занимающие нужное положение и имеющие нужные модификации. Таких октамеров вполне достаточно, чтобы они стали исходной областью, на основе которой в дочерних клетках будет воссоздаваться полная картина гистонов и их модификаций. Это касается не только стандартных гистонных октамеров, но и CENP-A-содержащих. Так передаются инструкции о том, где должны формироваться центромеры. Для этих «нестандартных» октамеров участки белка CENP-A, отличающиеся по аминокислотному составу от стандартных гистонов, играют важную роль в привлечении необходимых белков^17.

Эта информация, хранящаяся в виде химических модификаций, остается неизменной даже при создании яйцеклеток и сперматозоидов^18. Октамеры, содержащие CENP-A, остаются на прежнем месте, когда яйцеклетка и сперматозоид сливаются, образуя единую клетку, которая в конечном счете породит все триллионы клеток тела нового человека. Наши центромеры передавались из поколения в поколение на протяжении всей эволюции человека — и задолго до этого, через наших дальних эволюционных предков. При этом главным фактором являлось положение белков, а не конкретная ДНК-последовательность, к которой они прикреплялись.

Существуют препараты, нарушающие работу веретена деления, которое растаскивает продублированные хромосомы на противоположные края клеток. Веретено деления состоит из большого количества белков, и они сходятся друг с другом лишь в тот момент, когда клетка готова к растаскиванию реплицированных хромосом. Препарат паклитаксел делает веретено деления чересчур стабильным, так что этот комплекс белков не может распасться, когда он больше не нужен^19.

Почему это плохо для клетки? Представим себе пожарную машину с раздвижной лестницей. Отлично, когда лестница раздвигается, помогая вызволить людей с верхних этажей горящего здания. Но если пожарная команда не сложит лестницу после пожара и так и поедет с места катастрофы, на дороге наверняка случатся большие неприятности. То же самое происходит и с клетками, обработанными паклитакселом. Клеточные системы поймут, что веретено деления не прошло должной деактивации. Это станет причиной разрушения клетки. В Великобритании паклитаксел разрешено применять при лечении различных онкологических заболеваний, в том числе немелкоклеточного рака легких, рака груди, рака яичников^20.

Используя препарат, мешающий клеткам делиться, можно уничтожать раковые клетки быстрее, чем здоровые (которые размножаются медленнее). Но мы знаем, что аномальное разделение хромосом само по себе является признаком многих форм рака.

Количество имеет значение

Если разделение хромосом пойдет неправильно, одна дочерняя клетка может унаследовать и «исходную» хромосому, и ее дубликат. Другая же «дочка» не получит в наследство никаких хромосом. Иными словами, первая дочерняя клетка получит лишнюю хромосому, а у второй будет на одну меньше, чем нужно. Такая ситуация, когда количество хромосом не то, какое следует, называется анеуплоидией. Термин построен на основе греческих слов, означающих «не», «хороший» и «кратный» (в словах типа «двукратный», «трехкратный» и т.п.). Иными словами, анеуплоидия — несбалансированное геномное состояние.

Как ни удивительно, около 90% плотных (солидных) опухолей содержат анеуплоидные клетки, то есть клетки с «неправильным» числом хромосом^21. Картина анеуплоидии может оказаться весьма запутанной. Вероятно, если процесс разделения хромосом идет не так, как надо, работает фактор случайности. В единичной раковой клетке может находиться четыре копии одной хромосомы, две копии другой и одна копия третьей — или же какая-то иная хромосомная комбинация. Из-за такой вариативности очень трудно определить, является ли сама анеуплоидия первопричиной ракового процесса. Может быть, она служит лишь невинным маркером, как бы указывающим на раковый характер клетки? Вероятно, тут имеет место целый спектр вариантов, поскольку количество аномальных хромосом и их распределение во многом случайны. В некоторых раковых клетках могут появляться хромосомные комбинации, побуждающие клетку делиться быстрее. В других существуют комбинации, оказывающие противоположное действие или даже запускающие систему самоубийства раковой клетки. А в некоторых клетках комбинация хромосом может оказаться совершенно нейтральной, то есть вообще не производить никакого воздействия^22.

Примечательный факт: по-видимому, анеуплоидия имеет место и в некоторых нормальных клетках. Сообщалось, что целых 10% клеток в мозгу мышей и людей, возможно, анеуплоидны^23. В процессе развития организма доля «неправильных» клеток еще вырастает (до 30%), но многие из них уничтожаются^24. Насколько мы можем судить, остальные анеуплоидные клетки мозга активно функционируют^26. Не совсем понятно, зачем нам эти мозговые клетки с неправильным количеством хромосом. Сообщалось о похожей анеуплоидии в печени человека^26. Роль печеночной анеуплоидии тоже пока не ясна.

В случаях, описанных выше, анеуплоидия возникала уже после того, как появлялась основная часть клеток организма. Она проявлялась при делении клеток, создающих новые клетки (пусть иногда и раковые). Эффект таких неполадок в разделении хромосом, судя по всему, незначителен (возможно, его и вовсе нет). Вероятно, причина в том, что одновременно существует масса нормальных клеток, компенсирующих такой дефект.

Совершенно иная ситуация складывается при формировании гамет (яйцеклеток или сперматозоидов). Если при этом пара хромосом не сумеет разделиться как надо, одна из получившихся гамет обзаведется лишней копией хромосомы, а другая получит на одну хромосому меньше, чем полагается. Допустим, это происходит при формировании яйцеклеток, и хромосома 21 отделяется неправильно. Тогда у одной из получившихся яйцеклеток окажется две копии хромосомы 21, а у другой яйцеклетки — ни одной.

Если яйцеклетка, у которой нет хромосомы 21, затем окажется оплодотворенной, у получившегося эмбриона будет лишь одна копия хромосомы 21, и он очень скоро погибнет. Но если произойдет оплодотворение яйцеклетки, содержащей две копии хромосомы 21, у получившегося эмбриона будет три копии этой хромосомы. Риск выкидыша для таких эмбрионов выше, чем для нормальных, однако многие из них проходят все стадии развития, и в результате на свет появляется ребенок.

Многие из нас знакомы с людьми, имеющими три копии хромосомы 21, или хотя бы видели их. Обладание тремя копиями одной и той же хромосомы называется трисомией, поэтому явление, о котором идет речь, именуют трисомией 21. Такого рода неверное разделение хромосом — причина синдрома Дауна^27. Оно может происходить и из-за наличия в сперматозоиде двух копий этой хромосомы или же при неправильном разделении хромосом в ходе первых делений оплодотворенной яйцеклетки. Однако описанный выше «материнский» путь — наиболее распространенный.

Синдром Дауна затрагивает примерно одного из 700 новорожденных. Это комплексное заболевание может проявляться различным образом. Обычно наблюдаются дефекты сердца, характерный облик (строение тела, черты лица), та или иная степень неспособности к обучению. В наши дни у страдающих синдромом Дауна больше шансов дожить до зрелых лет благодаря более эффективному медикаментозному и хирургическому лечению, однако для них высок риск в сравнительно раннем возрасте получить болезнь Альцгеймера^28.

Комплексная природа характеристик синдрома Дауна ясно показывает, что для наших клеток очень важно иметь строго определенное число хромосом. У людей с синдромом Дауна 3 копии хромосомы 21, а не 2. Это 50%-ное увеличение количества хромосомы 21 (лишь одной из многих), а, следовательно, и количества генов этой хромосомы, приводит к серьезнейшим последствиям как для клетки, так и для ее хозяина. Клетки попросту неспособны справляться с таким избытком генов — наш организм способен компенсировать лишь сравнительно небольшие генетические изменения.

У человека наблюдают и две другие трисомии. Обе связаны с гораздо более серьезными заболеваниями, чем синдром Дауна. Причиной синдрома Эдвардса является трисомия хромосомы 18. Эта болезнь затрагивает 1 из 3 тысяч новорожденных. Примерно три четверти эмбрионов с трисомией 18 погибают еще в материнской утробе. Среди детей, которые все-таки рождаются на свет, примерно 90% умирают в течение первого же года жизни из-за сердечно-сосудистых дефектов. В утробе эмбрион растет очень медленно, приходит в наш мир с недостаточным весом, у таких детей сравнительно небольшие размеры головы, нижней челюсти и рта, а кроме того, целый спектр других мультисистемных проблем, в том числе и ярко выраженная неспособность к обучению^29.

Самое редкое из таких заболеваний — синдром Патау, или трисомия 13. Синдром затрагивает одного из 7 тысяч живых новорожденных. Родившиеся с этим заболеванием имеют серьезные аномалии развития и редко живут больше года. Болезнь поражает целый ряд органов и систем, в том числе сердце и почки. Часто встречается резко выраженное искажение формы черепа. Неспособность к обучению имеет очень острый характер^30.

Примечательно, что наличие лишней хромосомы при зачатии приводит затем к очевидным проблемам в развитии. В случае каждой из перечисленных трисомий уже с момента рождения младенца ясно, что у ребенка серьезные проблемы. (Собственно, благодаря дородовой диагностике большинство эмбрионов, пораженных этими недугами, выявляются еще во время беременности.) Это лишний раз подтверждает, что обладание нужным количеством хромосом жизненно важно для осуществления тонко скоординированного процесса развития.

Невольно задаешься вопросом, есть ли что-нибудь необычное в хромосомах 13, 18 и 21. Может быть, у них какие-то особые центромеры, вследствие чего эти хромосомы более подвержены неравному распределению при образовании яйцеклеток и сперматозоидов? А может быть, трисомии других хромосом тоже случаются, просто они не вызывают клинических эффектов, так что нам не приходит в голову отыскивать такие трисомии?

Тут мы имеем дело с удивительно распространенной научной ловушкой: мы обращаем внимание на то, что видим, а не на то, чего не видим. Мы наблюдаем младенцев с врожденной трисомией хромосом 13, 18 или 21, поскольку такие трисомии относительно безвредны (как бы дико это ни звучало). Эти три хромосомы относятся к числу самых маленьких, и каждая из них содержит сравнительно небольшое число генов. Обычно чем крупнее хромосома, тем больше в ней генов. Так что мы не наблюдаем трисомию хромосомы 1, вероятно, просто из-за ее размеров. Хромосома 1 — очень крупная, генов в ней много. Если яйцеклетка сольется со сперматозоидом, образовав зиготу с тремя копиями хромосомы 1, это приведет к сверхэкспрессии такого огромного количества генов, что функционирование клетки нарушится катастрофическим образом, и эмбрион погибнет уже на самой ранней стадии своего развития. Вероятно, это происходит еще до того, как женщина узнаёт о том, что беременна.

У женщин от 25 до 40 лет успешность оплодотворения in vitro при помощи донорских яйцеклеток не зависит от возраста^31. Однако вероятность того, что женщина забеременеет естественным путем, начинает снижаться примерно после двадцатипятилетнего возраста. Это различие позволяет предположить, что возраст матери существенно влияет на ее яйцеклетки и меньше — на матку. Мы уже знаем из исследований синдрома Дауна, что возраст матери играет роль в распределении хромосом по яйцеклеткам. Так что не будет особой натяжкой такая гипотеза: уменьшение вероятности забеременеть примерно после двадцатипятилетнего возраста отчасти может объясняться неполадками на самых ранних стадиях развития эмбриона, вызванными неправильным функционированием центромер и появлением яйцеклеток с катастрофически неправильным распределением крупных хромосом.

Глава 7. Рисование мусором

С 2011 по 2012 год в Великобритании появилось на свет 813 тысяч 200 детей^1. Используя данные о заболеваемости из предыдущей главы, можно предположить, что примерно 1200 из них родились с синдромом Дауна, около 270 — с синдромом Эдвардса и чуть меньше 120 — с синдром Патау. Это совсем небольшое число кроваток в огромных яслях, где живут больше трех четвертей миллиона детей. Трудно ожидать, что у обладателей избытка хромосом будет высокий уровень выживаемости.

Но удивительное дело — примерно половина детей, рожденных в этот период (свыше 400 тысяч младенцев), появились на свет с одной лишней хромосомой. Да-да, такая особенность отличает каждого второго из нас. Более того, эта лишняя хромосома — не какой-то крошечный генетический реликт. Это довольно-таки здоровенная хромосома. Как такое может быть? Ведь лишняя копия очень маленькой хромосомы способна вызвать тяжелейшие заболевания вроде синдромов Эдвардса или Патау?

Имя виновника — X-хромосома. Она не причиняет вреда благодаря процессу, в котором главную роль играет мусорная ДНК. Но прежде чем разобраться, как происходит такая защита, разберемся в том, что представляет собой X-хромосома.

Обычно хромосомы в клетках очень длинны и волокнисты. Их трудно отличить друг от друга. В оптическом микроскопе они выглядят как клубок спутанной шерсти. Но когда клетка готовится к делению, хромосомы отделяются друг от друга, становятся весьма структурированными и компактными. Зная правильные методики, можно выделить их из ядра, пометить специальными веществами и затем изучить каждую под микроскопом. На этой стадии хромосомы больше похожи на отдельные мотки шерсти для вышивания, а центромера напоминает бумажную трубочку, которая удерживает их на месте.

Анализируя снимки полного набора хромосом человеческой клетки, ученые сумели идентифицировать каждую отдельную хромосому. Они в буквальном смысле использовали процедуру «скопировать и вставить» для отдельных изображений хромосом, чтобы расположить их в нужном порядке. Именно так специалисты выявили причины синдромов Дауна, Эдвардса и Патау — анализировали хромосомы, взятые у больных детей.

Но перед тем, как стали ясны проблемы, лежащие в основе этих серьезных заболеваний, исследователи открыли основные принципы организации нашего генетического материала. Они показали, что нормальное количество хромосом в человеческой клетке равно 46. Исключения — яйцеклетки и сперматозоиды: в них по 23 хромосомы. Наши хромосомы собраны в пары. В каждой паре одну хромосому мы наследуем от матери, одну — от отца. Иными словами, мы получаем одну копию хромосомы 1 от матери и одну копию хромосомы 1 от отца. То же самое верно для хромосомы 2 и для всех остальных. Постойте, для всех ли?

На самом деле это верно для хромосом под номерами с 1 по 22. Их называют аутосомами. Глядя лишь на аутосомы клетки, нельзя определить, кому она принадлежит — самцу или самке. Однако это тут же становится понятно, если посмотреть на последнюю оставшуюся пару хромосом. Такие хромосомы называются половыми. У женщин две идентичные половые хромосомы крупного размера, именуемые X-хромосомами. У мужчин одна X-хромосома и одна очень маленькая хромосома, именуемая Y-хромосомой. (См. рис. 7.1.)

Рис. 7.1. Стандартные кариотипы, женский и мужской, показывают все хромосомы, имеющиеся в клетке. Вверху: женский кариотип, внизу: мужской. Единственное отличие — в последней паре хромосом. У женщин две крупные X-хромосомы. У мужчин одна крупная X-хромосома и одна маленькая Y-хромосома. (Wessex Regional Genetics Centre, Wellcome Images).

Несмотря на свои небольшие размеры, Y-хромосома оказывает огромное влияние на организм. Именно она определяет пол развивающегося эмбриона. В этой хромосоме содержится небольшое число генов, но они играют важнейшую роль в задании половой принадлежности. Собственно, половую принадлежность главным образом контролирует всего один ген[17],2: он запускает создание семенников. А это, в свою очередь, побуждает организм вырабатывать гормон тестостерон, что и приводит к маскулинизации эмбриона. Любопытно: как показало одно недавнее исследование, этого гена и еще одного гена вполне достаточно не только для создания мышей-самцов, но и для того, чтобы они вырабатывали работоспособную сперму и становились отцами мышат^3.

Напротив, X-хромосома обладает большими размерами и содержит свыше 1000 генов^4. Это может порождать проблемы. У мужских особей всего одна копия X-хромосомы, а значит, всего одна копия каждого из ее генов. Однако у самок эти цифры вдвое больше. Так что теоретически самки могли бы вырабатывать вдвое больше продуктов, кодируемых X-хромосомой, чем самцы. Трисомные заболевания, описанные в главе 6, показывают, что даже 50%-ный рост экспрессии генов одной маленькой хромосомы чрезвычайно вредит процессам развития организма. Каким же образом женский организм справляется со 100%-ным (по сравнению с мужскими особями) ростом экспрессии более 1000 генов?

У женщин есть выключатель

Дело в том, что женскому организму и не нужно с ним справляться. В клетках женщин экспрессия белков, кодируемых X-хромосомой, не отличается по своему уровню от аналогичной экспрессии в клетках мужчин. Женский организм достигает этого при помощи остроумного механизма, отключающего одну X-хромосому в каждой клетке. Этот механизм называется X-инактивацией (инактивацией X-хромосомы). Он играет важнейшую роль в человеческой жизни. Кроме того, этот процесс открыл для нас новые, совершенно неожиданные области биологии, где до сих пор ведутся активные исследования.

Вот одно из наиболее странных открытий, которые ученые совершили на этом пути. Оказывается, наши клетки умеют сами определять количество X-хромосом. В мужских клетках содержится по одной X-хромосоме и по одной Y-хромосоме, и они никогда не инактивируют свою единственную X-хромосому. Однако иногда мужские особи рождаются с двумя X-хромосомами и одной Y-хромосомой. Они все равно являются мужскими, так как за маскулинизацию отвечает Y-хромосома. Однако их клетки инактивируют лишнюю X-хромосому — точно так же, как поступают со своей второй X-хромосомой женские клетки.

С женскими особями происходит похожая история. Иногда женщины появляются на свет с тремя X-хромосомами в каждой клетке. В таком случае клетки отключают две X-хромосомы, а не одну. А если женщина рождается всего с одной X-хромосомой? Тогда клетка не отключает никаких X-хромосом.

Наши клетки умеют не только считать, но и помнить. Когда женский организм производит яйцеклетки, он обычно снабжает их лишь одной хромосомой из каждой пары. Это относится и к X-хромосомам. Мужской организм вырабатывает сперматозоиды, каждый из которых содержит либо X-, либо Y-хромосому. Когда сперматозоид, содержащий X-хромосому, сливается с яйцеклеткой, образуется одноклеточная зигота с двумя X-хромосомами, причем обе они активны. Однако на самой ранней стадии развития, всего после нескольких циклов деления, в каждой клетке эмбриона инактивируется одна из X-хромосом. Иногда это X-хромосома, унаследованная от отца, иногда — X-хромосома, унаследованная от матери. Каждая дочерняя клетка, возникающая при последующих циклах деления, отключает такую же хромосому, что и клетка материнская. А значит, среди примерно 50 триллионов клеток взрослой женщины в среднем примерно половина будет экспрессировать X-хромосому, полученную от яйцеклетки, а другая половина будет экспрессировать X-хромосому, полученную от сперматозоида.

Когда X-хромосома инактивируется, она приобретает весьма необычную физическую конформацию. ДНК при этом становится невероятно компактной. Представьте, что вы с вашим другом держитесь за противоположные концы полотенца. Вы начинаете крутить свой край по часовой стрелке, а ваш друг проделывает то же самое со своим краем. Скоро полотенце скручивается посередине, и вы сближаетесь. А теперь представьте, что полотенце у вас длиной метров пять, и вы скручиваете его, пока не образуется плотнейший комок диаметром всего один миллиметр. Примерно столь же плотно оказывается уложена и X-хромосома. Она образует плотную структуру, которую можно легко увидеть, разглядывая ядро женской клетки под микроскопом, тогда как все прочие хромосомы длинны, волокнисты и почти не видны. Такая уплотненная X-хромосома называется тельцем Барра.

Чтобы попытаться понять, как происходит инактивация X-хромосом, ученые изучали необычные линии клеток и необычные генетические линии мышей. Они сосредоточились на тех случаях, когда части X-хромосомы оказывались утрачены или же когда фрагменты X-хромосомы перескакивали на другие хромосомы. Как выяснилось, некоторые клетки, утратившие некую часть одной из своих X-хромосомы, по-прежнему сохраняли способность ее инактивировать (это показывает наличие тельца Барра). Однако клетки, утратившие другую часть X-хромосомы, оказались неспособны формировать тельца Барра, а значит, они не инактивировали хромосому.

Когда фрагменты X-хромосомы пересаживались на другие хромосомы, иногда эти аномальные хромосомы инактивировались, а иногда — нет. Все зависело от того, какой именно фрагмент X-хромосомы передавался.

Эти данные позволили ученым сузить область поиска участка X-хромосомы, играющего ключевую роль в ее инактивации. Вполне понятно, что этот участок назвали центром X-инактивации. В 1991 году одна из научных групп сообщила, что этот участок содержит в себе ген, который ученые окрестили Xist[18]. Лишь ген Xist, находящийся на неактивной хромосоме, экспрессировал Xist-РНК5,6. Вполне логично: X-инактивация — процесс асимметричный. В каждой паре эквивалентных X-хромосом одна инактивирована, а другая — нет. Поэтому представлялось закономерным, что соответствующим процессом управляет сценарий, при котором одна хромосома экспрессирует ген, а другая — нет.

Очень большой кусок мусора

Разумеется, напрашивался следующий вопрос: как работает ген Xist? Первым делом ученые попытались спрогнозировать состав и структуру белка, который кодируется этим геном. Обычно это довольно прямолинейная процедура. Узнав структуру молекулы Xist-РНК, оставалось ввести эти данные в несложную компьютерную программу, которая и должна предсказать аминокислотную последовательность, кодируемую этим геном. Xist-РНК — штука очень длинная, около 17 тысяч нуклеотидных оснований. Каждую аминокислоту кодирует группа из трех оснований, так что 17000-нуклеотидная РНК теоретически могла бы кодировать белок из более чем 5700 аминокислот. Но оказалось, что на деле самая длинная последовательность, вроде бы кодируемая Xist-РНК, содержит чуть меньше 300 аминокислот. И это несмотря на то, что Xist-РНК прошла сплайсинг (мы описывали этот процесс в главе 2), а значит, потеряла все «мешающие» мусорные последовательности.

«Проблема» заключалась в том, что эта Xist-РНК первоначально пестрела последовательностями, которые не кодируют аминокислоты, но которые действуют как стоп-сигналы, когда начинают формироваться белковые цепочки. Представьте, что вы строите высокую башню из «Лего». Она растет себе ввысь, пока вам не дают элемент крыши, в верхней части которого нет выступов или отверстий для закрепления следующего фрагмента. Когда вы поставите этот элемент, ваша башня больше не сможет увеличиваться.

Ученые задумались. Если Xist все же кодирует белок, тогда зачем же клетка с такими усилиями создает РНК длиной 17 тысяч нуклеотидных оснований[19] лишь для того, чтобы производить белок, который мог бы кодироваться РНК примерно в 20 раз меньшей длины? Генетики довольно скоро сообразили: тут происходит нечто иное и весьма странное.

ДНК находится в ядре клетки. Она копируется, образуя РНК. Затем эта РНК отправляется за пределы ядра, в те структуры, где действует как матрица для сборки белков. Но анализ показал, что Xist-РНК не покидает ядра. Она не кодирует никакой белок, даже короткий7,8.

Xist-РНК стала одним из первых примеров молекул РНК, действующих «самостоятельно», а не как носитель информации о белке. Это отличная демонстрация того, что мусорная ДНК (то есть ДНК, не приводящая к синтезу белка) отнюдь не бесполезный хлам. Она чрезвычайно важна сама по себе, поскольку без нее не может происходить X-инактивация.

Странности Xist-РНК не ограничиваются тем, что она не покидает ядра. Она даже не отделяется от X-хромосомы, которая ее вырабатывает. По сути, она прикрепляется к неактивной X-хромосоме и затем распространяется по ней. Вырабатывается все больше и больше Xist-РНК, и эта РНК постепенно покрывает неактивную X-хромосому. Этот процесс почему-то называется закрашиванием. Никто пока толком не знает физических основ этого процесса, в ходе которого Xist-РНК ползет вдоль хромосомы, подобно виноградной лозе, стремительно карабкающейся по стене со скоростью одна миля в минуту. Со времени этого открытия прошло больше 20 лет, но мы по-прежнему теряемся в догадках, как же все происходит. Мы точно знаем, что дело тут не в самой нуклеотидной последовательности X-хромосомы. Если центр X-инактивации переносится на одну из аутосом клетки, эта аутосома может инактивироваться, как если бы она была X-хромосомой^9.

Итак, Xist требуется для начала X-инактивации. Но у него есть помощники, поддерживающие этот процесс и делающие его более интенсивным. «Закрашивая» X-хромосому, Xist действует как участок, к которому могут прикрепляться белки ядра. Они соединяются с инактивируемой X-хромосомой и привлекают все новые и новые белки, что еще сильнее глушит экспрессию. Единственным геном, который не покрывается Xist-РНК и этими белками, остается сам ген Xist. Так он становится маяком экспрессии во мраке инактивированной X-хромосомы^10.

Слева направо, справа налево

Итак, мы столкнулись с ситуацией, когда кусок «мусорной» ДНК (то есть фрагмент, не кодирующий белки) играет жизненно важную роль для функционирования организмов половины человеческих существ. Недавно ученые обнаружили, что для X-инактивации требуется по меньшей мере еще один фрагмент мусорной ДНК. Тут может возникнуть путаница: он кодируется в том же самом месте X-хромосомы, что и Xist. Как мы знаем, молекула ДНК состоит из двух нитей (вспомним знаменитое изображение двойной спирали). Клеточная аппаратура, копирующая ДНК для образования РНК, всегда читает ДНК в одном направлении, то есть (назовем это так) от начала до конца определенной ДНК-последовательности. Однако две нити ДНК идут «в противоположных направлениях» друг относительно друга, словно две линии фуникулера на старинных морских курортах и горнолыжных базах. А значит, участок ДНК может нести два набора информации, просто эта информация записана «в противоположных направлениях».

Возьмите, к примеру, слово ТОРГ, которое мы получаем, читая буквы слева направо. Те же самые буквы можно прочесть справа налево. Тогда мы получим слово ГРОТ. Буквы одни и те же, но они дают другое слово с другим значением.

Фрагмент мусорной ДНК, необходимый для X-инактивации в придачу к Xist, носит остроумное название Tsix (то есть Xist, записанный задом наперед). Он находится в той же области ДНК, что и Xist, но на противоположной нити. Tsix кодирует РНК длиной 40 тысяч оснований (она более чем вдвое длиннее по сравнению с Xist-РНК). Подобно Xist-РНК, Tsix-РНК никогда не покидает ядра.

Хотя Tsix и Xist кодируются в одной и той же части X-хромосомы, они не экспрессируются вместе. Если X-хромосома экспрессирует ген Tsix, это препятствует той же самой хромосоме экспрессировать ген Xist. А значит, Tsix должен экспрессироваться активной X-хромосомой, в отличие от Xist, который всегда экспрессируется неактивной.

Эта взаимоисключающая экспрессия Tsix и Xist имеет ключевое значение на одной из стадий раннего развития организма. X-хромосома яйцеклетки утрачивает все белковые маркеры, которые показывают, что она инактивирована (если речь идет об инактивированной версии), а X-хромосома сперматозоида вообще никогда не инактивируется. После слияния яйцеклетки со сперматозоидом и 6-7 циклов деления получится эмбрион, состоящий примерно из сотни клеток. На этой стадии каждая клетка в женском эмбрионе отключает одну из своих X-хромосом случайным образом. Для этого требуется мимолетное, но интенсивное физическое взаимодействие между парой X-хромосом клетки. Всего часа на два эти хромосомы приходят в физическое соприкосновение. В результате одна из них оказывается инактивированной. Соприкосновение происходит лишь на небольшом участке X-хромосом — в центре X-инактивации, который кодирует и Xist-РНК, и Tsix-РНК^11.

Момент, длящийся вечно

Это праматерь всех мимолетных связей. В эти два часа возникают хромосомные решения, которых организм будет придерживаться всю оставшуюся жизнь. Не только в ходе развития плода, но и вплоть до самой смерти женщины, даже если эта смерть наступит через 100 с лишним лет. Эти решения затрагивают не сотню клеток, а триллионы — все клетки, которые появятся в результате их деления. Во всех дочерних клетках будет инактивироваться одна и та же X-хромосома.

Пока еще не совсем ясно, что же происходит в эти часы интимной связи X-хромосом на стадии раннего развития. Существующая ныне теория утверждает, что идет перераспределение мусорной РНК между этими двумя хромосомами, в результате чего одна из них наделяется всей Xist-РНК и становится неактивной X-хромосомой. Возможно (мы пока не знаем механизмов), одна из хромосом экспрессирует либо чуть больше, либо чуть меньше Xist или какого-то другого ключевого компонента. Но мы точно знаем, что процесс начинается, как только уровни содержания Tsix в хромосомах станут падать. Возможно, после падения этих уровней ниже какого-то критического порогового значения Xist может начать экспрессироваться одной из X-хромосом.

Обычно в экспрессии генов проявляется так называемый стохастический элемент. Иными словами, здесь частенько наблюдается случайная изменчивость уровня экспрессии. Если одна из хромосом экспрессирует чуть большее количество одного ключевого компонента (или нескольких таких компонентов), этого может оказаться достаточно для построения «самоусиливающейся» сети белков и молекул РНК. Поскольку такая неравномерность экспрессии, в сущности, стохастична (обусловлена случайным «шумом»), инактивация в данной сотне клеток тоже будет носить, по существу, случайный характер.

Вот одно сравнение. Представьте себе, что вы пришли вечером домой и вам страшно захотелось два тоста с сыром. Но как только вы начали готовить сей изысканный ужин, вам стало ясно, что сыра у вас в холодильнике недостаточно. Как вы поступите? Сделаете два тоста, каждый из которых будет содержать слишком малое количество сыра? Или уложите весь имеющийся сыр на один кусок хлеба, чтобы получить концентрированную дозу желанного молочного продукта? Вероятно, большинство предпочтет второй путь. В каком-то смысле пара X-хромосом делает то же самое, когда в эмбрионе происходит случайная инактивация. Эволюция предпочла не тот процесс, при котором у каждой из хромосом количество ключевого компонента чуть ниже критического, а тот процесс, когда этот компонент мигрирует к хромосоме, у которой его изначально чуть больше. Чем больше у вас имеется, тем больше вы получаете.

X-инактивация целиком зависит от «мусорной» ДНК, так что слово «мусорная» здесь не очень-то подходяще. Процесс играет жизненно важную роль в организме самок млекопитающих. Он необходим для нормального функционирования клеток и поддержания здорового состояния. Кроме того, он оказывает влияние на различные болезни и отклонения. Полномасштабный синдром ломкой X-хромосомы, приводящий к умственной отсталости (см. главу 1), затрагивает лишь мальчиков, поскольку соответствующий ген несет X-хромосома. У женщин, как мы знаем, две X-хромосомы. Даже если одна из них несет в себе мутацию, другая (нормальная) будет вырабатывать достаточно белка, чтобы носительница мутации смогла избежать самых опасных симптомов. Но у мужчин лишь одна X-хромосома и одна Y-хромосома, которая очень мала и не несет в себе большого количества генов, не предопределяющих пол. А значит, у мужчин нет и компенсаторного гена, способного сгладить воздействие мутации X-хромосомы при синдроме ломкой X-хромосомы.

То же самое относится к целому ряду генетических заболеваний, при которых именно X-хромосома несет в себе мутантный ген. Мальчики с большей вероятностью проявляют симптомы генетических заболеваний, связанных с X-хромосомой, чем девочки. Организм мальчика просто не может компенсировать действие неисправного гена единственной X-хромосомы. Соответствующие расстройства могут быть самыми разными, от сравнительно безобидных вроде дальтонизма (той его разновидности, при которой у человека нарушено восприятие красной и зеленой части спектра) до гораздо более серьезных недугов. В их числе — гемофилия В, нарушение в процессах свертывания крови. Носителем этого заболевания являлась, например, королева Виктория. Один из ее сыновей, Леопольд, серьезно страдал от него и умер в 31 год от кровоизлияния в мозг. Поскольку по меньшей мере две дочери Виктории также были носительницами этой болезни и поскольку королевские семейства Европы часто соединялись узами брака, эта мутация передалась и множеству других династий (самый известный пример — династия Романовых)12.

Хотя организм носительницы гемофильной мутации вырабатывает лишь 50% нормального количества фактора свертывания, этого хватает, чтобы защититься от симптомов болезни. Одна из причин — то, что фактор свертывания попадает из клеток, где он синтезируется, в кровеносную систему, где его концентрация становится достаточно высокой, чтобы защищать организм от кровотечений, в каких бы местах они ни происходили.

Впрочем, в некоторых обстоятельствах наличие у женщины двух X-хромосом еще не дает ей гарантии защиты от генетического заболевания, связанного с X-хромосомами. Синдром Ретта — разрушительное психоневрологическое заболевание, иногда представляющее собой, по сути, весьма острую форму аутизма. Новорожденные девочки с этим синдромом кажутся совершенно здоровыми, и в течение первых 6-18 месяцев жизни они благополучно проходят все этапы нормального развития. Но затем начинается деградация. Девочки утрачивают все разговорные навыки, которыми успели овладеть. У них появляются бессмысленные повторяющиеся движения рук. При этом целенаправленные движения (скажем, указание на предмет) исчезают. Остаток жизни они страдают от острой неспособности к обучению^13.

Причина синдрома Ретта — мутации одного из генов X-хромосомы, кодирующих белки[20],14. У женщин с этим синдромом одна нормальная копия этого гена и одна мутантная, не способная вырабатывать функционирующий белок. Если считать, что X-инактивация происходит случайным образом, можно ожидать, что в среднем половина клеток мозга будет экспрессировать нормальное количество нужного белка, а остальные клетки вообще не будут его экспрессировать. Клинические исследования с очевидностью показывают: если половина клеток мозга не в состоянии экспрессировать данный белок, это приведет к серьезным проблемам.

Синдром Ретта поражает в основном лишь девочек. Это необычно для X-заболеваний, поскольку в таких случаях недуг обычно поражает мальчиков, а девочки лишь являются его носителями. Можно задаться вопросом: как же мальчики защищаются от воздействий реттовской мутации? На самом деле они вовсе от него не защищаются. Мы почти никогда не обнаруживаем мальчиков с синдромом Ретта, поскольку мужские эмбрионы, пораженные этой болезнью, не развиваются как следует и попросту не доживают до родов.

Не следует недооценивать везение (и невезение)

Ученые, занимаясь своими исследованиями, размышляют о самых разных вещах, но очень редко — о роли, которую в жизни играет случай, удача, судьба. Если они и задумываются об этом, то обычно употребляют научные термины вроде «случайных флуктуаций» или «стохастических вариаций». А жаль. Иногда «везение» — образ куда более подходящий.

Мышечная дистрофия Дюшенна — серьезное заболевание, постепенно уничтожающее мускулы (см. главу 3). Мальчики с этим недугом в начале жизни чувствуют себя нормально, однако уже в детские годы их мышцы начинают характерным образом деградировать. Так, среди ножных мышц первыми тают мышцы бедер. В качестве компенсации организм развивает огромные икроножные мышцы, но спустя какое-то время увядают и они. К подростковым годам эти дети обычно пересаживаются в инвалидную коляску. Средняя продолжительность жизни у них — всего лишь 27 лет. Ранняя смертность во многом вызвана тем, что в конце концов разрушаются мышцы, задействованные в процессах дыхания^16.

Мышечную дистрофию Дюшенна вызывает мутация гена X-хромосомы, кодирующего крупный белок под названием дистрофин^16. Этот белок, похоже, действует как своего рода амортизатор для мышечных клеток. Из-за мутации мужской организм не в состоянии его вырабатывать, что в конечном счете приводит к разрушению мышцы. Организм женщин, являющихся носителями заболевания, обычно вырабатывает 50% нормального количества действующего дистрофина. Как правило, этого достаточно — благодаря одному необычному анатомическому свойству организма. По мере нашего развития индивидуальные мышечные клетки сливаются, создавая большую суперклетку с большим количеством отдельных ядер. А значит, каждая суперклетка имеет доступ к множеству копий необходимых генов, ведь ядер в ней много. Поэтому мышцы носительниц заболевания содержат (в общей сложности) достаточно дистрофина для нормальной работы. Это не та ситуация, когда в одной клетке достаточно белка, а в другой его нет вообще.

Врачи наблюдали необычный случай: у одной женщины проявлялись все классические симптомы дюшенновской мышечной дистрофии. Такие случаи чрезвычайно редки, но у нас есть способы их предсказания. Так, следует обеспокоиться, если мать женщины — лишь носительница заболевания, а отец по-настоящему от него страдал, но прожил достаточно долго, чтобы успеть зачать ребенка. В таком случае женщина явно унаследует мутантный ген от отца (поскольку у него лишь одна X-хромосома, а она поражена болезнью). Существует 50%-ная вероятность того, что та или иная яйцеклетка, которую вырабатывает организм матери-носительницы, также будет содержать мутантный ген, управляющий синтезом дистрофина. В этом случае обе X-хромосомы женщины будет обладать мутантной копией данного гена, и ее организм не сможет синтезировать необходимый белок.

Однако врачи, лечившие пациентку, изучили информацию о ее семье и выяснили, что отец женщины не страдал мышечной дистрофией Дюшенна. Потребовалось другое объяснение. Иногда при выработке яйцеклеток или сперматозоидов мутации возникают довольно-таки спонтанно. Ген, кодирующий дистрофин, очень большой, так что он (исключительно в силу размеров, то есть, по существу, довольно случайного фактора) подвергается повышенному риску мутации по сравнению с большинством других генов человеческого генома. Дело в том, что мутация — это, по сути, игра с числами. Иными словами, количественные параметры имеют здесь очень большое значение. Чем крупнее ген, тем больше вероятность того, что он претерпит мутацию. Итак, вот один из механизмов, посредством которых женщина может унаследовать мышечную дистрофию Дюшенна: если ей достается мутантная хромосома от матери-носительницы и новая мутация, которая произошла в сперматозоиде, оплодотворившем яйцеклетку.

Что ж, вообще-то это неплохая гипотеза для объяснения того, почему пациентка получила заболевание. Но тут возникла одна проблема. У пациентки имелась сестра. Сестра-близнец. Более того, идентичный близнец — однояйцевый (монозиготный), то есть выросший в результате слияния той же яйцеклетки и того же сперматозоида. И эта сестра-близнец отличалась завидным здоровьем и не демонстрировала никаких симптомов дюшенновской мышечной дистрофии. Две генетически идентичные женщины. При этом у одной есть наследственное генетическое заболевание, а у другой — нет. Как такое может быть?

Вернемся к той сотне клеток, которые подвергаются X-инактивации на ранней стадии развития эмбриона. Чисто случайным образом примерно 50% из них отключают одну X-хромосому, а остальные отключают другую. Такой же характер X-инактивации передается и всем их дочерним клеткам, до конца жизни хозяина клеток.

Сестре с дюшенновской мышечной дистрофией просто катастрофически не повезло на этой стадии развития. По чистой случайности все клетки, которые в конечном счете должны были превратиться в мышечную ткань, выключили нормальную копию X-хромосомы. Речь идет о той копии, которую женщина унаследовала от отца. А значит, в ее мышечных клетках осталась включенной лишь та X-хромосома, которую она унаследовала от матери — носительницы заболевания. Иными словами, осталась включенной мутантная X-хромосома. Поэтому мышечные клетки женщины не смогли экспрессировать дистрофин, и у нее появились симптомы, которые обычно наблюдаются лишь у мужчин.

А когда развивалась ее сестра (которая, напомним, ее генетически идентичный близнец), некоторые из клеток, которые затем станут мышечной тканью, отключали нормальную X-хромосому, а некоторые — мутантную. Поэтому мышцы сестры экспрессировали достаточно дистрофина, чтобы поддерживать себя в здоровом состоянии. Вот сестра и стала, подобно собственной матери, носительницей заболевания, не проявляющей его симптомов^17.

Неужели причина всего этого — просто флуктуация в распределении Xist-РНК, длинного фрагмента РНК, порожденного мусорной ДНК? Флуктуация длилась не больше двух часов. Она произошла в объеме пространства диаметром значительно меньше одной миллионной диаметра человеческого волоса. И тем не менее она предопределила, кто выиграет, а кто проиграет в этой лотерее, где выигрыш — здоровье.

Полосы и пятна везения

Быть может, еще удивительнее то, что некоторые из любителей кошек ежедневно наблюдают (и гладят) последствия X-инактивации. У черепаховых или трехцветных пятнистых кошек (по разные стороны Атлантики их называют по-разному) ярко выраженный узор из черных и рыжих пятен. Ген, контролирующий такую раскраску, может существовать в двух формах. Отдельная X-хромосома несет в себе либо рыжую, либо черную версию.

Если инактивируется X-хромосома, несущая черный цвет, то экспрессируется рыжая версия на другой хромосоме — и наоборот. Когда размер кошачьего эмбриона составляет примерно сотню клеток, в каждой клетке инактивируется одна или другая X-хромосома. Как и в других подобных случаях, все соответствующие дочерние клетки будут отключать ту же самую X-хромосому. В итоге некоторые из дочерних клеток породят клетки, которые создают пигмент шерсти. Все больше и больше таких клеток делятся и развиваются, но они остаются поблизости друг от друга. Таким образом, подобные дочерние клетки склонны держаться вместе — в кластерах (или, если угодно, пятнах). Благодаря определенной картине X-инактивации дочерних клеток будут возникать пятна рыжего меха и пятна черного меха. Этот процесс показан на рис. 7.2.

Рис. 7.2. Схема показывает, как появляются пятна рыжего или черного меха у черепаховых кошек (женского пола) в зависимости от инактивации X-хромосом, происходящей случайным образом. Гены, отвечающие за окраску шерсти, находятся в X-хромосоме. Если черная версия гена располагается в хромосоме, инактивируемой на ранней стадии развития эмбриона, все потомки этой клетки будут экспрессировать лишь рыжую версию гена. Обратная ситуация возникает, если инактивируется X-хромосома, несущая ген рыжести.

В 2002 году ученые весьма впечатляюще продемонстрировали, насколько случайным является процесс X-инактивации. Они клонировали трехцветную кошку. Взяв клетки взрослой кошки, они выполнили стандартную (но все равно ужасно сложную и хитроумную) процедуру клонирования. Для этого они взяли ядро из клетки взрослой кошки и поместили его в кошачью яйцеклетку, из которой предварительно удалили ее собственные хромосомы. Затем эту яйцеклетку подсадили кошке, игравшей роль суррогатной матери. Вскоре у этой кошки родился красивый и энергичный котенок женского пола. И что бы вы думали? Юная кошечка вовсе не оказалась генетически тождественной той, которую клонировали^18.

Когда такую процедуру осуществляют для клонирования животных, яйцеклетка обращается с новым ядром так, как если бы оно являлось естественным продуктом слияния какой-то яйцеклетки с каким-то сперматозоидом, очутившимся в ней обычным путем. Она извлекает из ДНК столько информации, сколько возможно, тем самым снова обретая базовую генетическую последовательность. Это происходит не так эффективно, как с обычной яйцеклеткой и сперматозоидом, в чем и состоит одна из причин, по которым доля успешных клонирований такого типа пока еще очень низка. Но иногда (как в данном случае) процесс идет как планировалось, и на свет все-таки появляется клонированное животное.

Когда ядро кошки-матери поместили внутрь яйцеклетки другой кошки, эта яйцеклетка внесла свои изменения в полученные таким путем хромосомы. В частности, удалила инактивирующие белки одной из X-хромосом и отключила экспрессию Xist. Так что в течение краткого периода на ранней стадии развития обе копии X-хромосомы являлись активными. Эмбрион развивался дальше. На стадии, когда он состоял примерно из сотни клеток, он подвергся обычному процессу случайной инактивации X-хромосомы в каждой клетке. Характер инактивации X-хромосом стандартным путем передавался дочерним клеткам. Поэтому юная кошка стала обладать иным узором рыжих и черных пятен по сравнению со своей клональной «матерью».

Какова мораль этой истории? Если у вас есть трехцветная кошка, которую вы считаете необычайно красивой, не скупитесь на фотографии и видео. После ее смерти можете даже вызвать таксидермиста, чтобы он сделал чучело. Но если к вам постучится странствующий клонировщик, гоните его прочь. Он не поможет вам увековечить уникальное животное.

Глава 8. Длинная игра

Не один год Xist-РНК считалась аномалией, странным молекулярным «выбросом», оказывающим чрезвычайно необычное влияние на экспрессию генов. Даже когда открыли Tsix, все равно многие считали возможным полагать, будто мусорные РНК участвуют лишь в жизненно необходимом, но уникальном процессе X-инактивации. Только в последние годы ученые начали осознавать, что человеческий геном экспрессирует тысячи молекул такого типа, и что они играют неожиданно важную роль в нормальном функционировании клеток.

Сегодня мы относим Xist- и Tsix-РНК к обширному классу длинных некодирующих РНК. Этот термин не очень точен: конечно же, имеются в виду РНК, которые не кодируют белки. Как мы увидим, длинные некодирующие РНК преспокойно кодируют другие функциональные молекулы. И эти функциональные молекулы сами представляют собой длинные некодирующие РНК.

Длинные некодирующие РНК определяются как молекулы, длина которых превышает 200 нуклеотидных оснований (цифра взята довольно-таки произвольно) и которые не кодируют белки, что отличает их от информационной РНК. Двести оснований — нижний предел размера. Самые крупные из таких некодирующих РНК могут насчитывать по сотне тысяч оснований. Подобных РНК множество, хотя ученые расходятся во мнении относительно их общего числа. По различным оценкам, в геноме человека их содержится от 10 тысяч до 32 тысяч1,2,3,4. Но хотя длинных некодирующих РНК существует много, уровень их экспрессии обычно не так высок, как у классических информационных РНК, кодирующих белки — как правило, менее 10% от уровня экспрессии средней информационной РНК^5.

Такая сравнительно низкая экспрессия любой из длинных некодирующих РНК — одна из причин, по которым на них до недавних пор не обращали особого внимания. В сущности, при анализе экспрессии молекул клеточной РНК длинные некодирующие РНК раньше просто не удавалось надежно детектировать, поскольку методы анализа не отличались достаточной чувствительностью. Но теперь ученые знают о существовании таких РНК, а следовательно, могли бы полагать, что сумеют полностью проанализировать геном любого организма (в том числе и человеческого) и предсказать существование таких РНК, просто исходя из вида ДНК-последовательности. В конце концов, генетики отлично научились делать такие предсказания для генов, кодирующих белки.

Однако для длинных некодирующих РНК это не так-то просто по целому ряду причин. Известно, как идентифицировать предполагаемые гены, кодирующие белки, поскольку такие гены обладают некоторыми удобными свойствами. Возле начала и конца таких генов есть определенные последовательности, которые помогают нам их искать. Кроме того, они кодируют предсказанные нами аминокислотные звенья, что еще больше укрепляет нас в уверенности: мы имеем дело с геном, кодирующим белок. Наконец, большинство генов, кодирующих белки, окажутся похожими, если рассматривать определенный ген у разных видов. А значит, выявив «классический» ген у животного вроде иглобрюха, легко будет в дальнейшем использовать найденную последовательность как основу для анализа человеческого генома с целью выяснения, имеется ли похожий ген у нас самих.

Но длинные некодирующие РНК не имеют таких ярко выраженных нуклеотидных индикаторов (в отличие от генов, кодирующих белки). Кроме того, у разных видов они сильно отличаются. Таким образом, знание нуклеотидной последовательности длинной некодирующей РНК какого-то другого вида едва ли поможет нам идентифицировать функционально схожую с ней последовательность в геноме человека. Менее 6% из представителей одного специфического класса длинных некодирующих РНК рыбы данио-рерио, популярного модельного животного, явно имеют аналогичные последовательности у мышей и человека^6. Лишь примерно 12% представителей того же класса длинных некодирующих РНК, обнаруживаемых у человека и мышей, можно найти у каких-то других животных7,8. Такое сравнительно слабое сохранение длинных некодирующих РНК в разных видах подтвердилось в ходе недавнего исследования, где сравнивалась экспрессия длинных некодирующих РНК из различных тканей разных видов четвероногих. Четвероногие (тетраподы) — все сухопутные позвоночные, в том числе и те, что «вернулись в море» (скажем, киты или дельфины). Исследователи сообщают, что 11 тысяч длинных некодирующих РНК обнаруживаются лишь у приматов. Лишь 2500 таких РНК являются общими для всех тетрапод, и только 400 из них можно отнести к древним, то есть (по определению авторов исследования) к таким, которые возникли свыше 300 миллионов лет назад, примерно в ту эпоху, когда разошлись эволюционные пути амфибий и других тетрапод. Авторы полагают, что эти древние длинные некодирующие РНК — как раз те, которые во всех организмах регулируются наиболее активно, и что они, вероятно, играют роль главным образом на ранних стадиях развития организма^9. На самых ранних стадиях эмбриогенеза большинство позвоночных выглядят очень похоже. Так что логично предположить: в самом начале нашей жизни мы и все наши близкие и дальние эволюционные родичи используем схожие пути и механизмы развития.

Несходство длинных некодирующих РНК у разных видов (наблюдающееся почти повсеместно) заставило некоторых авторов счесть, что такие РНК вообще не играют важной роли. Ведь если бы они имели большое значение, то меньше бы менялись в ходе эволюции и развития видов. На самом же деле последовательности, которые содержат код для этих «мусорных» РНК, эволюционируют гораздо стремительнее, чем последовательности, кодирующие белки.

Что ж, логично. Однако здесь все-таки есть чрезмерное упрощение. Возможно, длинные некодирующие РНК и длинны по количеству содержащихся в них нуклеотидных оснований, но это не обязательно значит, что они представляют собой какие-то вытянутые волокна, плавающие в клетке. Дело в том, что длинные молекулы РНК способны складываться, образуя трехмерные структуры. Нуклеотидные основания РНК образуют пары, почти по тем же правилам, которым следуют две соединяющиеся нити ДНК. Но РНК — молекула однонитевая, поэтому ее нуклеотидные основания спариваются лишь на сравнительно коротких отрезках. В итоге молекула изгибается, принимая сложные, но стабильные формы. Эти трехмерные структуры могут играть очень важную роль в функционировании длинной некодирующей РНК. Вполне возможно, что сама такая трехмерная структура во многом схожа у разных видов, даже если ее нуклеотидная последовательность у них сильно отличается^10. Это показано на рис. 8.1. К сожалению, трудно строить предсказания насчет схожести таких структур, основываясь на данных о нуклеотидной последовательности. Но такая методика все же полезна для нахождения функционально устойчивых длинных некодирующих РНК.

Рис. 8.1. Схема показывает, как две однонитевые молекулы длинной некодирующей РНК с различными нуклеотидными последовательностями могут образовывать структуру одной и той же формы. Структура определяется правилами образования пар. Нуклеотид А связывается только с У, а нуклеотид Ц — только с Г (они показаны квадратиками с различной окраской или узором). Перед вами упрощенная схема. На самом деле длинные некодирующие РНК могут обладать множеством участков, способных формировать сложные структуры. Кроме того, эти структуры трехмерны (здесь они для простоты изображены как плоские).

Бревна или щепки?

Из-за трудностей, которые возникают при выявлении длинных некодирующих РНК в нуклеотидной последовательности человеческого генома, большинство исследователей сейчас склоняются к более прагматичному подходу их идентификации — детектируют сами эти молекулы непосредственно в клетках. Однако в научном сообществе нет единого мнения насчет интерпретации результатов таких изысканий. Ярые сторонники мусорных последовательностей могли бы заявить: если какая-то последовательность экспрессируется как длинная некодирующая молекула РНК, эта молекула экспрессируется так по какой-то причине. Другие ученые настроены более скептически. Они утверждают, что такая экспрессия длинных некодирующих РНК — просто «сопутствующее событие». Иными словами, они считают, что экспрессия длинных некодирующих РНК — просто своего рода побочный эффект, возникающий при включении «настоящего» гена.

Что же имеется в виду под «сопутствующим событием»? Допустим, мы отпиливаем сучья бензопилой. Основная цель нашей деятельности — получить бревна, чтобы построить дом или приготовить дрова для печки. Мы не стараемся получить щепки или опилки, но они все равно возникают в результате работы бензопилы. Незачем тратить силы, пытаясь избежать щепок. Они, в общем-то, не мешают выполнению нашей основной задачи. А если мы все-таки найдем способ от них избавиться, это может снизить эффективность производства бревен. А кроме того, ведь мы можем случайно натолкнуться на метод использования щепок и опилок (побочного продукта нашего производства). К примеру, для мульчирования почвы в цветочном горшке или при устройстве логова для ручной змеи.

Вот и «мусорные скептики» заявляют: экспрессия длинных некодирующих РНК попросту означает, что при экспрессии генов, происходящей на каком-то участке, уменьшается подавление экспрессии другого генетического материала. В рамках этой модели производство длинных некодирующих РНК — всего лишь неизбежное следствие важного процесса. Неизбежное, но, в общем-то, несущественное и безвредное. Между тем «мусорные энтузиасты» возражают: такая модель не объясняет некоторых особенностей экспрессии длинной некодирующей РНК. Например, различные типы таких РНК экспрессируются при анализе образцов тканей различных областей мозга^11. Сторонники важной роли длинных некодирующих РНК заявляют: это свидетельствует о существенном значении таких молекул, иначе зачем бы разным зонам мозга включать разные длинные некодирующие РНК? Скептики возражают: различные длинные некодирующие РНК обнаруживаются лишь из-за того, что разные области мозга включают разные «классические» гены, кодирующие белки. Иными словами, опилки при разделывании дуба и сосны получаются разные, ничего удивительного.

Пока еще рано делать выводы. Получаемые сегодня данные позволяют дать один совет сторонникам двух этих крайних точек зрения: «Вам не мешало бы немного отдохнуть от споров». Скорее всего, истина где-то посередине. Существует только один по-настоящему надежный способ проверить гипотезу, согласно которой длинные некодирующие РНК выполняют какие-то функции в клетке. Этот способ состоит в том, чтобы проверить каждую из таких РНК в подходящем типе клеток. Подход представляется весьма разумным. Впрочем, он не столь прямолинеен, как может показаться. Отчасти причина этого кроется просто-напросто в цифрах. Если мы возьмемся детектировать сотни или даже тысячи различных длинных некодирующих РНК в клетке или в ткани, придется волей-неволей принимать решения, что же именно анализировать. Но для этого нужно предварительно иметь гипотезу насчет того, что эта конкретная длинная некодирующая РНК делает в клетке. Без такой гипотезы мы не будем знать, какие эффекты нам искать.

Есть и еще одна трудность. Многие из этих длинных некодирующих РНК находятся в той же области, что и «классические» гены, кодирующие белки. Иногда они могут находиться в той же самой позиции, просто на противоположной нити, как мы видели на примерю Xist и Tsix (см. главу 7). Другие такие РНК могут находиться на «мусорных» участках, лежащих между двумя областями одного и того же гена, кодирующими аминокислоты. (Впервые мы встретились с таким явлением, обсуждая атаксию Фридрейха в главе 2.) Существует масса способов расположения длинных некодирующих РНК. Это вызывает существенные экспериментальные затруднения при попытке исследовать функции нуклеотидных последовательностей.

Обычно функции генов проверяются при помощи их целенаправленного мутирования. Можно применять самые разные мутации, но чаще всего используются такие, которые либо выключают изучаемый ген, либо приводят к тому, что уровень его экспрессии начинает превышать норму. Но поскольку такое большое количество длинных некодирующих РНК пространственно перекрываются с генами, кодирующими белки, трудно внести мутацию в одно, не внося при этом мутацию в другое. А значит, перед нами встает очередная проблема: как определить, чем обусловлены наблюдаемые эффекты — изменением в длинной некодирующей РНК или изменением в гене, кодирующем белок?

Вот довольно легкомысленная аналогия. Один аспирант изучал слух лягушек. Он смастерил экспериментальную систему, которая позволяла ему определять, слышит ли лягушка (у которой он хирургическим путем кое-что удалил) громкий звук, в данном случае — пистолетный выстрел. Однажды он прибежал к своей научной руководительнице, радостно крича, что выяснил, как слышат лягушки. «Они слышат лапками!» — объявил он наставнице, которая восприняла эту новость с веселым удивлением. Когда она осведомилась, почему он так в этом уверен, молодой ученый ответил: «Всё просто. Обычно если я стреляю, лягушка слышит этот звук и подпрыгивает от испуга. Но когда я удалил ей лапки, они перестала подпрыгивать, когда я делаю выстрел. А значит, она слышит лапками[21].

Разумеется, теоретически вполне возможно, что некоторые неожиданные эффекты, иногда наблюдаемые при внесении мутаций в гены, кодирующие белки, обусловлены не выявленными нами изменениями в расположенных близ этих генов длинных некодирующих РНК, о присутствии которых мы даже не подозревали, когда проводили эксперимент.

Из-за такого потенциального взаимовлияния длинных некодирующих РНК и генов, кодирующих белки, многие ученые решили сосредоточить усилия на наборе длинных некодирующих РНК, которые не располагаются в этих областях. Выбор здесь велик: в такую категорию попадает как минимум 3500 длинных некодирующих РНК. Многие авторы склонны относить эти «более отдаленные от генов» длинные некодирующие РНК к отдельному классу. Они получили свое наименование[22],12. Впрочем, стоит иметь в виду, что при этом мы классифицируем такие молекулы по тому, что они не делают: они не располагаются в областях, где сидят гены, кодирующие белки. Вероятно, тем самым мы сгребаем большое количество длинных некодирующих РНК в один класс, хотя многие его представители могут сильно отличаться друг от друга по функциям.

Стремление поспешно создавать категории и классификации — давняя проблема в геномном анализе. Ученые ограничивают себя рамками определений, не обретя достаточного понимания биологических процессов. Представьте, что вы никогда в жизни не смотрели кино. И вдруг в течение недели вы увидели «Цилиндр», «Поющих под дождем», «Хорошего, плохого, злого», «Ровно в полдень», «Звуки музыки», «Великолепную семерку», «Кабаре», «Железную хватку», «Непрощенного» и «Вестсайдскую историю». Если вас попросят разбить эти фильмы на категории, вы можете сказать, что они относятся к двум жанрам — мюзиклам и вестернам. Отлично. Но что произойдет на следующей неделе, когда вы познакомитесь с «Дневником Бриджит Джонс» и «Гравитацией»? Или с такими картинами, как «Золото Калифорнии», «Семь невест для семерых братьев» или «Джейн-Катастрофа» — фильмами, где есть и песни с танцами, и ковбои? Вы не сумеете втиснуть эти картины в жанровые определения, которые сами же поспешили создать, еще толком не изучив кинематографического ландшафта. По той же причине не следует создавать чересчур большого количества отдельных классов длинных некодирующих РНК. Лучше сосредоточиться на реальных экспериментальных данных и на том, что они позволяют выяснить.

Хорошее начало жизни — половина дела

Необходимо в течение всей жизни должным образом контролировать экспрессию генов. Такой контроль имеет принципиально важное значение на самых ранних стадиях развития, поскольку малейшее отклонение от нормального течения событий в ходе первых клеточных делений может приводить к серьезнейшим последствиям. Особенно это важно для зиготы — клетки, которая образуется при слиянии яйцеклетки со сперматозоидом. Зиготу и первые клетки, возникающие в результате ее деления, называют тотипотентными клетками. Они способны создавать все клетки эмбриона и плаценты. Исследователи и рады бы работать с этими клетками, но таких клеток слишком мало. Большинство работ выполняется с эмбриональными стволовыми клетками (ЭС-клетками). Много лет назад они произошли от реальных эмбрионов. Но нам больше не нужны эмбрионы, чтобы получать такие клетки: их можно культивировать в лаборатории. ЭС-клетки образуются на чуть более поздней стадии развития эмбриона и уже не обладают такими неограниченными возможностями, как зигота. Их называют плюрипотентными: они обладают потенциалом, позволяющим формировать клетки любого типа, кроме плацентарных.

В правильно подобранных и тщательно контролируемых лабораторных условиях ЭС-клетки делятся, создавая новые плюрипотентные стволовые клетки. Однако сравнительно небольшие изменения условий в культуре приводят к потере этой плюрипотентности. И тогда ЭС-клетки начинают дифференцироваться на более специализированные клеточные типы. Одно из самых резких и заметных изменений происходит, когда ЭС-клетки в процессе дифференциации превращаются в сердечные и вдруг начинают синхронно сокращаться в чашке Петри. Обычно ЭС-клетки могут идти по различным путям развития в зависимости от того, как с ними обращаются.

Ученые манипулировали такими искусственно культивируемыми ЭС-клетками, намеренно прекращая экспрессию примерно 150 из длинных некодирующих РНК, которые расположены вдалеке от каких бы то ни было известных нам генов, кодирующих белки. В ходе каждого эксперимента подавляли экспрессию всего одной длинной некодирующей РНК. Обнаружилось, что в десятках случаев достаточно выключить всего одну длинную некодирующую РНК. чтобы ЭС-клетки утратили плюрипотентность и дифференцировались, давая клетки иных типов. Экспериментаторы проанализировали, какие гены экспрессируются до и после такого подавления длинных некодирующих РНК. Выяснилось, что свыше 90% этих РНК прямо или косвенно контролируют экспрессию генов, кодирующих белки. Во многих случаях отключение одной длинной некодирующей РНК влияло на экспрессию сотен генов, кодирующих белки. Причем почти всегда речь шла о генах, расположенных вдали от подавляемой РНК, а не вблизи.

Те же исследователи провели и обратный эксперимент. Они подвергли ЭС-клетки воздействию вещества, которое (как было известно заранее) вызывает дифференциацию. Затем проанализировали экспрессию в интересующем их классе длинных некодирующих РНК. Выяснилось, что экспрессия примерно 75% этих РНК падала по мере того, как клетки утрачивали плюрипотентность и проявляли готовность к дифференциации. Эти два набора данных вполне согласуются с гипотезой, в которой утверждается, что уровни экспрессии определенных длинных некодирующих РНК действуют как «сторожа», поддерживающие ЭС-клетки в плюрипотентном состоянии^13. Похоже, эти некодирующие РНК все-таки выполняют в клетке какую-то функцию — по крайней мере, на ранних стадиях развития организма.

Некоторые длинные некодирующие РНК могут оказывать влияние и на более поздние стадии развития. Мы уже встречались с Hox-генами в главе 4 — они играют важную роль при формировании частей тела. Именно мутация этих генов у дрозофил может приводить к необычным последствиям: скажем, на головке мушки вырастают лапки. Hox-гены располагаются в геноме кластерами. Эти области необычайно богаты длинными некодирующими РНК, однако в них мало древних вирусных повторяющихся последовательностей. Ученым очень хотелось выяснить, влияют ли длинные некодирующие РНК на деятельность Hox-генов, расположенных на том же участке генома. Для этого исследователи применили методику, уменьшающую экспрессию определенной длинной некодирующей РНК в области расположения Hox-генов у зародышей цыплят. Уменьшение экспрессии этой РНК привело к тому, что развитие конечностей у зародышей пошло не так, как полагается. Кости ближе к концам конечностей оказались аномально короткими^14. Похожий результат: подавление экспрессии другой длинной некодирующей РНК в аналогичном геномном регионе мышей привело к неправильному формированию костей позвоночника и запястий^15. Эти результаты говорят о том, что длинные некодирующие РНК играют важную роль как регуляторы экспрессии Hox-генов, а следовательно, и как регуляторы развития конечностей.

Длинные РНК и рак

Онкологические процессы можно считать в каком-то смысле оборотной стороной процессов развития. Одна из проблем при раковых заболеваниях — в том, что зрелые клетки могут меняться, вновь обретая некоторые характеристики менее специализированных клеток, и их способность к неуправляемому делению возрастает. Если вспомнить, какую важную роль играют длинные некодирующие РНК в плюрипотентности и развитии организма, мы вряд ли удивимся, узнав, что некоторые из них теперь связывают с онкологическими процессами.

В рамках одного из масштабных исследований анализировалась экспрессия длинных некодирующих РНК в более чем 1300 отдельных злокачественных опухолях четырех типов рака (простаты, яичников, разновидности опухоли мозга (глиобластомы) и особой формы рака легких). У пациентов, умиравших от этих болезней, обнаружили примерно сотню длинных некодирующих РНК с высокими уровнями экспрессии. Девять из этих РНК демонстрировали связь с онкологическими заболеваниями вне зависимости от того, какой тип рака исследовался. А значит, они могли бы, вероятно, служить более общими индикаторами, позволяющими предсказывать шансы пациента выжить^16.

Для трех из этих типов рака (рак простаты оказался исключением) в ходе того же исследования обнаружилось, что можно выявить длинные некодирующие РНК, отличающие один подкласс опухолей от другого. К примеру, у рака яичников существует целый ряд разновидностей, выделяемых в зависимости от того, какие типы клеток затрагивает болезнь. Это влияет как на «историю» развития опухоли у пациента, так и на прогнозы, которые делают врачи, и на выбор методик лечения. Возможно, в будущем анализ экспрессии определенных длинных некодирующих РНК в пробах биоматериала, взятого из опухолей, поможет медикам выбирать оптимальную стратегию лечения каждого отдельного пациента.

Количество работ, где сообщается о связи между экспрессией длинных некодирующих РНК и раком, постоянно растет. Генетические исследования онкозаболеваний также приводят к интригующим результатам. Причина некоторых их разновидностей — единичная, но очень сильная мутация, наследуемая в пределах одной семьи. Возможно, наиболее известный пример здесь — мутантный ген BRCA1, чрезвычайно увеличивающий риск развития агрессивной формы рака груди у женщин. Именно знание о том, что у нее есть мутация данного гена, побудило актрису Анджелину Джоли пойти на двойную мастэктомию в 2013 году. Такие сильные мутации отдельного гена довольно редки при раковых процессах, но ряд исследований показал, что целый ряд онкологических заболеваний несет в себе генетический компонент. Проблема в том, что когда ученые стали выяснять, где именно возникают генетические вариации, связываемые с повышенным риском рака, обнаружилось, что такие изменения часто происходят к областях генома, где нет генов, кодирующих белки. Среди более чем 300 изученных вариаций такого типа, связываемых с онкологическими процессами, лишь 3,3% меняли аминокислотный состав белка, зато свыше 40% располагались в зонах между обычными, «классическими» генами, кодирующими белки. Возможно, такие вариации влияли не на гены, кодирующие белки, а на длинные некодирующие РНК. Недавние исследования подтвердили это предположение для некоторых из таких вариаций по меньшей мере в случае двух разновидностей рака (папиллярного рака щитовидной железы и рака простаты)17.

Последние результаты исследований свидетельствуют о том, что в некоторых случаях длинные некодирующие РНК не просто как-то связаны с онкологическими процессами, а сами реально меняют поведение раковых клеток. И это вселяет в наши души некоторый оптимизм.

Так, существует длинная некодирующая РНК, чья экспрессия повышается при раке простаты. Эта сверхэкспрессия вызывает понижение экспрессии важнейших белков, которые обычно удерживают клетку от слишком быстрого размножения18,19. А значит, сверхэкспрессия этой длинной некодирующей РНК производит такое же действие, какое произвели бы мы, сняв с ручного тормоза автомобиль, припаркованный на склоне холма. Длинная некодирующая РНК, вызывающая деформации скелета, если ее отключают у развивающихся мышей, претерпевает сверхэкспрессию при многих разновидностях рака, в том числе при раке печени^20, колоректальной области^21, поджелудочной железы^22, груди^23. Выявив ее сверхэкспрессию, медики дают пациентам неблагоприятный прогноз. Исследования раковых клеток, культивируемых в лабораторных условиях, позволяют предположить, что эта длинная некодирующая РНК, возможно, увеличивает риск метастаз — миграции больных клеток в другие области организма.

Едва ли не самые убедительные свидетельства активной роли длинных некодирующих РНК в онкологических процессах удается получить при изучении рака простаты. Вначале рост новообразований зависит от уровня мужского гормона тестостерона. Тестостерон связывается со специфическим рецептором, что приводит к активированию различных генов, способствующих размножению клетки. Такое связывание тестостерона напоминает нажатие на педаль газа. На первой стадии рак простаты лечат при помощи препаратов, останавливающих связывание гормона с его рецептором, как если бы между вашей ногой и акселератором вставили какой-то предмет, мешающий нажимать на газ.

Но со временем раковая клетка находит способ обойти это препятствие. Рецептор гормона ухитряется активировать гены вне зависимости от того, присутствуют ли поблизости молекулы тестостерона. Это как если бы кто-то водрузил мешок сахара на педаль газа. Педаль останется в нажатом состоянии и будет ускорять вашу машину, даже если вы задерете обе ноги на приборную панель. Ученые показали, что основную роль в этом онкологическом процессе играют две длинные некодирующие РНК, которые проявляют сильную сверхэкспрессию при агрессивной форме рака простаты. Эти РНК способствуют воздействию рецептора, усиливая генетическую экспрессию, даже когда рядом нет гормона, и ускоряя размножение клеток. Иными словами, такие РНК играют роль мешка сахара на педали газа. Если же в модельных системах, с помощью которых изучают рак, подавить экспрессию этих особых длинных некодирующих РНК, рост опухолей резко замедляется. Вот еще одно подтверждение важнейшей роли, которую играют данные молекулы^24.

На рак простаты оказывает влияние еще одна длинная некодирующая РНК. Чем выше ее содержание, тем агрессивнее онкологический процесс, короче период рецессии после курса лечения и выше риск летального исхода. Подавление этой длинной некодирующей РНК оказывает при изучении онкологических моделей эффект, подобный описанному выше. Однако, по-видимому, в данном случае происходящие процессы не имеют прямого отношения к взаимодействиям с тестостероновым рецептором^25. По-видимому, длинные некодирующие РНК могут самыми разными путями влиять на развитие рака, даже в опухоли одного типа.

Длинные РНК и мозг

Выяснением функций этих молекул интересуются не только онкологи. В мозгу экспрессируется больше длинных некодирующих РНК, чем в какой-либо другой ткани или органе (возможное исключение — семенники)26. Некоторые такие РНК даже остались неизменными при эволюционном переходе от птиц к человеку: их экспрессия проявляется точно так же, в тех же областях и на тех же стадиях развития. Возможно, они сохранили и свои функции (вероятно, влияющие на нормальное развитие мозга). Однако многие из длинных некодирующих РНК, экспрессируемых в мозгу, специфичны для человека или приматов в целом. Ученые задумались: может быть, такие РНК отвечают (хотя бы отчасти) за чрезвычайно сложные когнитивные и поведенческие функции, отличающие высших приматов? 27

Удалось выявить длинную некодирующую РНК, которая влияет на то, каким образом клетки мозга образуют связи друг с другом^28. Еще одна длинная некодирующая РНК, возникшая при нашем эволюционном отделении от крупных человекообразных обезьян, может участвовать в регуляции гена, необходимого для уникальных процессов развития, формирующих кору головного мозга человека^29.

Эти примеры, помимо всего прочего, позволяют сделать предположение, что длинные некодирующие РНК играют в мозгу положительную роль. Впрочем, они могут способствовать и развитию патологий. Болезнь Альцгеймера — губительное слабоумие, которое обычно связывают с процессами старения. Поскольку средняя продолжительность жизни человека увеличивается, болезнь Альцгеймера становится все более распространенным недугом. По данным Всемирной организации здравоохранения, более 35 миллионов человек по всему миру страдают старческим слабоумием, и этот показатель может удвоиться к 2030 году^30. Пока нет препарата, который излечивал бы эту страшную болезнь. Существующие лекарства лишь замедляют ее развитие. Эмоциональные и экономические потери от нее колоссальны, но разработка новых методик лечения идет чудовищно медленно. Отчасти это вызвано тем, что пока еще не понятно, какие именно нарушения происходят в клетках страдающих болезнью Альцгеймера.

По меньшей мере одна важная стадия этого процесса — выработка нерастворимых бляшек в мозгу (их можно обнаружить при аутопсии). Эти бляшки состоят из неправильно сложенных белков. Главный среди них — бета-амилоид. Он синтезируется, когда фермент BACE1 разрезает более крупный белок. Одна из длинных некодирующих РНК вырабатывается на том же участке генетической последовательности, что и BACE1, только на противоположной нити ДНК (вспомним Xist и Tsix).

Эта длинная некодирующая РНК и стандартная информационная РНК фермента BACE1 связываются друг с другом, что делает BACE1-РНК более стабильной, и она остается в клетке дольше. А потому клетка может синтезировать больше копий белка BACE1. Это приводит к росту производства бета-амилоида, важнейшего игрока в процессе формирования бляшек^31.

Похоже, что уровень содержания этой длинной некодирующей РНК повышается в мозгу пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Впрочем, эти данные трудно интерпретировать. Возможно, такое повышение — всего лишь следствие общей повышенной экспрессии в этой области. Вспомните аналогию, которую мы приводили выше: чем больше бревен вы пилите, тем больше опилок получается. Ученые нашли способ уменьшить экспрессию лишь этой длинной некодирующей РНК у модельных мышей, часто проявлявших альцгеймеровскую патологию. И подавление этой длинной некодирующей РНК привело к уменьшению содержания белка ВАСЕ1 и содержания бета-амилоидных бляшек! Вот вам подтверждение идеи, согласно которой эта длинная некодирующая РНК — одна из причин этой губительной болезни^32.

Длинные некодирующие РНК могут влиять не только на центральную нервную систему. Нейропатическая боль — состояние, при котором пациент испытывает неприятные, болезненные ощущения даже при отсутствии физических раздражителей. Ее причиной служит аномальная электрическая активность нервов, по которым сигналы от периферии тела передаются в центральную нервную систему (в головной и спинной мозг). Это заболевание бывает очень мучительным, причем обычные болеутоляющие вроде аспирина или парацетамола почти не помогают. Зачастую неясно, почему нервы ведут себя столь аномальным образом. Авторы одного из недавних исследований предполагают: в некоторых случаях причиной может стать рост содержания длинной некодирующей РНК, способной изменять уровни экспрессии в одном из таких электрических каналов. Она связывает молекулу информационной РНК, кодирующую данный канал, тем самым меняя ее стабильность, а, значит, и количество вырабатываемого белка^33.

Сейчас выявляются все новые и новые типы заболеваний, одной из причин которых (как заявляют исследователи) служат длинные некодирующие РНК^34. Однако по-прежнему ведутся споры о том, насколько важную роль играют эти длинные некодирующие РНК и насколько активно они функционируют. Могут ли они играть такую же существенную роль в организме, как белки? Вероятно, на индивидуальном уровне ответ будет, как правило, отрицательным, если только мы не имеем дело с такой явно жизненно важной молекулой, как Xist. Но, возможно, не имеет особого смысла рассматривать влияние отдельных длинных некодирующих РНК.

Недавно ученые мимоходом выдвинули такую гипотезу: «Существует немалая вероятность, что многие из этих длинных транскриптов в лучшем случае лишь слегка корректируют процессы управления геномом, подталкивая или искажая их, но при этом не являясь непосредственными выключателями процессов»35. Однако сложность и гибкость описываемых механизмов зависит главным образом, метафорически говоря, не от черно-белой картины, не от включения/выключения динамиков, а от тонких градаций громкости звука, от оттенков серого. Возможно, с биологической точки зрения мы очень многим обязаны этим подталкиваниям и искажениям.

Глава 9. Раскрашивая темную материю

В биологии за вопросом «Что делает какой-то объект?» почти всегда следует другой: «Как он это делает?». Мы знаем, что такое длинные некодирующие РНК, и мы знаем по меньшей мере кое-какие их функции: эти РНК регулируют экспрессию генов. Отсюда вытекает логичный вопрос: каким образом они это проделывают?

Не ждите одного общего ответа. Человеческий геном производит многие тысячи длинных некодирующих РНК. Вряд ли все они действуют одинаково. Однако мы уже начали выявлять здесь некоторые единые темы.

Одна из наиболее важных тем имеет отношение к свойству, с которым мы уже сталкивались в главе 6, обсуждая центромеры и их роль в делении клеток. Вновь обратившись к рис. 6.3, вспомним, что ДНК наших клеток обернута вокруг групп, в каждой из которых содержится по 8 особых белков — гистонов. Мы рассматривали гистоны лишь как «упаковочные» белки, однако на самом деле они выполняют гораздо более сложные задачи. Наши клетки способны модифицировать гистоны или саму ДНК. Они осуществляют это, добавляя к ним небольшие химические группы. Эти химические прибавления не изменяют саму нуклеотидную последовательность гена. Ген по-прежнему будет кодировать ту же самую молекулу РНК и тот же самый белок (если речь идет о гене, кодирующем белок). Однако такие модификации меняют вероятность того, что данный ген будет экспрессироваться. Пристраиваемые группы сами служат участками, к которым прикрепляются другие белки. Эти модификации — первичные участки прикрепления, на основе которых постепенно выстраиваются большие белковые комплексы, которые в конечном счете и выключают (или включают) ген.

Такие изменения в ДНК и белках, на которые она влияет, называются эпигенетическими модификациями^1. «Эпи-» происходит от греческого слова, означающего «на», «в», «в добавление к», «точно так же, как». Подобные модификации — своего рода добавление к генетической последовательности. Наиболее распространенная из них (все остальные распространены гораздо меньше) наблюдается на тех участках, где за нуклеотидным основанием Ц следует основание Г. Такая последовательность называется ЦГ-последовательностью. Клеточные ферменты способны добавить тут модифицирующую — здесь метильную — группу. Она пристраивается к основанию Ц. Метильная группа состоит всего из одного атома углерода и трех атомов водорода. Она имеет очень маленькие размеры. Прикрепить такую группку на основание Ц — то же самое, что прикрепить листок клевера на боковую часть цветка подсолнуха.

Если на данном участке ДНК много ЦГ-мотивов, он имеет много мест, к которым способна эпигенетически присоединяться метильная группа. Это привлекает белки, подавляющие экспрессию соответствующего гена. В экстремальных случаях, когда имеется множество ЦГ-мотивов, находящихся поблизости друг от друга, метилирование ДНК может оказывать чрезвычайно сильное и глубокое воздействие. В сущности, при этом ДНК меняет форму и соответствующий геи полностью выключается. Более того, он может отключаться не только в данной клетке, но и во всех дочерних, создаваемых ею в результате деления. В неделящихся клетках (скажем, нейронах мозга) такие схемы метилирования ДНК порой складываются еще в тот период, когда мы находимся в утробе матери. Многие из этих схем будут продолжать действовать и через сто лет, если нам удастся протянуть так долго.

Осознание того, что метилирование ДНК умеет практически на всю жизнь отключать гены конкретного человека, произвело много шума. Похоже, наконец-то ученые обзавелись механизмом, объяснявшим то, что десятилетиями мучило специалистов. Уже давно было известно, что генетика объясняет не все: существует масса ситуаций, когда два генетически идентичных объекта все же различны. Вот примеры. Когда гусеница окукливается и затем превращается в бабочку, она продолжает использовать тот же геном. Генетически тождественные друг другу мыши, выращенные в лаборатории при совершенно одинаковых условиях, имеют разный вес.

Мы с вами, дорогие читатели, являем собой подлинные шедевры эпигенетики. 50-70 триллионов клеток человеческого организма почти все содержат, по большому счету, один и тот же генетический код[23]. И выделяющие соль клетки наших потовых желез, и кожные клетки наших век, и клетки, которые вырабатывают амортизирующую хрящевую ткань в наших коленях, — все они содержат одну и ту же ДНК. Они просто по-разному используют информацию, содержащуюся в ее генах: тут многое зависит от конкретной ткани. Скажем, нейроны головного мозга экспрессируют рецепторы нейротрансмиттеров, но отключают гены, отвечающие за выработку гемоглобина — пигмента, в котором наши красные кровяные тельца переносят кислород.

Все это — примеры ситуаций, которые мы не первое десятилетие именуем эпигенетическими явлениями. Да-да, тот же самый термин, что и для модификаций. И не зря. Речь идет о ситуациях, когда происходит что-то «в добавление к» генетическому коду.

Открытие процесса метилирования ДНК наконец дало нам механизм эпигенетических явлений. В нейроне гены, отвечающие за выработку гемоглобина, подвергаются массированному метилированию и отключаются. Они остаются в отключенном состоянии на протяжении всей жизни человека. Однако в клетках, порождающих красные кровяные тельца, эти гены не метилируются, и гемоглобин преспокойно синтезируется. Зато в этих клетках при помощи эпигенетического механизма отключаются гены, кодирующие рецепторы нейротрансмиттеров.

Метилирование ДНК — процесс, приводящий к довольно стойким изменениям. Удалить модифицирующие группы на удивление трудно. Это хорошо — если вашим клеткам нужно на протяжении долгих периодов поддерживать определенные гены в отключенном состоянии. Однако зачастую наши клетки вынуждены откликаться на кратковременные изменения в своем окружении: скажем, если мы пьем алкогольные напитки или вымотались после собеседования при устройстве на работу. Тогда организм обращается к другой системе. Клетки добавляют модификации к гистонам, расположенным рядом с генами. Этот процесс тоже может отключать гены, однако такие модификации сравнительно легко удалить, а значит, при необходимости клетка сумеет быстро включить гены вновь. Гистонные модификации также могут применяться для модулирования экспрессии гена: его можно включить слегка, посильнее, очень сильно, на всю катушку. Метилирование ДНК в этом смысле подобно выключателю, а модификации гистонов — регулятору громкости.

Гистонные модификации могут выступать как механизм тонкой настройки генетической экспрессии благодаря тому, что таких модификаций множество. Если ДНК сравнить с черно-белым изображением (возможно, разбавленным некоторыми оттенками серого в зависимости от уровня метилирования), то гистонные модификации — это яркая цветная картинка. В гистонах есть множество аминокислот, способных подвергаться модификации. К этим многообразным аминокислотам могут пристраиваться по меньшей мере 60 различных химических групп. Это выводит нас на невероятный уровень сложности, поскольку для каждого гена (или для одного и того же гена в разных типах клеток) существуют тысячи возможных комбинаций гистонных модификаций. Клетка интерпретирует их по-разному, поскольку эти модификации будут привлекать различные комплексы белков, контролирующие генетическую экспрессию и картину ее распределения. Одни комбинации будут усиливать экспрессию генов, другие — ослаблять ее.

Отыскать местечко в геноме

Но ученых годами терзала одна загадка. Ферменты, пристраивающие модификации к гистонам, не различают особенностей ДНК-последовательности. Они не связываются с ДНК и не умеют отличать одну ДНК-последовательность от другой. Однако выяснилось, что в присутствии определенного стимула (для разных ферментов он может быть разным) ферменты с высокой точностью модифицируют определенные гистоны. Они добавляют модифицирующие группы к гистонам, расположенным на нужных генах (или удаляют из них модифицирующие группы), игнорируя близлежащие гистоны, связанные с генами, которые их не интересуют.

Современные исследования вроде бы показывают, что одна из функций длинных некодирующих РНК — выступать в роли своего рода молекулярного клейкого вещества, привлекающего гистономодифицирующие ферменты в окрестности выбранных генов. Одно из указаний на это получено при изучении функций определенных длинных некодирующих РНК в эмбриональных клетках человека (мы говорили об этих клетках в главе 8). Ученые показали, что примерно треть исследованных длинных некодирующих РНК соединяется с белковыми комплексами, в состав которых входят и гистономодифицирующие ферменты. Чтобы выяснить, имеет ли какие-то функциональные последствия такое связывание длинных некодирующих РНК с белками, исследователи подавляли экспрессию гистономодифицирующего фермента, который входит в состав комплекса. Почти в половине случаев изучаемые воздействия на клетку и на экспрессию генов оказывались такими же, как если бы экспериментаторы подавляли самую длинную некодирующую РНК. Это позволило предположить, что длинная некодирующая РНК и ферменты, модифицирующие гистоны, действительно ведут в клетке совместную деятельность^2.

Многие исследователи взаимодействия между длинными некодирующими РНК и эпигенетическими системами обращают главное внимание на определенный эпигенетический фермент. Он производит особую гистонную модификацию, которую с высокой вероятностью связывают с отключением генов. Будем называть этот фермент главным репрессором[24]. Оказалось, он взаимодействует со множеством различных длинных некодирующих РНК.

Длинная некодирующая РНК этого гена нацеливается на главный репрессор этого гена, а он затем создает на гистонах репрессивные модификации, тем самым заглушая экспрессию генов. Эти репрессивные модификации привлекают к себе другие белки, которые связываются с данным геном и подавляют его еще сильнее.

Такой контроль, осуществляемый главным эпигенетическим ферментом-репрессором, часто используется для управления генами, которые кодируют другие эпигенетические ферменты. Нередко такие гены оказывают противоположное воздействие на главный репрессор, то есть они склонны не отключать, а включать гены. Суммарный эффект таков: главный репрессор оказывает сильное влияние на общий характер генетической экспрессии^3. Он подавляет гены не только напрямую, но и при косвенном воздействии — препятствуя экспрессии эпигенетических ферментов, которые обычно отключают другие гены. Получается двойной эпигенетический удар.

Как правило, это совершенно нормальная составляющая процессов контроля генетической экспрессии в наших клетках. Система делает в точности то, что должна делать: обеспечивает синхронную работу всех сложных клеточных механизмов. Но если в этом комплексном взаимодействии между некодирующими РНК и эпигенетической аппаратурой что-то пойдет не так, могут возникнуть проблемы.

К сожалению, именно это, по-видимому, происходит при некоторых формах рака. При определенных разновидностях онкологических заболеваний главный репрессор претерпевает сверхэкспрессию (скажем, при различных видах рака простаты^4 и рака груди^5). Такая сверхэкспрессия считается негативным прогностическим фактором для больных. При некоторых видах рака крови главный репрессор мутирует, что делает его аномально активным^6. Похоже, в каждом из таких случаев подавляется «не тот» ген. Отсюда дисбаланс: белки, побуждающие клетку размножаться, «обгоняют» те белки, которые обычно действуют как тормоз. Так клетку подталкивают к раковому состоянию. А препараты, ингибирующие активность главного репрессора, пока еще находятся на ранних стадиях клинических испытаний^7.

Главный репрессор действует как часть большого комплекса белков[25]. Исследователи показали, что самые разные длинные некодирующие РНК так или иначе связаны с функционированием этого комплекса. Возможно, существует целый ряд способов достижения репрессивных модификаций — в зависимости от типа клетки и от ее поведения. В главе 8 мы познакомились с длинной некодирующей РНК, чья сверхэкспрессия способствует развитию рака простаты. Удалось показать, что она связывается с главным репрессором и направляет его на определенные гены, в том числе и на те, которые в нормальных условиях сдерживают размножение клеток^8. Эта находка подтверждает гипотезу, согласно которой существует тонкий баланс между длинными некодирующими РНК и эпигенетическими модификаторами, а нарушение такого равновесия может оказаться опасным для клетки или для организма в целом. Подкрепляют эту гипотезу и схожие данные о связывании длинной некодирующей РНК, участвующей в процессах возникновения деформаций скелета и развитии целого ряда форм рака (мы обсуждали эту РНК в той же главе). Данная РНК связывается с комплексом, содержащим главный репрессор, а одновременно — с другим эпигенетическим ферментом, способным вызывать дополнительную репрессивную модификацию^9.

В этом объяснении как бы подразумевается, что длинная некодирующая РНК транскрибируется на гене, чьи гистоны атакуются главным репрессором или другими эпигенетическими ферментами (или же она транскрибируется рядом с этим геном). Трудно выяснить, как обстоит дело в реальности. Существующие данные вроде бы подтверждают: так и есть. Главный репрессор может связываться со всевозможными молекулами длинных некодирующих РНК. Комплекс, содержащий главный репрессор, способен распознавать те или иные типы гистонных модификаций — в зависимости от компонентов самого комплекса. Эти компоненты могут оказаться различными в разных клетках. «Сканируя» близлежащие гистоны, такие комплексы могут распознавать многообразные картины модификаций и усиливать их, добавляя к ним главные репрессивные модификации. А если данная область сильно насыщена модификациями, которые приводят к генетической экспрессии, этот комплекс может ингибироваться, и главный репрессор оставит гистоны в покое. Вот вам еще один пример того, что линейное мышление не всегда годится для рассуждений о том, что первично. Картина модификаций часто поддерживается или создается лишь как следствие комбинаций гистонных модификаций, уже имеющихся в геноме10,11.

Похоже, то же самое верно и для противоположного эффекта — когда активные участки остаются активными. Сообщалось о длинных некодирующих РНК, экспрессируемых на участках, где гены, кодирующие белки, находятся во включенном состоянии. Эти длинные некодирующие РНК остаются прикрепленными к тому геномному региону, где они вырабатываются. Тем самым они, вероятно, образуют своего рода третью нить в дополнение к двойной спирали ДНК. Эти длинные некодирующие РНК связываются с ферментами, которые нацепляют на ДНК метильные модификации. При этом такие РНК останавливают работу этих ферментов. А значит, гены данной области по-прежнему остаются в активном состоянии^12.

Если вы неактивны, вы остаетесь неактивны

Xist-РНК, играющая, как мы уже знаем, главную роль в подавлении экспрессии одной из X-хромосом женской клетки, оказалась одной из первых длинных некодирующих РНК, о которых стало известно, что они обладают какой-то функцией. Неудивительно, что именно ее взаимодействие с эпигенетической системой удалось показать наиболее отчетливо. По мере того, как Xist-РНК распространяется вдоль X-хромосомы, она привлекает другие белки. Многие из них — эпигенетические ферменты, которые добавляют химические модификации либо к ДНК, либо к гистону. В число этих ферментов входит главный репрессор гистонов, а также ферменты, которые пристраивают метильные группы к ДНК^13. Они порождают эпигенетические модификации, усиливающие подавление генов и в конечном счете приводящие к гиперкомпактизации X-хромосомы и образованию тельца Барра (мы встречались с ним в главе 7).

Может показаться странным, что эпигенетические модификации после клеточного деления всегда вновь появляются на нужной X-хромосоме. Приведем один довольно наглядный пример не из мира клеток. Допустим, у вас есть две бейсбольные биты. Одну из них вы покрыли магнитной краской (будем считать, что такая краска — аналог Xist-РНК). После того, как краска высохла, вы бросили обе биты в трубку с маленькими железными дисками. Одна сторона каждого диска покрыта мельчайшими крючочками, как часть застежки-липучки. Эти диски будут изображать эпигенетические белки, которые связываются с участком хромосомы, покрытым Xist-РНК. Такие диски будут прилипать к бите с магнитным слоем, а не к другой. Затем вы извлечете эти биты (вместе с дисками, прилипшими к одной из них) и бросите их в трубку с красивыми цветочками из ткани, к каждому из которых прикреплена часть застежки-липучки, но уже с петельками, а не с крючочками. Это аналог модификаций. Разумеется, цветки будут прилипать лишь к бите, которую вы покрыли магнитным слоем, несмотря на то, что сами цветки не способны ни к чему примагничиваться.

Можно продолжить этот несколько чудноватый мысленный эксперимент. Даже если вы снимете цветки с биты и затем бросите ее в еще одну трубку, содержащую цветки с липучками-петельками, она снова покроется этими цветками. Можете даже ободрать с нее все диски, но если вы затем снова окунете магнитную биту сначала в первую, а затем во вторую трубку, такая бита все равно покроется цветками.

Собственно, сделать так, чтобы эта бита не покрылась цветками после погружения в две трубки, можно единственным способом — счистить с нее магнитную краску. По сути, именно это и происходит, когда женский организм вырабатывает яйцеклетки. Все инактивирующие метки удаляются с X-хромосом и из всех дочерних клеток. Иными словами, все яйцеклетки становятся «чистыми» — в том смысле, что они не передают инактивацию своему потомству. «Магнитную краску» придется заново нанести на одну из X-хромосом в ходе ранней стадии развития эмбриона.

Как заставить древних чужаков хранить молчание

Длинные некодирующие РНК явно взаимодействуют с эпигенетическими белками и помогают организму регулировать их функционирование. Впрочем, не стоит думать, будто это единственный путь, каким генетический мусор общается с эпигенетической системой. Вовсе нет. Мы уже видели в главе 4, что человеческий геном давно захвачен огромным количеством повторяющихся ДНК-последовательностей. Мы уже знаем, как важно поддерживать их в отключенном состоянии. Некоторые исследователи предполагают даже, что эпигенетический контроль экспрессии генов мог изначально возникнуть именно для того, чтобы держать в узде определенные мусорные области^14. По их мнению, эпигенетическая система лишь позже вошла на новую для себя территорию регуляции нормальных эндогенных генов.

Впечатляющий пример взаимодействия между мусорной ДНК, эпигенетической системой, внешностью и поведением млекопитающего демонстрирует одна из генетических линий мышей — вполне жизнеспособная линия, полученная при скрещивании с желтыми агути. Все мыши этой линии генетически идентичны, но по виду весьма сильно отличаются друг от друга. Одни — толстые и желтые, другие — худые и бурые, а некоторые — нечто среднее. Такие различия во внешности вызваны различным протеканием процессов эпигенетической регуляции мусорной области ДНК. У этих мышей повторяющийся элемент ДНК-последовательности встроен в геном, где предшествует определенному гену. Этот элемент может случайным образом подвергаться метилированию, причем в различной степени. Чем сильнее метилирование, тем больше подавляется активность повторяющегося элемента ДНК-последовательности. А это, в свою очередь, влияет на близлежащий ген^16. Именно уровни экспрессии этого гена в конечном счете и определяют, насколько толстой и насколько желтой будет мышь. Это упрощенно показано на рис. 9.1.

Эпигенетика и экспансия

Общение между эпигенетической системой и мусорной ДНК также одна из причин влияния некоторых генетических мутаций на организм. Классический пример — синдром ломкой X-хромосомы, описанный в главах 1 и 2. Мутация, вызывающая это заболевание, сводится к увеличению количества повторов триплета ЦЦГ (к экспансии этого триплета). Иногда в результате появляются тысячи его копий. Повторяющийся элемент содержит основание Ц, за которым следует основание Г: перед нами та самая последовательность ЦГ, о которой мы говорили выше как о мишени для метилирования ДНК. Когда количество повторов этой мусорной последовательности становится чрезвычайно большим, она теряет устойчивость к воздействию белков и ферментов, добавляющих метильную группу в ЦЦГ-мотив. В итоге клетка уже не может экспрессировать белок ломкой X-хромосомы. Следствие такого взаимодействия между мусорной ДНК и эпигенетической системой — целая человеческая жизнь, отягощенная трудностями в обучении и социальном общении.

Рис. 9.1. Вверху: вставка усиливает экспрессию гена агути, что приводит к появлению толстой желтой мыши. Внизу: вставку модифицировали путем метилирования ДНК. Теперь вставка уже не влияет на экспрессию гена агути. Результат — худая бурая мышь.

Глава 10. Почему родителям так нравится мусор

Одна из первых библейских историй, с которыми знакомятся дети, воспитываемые в иудео-христианской традиции, повествует о сотворении мира. В Книге Бытия рассказывается о том, как Бог творит землю, небо и все, что на них есть. В конце концов Он создает Адама и Еву. Далее освоение нашего мира становится задачей этой парочки и их потомков. Жизнь людей идет уже без всякого Божественного вмешательства (если не считать известного христианского сюжета, о котором идет речь в Новом Завете).

История об Адаме и Еве прочно впечаталась в человеческое сознание. Возможно, это причина (или отражение) укорененного в нас простого биологического представления. Оно сводится к следующему: чтобы произвести на свет ребенка, нужны мужчина и женщина. С биологической точки зрения невозможно создать дитя при помощи двух мужчин, двух женщин или одной-единственной женщины.

Это кажется биологической данностью. Усомниться в ней практически никогда и никому не приходит в голову. Ведь человек, подобно всем прочим живородящим млекопитающим, принадлежит к единственному классу животных, где никогда не происходит «непорочного» рождения. Для появления потомства яйцеклетку млекопитающего должен оплодотворить сперматозоид. Однако во всех прочих классах встречаются примеры самок, которые порождают живых отпрысков без всякого спаривания. И это не ограничивается низшими классами вроде насекомых. На такое способны некоторые виды рыб, амфибий, рептилий и даже птиц. А вот млекопитающие так делать не умеют. Это позволяет предположить, что такой запрет на однополое воспроизводство (девственное размножение, партеногенез) возник сравнительно недавно (по эволюционным меркам), вскоре после отделения друг от друга эволюционных ветвей млекопитающих и пресмыкающихся, то есть немногим более 300 миллионов лет назад.

Можно предположить, что такая неспособность млекопитающих к партеногенезу — скорее вопрос доставки генетического материала, чем следствие каких-то фундаментальных биологических причин. Вероятно, две яйцеклетки млекопитающих просто не могут слиться, а значит, не могут и образовать зиготу, которая затем даст начало всем остальным клеткам нового организма. Следовательно, млекопитающим нужен для размножения донор мужского пола, ибо только сперматозоид способен проникнуть в яйцеклетку и доставить по назначению свой груз ДНК. Ну да, яйцеклетки млекопитающих при обычных условиях действительно не могут сливаться друг с другом. Но это не очень-то удачное объяснение. Реальное объяснение куда интереснее. Его продемонстрировали в ходе серии изящных экспериментов в середине 1980-х годов. Модельной системой, как частенько бывает, служили мыши.

Экспериментаторы выделили оплодотворенные мышиные яйцеклетки и удалили ядро из каждой такой яйцеклетки. Затем они ввели в эти яйцеклетки ядра из других яйцеклеток или из сперматозоидов, после чего поместили их в матку мышиной самки-реципиента. Результаты схематически показаны на рис. 10.1.

Живые мыши в таких случаях появлялись на свет, если яйцеклетку одновременно снабжали ядром другой яйцеклетки и ядром сперматозоида. Если в яйцеклетку одновременно встраивали два ядра других яйцеклеток или два ядра сперматозоидов, эмбрионы некоторое время развивались, но очень скоро погибали. С генетической точки зрения это выглядело весьма непонятно. Ведь во всех трех системах «восстановленная» яйцеклетка содержала нужное количество ДНК. В смысле ДНК-последовательности нет особой разницы между ДНК сперматозоида и ДНК яйцеклетки. К тому же эксперименты специально проводили так, чтобы донорские яйцеклетка и сперматозоид давали реципиенту по одной X-хромосоме. Во всех трех случаях использовались одни и те же ДНК-последовательности. Однако живое потомство рождалось лишь в том случае, когда эти ДНК-последовательности одновременно предоставляли самец и самка^1.

Рис. 10.1. Если в «пустую» яйцеклетку, утратившую собственное ядро, встроить ядро другой яйцеклетки и ядро сперматозоида, в результате появится на свет живая мышь. Если встроить в нее два ядра яйцеклеток или два ядра сперматозоидов, получившиеся эмбрионы не будут развиваться нормально. Однако во всех трех случаях мы имеем дело с одной и той же генетической информацией.

Мы почти уверены, что такое требование одновременного присутствия яйцеклетки и сперматозоида применимо не только к мышам. У человеческих особей встречается заболевание, именуемое пузырным заносом (хориоаденомой, доброкачественной гестационной трофобластической болезнью). Женщина, страдающая им, может казаться беременной, набирать вес, часто испытывать острую утреннюю тошноту. Однако сканирование тела выявляет у нее лишь аномально увеличенную плаценту, полную пузырей с жидкостью, а никакого эмбриона не обнаруживается. В среднем на каждые 1200 беременностей наблюдают один случай пузырного заноса, хотя в некоторых азиатских популяциях этим заболеванием страдает одна из 200 беременных. Возникшее образование спонтанно абортируется примерно через 4-5 месяцев после оплодотворения, хотя в странах с развитой пренатальной медициной врачи удаляют его раньше, чтобы предотвратить развитие потенциально опасных опухолей.

Генетический анализ такой аномалии дает массу ценной информации. Оказывается, в большинстве случаев пузырный занос возникает, когда сперматозоид попадает в яйцеклетку, в которой почему-то нет ядра. Все 23 хромосомы сперматозоида честно копируются, и количество хромосом, как и положено, становится равным 46. Примерно в одной пятой случаев пузырный занос происходит, когда два сперматозоида одновременно проникают в одну из необычных безъядерных яйцеклеток: при этом, опять-таки, в ней оказывается правильное количество хромосом. Как и в вышеизложенных экспериментах с мышами, пузырное образование содержит нужное число хромосом, однако их дает лишь один из родителей, что и приводит к серьезным нарушениям развития эмбриона.

Случаи пузырного заноса и опыты на мышах показали нечто весьма фундаментальное. Они продемонстрировали, что гаметы (яйцеклетка и сперматозоид) снабжают будущий организм еще какой-то информацией помимо генетического кода. Ведь наблюдаемые явления попросту невозможно объяснить, исходя лишь из количества ДНК или характера ДНК-последовательности. В сущности, это явление относится к области эпигенетики. Теперь нам известно, что на молекулярном уровне оно объясняется взаимодействием эпигенетической системы с мусорной ДНК.

Откуда берется ДНК

Ученые обнаружили: некоторые области ДНК несут в себе эпигенетические модификации, как бы сообщающие: «Я — от матери» или «Я — от отца». Это так называемый родительский эффект (parent-of-origin effect). В этих областях генома для нормального развития требуется, чтобы потомок унаследовал одну копию определенного гена (или генов) от матери и одну — от отца.

Такие эпигенетические модификации — не просто голубенькие или розовенькие украшения, показывающие, кто предоставил вам копию гена. Эти модификации контролируют экспрессию определенных генов таким образом, чтобы в каждой паре один включался (скажем, тот, что унаследован от отца), а другой (в данном случае — доставшийся от матери) выключался. Этот процесс называется импринтингом («впечатыванием»): в гены «впечатывается» информация об их происхождении (то есть от кого из родителей они унаследованы).

Обычно то, что клетка экспрессирует две копии гена, кодирующего белок, предоставляет ей своего рода страховку. Даже если одна из копий претерпит мутацию или окажется неправомерно подавленной посредством аномальных эпигенетических модификаций, у клетки все равно останется запасная, нормальная копия. Но если одна из таких копий отключилась из-за импринтинга, клетка становится более подверженной случайному отключению другой копии. Однако некоторые гены в клетке все-таки идут на такой риск, что означает: преимущества импринтинга должны перевешивать его недостатки.

Не случайно такая система возникла лишь у млекопитающих. Самки млекопитающих вносят необычайно большой вклад в развитие своего потомства. Они долго держат детеныша внутри своего тела, делясь с отпрыском питательными веществами через плаценту. Ну да, многие представительницы других классов тоже очень заботятся о своем потомстве. Птицы высиживают яйца, крокодилы хитроумно располагают кладку в гнезде, тщательно регулируя ее температуру. Однако ни у какого другого класса самка не кормит развивающийся эмбрион столь обильно и активно.

Уровень материнской заботливости сдерживается эволюционными причинами. Чтобы успешно передать гены детенышу, самка млекопитающего предпочла бы иметь несколько шансов на такую передачу. Вполне возможно, что ей могут встретиться на жизненном пути другие партнеры, более подходящие (в эволюционном смысле), чем тот, чье потомство она сейчас несет в себе. Поэтому, хотя она многое вкладывает в каждую беременность, самка обладает способностью спариваться неоднократно, что вполне логично. При этом она получит явные эволюционные преимущества, если постарается сделать так, чтобы развивающийся эмбрион (или эмбрионы) получал от нее достаточно питательных веществ. Благодаря этому он будет иметь более высокие шансы на выживание и последующее размножение. Однако не стоит отвлекать на эмбрион такое количество питательных веществ, чтобы их не хватало матери. Во всяком случае, она не должна в результате погибать или утрачивать способность давать потомство.

А вот с самцом история несколько иная. Если его потомок вытянет из матери столько соков, что она больше не сможет размножаться, самцу на это будет, в общем, наплевать. В эволюционном смысле он хочет от наследника лишь одного: чтобы он питался как можно лучше и был как можно сильнее. Тогда у него будут наивысшие шансы на успешное достижение половой зрелости и передачу генов собственным потомкам. Самец, скорее всего, будет спариваться и с другими самками: лишь сравнительно небольшое число видов млекопитающих образует пару на всю жизнь.

Самки млекопитающих не в состоянии решать, какую долю питательных веществ передавать эмбриону, обитающему в утробе. Это вам не птицы — те-то могут раньше времени бросить гнездо. Поэтому эволюция добилась эпигенетического перемирия в этой гонке питательных вооружений. Возник механизм импринтинга, позволяющий сбалансировать конкурирующие требования мужского и женского вклада в геном. У небольшого количества генов эпигенетические модификации ДНК, наследуемой от отца, задают характер генетической экспрессии, способствующий росту эмбриона. Но у тех же генов иной характер генетической экспрессии, задаваемый эпигенетическими модификациями ДНК, наследуемой от матери, оказывает на эмбрион противоположное действие.

В ходе развития эмбриона определенные отцовские гены часто способствуют экспрессии большой и эффективной плаценты, ведь именно этот орган питает эмбрионы. Вот почему при пузырном заносе, когда весь генетический материал поступает от отца, развивается аномальная и очень крупная плацента.

Отключение посредством включения

Среди генов, кодирующих белки, импринтингу подвергаются немногие. У мышей таких генов около 140^2. Они образуют кластеры из 2-12 генов. Многие из этих кластеров довольно похожи на аналогичные кластеры, существующие в человеческом геноме^3. Кстати, у сумчатых количество генов, подвергающихся импринтингу, гораздо ниже, ведь эти животные кормят свое потомство в утробе относительно недолго^4.

Определяющий компонент каждого такого кластера — область мусорной ДНК, которая управляет экспрессией генов, кодирующих белки. Этот определяющий компонент называется областью, контролирующей импринтинг (ОКИ, imprinting control element, ICE). Представьте, что вам надо осветить комнату при помощи двенадцати лампочек. Если вы хотите менять уровень освещенности, можно использовать лампочки с разной светимостью и отдельные выключатели для каждой. Но это довольно трудоемкий способ контролирования общего уровня освещенности. Лучше организовать всю эту дюжину лампочек в единую цепь и управлять ими одновременно — с помощью обычного выключателя или реостата (если вам хочется большей плавности).

ОКИ действует как общий реостат, однако тут есть небольшое отличие от нашей электрической аналогии. ОКИ играет важную роль благодаря тому, что она способствует экспрессии длинной некодирующей РНК. Эта РНК способна подавлять экспрессию генов окружающего кластера. По сути, импринтинг зависит от двух типов мусорной ДНК: геномных областей, контролирующих импринтинг, и тех длинных некодирующих РНК, на которые ОКИ оказывают контролирующее действие. Если в определенном кластере включается длинная некодирующая РНК, она подавляет экспрессию входящих в этот кластер генов, кодирующих белки. С другой стороны, если длинная некодирующая РНК, управляемая ОКИ, подавляется, то гены кластера, кодирующие белки, могут активироваться.

Импринтинг в высочайшей степени зависит от мусорной ДНК и ее общения с эпигенетической системой. Область, контролирующую импринтинг, можно эпигенетически модифицировать. Экспрессия длинной некодирующей РНК зависит от того, метилирована ли ДНК в области, контролирующей импринтинг. Если метилирована, то это препятствует экспрессии данной некодирующей РНК. Если же ОКИ избежала метилирования, эта длинная некодирующая РНК все же будет экспрессироваться. В сущности, тут идут взаимозависимые процессы. Если длинная некодирующая РНК экспрессируется, то гены, расположенные в кластере на той же хромосоме, будут подавляться. Если же длинная некодирующая РНК не экспрессируется, гены, расположенные в кластере на той же хромосоме, будут включаться. Длинная некодирующая РНК в зонах, подвергшихся импринтингу, иногда может иметь невероятную длину, доходящую до 1 миллиона нуклеотидных оснований: ошеломляющая цифра^5.

К сожалению, мы пока довольно поверхностно разбираемся в конкретных механизмах, используемых длинной некодирующей РНК для подавления экспрессии близлежащего кластера генов. Здесь тоже наверняка не обошлось без эпигенетической системы, которая помогла внести репрессивные эпигенетические модификации в гены, кодирующие белки. Если в развивающемся эмбрионе подавляются ключевые эпигенетические гены (скажем, главный репрессор, с которым мы познакомились в главе 9), некоторые из генов, подвергшихся импринтингу, экспрессируются, хотя при обычных условиях они бы оставались в выключенном состоянии^6. И это верно не только для главного репрессора. Выключение других эпигенетических генов, порождающих репрессивные гистонные модификации, оказывает похожее воздействие7,8. Это лишний раз показывает, какую важную роль играет эпигенетическая система в выполнении инструкций, содержащихся в длинной некодирующей РНК. Вероятно, такие процессы происходят благодаря тому, что длинная некодирующая РНК привлекает соответствующие ферменты к кластеру, подвергшемуся импринтингу, тем самым таргетируя гистонные модификации генов, кодирующих белки.

Эпигенетические модификации есть и в самой ОКИ. Как и следовало ожидать, при метилировании ДНК в области, контролирующей импринтинг, именно гистонные модификации непосредственно влияют на отключение генов. Если же ОКИ не метилирована, то эти гистонные модификации влияют на включение генов. Характер распределения эпигенетических модификаций в ОКИ — один и тот же и во всей ДНК, и в ее гистонах^9.

В ходе импринтинга определяющим фактором является то, метилирована ли мусорная ДНК, образующая эту область. Высказываются предположения, что сам процесс метилирования областей, контролирующих импринтинг, возник, когда подавление близлежащих паразитических элементов (мы описывали такие элементы в главе 4) стало распространяться и на соседние зоны. Возможно, это создало преимущество с точки зрения приспособленности, поэтому в ходе естественного отбора такая особенность передалась и последующим поколениям^10. Но вот один интригующий факт. У самых примитивных млекопитающих — яйцекладущих существ вроде утконоса и ехидны — необычно мало паразитических элементов близ тех регионов генома, где мы могли бы ожидать найти области, контролирующие импринтинг у более высокоразвитых млекопитающих^11.

Как провести импринтинг заново

Но каким же образом характер метилирования закрепляется в ОКИ современных млекопитающих и передается из поколения в поколение? Ведь он не зависит от различий в ДНК-последовательностях между геномами, унаследованными от матери и отца. Как же он укореняется в геноме? Допустим, женщина унаследует зоны, подвергшиеся импринтингу, от своего отца. В них ОКИ особым образом метилированы/не метилированы: характер метилирования подтверждает, что она унаследовала этот участок генома от своего папаши. Но если она передаст ту же импринтированную зону своему отпрыску, все следы отцовского импринтинга неизбежно сотрутся. На смену им придет характер метилирования, показывающий, что он унаследован от матери.

На первый взгляд кажется, что тут полно внутренних противоречий. Возможно, в этой путанице легче разобраться, если вновь обратиться к миру мюзиклов. Речь пойдет уже не об Оскаре Хаммерстайне, а о Хэле Дэвиде — поэте-песеннике, который долгое время сотрудничал с композитором Бертом Бакараком. Именно они сочинили песенки для киномюзикла 1973 года «Потерянный горизонт». Одна из них стала весьма известной. В ней есть полезная для нас идея: «Мир — круг без начала и конца». Процессы развития гораздо легче представить себе именно как такие бесконечные круги, а не как прямые линии. Такой цикл «надень—сними—надень», свойственный возникновению ОКИ, подвергающейся импринтингу, схематически показан на рис. 10.2. Мы видим, что яйцеклетки всегда передают потомству материнскую картину метилирования ОКИ. Такой же процесс позволяет сперматозоиду всегда передавать потомству отцовскую картину метилирования.

Рис. 10.2. Циклы метилирования и деметилирования обеспечивают процесс передачи потомству хромосом, которые содержат нужные модификации, указывающие на то, от какого родителя передан материал.

Разумеется, эта схема порождает свои вопросы. Каким образом развивающиеся яйцеклетки и сперматозоиды идентифицируют области, контролирующие импринтинг? И откуда они знают, какие области надо метилировать, а какие — нет? Сейчас этими проблемами активно занимаются ученые. Возможно, для каждой ОКИ процесс проходит по-своему. Возможно, в мужских и женских половых клетках он также протекает по-разному. Честно говоря, многое здесь пока остается тайной. Однако мы все-таки сумели кое-что прояснить. Мы знаем, что в материнской зародышевой (генеративной) линии, то есть в клетках, порождающих яйцеклетки, важнейшую роль в этом процессе играют ферменты, способные пристраивать метильные группы к неметилированным ЦГ-мотивам ДНК[26],12. После этого сложившийся характер метилирования активно поддерживается ферментом, чья функция как раз и состоит в сохранении существующей картины метилирования[27],13. Вероятно, другие белки также вовлечены в формирование и поддержание нужных картин метилирования. Некоторые из них, возможно, селективно экспрессируются в развивающихся половых клетках.

Как же ферменты половых клеток ухитряются распознавать области, контролирующие импринтинг, среди прочей геномной ДНК? Опять-таки, здесь наши знания неполны. Впрочем, предполагается, что тут могут играть роль некоторые повторяющиеся последовательности в этих особых зонах мусорной ДНК^14. У разных видов эти конкретные последовательности могут существенно отличаться по составу. Но они могут выглядеть куда более схоже, если рассмотреть их трехмерную структуру. Возможно, клетка умеет как-то распознавать их не по составу последовательности, а по форме^15. Это чем-то напоминает результаты исследований длинных некодирующнх РНК из главы 8.

Хотя ученые пока не ответили на массу вопросов, касающихся импринтинга, они убеждены: именно из-за этого процесса в создание потомства вносят вклад оба пола. В 2007 году сложный комплекс экспериментов по спариванию генетически модифицированных мышей показал, что все-таки можно получать жизнеспособных мышей, встраивая два ядра яйцеклеток в одну оплодотворенную яйцеклетку. Это удалось сделать, искусственно изменив характер импринтинга в двух зонах мышиного генома. В одном из яйцеклеточных ядер создали картину метилирования, похожую на нормальную отцовскую, а не на материнскую. Так экспериментаторы обманули механизмы развития, заставив их поверить, будто генетический материал происходит от самца, а не от самки. Опыты продемонстрировали особенно значимую роль, которую играют эти две зоны, подвергшиеся импринтингу, в процессах контролирования развития организма. Кроме того, опыты показали и то, что единственное реальное препятствие на пути «двуматеринского» размножения — картина метилирования ДНК в ключевых генах. Эксперименты стали опровержением предыдущей гипотезы, согласно которой для размножения требуется сперматозоид, поскольку он сам по себе несет необходимые «сопутствующие факторы», такие, как определенные белки или молекулы РНК, необходимые для того, чтобы должным образом запустить развитие эмбриона^16.

Вернемся к рис. 10.2. Легко видеть, что характер импринтинга может меняться в ходе развития организма. Похоже, такой контроль экспрессии генов, задаваемый при помощи импринтинга, особенно важен именно в процессе развития. Так, у мышей большинство из примерно 140 импринтируемых генов демонстрируют импринтинг лишь в плаценте. Во взрослых тканях либо экспрессируются обе копии каждого из таких генов, либо не экспрессируется ни одна из копий. Вот еще одно подтверждение того, что именно контроль роста на ранних стадиях развития, вероятно, стал главной причиной возникновения импринтинга у некоторых представителей царства животных. По-видимому, тут сыграл роль «географический» фактор. В кластерах импринтинга ближайшие к ОКИ гены могут сохранять импринтинг во всех тканях. Однако гены, находящиеся дальше от этого «контрольного центра», проявляют импринтинг лишь в плаценте. Похоже, некоторые типы клеток мозга особенно склонны к сохранению импринтинга, хотя в большинстве случаев среди ученых нет единого мнения о том, почему это приносит эволюционные преимущества. Выдвигались предположения, что длинные некодирующие РНК, вырабатываемые в ОКИ, способствуют ДНК-метилированию ближайших генов, однако при этом привлекают гистонные модификации к более отдаленным генам кластера^17. Поскольку гистонные модификации легче изменять, чем картину метилирования ДНК, такие изменения могут служить механизмом освобождения более отдаленных генов от импринтинга (по мере взросления тканей).

Итак, импринтинг действительно происходит, и мы уже начали проникать по крайней мере в некоторые его механизмы. Вспомним гипотезу, согласно которой импринтинг появился для того, чтобы уравновесить конкурирующие эволюционные стремления матери и плода (плода — а значит, косвенным образом, и отца). В свете этой гипотезы неудивительно, что большинство генов, кодирующих белки и контролируемых при помощи импринтинга, вовлечены в рост эмбриона, в процессы грудного вскармливания, а также в метаболические процессы^18. Не приходится удивляться и тому, что при нарушениях импринтинга самые распространенные симптомы — дефекты роста и развития.

Когда импринтинг идет не так

Исследования расстройств, связанных с импринтингом, по-настоящему начались в 1980-е годы, когда впервые стала возможной идентификация генов, связываемых с наследственными заболеваниями. Для этого, в частности, отыскивали семьи, где хотя бы один человек страдал от данной болезни, и затем проводили в этих семьях анализ, пытаясь приблизительно выявить область хромосомы, ставшую причиной заболевания. Сегодня мы можем проделывать это довольно легко, ведь у нас есть полная расшифровка нуклеотидной последовательности нормального человеческого генома и доступ к весьма дешевым технологиям секвенирования. Однако тогда, в 1980-е, найти мутацию, вызывающую болезнь, было не так-то просто — все равно, что отыскать определенную перегоревшую лампочку, когда известно лишь, что она перегорела в каком-то американском доме. Для выявления мутаций, причин той или иной болезни, требовались годы упорного труда больших коллективов ученых.

Целый ряд таких научных групп занимался синдромом Прадера-Вилли. Младенцы, родившиеся с этим синдромом, слишком мало весят при появлении на свет, а кроме того, у них нарушен сосательный рефлекс. Лишь после отлучения от груди у них начинает нормально развиваться тонус мышц, а до этого младенческое тельце довольно вялое. По мере взросления у таких детей просыпается ненасытный аппетит. В результате у них рано возникают экстремальные формы ожирения. Кроме того, они страдают от умственной отсталости, пусть и проявляемой в мягкой форме^19.

Совершенно другая группа ученых занималась исследованием заболевания с совсем иными симптомами. Речь идет о синдроме Ангельмана. У детей с этим синдромом маленькая, недоразвитая голова, они с трудом обучаются, а кроме того, очень поздно переходят на твердую пищу. Такие дети склонны к беспричинным взрывам смеха. К счастью, отвратительно-бестактное описание этих пациентов как «счастливых манекенов» употребляется сейчас все реже^20.

Представьте, что вы прокладываете железную дорогу через весь континент. Одна бригада рабочих начинает с востока и продвигается на запад, а другая идет ей навстречу. Вначале бригады находятся на совершенно различных территориях, однако постепенно сближаются. В конце концов (если все идет как надо), они встречаются в некоей точке, пожимают друг другу руки, выпивают в честь окончания работы. Что-то подобное случилось и с группами, исследовавшими синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана. Только вот ученые, в отличие от железнодорожных рабочих из нашего примера, вовсе не ожидали, что встретятся. Они считали, что строят независимые железные дороги в совершенно разные города. И все-таки они очутились в одном и том же месте.

По мере того, как набирало обороты картирование хромосомных зон, ответственных за синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана, становилось все яснее, что на эти два заболевания влияет одна и та же область генома. Поначалу выдвигалось наиболее очевидное предположение: причина этих заболеваний — два разных гена, расположенных очень близко друг от друга. Однако в конце концов выяснилось, что оба этих заболевания вызывает дефект на одном и том же строго определенном участке генома.

Оба недуга имеют одну и ту же генетическую подоплеку — утрату небольшого участка хромосомы 15. Родители больных детей не страдали от этих заболеваний. Когда ученые исследовали хромосомы родителей, выяснилось, что эти хромосомы у них не повреждены. Утрата важнейшего участка хромосомы 15 происходила в процессе формирования яйцеклеток или сперматозоидов[28].

Казалось очень странным, что удаление небольшой части хромосомы способно вызывать два таких разных заболевания. Загадка стала проясняться, когда ученые показали: важно даже не само отсутствие этого маленького участка хромосомы 15. Важно то, почему он отсутствует. Как выяснилось, 70% изученных детей с синдромом Прадера-Вилли унаследовали аномальную хромосому 15 от мутантных клеток сперматозоидов. А 70% детей с синдромом Ангельмана унаследовали аномальную хромосому от мутантных яйцеклеток. Чуть позже исследователи установили, что 25% изученных детей с синдромом Прадера-Вилли обладали двумя совершенно нетронутыми хромосомами 15, в которых не наблюдалось никакой нехватки генетического материала. Дело в том, что эти пациенты наследовали обе копии хромосомы 15 от матери, а не по одной копии от каждого из родителей[29]. Меньшая доля страдающих синдромом Ангельмана имела по две нормальные копии хромосомы 15, причем обе копии наследовались от отца.

Такие картины наследования обретают смысл, только если привлечь концепцию импринтинга (см. рис. 10.3). Во всех аномальных ситуациях в клетках пациента отсутствует контролирующая импринтинг зона, которую ему следовало получить от одного из родителей. Результат — аномальные уровни экспрессии генов, которые в обычных условиях находились бы под жестким «родительским контролем». Это приводит к патологиям, в том числе к недостаточному или чрезмерному развитию органов и тканей.

Исследователи сумели еще больше сузить круг проблем, которые могли бы приводить к этим заболеваниям. Для этого они проанализировали гены, управляемые зонами, контролирующими импринтинг. Выяснилось, что среди обследованных пациентов, страдающих синдромом Ангельмана, примерно 10% унаследовали всю нужную ДНК от каждого из родителей. Однако у них имеется мутация в ДНК, унаследованной от матери. Она происходит не в ОКИ, а в гене, управляемом ОКИ. Это ген, кодирующий белок. Обычно данный ген экспрессируется лишь на хромосоме, наследуемой от матери. На хромосоме, наследуемой от отца, этот ген глушится импринтингом. Если ген, полученный от матери, не в состоянии вырабатывать белок из-за мутации, это означает, что такая клетка вообще не может синтезировать данный белок, что и приводит к патологии[30].

С синдромом Прадера-Вилли еще более необычная ситуация. Удалось выявить небольшое количество пациентов, у которых отсутствует лишь один из генов, находящихся на этом важнейшем участке хромосомы 15. Этот ген не кодирует белок, однако он кодирует целый набор некодирующих РНК. Все эти РНК обладают сходными функциями21,22,23: они вовлечены в процессы регуляции еще одного класса РНК, не кодирующих белки. Похоже, отсутствие одного-единственного гена, не кодирующего белок, имеет определяющее значения для развития большинства симптомов, характерных для синдрома Прадера-Вилли.

Рис. 10.3. Обычно мы наследуем одну копию хромосомы 15 по материнской линии, а одну — по отцовской. Если обе копии наследуются по материнской линии, у ребенка возникает синдром Прадера-Вилли. То же самое происходит, если копия хромосомы 15, наследуемая от отца, утратила импринтированный участок, несущий в себе отцовскую картину эпигенетических модификаций. В сущности, к синдрому Прадера-Вилли приводит нехватка отцовски-специфической информации. Синдром Ангельмана обусловлен дефектом того же самого участка хромосомы 15, но в данном случае заболевание вызвано нехваткой матерински-специфической информации.

Из всего этого можно сделать далеко идущие выводы. Итак, одна из зон мусорной ДНК (область, контролирующая импринтинг) управляет экспрессией фрагмента мусорной ДНК, который, в свою очередь, кодирует длинную некодирующую РНК. Эта длинная некодирующая РНК, в свою очередь, оказывает определяющее воздействие на регуляцию экспрессии гена, который кодирует целый набор некодирующих РНК. А роль этих некодирующих РНК — в том, чтобы осуществлять регуляцию других РНК, не кодирующих белки. Зная обо всем этом, как-то трудно утверждать, будто мусорная ДНК не обладает никакой функцией.

Синдром Прадера-Вилли и синдром Ангельмана — не единственные заболевания человека, при которых дефекты импринтинга приводят к аномалиям в росте и развитии, а также к ряду других сопутствующих проблем — например, сложностям при обучении. Еще одна взаимосвязанная пара болезней — синдром Сильвера-Рассела^24 (проявляется как карликовость) и синдром Беквита-Видемана^25 (проявляется как гигантизм). Для некоторых пациентов причиной болезни (той или другой) становятся «родительские» неполадки на одном и том же участке хромосомы 11. Этот импринтинговый локус устроен особенно сложно. Здесь задействовано множество генов и больше одной ОКИ.

Схожие взаимосвязи можно выявить и на других хромосомах. Дети, наследующие обе копии хромосомы 14 от матери, страдают задержкой роста в пренатальный и постнатальный период, однако позже у них развивается ожирение^26. Но если обе копии хромосомы 14 ребенок получает от отца, развивается ненормально большая плацента, и дитя появляется на свет с самыми разными проблемами, в том числе с дефектами брюшной стенки27,28.

У большинства этих заболеваний есть столь же редкие разновидности, возникающие из-за эпигенетических погрешностей. Небольшое количество пациентов наследует правильную ДНК от нужного родителя. Эта ДНК не является мутантной. И тем не менее у пациентов возникает импринтинговое заболевание. В этих редких ситуациях обычно нарушаются процессы закрепления и поддержания импринтинга в зиготе и на ранних стадиях развития, что может приводить к неправильному метилированию (или неправильному неметилированию) ОКИ. В результате эта ОКИ отключается или включается тогда, когда не должна этого делать. Вот еще одно подтверждение того, какую важную роль играет общение между мусорной ДНК и эпигенетической аппаратурой.

Влияние катастрофического события

В 1978 году родилась девочка по имени Луиза Браун. Увидев ее, вы бы решили, что это самый обыкновенный ребенок. Несомненно, родители считали ее самым необыкновенным ребенком в мире. Да и какие родители не думают так о своих детях? Однако в данном случае супруги Браун были правы. О рождении их дочери возвещали первые полосы газет всего мира. Дело в том, что она стала первым «ребенком из пробирки».

Яйцеклетку ее матери оплодотворил сперматозоид ее отца не в обычных условиях, а в лабораторной чашке. Затем эту яйцеклетку вновь поместили в утробу матери. Такой процедурой воспользовались из-за того, что фаллопиевы трубы миссис Браун оказались заблокированными, и она не могла зачать дитя естественным путем. Успешное появление на свет Луизы Браун открыло новую эру в лечении бесплодия. По оценкам специалистов, с тех пор более 5 миллионов детей родились благодаря вспомогательным репродуктивным технологиям^29.

Некоторые заявляли, что применение вспомогательных репродуктивных технологий может повысить распространенность импринтинговых заболеваний, особенно синдромов Беквита-Видемана, Сильвера-Рассела и Ангельмана. Такая озабоченность возникла из-за того, что эмбрионы при этом выращиваются в лаборатории как раз в тот определяющий период, когда складывается картина импринтинга. Как ни странно, мы до сих пор не знаем, действительно ли это такая большая проблема. Позвольте, ведь эти 5 миллионов детей — отличная база для анализа? Однако не следует забывать, что болезни, связанные с импринтингом, встречаются редко: при обычных родах — в одном из нескольких тысяч или даже десятков тысяч случаев. При анализе столь редких событий статистические данные легко интерпретировать неверно.

Помните «Конкорд», одну из всего-навсего двух моделей сверхзвуковых самолетов, когда-либо обслуживавших коммерческие рейсы? Не одно десятилетие «Конкорд» считался самым безопасным самолетом в мире, поскольку с ним никогда не случалось авиакатастроф со смертельным исходом. Но после трагического инцидента в парижском аэропорту «Шарль де Голль» в 2000 году, когда погибло 109 пассажиров и членов экипажа, он стал, статистически выражаясь, одним из самых небезопасных самолетов в мире. Разумеется, это произошло лишь из-за того, что «Конкорд» совершал полеты гораздо реже, чем большинство авиалайнеров, и количество перевозимых пассажиров также оказывалось малым (внутренняя часть этого самолета отличалась неожиданно миниатюрными размерами). А следовательно, одно-единственное событие смогло оказать колоссальное влияние на статистические данные, подсчитываемые слишком прямолинейно, без учета многих обстоятельств.

То же самое и с импринтинговыми заболеваниями. Если в обычных условиях вы ожидаете увидеть 50 случаев болезни на каждые 6 миллионов родившихся младенцев, как вы интерпретируете 55 случаев среди рожденных при посредстве вспомогательных репродуктивных технологий? Привело ли к этому десятипроцентному росту заболеваемости дополнительное медицинское вмешательство? А может, это просто статистический шум?[31] Следует также иметь в виду, что бесплодие само по себе способно вызывать некоторое усиление импринтинговых проблем, и применение вспомогательных репродуктивных технологий лишь их выявляет. Вполне возможно, что для сперматозоидов или яйцеклеток людей с пониженной фертильностью выше вероятность импринтинговых дефектов. Однако не исключено, что такие дефекты удалось выявить только из-за того, что эти люди смогли обзавестись потомством благодаря современным медицинским технологиям. В прошлом они бы вообще не смогли иметь детей, так что мы и не увидели бы воздействий, которые оказывает на потомство этот дефект импринтинга^30. Вот вам одна из запутанных ситуаций в биологии, когда восприятие видимой нами картины может искажаться из-за явлений, не попадающих в поле нашего зрения.

Глава 11. Особое задание для мусора

Вполне возможно, что самая чудесная и притягательная особенность биологии — ее замечательная непоследовательность. Биологические системы возникали и эволюционировали потрясающе изобретательными путями, узурпируя существующие процессы, при малейшей возможности переориентируя их на выполнение других, совершенно новых задач. А значит, почти всякий раз, когда нам кажется, будто мы нащупали в природе какую-то стойкую тему, обнаруживаются исключения из правил. Более того, иногда вообще очень трудно разобраться, где норма, а где отклонение.

Возьмем мусорную ДНК и молекулы РНК, не кодирующие белки. Почти все, о чем мы говорили до сих пор, вроде бы позволяет нам вывести примерно такую гипотезу:

Когда мусорная ДНК кодирует РНК, не кодирующую белок (то есть мусорную РНК), эта РНК служит лишь своего рода подпоркой, направляющей деятельность белков в определенные участки генома.

Эта гипотеза наверняка должна согласовываться с теми ролями, которые играют в организме длинные некодирующие РНК. Они работают как застежка-липучка, расположенная между эпигенетическими белками и ДНК или гистонами. Такие белки часто действуют в комплексе, причем как минимум одним из членов комплекса зачастую оказывается фермент, то есть белок, ускоряющий химическую реакцию. Это может быть реакция, пристраивающая эпигенетические модификации к ДНК или гистонам (либо убирающая такие модификации) — или же добавляющая еще одно нуклеотидное основание к растущей молекуле информационной РНК.

Во всех этих ситуациях белок — своего рода глагол в молекулярном предложении. Это молекула действия.

При всей привлекательности такой модели у нее имеется один обидный недостаток. Встречается ситуация, где все роли перевернуты. В этой обратной ситуации белки относительно молчаливы, а вот мусорная РНК сама действует как фермент, вызывая химические изменения в другой молекуле.

Звучит странно. Есть даже искушение предположить, что это просто единичное исключение, редкая причуда природы. Пусть так. Но это, знаете ли, весьма примечательное исключение: молекулы мусорной РНК, обладающие такой функцией, составляют примерно 80% от всех молекул РНК, находящихся в клетке человека в любой момент времени^1. Мы уже не одно десятилетие знаем о существовании этих необычных РНК. Тем удивительнее, что мы до сих пор придерживались столь белкоцентрического взгляда на наш геномный ландшафт.

Молекулы РНК, наделенные этой странной функцией, называются рибосомными РНК, или рРНК. Нетрудно догадаться, что в основном они располагаются в клеточных структурах, именуемых рибосомами. Эти структуры находятся не в ядре, а в цитоплазме. Рибосомы — структуры, где информация, содержащаяся в молекулах информационной РНК, конвертируется в связанные друг с другом цепочки аминокислот, в результате чего и синтезируются белковые молекулы. Если вспомнить нашу аналогию с вязанием, которую мы использовали в первых двух главах книги, рибосомы — это все те дамы-вязальщицы, которые превращают информацию, напечатанную на бумаге, в теплые носки и теплые перчатки для бойцов, сражающихся где-то за морем^2.

По массе рРНК составляет около 60% общей массы рибосомы. Остальные 40% приходятся на белки. Молекулы рРНК группируются в две основные субструктуры. В одной содержится три типа рРНК и примерно 50 различных белков. В другой субструктуре лишь один тип рРНК и около 30 белков. Рибосому иногда рассматривают как единый макромолекулярный комплекс, поскольку она представляет собой весьма крупный и структурированный конгломерат из множества различных компонентов. Можно считать ее чем-то вроде большого робота, синтезирующего белки.

Когда на основе генов, кодирующих белки, вырабатываются молекулы информационной РНК, эти молекулы выводятся за пределы ядра и направляются в ту область клетки, где и расположены рибосомные роботы. Молекулы информационной РНК постепенно пропускаются через рибосому. Так генетические инструкции, которые несет информационная РНК, считываются рибосомой. В результате появляется череда аминокислот, соединенных вместе в нужном порядке. Именно рибосомная РНК осуществляет реакцию, посредством которой та или иная аминокислота соединяется со своей соседкой. В результате получается длинная и стабильная белковая молекула.

Информационная РНК пропускается сквозь одну рибосому, и в это же время другая рибосома может прикрепляться к началу того же послания, также создавая белковые цепочки. Вот почему одна молекула информационной РНК может использоваться как матрица для изготовления множества копий одного и того же белка. Этот процесс схематически показан на рис. 11.1.

Рис. 11.1. Молекула информационной РНК движется сквозь рибосому слева направо. Рибосома при этом выстраивает белковую цепочку. Когда начало информационной РНК появляется из рибосомы, которая с ней работает, оно может встретиться с другой рибосомой. В результате одной и той же молекулой информационной РНК могут единовременно заниматься несколько рибосом. Все эти рибосомы будут синтезировать полноразмерные белки.

Аминокислоты доставляются к рибосомам другим типом мусорной РНК — транспортной РНК, или тРНК. Это довольно маленькие некодирующие РНК, их длина составляет примерно 75-95 нуклеотидных оснований^3. Но они способны складываться, создавая затейливую трехмерную структуру, которую обычно называют «лист клевера». К одному концу тРНК прикреплена определенная аминокислота. На другом конце находится петелька из трех нуклеотидных оснований. Этот триплет может соединяться с определенной последовательностью молекулы РНК. В сущности, тут используются такие же правила, как и при образовании нуклеотидных пар ДНК.

Молекулы тРНК служат своего рода посредниками между нуклеотидной последовательностью, которую несет информационная РНК (а изначально — ДНК), и синтезируемым белком. Молекулы тРНК обеспечивают выстраивание аминокислот в должном порядке, благодаря чему как раз и возникает соответствующий белок. Схематически это показано на рис. 11.2. Когда две аминокислоты удерживаются рядом друг с другом на рибосоме, рибосомная РНК может провести химическую реакцию, которая присоединяет хвост одной аминокислоты к голове соседней. Так и формируется белковая цепочка.

Рис. 11.2. По мере того, как информационная РНК движется сквозь рибосомы, молекулы транспортной РНК подводят нужные аминокислоты на нужные места в цепочке (на основании правил образования пар нуклеотидных оснований). Аппаратура рибосомной РНК соединяет соседние аминокислоты, образуя белковую цепочку.

Некоторые из триплетов, расположенных на информационной РНК, не соответствуют никаким триплетам транспортной РНК. Их называют стоп-сигналами. Когда рибосома считывает такой сигнал, она не может поместить тРНК в нужное место, в результате чего рибосома отсоединяется от информационной РНК, и белок прекращает расти. Это те самые элементы крыши из конструктора «Лего», о которых мы говорили в главе 7. Затем рибосома находит другую молекулу информационной РНК для трансляции ее в белок — или же возвращается к началу первой молекулы.

Хотя в основе всей этой сложнейшей процедуры лежит деятельность гигантского комплекса, в состав которого входят 4 типа рибосомной РНК и около 80 белков, процесс добавления новых аминокислот к растущему белку идет весьма быстро. Нелегко точно измерить его скорость в человеческих клетках, но вот у бактерий каждая рибосома может пристраивать аминокислоты к растущему белку со скоростью около 200 аминокислот в секунду. Возможно, процесс идет не так стремительно, как в человеческих клетках. Но эти 200 аминокислот все равно достраиваются примерно за вдесятеро меньшее время по сравнению с тем, какое понадобилось бы нам для скрепления друг с другом всего пары элементов «Лего» при строительстве нашей игрушечной башни. И не забудьте, что рибосома скрепляет друг с другом не первые попавшиеся кирпичики «Лего». Представьте, что нам нужно всякий раз выбирать лишь по 2 из 20 типов строительных блоков (существует 20 различных аминокислот) и затем скреплять такие блоки друг с другом в нужном порядке, проделывая эту операцию много раз в секунду. Непростая задача.

Наши клетки вынуждены ежесекундно производить миллионы белковых молекул, так что нам нужно, чтобы наши рибосомы действовали очень эффективно. Кроме того, для удовлетворения спроса на белки требуется очень много рибосом — до 10 миллионов миниатюрных роботов в отдельной клетке^4. Чтобы создавать достаточное количество рибосом, наши клетки обзавелись множеством копий рРНК-генов. Вместо того, чтобы зависеть от процесса создания рРНК по классической схеме, когда один ген наследуется от каждого из родителей, мы наследуем около 400 рРНК-генов, распределенных по 5 различным хромосомам^5. Согласитесь, огромное богатство. Благодаря этому, в частности, у нас не очень-то высока вероятность заболеваний, вызываемых мутациями этих генов. Ведь если одна из копий мутирует, всегда есть масса запасных. Поэтому наш организм, скорее всего, сумеет компенсировать дефект благодаря всем нормальным версиям гена, кодирующим ту же самую молекулу рРНК. Иное дело — мутации генов, кодирующих белки: такие гены также присутствуют в рибосомах. Мы пока не успели детально изучить функции многих из этих генов. Некоторые, судя по всему, вообще не играют важной роли в функционировании рибосом. Но есть здесь и такие гены, мутация которых все-таки вызывает заболевания.

Два наиболее известных примера — анемия Даймонда-Блекфена и синдром Тричера Коллинза. Их причиной служат наследуемые мутации двух разных генов, кодирующих белки. Следствие такой мутации в обоих случаях — уменьшение количества рибосом. Номы еще не до конца понимаем, как именно это влияет на функционирование клеток. Ведь если единственный важный фактор — снижение числа рибосом, клинические последствия будут одинаковы в обоих случаях. Однако это не так. Главный симптом анемии Даймонда-Блекфена — нарушение процессов выработки красных кровяных телец. Основные симптомы при синдроме Тричера Коллинза — деформации головы и лица, приводящие к проблемам с дыханием, глотанием и слухом^6.

Поскольку нам требуется много рибосом, а значит, и много рРНК-генов, логично предположить, что нам нужно и много тРНК-генов, чтобы обеспечивать нас большим количеством молекул транспортной РНК для доставки аминокислот к рибосомам. В человеческом геноме около 500 тРНК-генов, распределенных почти по всем хромосомам^7. Это дает такие же преимущества, как и наличие множества копий рРНК-генов.

Возможно, между рРНК и импринтингом существует некое странное и интригующее перекрывание. Как уже говорилось в главе 10, среди больных синдромом Прадера-Вилли есть небольшое количество пациентов, у которых заболевание затрагивает лишь одну зону мусорной ДНК. Эта зона кодирует целый набор некодирующих РНК. Такие РНК называются малыми ядрышковыми РНК[32]. Эти некодирующие РНК мигрируют к области ядра, которая называется ядрышком и которая играет очень важную роль в биологии рибосом. Ядрышко — то место, где происходит сборка зрелых рибосом (см. рис. 11.3).

Рис. 11.3. Молекулы информационной РНК для рибосомных белков создаются в ядре и затем доставляются к существующим рибосомам цитоплазмы. Новые рибосомные белки переносятся обратно, в определенную область ядра. Там они соединяются с молекулами рибосомной РНК, создавая новые рибосомы, которые затем выводятся в цитоплазму, чтобы действовать в ней.

В ядрышке эти рРНК и белки модифицируются. Затем из них в процессе сборки создаются зрелые «нетронутые» рибосомы, которые выводятся обратно в цитоплазму. Они готовы осуществлять свои функции роботов, создающих белки. Малые ядрышковые РНК требуются для того, чтобы определенные модификации должным образом происходили в молекулах рРНК. Подобно тому, как ДНК и гистоны можно модифицировать, пристраивая к ним метильную группу, молекулы рРНК также можно метилировать. Вероятно, малые ядрышковые РНК облегчают этот процесс, находя на рРНК участки, где могут образовывать нуклеотидные пары. Опять-таки, в основе этого — связывание соответствующих нуклеотидных оснований двух нуклеиновых молекул. После того, как соединение произошло, малые ядрышковые РНК привлекают ферменты, способствующие пристраиванию метильных групп к молекулам рРНК. Вероятно, это чем-то похоже на то, как длинные некодирующие РНК привлекают ферменты, модифицирующие гистоны[33]. Пока еще не вполне ясно, почему эти модификации важны для рРНК. Согласно одной из гипотез, они помогают стабилизировать взаимодействия между молекулами рРНК и рибосомными белками.

Есть искушение предположить, что причиной симптомов, возникающих при синдроме Прадера-Вилли, как раз и является неправильный контроль рРНК-модификаций со стороны малых ядрышковых РНК. Но пока это лишь версия. Проблема в том, что теперь мы понимаем: малые ядрышковые РНК могут также таргетировать и многие другие типы молекул РНК. Поэтому нельзя с уверенностью сказать, в каком из процессов у больных детей происходят нарушения.

Рибосомы — чрезвычайно древние образования. Их можно обнаружить в весьма примитивных организмах, к примеру, даже у бактерий — крошечных одноклеточных, в клетках которых нет ядра, а значит, ДНК у них не отделена от цитоплазмы. Специалисты по эволюционной биологии часто используют ДНК-последовательности генов, кодирующих различные рРНК, чтобы проследить, как отделялись друг от друга виды, со временем оказавшиеся на разных ветвях эволюционного древа.

Бактерии отделились от более сложных организмов примерно 2 миллиарда лет назад^8. Поэтому, хотя мы все-таки обнаруживаем рРНК-гены у этих наших одноклеточных родичей (очень дальних), эти гены сильно отличаются от наших. Оказывается, это очень хорошо! Некоторые из наиболее распространенных и наиболее успешно действующих антибиотиков работают благодаря ингибированию бактериальных рибосом^9. В числе этих препаратов — тетрациклин и эритромицин. Они нарушают деятельность бактериальных рибосом, но не человеческих. Мы сегодня так привыкли использовать антибиотики, что подчас забываем, какую важную роль они сыграли в развитии медицины. Начиная с момента своего триумфального появления в 1940-е годы, антибиотики сохранили жизни миллионов людей. И многих из них удалось спасти благодаря тому, что у разных видов по-разному устроено то, что пуристы назвали бы мусорной ДНК. Не правда ли, забавно?

Мы зависим от тех, кто нас захватил

Еще забавнее то, что каждый из нас колонизирован организмами, появившимися (в эволюционном смысле), вероятно, примерно тогда же, когда наши прародители отделились от предков современных бактерий. Собственно, «колонизирован» — это еще мягко сказано. И наше выживание, и выживание всех других многоклеточных на Земле, от травы до зебр, от китов до червей, в огромной мере зависит от этой колонизации. От нее зависит даже выживание дрожжей, тех самых, которые мы используем для приготовления хлеба и пива.

Миллиарды лет назад в клетки наших самых первых предков вторглись крошечные организмы. На этой стадии, вероятно, не существовало организмов размером более 4 клеток, да и они, эти клетки, не отличались особой специализированностью. Вместо того, чтобы начать войну друг с другом, захваченные клетки и их микроскопические захватчики пришли к компромиссу, от которого выиграли обе стороны. Так завязалась прекрасная дружба, длящаяся уже миллиарды лет.

Эти крошечные организмы постепенно превратились в важнейшие компоненты наших клеток — митохондрии. Они расположены в цитоплазме. По сути, эти субклеточные органеллы — миниатюрные генераторы, вырабатывающие энергию, которая требуется нашему организму для выполнения всех его стандартных функций. Именно митохондрии позволили нам использовать кислород для извлечения полезной энергии из пищевых продуктов. Без них мы оставались бы зловонными четырехклеточными ничтожествами, которым едва-едва хватало бы энергии хоть на что-то полезное.

Почему мы так уверены, что митохондрии — потомки микроорганизмов, некогда живших отдельно от нас? Вот одна из причин такой уверенности: у митохондрий свой собственный геном. Он куда меньше, чем «настоящий» человеческий геном, хранящийся в ядре клетки. Его длина чуть больше 16 500 пар нуклеотидных оснований: сравните с 3 миллиардами пар оснований ядерного генома. В отличие от наших хромосом, митохондриальный геном уложен в кольцевую структуру. В нем лишь 37 генов. Примечательно, что более половины из них не кодируют белки. Двадцать два гена кодируют молекулы митохондриальной тРНК^10, а два гена — молекулы митохондриальной рРНК. Это позволяет митохондриям производить рибосомы, которые затем используются для создания белков по инструкциям других генов митохондриальной ДНК[34]’11.

В эволюционном смысле это кажется очень рискованной стратегией. Функционирование митохондрий невероятно важно для всего живого, а функционирование рибосом — еще важнее для функционирования митохондрий. Почему же столь важный процесс не обеспечен системой подстраховки в виде дополнительных копий рибосомных генов в наших клеточных электростанциях?

Дело в том, что митохондриальная ДНК наследуется не так, как ядерная ДНК. В ядре мы наследуем по одному набору хромосом от каждого из родителей. А вот с митохондриальным наследованием дело обстоит иначе. Мы наследуем митохондрии лишь от матери. Может показаться, что это еще более рискованный сценарий. Ведь если мы унаследуем от матери мутантный митохондриальный ген, нам не придется рассчитывать на запасной отцовский.

Но тут (конечно же) есть свои тонкости. Мы получаем от матери не одну митохондрию, а сотни тысяч (возможно, до миллиона). И они не одинаковы с генетической точки зрения, поскольку не все происходят от одной митохондрии клетки-предшественницы. Всякий раз, когда клетка делится, ее митохондрии также делятся — и передаются дочерним клеткам. Даже если в каких-то из этих митохондрий и возникнут мутации, в клетке всегда будет иметься множество других митохондрий — вполне нормальных.

Это не значит, что здесь никогда не случается никаких сбоев. Зачастую проблемы связаны с тРНК-генами митохондриальной ДНК. Это приводит к ослаблению и атрофии мышц^12, потере слуха^13, гипертонии^14, сердечным неполадкам^15. Впрочем, у разных пациентов симптомы могут существенно отличаться — даже в пределах одной и той же семьи. Наиболее вероятная причина этого в том, что симптомы, возможно, начинают возникать, лишь когда доля мутантных митохондрий в той или иной ткани достигает какого-то порогового значения. А это, скорее всего, происходит лишь на сравнительно позднем этапе жизни, становясь следствием случайного и неравномерного распределения «хороших» и «плохих» митохондрий при делении клеток.

Неужели всего этого недостаточно, чтобы показать: РНК — не какая-то бедная родственница ДНК, не «низший вид» по сравнению с белками? Тогда задумайтесь вот над чем. Несмотря на то, что ДНК может считаться олицетворением биологии, вся жизнь на Земле, видимо, произошла все-таки не от ДНК, а от РНК.

В начале была РНК (по-видимому)

ДНК — великая молекула. Она хранит в себе массу информации. Благодаря структуре ДНК (знаменитой двойной спирали) эту информацию легко копировать, при этом молекула удивительно стабильна. Но если попытаться заглянуть в далекое прошлое, когда, миллиарды лет тому назад, жизнь на Земле только зарождалась, трудно представить, что это случилось на основе ДНК-генома.

Дело в том, что ДНК великолепно умеет хранить информацию, но при этом совершенно бесполезна, когда речь заходит о создании чего-либо на базе этой информации. ДНК не в состоянии действовать как фермент, а потому не в состоянии сделать даже свою копию. Как же она могла стать исходным генетическим материалом?

Но если мы обратимся к рРНК, молекуле, которая не пользуется особой славой даже среди ученых (ну, среди большинства из них), то мы придем к некоему озарению. Молекула рРНК содержит информацию о нуклеотидной последовательности, однако одновременно является и ферментом! Очень вероятно, что РНК могла выполнять в прошлом целый ряд ферментативных функций, а это могло привести к эволюционному развитию системы самоподдерживающейся и самораспространяющейся генетической информации.

В 2009 году вышла удивительная статья, авторы которой описывали, как они создали именно такую систему. Они генетическим путем сотворили две разновидности молекул РНК, каждая из которых могла вести себя как фермент. Когда в лабораторных условиях к смеси этих молекул добавили необходимое им сырье (в том числе отдельные РНК-основания), эти две разновидности молекул принялись делать копии друг друга. Используя существующие РНК-последовательности как матрицы для новых молекул, они производили идеальные копии. По мере того, как их снабжали сырьем, они штамповали всё новые и новые копии. Система стала самоподдерживающейся. Исследователи пошли еще дальше. Они смешали большее число разновидностей РНК, каждая из которых обладала ферментативным действием. Запустив эксперимент, ученые обнаружили, что численность двух последовательностей быстро превысила численность всех остальных. По сути, складывалась не только самоподдерживающаяся система, но и система, способная на самостоятельный внутренний отбор. Наиболее эффективные пары молекул РНК воссоздавали себя гораздо стремительнее, чем другие пары^16. А совсем недавно удалось создать разновидность ферментативной РНК, которая сама создает собственные копии (то есть ей даже не нужна для этого пара)17.

В Великобритании до сих пор можно услышать старинную пословицу «Где грязь, там и медь», означающую, что деньги можно получать из всякой дряни. Может быть, где мусор, там и жизнь?

Глава 12. Включить и усилить

«Бугатти вейрон» — самый дорогой автомобиль для езды по обычным дорогам. Стоит он всего-навсего 1 миллион 700 тысяч долларов. Трудно определить, какая машина самая дешевая. Возможно, на эту честь может претендовать «дачия сандеро»: ее цена — примерно процент от цены «вейрона». Однако у обоих транспортных средств есть много общего. В частности, оба необходимо завести, прежде чем куда-нибудь на них поехать. Если вы не запустите двигатель, у вас ничего не выйдет.

С нашими генами, кодирующими белки, такая же история. Пока их не активируют и не скопируют на информационную РНК, они не будут ничего делать, оставаясь просто инертными фрагментами ДНК, точно так же, как роскошный «вейрон» остается лишь грудой металла и аксессуаров, пока вы не повернете ключ зажигания. Включение гена зависит от участка мусорной ДНК, называемого промотором. Промотор располагается в начале каждого гена, кодирующего белок.

Если представить себе автомобиль традиционного типа, то промотор — это скважина для ключа зажигания. Сам ключ — это комплекс белков, которые соединяются с промотором. Эти белки называются транскрипционными факторами. Они, в свою очередь, связываются с ферментом, который создает информационные РНК, содержащие копии гена. Такая последовательность событий как раз и вызывает экспрессию гена (и управляет ею).

Сравнительно просто выявить промоторы, анализируя ДНК-последовательности. Промоторы всегда встречаются непосредственно перед областями, кодирующими белки. Кроме того, обычно они содержат характерные ДНК-мотивы. Дело в том, что транскрипционные факторы — особый тип белков, способных распознавать определенные ДНК-последовательности и связываться с ними. При анализе эпигенетических модификаций промоторов мы можем выявить некую устойчивую картину. У промоторов имеются определенные наборы эпигенетических модификаций, в зависимости от того, активен ли ген в клетке. Эти эпигенетические модификации — немаловажные регуляторы процессов связывания транскрипционных факторов. Некоторые модификации привлекают транскрипционные факторы и соответствующие ферменты, что приводит к экспрессии гена. Другие же препятствуют связыванию транскрипционных факторов, что очень затрудняет включение гена.

Ученые могут скопировать промотор и встроить его в какой-то другой участок генома или даже в геном другого организма. Такие эксперименты подтвердили, что промоторы обычно действуют, располагаясь непосредственно перед геном. Удалось показать также, что промотор должен «указывать» в нужном направлении. Если вы вставите промотирующую последовательность перед геном, но «задом наперед», она не будет работать. Это как если бы вы вверх ногами вставили ключ в замок зажигания. Действие промоторов зависит от их ориентации.

Промоторы толком не различают гены, которые они контролируют. Они просто включают ближайший ген, если находятся от него на достаточно небольшом расстоянии и «указывают» в нужном направлении. Это позволяет ученым использовать промоторы для управления экспрессией каждого интересующего их гена. Очень удобно для экспериментаторов. Но есть у этих процессов и обратная сторона. При некоторых формах рака основная проблема (на молекулярном уровне) сводится к тому, что ДНК наших хромосом «запутывается», и промотор запускает экспрессию не того гена. Для онкологических заболеваний речь идет о гене, который увеличивает скорость размножения клеток. Впервые такое явление обнаружили, исследуя разновидность рака крови, именуемую лимфомой Бёркитта (вероятно, она по-прежнему остается самым известным примером данного процесса). При этом недуге сильный промотор, находящийся на хромосоме 14, начинает располагаться «выше» гена хромосомы 8, кодирующего белок, способный существенно ускорять размножение клеток[35],1. Последствия могут быть катастрофическими. Белые кровяные тельца (лейкоциты), несущие в себе такую перестановку, растут и делятся очень быстро, в результате чего их доля в крови неуклонно увеличивается. При ранней диагностике заболевания можно вылечить свыше половины пациентов, хотя для этого требуется интенсивная химиотерапия^2. У тех, кому поставили диагноз слишком поздно, угасание идет ужасающе быстро, приводя к летальному исходу за какие-то недели.

В здоровых тканях различные промоторы могут проявлять активность лишь в определенных типах клеток — обычно благодаря тому, что они полагаются на транскрипционные факторы, экспрессируемые лишь некоторыми, определенными типами клеток. Кроме того, промоторы обладают различной силой. Что имеется в виду? Сильные промоторы включают гены весьма агрессивным образом, в результате порождая множество копий информационной РНК, формируемой на основе гена, кодирующего белок. Именно это происходит при лимфоме Бёркитта. Слабые промоторы меньше влияют на уровень генетической экспрессии. Сила промотора в клетках млекопитающих зависит от множества параметров и особенностей этих клеток, в том числе от ДНК-последовательности, но также от наличия и доступности транскрипционных факторов, от эпигенетических модификаций и, вероятно, от целого ряда других переменных, которые мы пока не знаем.

Управляя плавно меняющимся откликом

Каждый конкретный промотор в каждом конкретном типе клеток вызывает относительно постоянный уровень генетической экспрессии — по крайней мере, в экспериментальных системах. Однако при обычных обстоятельствах экспрессия генов — явление не пороговое. Гены могут экспрессироваться в разной степени. Сравним это с возможностью придавать машине любую скорость от одной мили в час до максимальной (больше 250 миль в час для «вейрона», меньше половины этой величины для «сандеро»). В клетках такая гибкость достигается благодаря целому ряду взаимодействующих процессов, в том числе и эпигенетических. Однако на нее влияет и еще одна область мусорной ДНК — так называемый энхансер.

По сравнению с промоторами энхансеры — штука очень туманная. Обычно они представляют собой последовательности длиной в несколько сотен пар нуклеотидных оснований, однако такие области почти невозможно идентифицировать лишь при помощи анализа ДНК-последовательности^3. Они просто слишком разнообразны. Выявление энхансеров затруднено еще и тем, что они не обязательно функционируют постоянно. Так, удалось выявить набор латентных энхансеров, который начинает регуляцию генетической экспрессии, лишь когда сами эти энхансеры каким-то образом активируются неким стимулом. А значит, вполне возможно, что в геномной последовательности не существует каких-то изначально заданных областей-энхансеров со строго определенной ролью.

Воспалительная реакция — первый рубеж обороны организма при защите, к примеру, от бактериальных инфекций. Клетки, расположенные близ места вторжения захватчиков, выделяют химические вещества и сигнальные молекулы, которые создают для чужаков весьма враждебную среду. Это как если бы срабатывание домашней сигнализации вызывало целый ливень горячей и вонючей жидкости, обрушивающийся на комнату, куда проник незадачливый взломщик.

Ученые, исследующие воспалительный отклик организма, одними из первых сумели показать, что ДНК-последовательности могут при необходимости становиться энхансерами. Выяснилось, что как только воспалительный стимул исчезает, энхансеры не возвращаются в инертное состояние. Они остаются энхансерами, готовыми снова повысить уровень экспрессии соответствующих генов, если клетки вновь встретятся с этим воспалительным стимулом^4. По-видимому, не случайно эти энхансеры регулируют деятельность генов, вовлеченных в отклик организма на вторжение чужаков. Такая память, проявляемая в виде экспрессии генов, может позволять организму как можно эффективнее и быстрее побеждать инфекцию. Это большое преимущество.

Эпигенетика и энхансеры: интенсивное общение

Итак, гены могут сохранять память даже после исчезновения стимула. Каким образом? В частности, благодаря эпигенетике. Эпигенетические модификации способны облегчить последующую активацию генов, поддерживая их в сравнительно «неподавленном» состоянии. Это как с врачом, который не уехал в отпуск, а дежурит и ждет вызова. В вышеописанном исследовании ученые показали, что определенные гистонные модификации оставались на «новых» энхансерах и после исчезновения воспалительного стимула, тем самым поддерживая эти энхансеры в состоянии боевой готовности.

Вообще говоря, мы начинаем чуть больше продвигаться в идентификации энхансеров по эпигенетическим модификациям, которые не зависят от соответствующих ДНК-последова-тельностей. Эти модификации могут использоваться как функциональные маркеры, показывающие, как клетки определенного типа используют данный фрагмент ДНК. Удалось показать также, что эти модификации порой меняются при онкологических заболеваниях, создавая различные картины генетической экспрессии, а те могут вносить свой вклад в клеточные трансформации, которые, в свою очередь, как раз и приводят к раковым процессам^5.

Но даже если нам все-таки удается найти эпигенетический «автограф», который указывает, что мы, возможно, имеем дело с энхансером, нам все равно мешает еще одна проблема. Мы не знаем, на какой ген, кодирующий белок, он влияет. Это можно попытаться выяснить лишь одним способом — разрушая энхансер при помощи генетических манипуляций и затем оценивая, на какие гены воздействует такая перемена. Дело в том, что энхансеры функционируют не так, как промоторы. Энхансеры работают независимо от своей ориентации. Иными словами, неважно, в какую сторону они «указывают». Есть и еще более резкое различие: энхансеры могут располагаться очень далеко от того кодирующего белок гена, на экспрессию которого они влияют.

Кроме того, энхансеров гораздо больше, чем мы могли бы ожидать. В ходе недавнего широкомасштабного исследования изучались картины гистонной модификации примерно в 150 человеческих клетках. При поиске рисунков модификаций, похожих на энхансерные, оказалось возможным выявить около 400 тысяч кандидатов на роль областей-энхансеров^6. Это гораздо больше, чем требовалось бы в случае существования взаимно однозначного соответствия между энхансерами и генами, кодирующими белки. И даже если мы предположим, что длинные некодирующие РНК тоже обладают энхансерами, это число все равно окажется слишком большим.

Не все энхансеры обнаружились в каждом типе клеток. Это вполне согласуется с моделью, в которой один и тот же фрагмент ДНК может обладать разными функциями в разных типах клеток, в зависимости от своих эпигенетических модификаций.

Сегодня нет четких моделей функицонирования энхансеров. Ученые предполагают, что во многих случаях они очень сильно зависят от генетического мусора иного типа — от длинных некодирующих РНК. Собственно, некоторые классы длинных некодирующих РНК могут экспрессироваться на самих энхансерах^7. Многие длинные некодирующие РНК участвуют в процессах подавления экспрессии генов. Но теперь немало ученых считают, что существует и обширный класс длинных некодирующих РНК, усиливающих экспрессию генов. Впервые такую гипотезу высказали применительно к длинным некодирующим РНК, которые регулируют соседствующие с ними гены. В ходе ряда экспериментов искусственное усиление экспрессии длинной некодирующей РНК приводило к усилению экспрессии ближайшего к ней гена, кодирующего белок. И наоборот, искусственное подавление экспрессии длинной некодирующей РНК приводило к снижению экспрессии гена, кодирующего белок^8.

Дальнейшие подтверждения этой гипотезы удалось получить, анализируя временной характер включения/выключения длинных некодирующих РНК и информационных РНК, которые ими регулируются (как считали ученые). Исследователи подвергали клетки воздействию стимула, который, как они уже знали, вызывает экспрессию определенного гена. Как выяснилось, усиливающая («энхансерная») длинная некодирующая РНК включалась раньше, чем информационная РНК близлежащего гена, кодирующего белок9,10. Это отвечает модели, согласно которой длинная некодирующая РНК, расположенная в области-энхансере, включается в ответ на стимул, а затем, в свою очередь, помогает усилить экспрессию гена, кодирующего белок (или включить этот ген).

Длинная некодирующая РНК способствует такому усилению не сама по себе. Для успешного осуществления процесса необходимо присутствие большого комплекса белков. Такой комплекс называется медиатором. Длинная некодирующая РНК связывается с медиатором, направляя его деятельность на близлежащий ген. Один из белков медиатора способен пристраивать эпигенетические модификации к соседствующему с ним гену, кодирующему белок[36]. Это помогает рекрутировать фермент, создающий копии информационной РНК. Затем эти копии используются как матрицы для производства белка.

Существует неизменная взаимосвязь между медиатором и длинной некодирующей РНК. Искусственно вызванные понижения уровня экспрессии длинной некодирующей РНК или какого-то белка, входящего в состав медиатора, всякий раз приводили к понижению уровня экспрессии ближайшего гена^11.

Важность физического взаимодействия между длинными некодирующими РНК и медиатором показали на примере одного из генетических заболеваний человека. Речь идет о синдроме Опица-Каведжиа. Дети, родившиеся с этим недугом, испытывают трудности при обучении, у них пониженный мышечный тонус и непропорционально большая голова^12. Они наследуют мутацию одного-единственного гена. Этот ген кодирует белок медиатора, взаимодействующего с молекулами длинной некодирующей РНК[37].

Чем больше ученые анализировали деятельность медиатора, тем интереснее им становились эти исследования. Одной из причин такого интереса явилось то, что медиатор отвечает за действия группы энхансеров, обладающих необычными способностями. Это так называемые суперэнхансеры. Они играют особенно важную роль в эмбриональных стволовых клетках (ЭС-клетках), плюрипотентных клетках человеческого организма, которые способны стать клетками практически любого типа^13.

Суперэнхансеры — кластеры энхансеров, действующих сообща. По размерам эти кластеры примерно вдесятеро больше обычных энхансеров, а потому могут связываться с огромным количеством белковых молекул. В этом они значительно превосходят обыкновенные энхансеры. Суперэнхансеры способны резко усиливать экспрессию регулируемых ими генов. Но дело не только в числе белков, с которыми они связываются. Ученых больше интересует, что это за белки.

Как мы уже видели (глава 8), ЭС-клетки не остаются плюрипотентными по каким-то случайным причинам или просто в силу своей пассивности. Чтобы ЭС-клетки сохраняли свой потенциал, они должны очень тщательно регулировать собственные гены. Даже сравнительно малые возмущения в генетической экспрессии могут толкнуть ЭС-клетку по пути, который превратит ее в клетку специализированную. Представьте себе известную игрушку — гибкую шагающую пружину «слинки». Установим ее на верхней ступеньке длинного лестничного пролета. Малейшего толчка в нужную сторону достаточно, чтобы «слинки» начала свое весьма долгое путешествие. Может быть, лучше представить себе «слинки», которую удерживает от спуска по ступенькам небольшой грузик, прикрепленный к ее верхнему концу. Уберите груз — и пружина зашагает вниз.

Существует целый набор белков, абсолютно необходимых для поддержания плюрипотентности ЭС-клеток. Эти белки называются главными регуляторами (master regulators). Их можно уподобить грузику на верхнем конце «слинки». Уровень экспрессии главных регуляторов в ЭС-клетках очень высок, однако в специализированных клетках он гораздо, гораздо ниже.

Важную роль этих белков недвусмысленно продемонстрировали в 2006 году. Японские ученые искусственно экспрессировали комбинацию из четырех таких главных регуляторов в клетках, уже прошедших дифференциацию, обеспечив при этом очень высокие уровни экспрессии. Как ни поразительно, это породило целую череду молекулярных событий, кульминацией которых стало создание клеток, по своему действию почти идентичных ЭС-клеткам^14. Это как если бы «слинки» вдруг прошагала с нижней ступеньки обратно на верхнюю. Клетки, созданные таким способом[38], в организме могут превращаться в человеческие клетки практически любого типа. Замечательная работа. Изыскания, которые за ней последовали, вызвали большое воодушевление. Ведь теперь в принципе оказалось возможным выращивать клетки-заменители для лечения огромного числа заболеваний — от слепоты и диабета первого типа до болезни Паркинсона и сердечной недостаточности.

До развития этой новой технологии ученые испытывали огромные трудности при создании нужных клеток для лечения тех или иных болезней человека. Дело в том, что клетки, взятые у одного человека, обычно не удается спокойно имплантировать другому. Иммунная система распознает донорские клетки как чужеродные и уничтожает их, как если бы они являлись организмом-захватчиком. Однако, как показано на рис. 12.1, теперь мы в принципе имеем возможность производить клетки, идеально подходящие конкретному пациенту.

Рис. 12.1. Теория, в принципе позволяющая использовать клетки, выращенные на основе биоматериала пациента, для лечения этого конкретного пациента.Имплантируйте клетки в организм пациента.

На основе этой работы 2006 года возникла целая отрасль промышленности, потенциальный оборот которой составляет миллиарды долларов. Кроме того, исследователи получили одну из самых «быстрых» Нобелевских премий по физиологии и медицине: им присудили ее всего через 6 лет после первой публикации^15.

В нормальных ЭС-клетках некоторые белки, являющиеся главными регуляторами, при соединении с суперэнхансерами дают очень высокую плотность белков в зоне связывания. Сами же суперэнхансеры регулируют некоторые ключевые гены, поддерживающие плюрипотентное состояние клеток. В тех же местах очень высока концентрация комплекса-медиатора. Подавление экспрессии одного из главных регуляторов или медиатора оказывает весьма схожее воздействие на экспрессию этих ключевых генов. Уровни экспрессии падают, и увеличивается вероятность того, что ЭС-клетки начнут дифференцироваться, превращаясь в клетки специализированные.

Поскольку плюрипотентное состояние ЭС-клеток во многом определяется высокими уровнями экспрессии главных регуляторов, неудивительно, что сами главные регуляторы контролируются суперэнхансерами. Это создает систему с положительной обратной связью (см. рис. 12.2).

Циклы с положительной обратной связью сравнительно редко встречаются в биологии — главным образом из-за того, что в том случае, если они начнут вести себя как-то не так, их трудно будет снова обуздать. По счастью, кодирующие белок гены, регулируемые суперэнхансерами, весьма чувствительны к малейшим изменениям связывания главных регуляторов и к целому ряду других факторов. А значит, не исключено, что даже небольшого изменения в балансе этих факторов может оказаться достаточно для прерывания этого цикла с положительной обратной связью, что позволит клеткам не оставаться плюрипотентными, а начать дифференциацию. В конце концов, обычно не требуется больших усилий, чтобы столкнуть пружину «слинки» с лестницы.

Сообщалось также о наличии суперэнхансеров в клетках злокачественных опухолей. Вероятно, там они взаимодействуют с генами, оказывающими ключевое воздействие на размножение клеток и развитие раковых процессов^16. Один из генов, регулируемых таким суперэнхансером, порождает лимфому Бёркитта (мы уже упоминали этот ген в данной главе). В кое-каких нормальных специализированных клетках тоже имеются суперэнхансеры. Они связываются с белками, специфическими для клеток данного типа и определяющими особенности клетки.

Рис. 12.2. Цикл с положительной обратной связью, поддерживающий высокий уровень экспрессии генов, которые отвечают за выработку главных регуляторов.

Преодолевая расстояния

В большинстве событий, которые мы описывали в этой главе, участвуют энхансеры, которые находятся сравнительно близко от таргетируемых ими генов: обычно в пределах 50 тысяч нуклеотидных оснований. Довольно легко представить себе, как это происходит: длинная некодирующая РНК и комплекс-медиатор действуют как своего рода якорь для фермента, копирующего ДНК в информационную РНК. Однако во многих ситуациях энхансер и регулируемый им ген, кодирующий белок, на хромосоме отстоят друг от друга довольно далеко: их может разделять до нескольких миллионов пар нуклеотидных оснований. Такая же разница, как между попыткой передать солонку кому-то на противоположном конце стола и попыткой передать ее кому-то, кто располагается на другом конце футбольного поля. Нелегко представить себе, каким образом может осуществляться такого рода дистанционное взаимодействие между геном и энхансером. Размеров длинной некодирующей РНК и комплекса-медиатора не хватит, чтобы перекрыть такое огромное расстояние.

Чтобы разобраться в этом процессе, придется усложнить обычный образ генома. Как правило, весьма полезно и удобно описывать ДНК как веревочную лестницу или железнодорожные пути, ибо это помогает вообразить две ее нити и то, как они удерживаются вместе посредством пар нуклеотидных оснований. Однако проблема в том, что при этом мы думаем о ДНК как о чем-то линейном, к тому же достаточно жестком, поскольку подсознательно мы сравниваем ее с твердыми предметами из более привычной нам среды.

Но мы уже знаем, что ДНК — не жесткая молекула, ведь ее можно очень сильно сплющивать, сминать, комкать, чтобы она уместилась в ядре. Так что давайте углубим наши исследования. Если все-таки принять двунитевую природу ДНК как данность (чтобы не усложнять картину), можно представить себе фрагмент нашего генома как длинную макаронину — возможно, самый длинный в мире кусок лапши тальятелле. В двух местах она отмечена пищевым красителем: эти места изображают энхансер и ген, кодирующий белок. Глядя на рис. 12.3, мы видим два возможных сценария. Пока макароны не сварили, они сохраняют жесткость, и энхансер находится вдали от гена. Но после варки макароны становятся гибкими. Теперь они могут сгибаться во всевозможных направлениях, в результате чего окрашенные участки, изображающие энхансер и ген, могут сближаться.

Некоторые части наших хромосом в определенных клетках подавляются и выключаются почти навсегда — чтобы отключить гены, которые никогда не понадобится экспрессировать в тканях данного типа. Скажем, клеткам нашей кожи незачем экспрессировать белки, которые используются кровью для переноса кислорода. В клетках кожи соответствующие области генома совершенно недоступны: они плотно свернуты и напоминают чересчур сжатую пружину. Однако в этих же клетках есть громадные области, не находящиеся в таком сверхсжатом состоянии. Гены в них вполне доступны и могут включаться. ДНК в таких зонах напоминает самую длинную вареную макаронину в мире, целиком заполняющую кастрюлю. Макаронина сгибается и извивается в кипящей воде, образуя всевозможные петли и дуги.

Рис. 12.3. Упрощенная схема показывает, как складывание гибкой молекулы ДНК может сблизить два отдаленных ее участка — скажем, энхансер и ген, кодирующий белок.

В таких случаях ген, кодирующий белок, и расположенный вдали от него энхансер могут сильно сближаться друг с другом. Затем длинная некодирующая РНК и комплекс-медиатор удерживают две петли вместе, обеспечивая усиление экспрессии гена. В этом медиатору должен помогать еще один комплекс[39]. Этот дополнительный комплекс требуется также для разделения хромосом, прошедших дупликацию в процессе деления клетки, так что он хорошо оснащен для работы с масштабными перемещениями ДНК. Мутации в некоторых генах, кодирующих белки этого дополнительного комплекса, вызывают две болезни развития — синдром Робертса и синдром Корнелии де Ланге^17. Их проявления могут быть довольно разными и, вероятно, определяются тем, какой именно ген мутирует и какова эта мутация. Обычно дети с этими заболеваниями рождаются слишком маленькими и в дальнейшем сохраняют это отставание в росте. Они испытывают трудности с обучением. Зачастую у них деформированы конечности^18.

Подобный «петлевой» механизм распространен довольно широко. Возможно, он применим не только к энхансерам. Не исключено, что с его помощью и другие регуляторные элементы сближаются с теми или иными генами. В рамках исследования трех клеточных типов, затронувшего лишь 1% человеческого генома, удалось выявить более 1000 таких дистанционных взаимодействий в каждой линии клеток. Эти сложные взаимодействия чаше всего связывали области, разделенные примерно 120 тысячами пар нуклеотидных оснований. Среди более чем 90% таких петель ближайший ген просто игнорировался. Представьте, что вам понадобилось одолжить немного сахара, и вы отправляетесь не к ближайшему соседу, а к кому-нибудь, кто живет в полумиле от вас.

Продолжим тему соседей. Описываемые внутриклеточные взаимодействия ужасающе легкомысленны. Представьте себе свингерскую вечеринку 1970-х, только во много раз более разнузданную. Исследователи обнаружили, что у некоторых генов количество различных регуляторных областей, с которыми они взаимодействуют, доходит до 20. А у некоторых регуляторных областей количество генов, с которыми они взаимодействуют, доходит до десятка. Вероятно, не все эти взаимодействия происходят в одной и той же клетке в одно и то же время. Ученые показали главное: между генами и регуляторными регионами нет добропорядочных однозначных отношений «А и В». Нет, мы имеем дело со сложным набором взаимодействий, дающим клетке (или организму в целом) необычайно гибкие возможности регулирования всего этого пестрого узора генетической экспрессии^19. Нам еще многое предстоит выяснить об этих сетях и о том, как они действуют. Сейчас дело выглядит так: мусорная ДНК, формирующая промоторы, заводит наши генетические моторы, но есть и мусорная ДНК, формирующая длинные некодирующие РНК и энхансеры. Она-то и превращает двигатель из слабенького сандеровского в такой, который вполне может разогнать «вейрон» на автостраде жизни.

От кустарного промысла до фабричного конвейера

Несомненно, образование петель между отдельными регуляторными областями и генами — явление примечательное. Однако в клетках происходит и череда других дистанционных взаимодействий, еще более впечатляющая. Чтобы осознать ее значение, совершим небольшой экскурс в историю. В Британии начала XIX века основную часть текстильных работ выполняла кустарная промышленность. В сущности, речь идет о надомном производстве. Каждое из таких хозяйств производило сравнительно немного. Если для какого-нибудь региона страны составить карту центров текстильного производства того времени, вы увидите множество отдельных точек, каждая из которых показывает дом, где велось производство. А полвека спустя, в эпоху промышленной революции, картина стала совершенно иной. Вместо довольно однородного распределения точек, как на полотне пуантилиста, вы увидите на карте лишь несколько больших пятен, показывающих расположение крупных фабрик.

В человеческой клетке каждого типа обычно включены тысячи генов, кодирующих белки. Эти гены распределены по нашим 46 хромосомам. Можно бы ожидать, что при анализе клеток те места, где расположены включенные гены, будут выглядеть как тысячи крошечных точек, разбросанных по всему ядру. Однако (схематически это показано на рис. 12.4) на самом деле мы увидим лишь примерно 300-500 более крупных пятен^20. Генетическая экспрессия в наших клетках — это вам не надомное производство. Она происходит в определенных местах ядра — на клеточных фабриках^21.

Рис. 12.4. Точками обозначены позиции расположенных в ядре генов, кодирующих белки. Если бы эти гены располагались в ядре лишь в зависимости от своего положения на хромосомах, мы увидели бы диффузную картину (слева). На самом деле гены группируются друг с другом в трехмерном пространстве, создавая узор генетической локализации, показанный более крупными точками (справа).

Каждая фабрика содержит от 4 до 30 копий фермента, создающего молекулу информационной РНК на основе матрицы ДНК. Кроме того, на фабрике имеется большое количество других молекул, которые требуются для выполнения этой работы22,23. Ферменты остаются на месте, а нужный ген «прокручивается» через них в ходе своего копирования^24. Чтобы ген добрался до фабрики, ДНК должна образовать петлю, дотягиваясь до нужной части клеточного ядра. Однако самый хитроумный фокус — в том, что на одной и той же фабрике может копироваться в информационную РНК более одного гена одновременно. Комбинация генов на той или иной фабрике не случайна. Как правило, там собираются гены, кодирующие те белки, которые выполняют в клетке родственные функции. Это как если бы на обычной фабрике у вас имелось несколько параллельных сборочных конвейеров. Как только все линии завершат выполнение своих индивидуальных задач, фабрика может собрать конечный продукт из получившихся компонентов. Одна фабрика делает лодки, другая выпускает миксеры. Фабрики в наших клетках обеспечивают скоординированную экспрессию генов. А значит, хромосомы одновременно образуют множество петель, сходящихся в одних и тех же областях.

Вот, к примеру, фабрика генов, кодирующих белки, необходимые для создания гемоглобина, сложной молекулы, которая переносит кислород в крови^25. Другая фабрика используется для производства белков, необходимых для формирования сильной иммунной реакции^26. Важная составляющая эффективного иммунного отклика — синтез белков, именуемых антителами. Антитела циркулируют в крови и других средах, связываясь с любыми чужеродными объектами, которые они обнаруживают. Ученые активировали клетки, вырабатывающие антитела, и стали исследовать, как ключевые гены будут образовывать петли. Изучались как раз гены, требуемые для создания антител. Как выяснилось, эти гены направлялись на одну и ту же фабрику. Любопытно, что некоторые из них при обычных условиях физически отдалены друг от друга, поскольку находятся на разных хромосомах.

Этот замечательный способ координации генетической экспрессии может повлечь за собой и некоторый риск. Лимфома Бёркитта — агрессивная форма рака, о которой мы уже упоминали в этой главе. При данном заболевании аномальным становится как раз тот тип клеток, который вырабатывает антитела. Сильный промотор с одной хромосомы занимает аномальную позицию рядом с геном другой хромосомы. До недавнего времени мы не понимали, почему эти области так склонны к объединению. Мы считали их физически отдаленными друг от друга, ведь они расположены на разных хромосомах. Но теперь нам известно, что обе области, обменивающиеся материалом и тем самым создающие эту опасную аномалию — гибридную хромосому, — способны перемещаться на фабрику, описанную чуть выше. Возможно, именно таким образом эти две различные хромосомы сближаются достаточно тесно, чтобы обменяться генетическим материалом. Не исключено, что обмен происходит, когда обе одновременно ломаются и затем неправильно ремонтируются на этой фабрике.

Может показаться, что эволюция в процессе отбора предпочла бы отбраковать эту опасную ситуацию. Но следует помнить, что естественный отбор зиждется на компромиссах, а не на стремлении к абсолютному совершенству. Возможность вырабатывать антитела, борющиеся с инфекциями, а значит, помогающие нам прожить достаточно долго, чтобы успеть размножиться, дает преимущества, явно перевешивающие потенциальные негативные последствия в виде увеличения риска развития онкологических заболеваний.

Глава 13. Ничейная земля

Когда мы вспоминаем Первую мировую войну, многие из нас сразу же представляют себе бойцов, сидящих в окопах. Противостоящие армии вгрызаются в грязные поля, чтобы месяцами пребывать в свойственной войнам «скуке, перемежаемой мгновениями острейшего ужаса»1. Между расположениями двух противников лежали разделяющие их участки «ничейной земли», они могли иметь ширину всего в сотни метров, а могли простираться и более чем на километр. По ночам солдаты вылезали из своих траншей на разведку или чтобы протянуть колючую проволоку, а бывало и так, что нужно было забрать своих раненых и тела убитых.

Геном человека содержит много областей «ничейной земли», отделяющей различные его компоненты друг от друга. Подобно топям Первой мировой, эти геномные барьеры отличаются по размеру и довольно-таки зыбки: все зависит от того, как они располагаются по отношению к движениям «войск». Как и на ничейной земле в те чудовищные годы европейской бойни, на этих участках все время что-то происходит. Тут связываются белки, складываются эпигенетические модификации, регулируются взаимодействия между различными генетическими элементами...

Для наших клеток это важно, поскольку большинство наших генов разбросаны по всему геному[40],2. Иными словами, почти все гены распределены по нашим 23 парам хромосом довольно-таки бессистемно. Как мы уже видели, гены, кодирующие белки, которые необходимы для выработки гемоглобина, сидят совсем не рядом и сближаются только благодаря изменениям в трехмерном расположении хромосом.

В наших клетках ген, кодирующий белок, который необходим для печени эмбриона, запросто соседствует с геном, кодирующим другой белок — экспрессируемый в коже взрослого человека. Существует огромное количество таких ситуаций, и это может вызывать трудности. А значит, нашим клеткам требуются барьеры между различными компонентами, чтобы поддерживать различные картины генетической экспрессии. Характер контроля должен соответствовать типу клетки и стадии развития организма. Мы вовсе не хотим, чтобы зубные гены экспрессировались у нас в глазах, а сердечные — в мочевом пузыре.

Мы знаем, что на экспрессию генов влияют эпигенетические модификации. Взять хотя бы мозг. Есть некоторые гены, которые никогда не экспрессируются в нейронных клетках. К примеру, белок кератин используется в волосах и ногтях, однако не играет никакой роли в сером веществе взрослого человека. В нейронах ген, отвечающий за синтез кератина, отключается и остается в неактивном состоянии благодаря определенной картине эпигенетических модификаций. Однако, как мы уже видели, эпигенетические модификации слепы по отношению к характеру ДНК-последовательности. Что мешает этим репрессивным модификациям проползти по геному за пределы кератинового гена, начав отключать и другие гены?

А ведь эпигенетические модификации зачастую являются самоподдерживающимися, что еще сильнее осложняет дело. Рассмотрим модификации, вовлеченные в процесс подавления генетической экспрессии. Эти модификации привлекают к себе другие белки, которые только усиливают первоначальное изменение. Следовательно, реактивировать экспрессию гена становится еще труднее. Эти белки, в свою очередь, привлекают белки, которые продолжают добавлять к ДНК-последовательности новые репрессирующие эпигенетические модификации, чтобы геи совсем уж не смог избежать инактивации. Впрочем, можно считать, что границы такого подавления достаточно размыты, поскольку эпигенетическая аппаратура не умеет распознавать конкретные ДНК-последовательности. Поэтому на периферии подавляемых областей эпигенетические модификации могут распространяться дальше, чем полагалось бы.

Останавливая распространение

В процессе эволюции наши клетки выработали любопытный способ предотвращения этого нежелательного явления. Подобно тому, как пожарные команды вырубают рощи или взрывают здания, чтобы остановить огненную стихию, наш геном иногда лишает топлива эпигенетические машины. Мусорная ДНК, служащая изолятором между инактивированными и активными областями генома, утрачивает свои гистоны. А если не будет белков-гистонов, то не будет и эпигенетических гистонных модификаций. Без модификаций не будет распространяться эпигенетическая активность. Это не позволяет репрессивным модификациям добираться до активных генов, а кроме того, предотвращает и обратный эффект. Процесс этот схематически показан на рис. 13.1.

Рис. 13.1. Вверху: картины репрессивной модификации распространяются от одного гена к соседнему. Внизу: нехватка гистонов в изолирующих областях между двумя генами предотвращает распространение репрессивных эпигенетических модификаций, поэтому ген, изображенный справа, не подвергается аномальному отключению.

Но поскольку разные клетки требуют изолирования разных областей (в конце концов, мы же хотим, чтобы кератин экспрессировался в клетках, производящих волосы), можно заключить, что самой по себе ДНК-последовательности еще недостаточно для формирования изолятора. Подобные изоляторы (инсуляторы) создаются путем комплексных и зависящих от конкретной ситуации взаимодействий между геномом и комбинациями белков, экспрессируемых клеткой в данный момент.

Один из самых важных таких белков экспрессируется почти повсеместно. Будем называть его 11-FINGER[41]. Это крупный высококонсервативный белок с характерной структурой. Складываясь в трех измерениях, он образует 11 пальцеобразных отростков (finger — от англ, палец), торчащих из него. Каждый из этих 11 пальцев может распознавать определенную ДНК-последовательность, однако не все пальцы умеют распознавать одну и ту же.

Представьте себе одиннадцатипалого пианиста. На нем шерстяные перчатки. Шерсть на каждом перчаточном пальце окрашена в один из четырех цветов. Каждая клавиша пианино также окрашена в один из четырех цветов, причем распределение окраски случайно. Правила таковы: пианист может извлекать любую ноту, какую ему заблагорассудится, но всегда должен одновременно нажимать от 2 до 11 клавиш, причем цвета перчаточных пальцев и цвета клавиш должны совпадать. Похоже, тут возможно несметное количество комбинаций. А теперь представьте, что у инструмента не десятки, а тысячи клавиш.

Вот и белок 11-FINGER способен связываться со множеством различных геномных последовательностей аналогичным образом. Он может присоединяться к десяткам тысяч мест (сайтов связывания) в человеческих клетках. Он прикрепляется не только к ДНК: 11-FINGER связывается и с белками. Представьте себе, что у нашего многопалого пианиста на тыльной стороне перчаток липучки, которые могут соединяться с пушистыми шариками. Цветные пальцы молотят по клавишам, а тыльная сторона кистей понемногу покрывается шариками.

Так и обстоит дело с белком 11-FINGER. Пальцеобразные выступы связываются с ДНК, а другие поверхности белка соединяются с белками. Конкретная картина связывания будет зависеть от конкретного набора белков, экспрессируемых клеткой. Один из белков способен менять характер скручивания ДНК, что может играть важную роль в контролировании генетической экспрессии^3. Другой белок добавляет определенные эпигенетические модификации^4. В некоторых областях разновидности геномных «незваных гостей» служат изоляторами, которые препятствуют распространению активирующих или подавляющих эпигенетических модификаций из одной области в другую^5.

Некоторые тРНК-гены могут выступать как инсуляторы. Они способны мешать процессу, в ходе которого экспрессия одного гена вызывает неподобающую экспрессию соседнего. Это еще одно преимущество обладания большим количеством тРНК-генов, показывающее, сколь экономно эволюция обычно распоряжается своим сырьем.

Схематически эти процессы показаны на рис. 13.2. Классический ген, кодирующий белок, покрыт эпигенетическими модификациями, усиливающими экспрессию этого гена. Фермент, который связывается с геном и копирует его в РНК (которая в конечном счете будет должным образом обработана для создания из нее зрелой информационной РНК), иногда может вести себя как неуправляемо катящийся поезд: начав копирование, он обычно уже не хочет останавливаться. Если поблизости окажется еще один ген, кодирующий белок, фермент может и его скопировать. Но если между генами два или больше тРНК-генов, такого не произойдет. Заметим, что тРНК-гены почти все время пребывают во включенном состоянии, поскольку они участвуют в создании всех белков. Существует фермент, копирующий тРНК-гены для создания тРНК-молекул на основе ДНК-матрицы. Однако это не тот фермент, который выполняет схожую работу, производя молекулы информационной РНК на основе классических генов, кодирующих белки. Фермент, создающий молекулы тРНК, ведет себя как здоровенный вышибала, не позволяющий другому ферменту войти и добраться до ближайшего гена. А поскольку фермент, копирующий тРНК-гены, не может связываться с классическими генами, кодирующими белки, общая генетическая экспрессия в этой области все время остается под жестким пространственным контролем^6.

Рис. 13.2. Фермент, который копирует ДНК генов, кодирующих белки, в информационную РНК, связывается с отмеченным звездочкой местом в начале гена А. Если его не остановят, фермент может продолжать копирование, пока не скопирует и кодирующий белок ген В в информационную РНК (скорее всего, копирование гена В при этом совсем не требуется). тРНК-гены копируются с ДНК на действующие молекулы тРНК при помощи другого фермента. Это останавливает работу фермента, создающего информационную РНК на основе гена А, и предотвращает неправильное использование гена В.

Многие биологи очень любят подчеркивать выгоды, которые наука получила от развития технологий ДНК-секвенирования, и всегда существует искушение счесть, что большинство серьезных прорывов в этой сфере совершаются ныне благодаря высокотехнологичным молекулярным методам. На самом же деле нам очень помогают продвигаться вперед понимание основ биологии человека и логическое мышление.

Почему XX отличается от XXX

В главе 7 мы видели, что организм самок млекопитающих всегда инактивирует одну из X-хромосом в каждой из своих клеток — чтобы уровень экспрессии генов X-хромосом у них оставался равным уровню экспрессии этих генов у самцов. Если женская клетка содержит три X-хромосомы, она отключает две из них. А если в клетке лишь одна X-хромосома, она так и остается включенной.

Отсюда следует довольно очевидное предсказание. Неважно, сколько X-хромосом в клетке, поскольку X-инактивация всегда будет гарантировать, что одна из них останется функционально активной. А следовательно, пока у человека содержится хотя бы одна X-хромосома в каждой клетке, этот человек будет совершенно нормальным и здоровым.

На самом деле это не так. Бывает, что женщины с одной-единственной X-хромосомой или с тремя X-хромосомами проявляют зримые патологические симптомы. Точно так же дело обстоит с мужчинами, наделенными двумя X-хромосомами в придачу к своей Y-хромосоме. Может быть, у таких людей не очень хорошо работает X-инактивация? Нет, вряд ли. Ведь X-инактивация — система весьма устойчивая. Маловероятно, что она будет всегда работать идеально (биология не знает таких примеров), но случайные нарушения ее функционирования не объясняют, почему все женщины с единственной X-хромосомой демонстрируют весьма схожие клинические симптомы.

У женщин с единственной X-хромосомой рост ниже среднего и недоразвиты яичники^7. У женщин с тремя X-хромосомами рост выше среднего, а кроме того, в детском возрасте у них часто возникают трудности при обучении и наблюдается отставание в развитии^8. У мужчин с двумя X-хромосомами (и, конечно, с Y-хромосомой) рост выше среднего, а яички у них могут отличаться сравнительно небольшими размерами, что приводит к пониженной выработке мужского гормона тестостерона. Для них также повышен риск возникновения трудностей при обучении^9.

Данные симптомы могут очень расстраивать пациентов и их родителей, однако симптомы эти куда мягче, нежели те, что наблюдаются у больных с аномальным количеством аутосомных хромосом (вспомните синдромы Дауна, Эдвардса и Патау). Дело в том, что у X-хромосомы большие размеры, и большинство ее генов должным образом инактивируется вне зависимости от того, сколько копий этой хромосомы имеется в клетке. Однако некоторые гены не проходят нужной инактивации.

Чтобы разобраться в происходящем, вернемся к моменту зарождения яйцеклетки или сперматозоида. На определенной стадии процесса хромосомы выстраиваются попарно, а затем хромосомы каждой пары растаскиваются по противоположным краям клетки. Клетка делится, и в каждой ее «дочке» содержится по одной хромосоме из каждой пары. Это легко себе представить на примере женской клетки. Две X-хромосомы образуют пару, которую затем можно разделить — точно так же, как любую другую пару хромосом с номерами от 1 до 22. Но когда мужской организм создает сперматозоиды, возникает проблема. Мужские клетки содержат по одной крупной X-хромосоме и по одной крошечной Y-хромосоме. Они сильно отличаются друг от друга. Однако при формировании сперматозоидов X-хромосома и Y-хромосома должны ухитриться каким-то образом найти друг друга и образовать пару, несмотря на то, что они так непохожи.

Почему им все-таки удается это проделывать? Потому что на концах у каждой X- и Y-хромосомы имеется небольшая область, в которой они очень схожи. Это позволяет им узнавать друг друга и сближаться при делении клетки, «держась за руки» до тех пор, пока им не нужно будет разлететься по противоположным концам «танцпола».

Эти области именуются псевдоаутосомными зонами. В них содержатся гены, кодирующие белки. Кроме того, они защищены от подавления при X-инактивации. С генами псевдоаутосомной зоны клеточные механизмы вообще обращаются совершенно иначе, нежели с большинством других генов X-хромосомы. Такая картина распределения активированных и инактивированных генов, приводящая к возникновению заметных патологических симптомов у мужчин и женщин с неправильным количеством X-хромосом, стала четким биологическим признаком того, что клетка обладает возможностями для функционального разделения различных блоков ДНК. И в основе этих возможностей лежат фундаментальные процессы.

X-инактивация определяется распространением по хромосоме длинной некодирующей Xist-РНК, которую эта хромосома экспрессирует. Однако Xist-РНК не распространяется в псевдоаутосомные зоны. Такая защита псевдоаутосомных зон от ее проникновения показывает: в ходе своего развития наш геном обзавелся умением проводить демаркационную линию в ключевых местах. Некогда Жан-Люк Пикар из «Звездного пути» провозгласил по поводу вылазок Борга в пространство Федерации: «Эта линия должна быть проведена здесь, не дальше!»10. Мусорные области-инсуляторы препятствуют распространению ползучего геномного паралича, исходящего из Xist-локуса.

Рисунок 13.3 показывает, как эти области, избежавшие инактивации, вызывают изменения у обладателей неправильного количества X-хромосом. Организм женщины, имеющей лишь одну X-хромосому в каждой клетке, экспрессирует в псевдоаутосомных зонах только 50% от нормального количества генетических продуктов, вырабатываемых в этих зонах у обычной женщины (то есть XX-женщины). Организм женщины, обладающей тремя X-хромосомами в каждой клетке, экспрессирует в псевдоаутосомных зонах на 50% больше генетических продуктов, чем XX-женщина. Аналогичная ситуация с организмом мужчины, обладающего двумя X-хромосомами и одной Y-хромосомой. Его аутосомные зоны вырабатывают на 50% больше генетических продуктов, чем аутосомные зоны обычного мужчины, имеющего одну X- и одну Y-хромосому.

Не случайно и мужчины, и женщины, обладающие лишней X-хромосомой, обычно выше среднего роста, а женщины с недостающей X-хромосомой — ниже. Псевдоаутосомная зона содержит определенный ген, кодирующий белок[42],11 и контролирующий экспрессию других генов. Этот ген играет важную роль в развитии скелета, а особенно — длинных костей рук и ног. У мужчин и женщин с лишней X-хромосомой экспрессия этого гена выше нормы, в результате чего обычно увеличивается длина ног, а значит, и общий рост. У женщин с нехваткой одной X-хромосомы наблюдается обратная ситуация. Это один из немногих примеров, когда можно уверенно выявить отдельный регион человеческого генома, оказывающий существенное влияние на нормальный диапазон роста человека. Впрочем, рост находится и под влиянием многочисленных участков генома вне этого региона^12, причем многие из них представляют собой участки мусорной ДНК, и мы пока не знаем, какой вклад каждый из них вносит в то, кем вы станете — баскетболистом из «Гарлем глобтроттерс» или коротышкой, которого трудно заметить в барной толпе.

Рис. 13.3. Влияние различного количества X-хромосом на мужские и женские клетки. Из-за X-инактивации в каждой клетке активна лишь одна X-хромосома. Но поскольку псевдоаутосомные зоны на обоих концах X- и Y-хромосом избегают X-инактивации, при изменении числа X-хромосом количество этих зон патологически возрастает или патологически уменьшается.

Глава 14. Проект ENCODE, или Как большая наука взялась за мусорную ДНК

Если вы когда-нибудь окажетесь в безлунную и безоблачную ночь вдали от огней большого города, раздобудьте одеяло, расстелите его на земле и, улегшись, посмотрите вверх, на звезды. Это одно из самых чудесных зрелищ, какие только можно себе вообразить. Особенно поражает оно тех, кто всю жизнь проводит в мегаполисе. Кажется, что серебристых блесток на черном бархате небес так много, что их и не сосчитать.

Но если у вас под рукой телескоп, вы поймете, что на небосводе много такого, чего не различишь невооруженным глазом. Взять хотя бы кольца Сатурна. И звезд вы обнаружите неизмеримо больше, чем могли бы себе представить. В мнимой черноте Вселенной куда больше объектов, чем можно разглядеть без помощи приборов. Это становится еще очевиднее, если применить оборудование, способное распознавать излучение, находящиеся за пределами диапазона видимых нами волн. К нам сразу потоком хлынет новая информация, поставляемая самыми разными волнами, от гамма-лучей до фонового микроволнового излучения. Эти звезды и прочие космические объекты столетия назад были там, где они находятся сейчас, просто мы не могли обнаружить их, используя лишь собственные глаза.

В 2012 году появилась масса статей, посвященных попыткам обратить своего рода телескоп на самые таинственные закоулки человеческого генома. Этой работой занялся консорциум ENCODE, объединивший усилия сотен ученых из самых разных исследовательских организаций. ENCODE — сокращение, которое расшифровывается как «Encyclopaedia Of DNA Elements» («Энциклопедия элементов ДНК»)1. При помощи самых чувствительных методов, доступных сейчас науке, исследователи изучали многочисленные свойства человеческого генома. Удалось проанализировать около 150 различных типов клеток. Получаемые данные объединяли, а затем обрабатывали по одной и той же схеме, чтобы корректно сравнивать информацию, полученную при помощи разных методик и технологий. Это очень важно, поскольку обычно чрезвычайно трудно сопоставлять наборы данных, получаемых и анализируемых независимо друг от друга. А ведь раньше нам приходилось опираться именно на такую мешанину результатов.

Публикация результатов, полученных в рамках проекта ENCODE, привлекла колоссальное внимание прессы, а также научного сообщества. Средства массовой информации запестрели заголовками типа: «Научный прорыв. Теория „мусорной ДНК“ генома опровергнута»2; «ДНК-проект интерпретирует „Книгу Жизни“»3 или «Международная армия ученых взламывает код „мусорной ДНК“»4. Надо сказать, что многие ученые действительно были приятно удивлены, увидя результаты, полученные в рамках проекта ENCODE, и теперь ежедневно используют их в собственных работах. Но возгласы одобрения звучали отнюдь не отовсюду. Критика раздавалась главным образом из двух научных лагерей. В первый входили «мусорные скептики», во второй — эволюционисты-теоретики.

Чтобы понять чувства, обуявшие ученых первой группы, обратимся к одному из самых амбициозных заявлений, приведенных в статьях ENCODE:

Эти данные позволили нам приписать биохимические функции 80% генома. Особенно это касается зон, лежащих за пределами хорошо изученных участков, то есть за пределами областей, которые кодируют белки^5.

Иными словами, участники проекта ENCODE как бы заявляли: перед нами не темное небо, лишь менее чем на 2% занятое звездами. Они утверждали: небосвод нашего генома на четыре пятых заполнен всевозможными объектами. Причем большинство объектов — отнюдь не звезды (если считать, что звезды в этом сравнении — гены, кодирующие белки). Вероятно, это астероиды, планеты, естественные спутники планет, метеоры, кометы и прочие межзвездные тела, какие только можно себе представить.

Как мы видели, многие исследовательские группы уже и до этого приписали определенные функции каким-то из этих темных областей: вспомним промоторы, энхансеры, теломеры, центромеры, длинные некодирующие РНК (это лишь несколько примеров). Так что большинство ученых вполне устраивала идея, согласно которой в нашем геноме содержится не только эта небольшая доля генетического материала, кодирующая белки. Но 80% генома, обладающие функциями? Это казалось чересчур смелым заявлением.

Данные ENCODE многих поразили. Тем не менее их предвестием стали результаты многочисленных косвенных исследований, на протяжении предыдущего десятилетия проводившихся учеными, которые все пытались понять, отчего человек так сложно устроен. Над этой проблемой ломало голову немало специалистов и неспециалистов с тех самых пор, как выяснилось: полная расшифровка человеческого генома не выявила у человека большего числа генов, кодирующих белки, по сравнению с куда более простыми организмами. Исследователи проанализировали размеры части генома, кодирующей белки, у различных представителей царства животных, и процентную долю, которую составлял мусор в общем объеме генома. Результаты этого анализа (мы уже бегло коснулись их в главе 3) сжато показаны на рис. 14.1.

Как мы уже знаем, количество генетического материала, кодирующего белки, не очень-то соотносится со сложностью организма. Куда более убедительная зависимость существует между процентной долей мусора в геноме и тем, насколько сложно устроен носитель этого генома. Пытаясь интерпретировать этот факт, исследователи предположили, что различия между простыми и сложными существами порождаются главным образом именно мусорной ДНК. Возможно, это означает, что существенная доля мусорной ДНК все-таки обладает какими-то функциями^6.

Рис. 14.1. График показывает, что по мерю увеличения сложности организма доля мусорной ДНК в геноме нарастает быстрее и отчетливее, чем размер части, кодирующей белки.

Множественные параметры

ENCODE рассчитывал долю функционирующих участков в нашем геноме, объединив всевозможные данные. В число этих данных вошла и информация о молекулах РНК, которые удалось обнаружить участникам проекта. Среди этих РНК оказались представлены как кодирующие белки, так и не кодирующие их, то есть мусорные РНК. Все они имели самую разную длину — от молекул протяженностью в тысячи нуклеотидных оснований до молекул в сотню раз меньше. Кроме того, ENCODE считал геномные области имеющими функции, если такие зоны несли на себе определенные комбинации эпигенетических модификаций, обычно связываемые с функциональными областями. Другие подходы предполагали, в частности, анализ участков, которые образуют петли и благодаря этому сближаются. Еще одна методика подразумевала характеризацию генома по специфическим физическим свойствам, связываемым с той или иной функцией[43].

Свойства эти отличались у разных типов человеческих клеток, что подтвердило гипотезу, согласно которой клетки могут использовать одну и ту же геномную информацию весьма гибко. К примеру, изучение образования петель показало, что одна разновидность взаимодействий между различными участками генома наблюдается лишь у каждого третьего из исследованных типов клеток^7. Это позволяет предположить, что сложная трехмерная укладка нашего генетического материала — явление комплексное и зависящее от типа клетки.

Изучая физические характеристики, обычно связываемые с регуляторными областями, ученые пришли к выводу, что регуляторные участки ДНК также активируются в зависимости от типа клетки — и что, в свою очередь, характер клетки (то, какой она станет) формируется под действием этой мусорной ДНК^8. К этому выводу исследователи пришли после того, как выявили около 3 миллионов таких мест (сайтов) путем анализа клеток 125 различных типов. Это не означает, что у клеток каждого типа 3 миллиона сайтов. Это лишь означает, что, проанализировав все эти клеточные типы, ученые обнаружили 3 миллиона сайтов. Опять-таки, это наводит на мысль, что регуляторный потенциал генома может использоваться по-разному — в зависимости от нужд той или иной клетки. Распределение сайтов по клеточным типам упрощенно показано на рис. 14.2.

Рис. 14.2. Анализируя наборы данных проекта ENCODE, ученые выявили свыше трех миллионов сайтов с характеристиками регуляторных областей (исследуя множество клеточных линий человека). Площади кругов отражают распределение таких сайтов. Большинство их обнаруживали в клетках двух и более типов, хотя значительная их доля оказалась специфической для отдельных типов клеток. И лишь очень малую часть сайтов удалось найти в каждой из проанализированных клеточных линий.

Свыше 90% регуляторных участков, выявленных благодаря этому методу, находились более чем за 2500 пар нуклеотидных оснований от начала ближайшего гена. Иногда они располагались вдали от всех генов, а иногда — в мусорной области, входящей в состав гена, но все равно они размещались далеко от его начала.

Большинство промоторов генов ассоциированы более чем с одним таким участком, а каждый такой участок обычно ассоциирован более чем с одним промотором. Однако, опять-таки, наши клетки, судя по всему, контролируют генетическую экспрессию отнюдь не прямолинейно. Они используют сложные сети взаимодействующих узлов.

Среди наиболее поразительных данных — информация, позволяющая предположить, что более 75% нашего генома хоть когда-нибудь, хоть в каких-нибудь клетках копируется в РНК^9. Любопытное предположение. Никто не мог ожидать, что три четверти мусорной ДНК наших клеток может реально использоваться для производства РНК. При сравнении информационных РНК, кодирующих белки, с длинными некодирующими РНК ученые выявили существенную разницу в картине экспрессии. В 15 изученных клеточных линиях информационные РНК, кодирующие белки, гораздо охотнее экспрессировались во всех клеточных линиях, чем длинные некодирующие РНК (см. рис. 14.3). Исследователи пришли к выводу: длинные некодирующие РНК играют определяющую роль в управлении судьбой клеток.

Взятые в совокупности, данные из статей, опубликованных в рамках проекта ENCODE, рисуют картину весьма активного человеческого генома с чрезвычайно сложными схемами взаимодействия и «общения». В сущности, мусорная ДНК набита информацией и инструкциями. Нелишне повторить здесь указания гипотетического режиссера из Введения: «Если вы ставите „Гамлета“ в Ванкувере и „Бурю“ в Перте, в такой-то строке „Макбета“ ударение должно падать на четвертый слог. Если только при этом любительская труппа не ставит „Ричарда III“ в Момбасе, в Кито не идет дождь»10.

Рис. 14.3. Экспрессию генов, кодирующих белки, и генов, не кодирующих белки, проанализировали на примере пятнадцати различных типов клеток. Выяснилось, что гены, кодирующие белки, гораздо чаще экспрессируются во всех типах клеток, чем области, которые вырабатывают молекулы РНК. не кодирующие белки.

Всё это звучит очень вдохновляюще. Почему же тогда многие относятся к значимости этих данных с таким скептицизмом? Отчасти из-за того, что статьи, вышедшие в рамках проекта ENCODE, явили миру очень уж громкие заявления. Самым громким стало утверждение, что целых 80% генома обладают функциями. Проблема в том, что в основе некоторых таких утверждений лежали косвенные измерения самих функций. Особенно это касается исследований, где заключение о наличии функции выводили либо из присутствия эпигенетических модификаций, либо из других физических характеристик ДНК и ассоциированных с ней белков.

Потенциальное против реального

Скептики возражают: эти данные в лучшем случае указывают на то, что исследуемая область потенциально может обладать какой-то функцией. А это слишком туманный признак, и пользы от него ждать не приходится. Представьте себе огромный особняк, владельцы которого впали в нищету, поэтому им отключили электричество за неуплату. Допустим, в здании двести комнат, а в каждой из них — по пять выключателей. Потенциально каждый выключатель может зажечь лампочку, но вполне возможно, что некоторые выключатели вообще никогда не соединялись ни с какими проводами (аристократы не славятся электротехническими талантами), а некоторые лампочки давным-давно перегорели. Сам факт, что на стенах торчат выключатели, которыми можно щелкать туда-сюда, из положения ВКЛ в положение ВЫКЛ и обратно, еще не означает, что при помощи этих устройств действительно удастся изменить уровень освещенности в комнатах.

Возможно, такая же ситуация и у нас в геноме. В нем могут существовать области, несущие на себе эпигенетические модификации или обладающие определенными физическими свойствами. Однако этого недостаточно для того, чтобы показать функциональность этих областей. Не исключено, что эти характеристики возникли просто как побочный эффект чего-то, что происходило поблизости.

Взгляните на любой снимок, запечатлевший Джексона Поллока за созданием его очередного шедевра в жанре абстрактного экспрессионизма^11. Скорее всего, вы увидите, что пол в его студии при этом забрызган красками. Но это не значит, что брызги и пятна краски на полу — часть создаваемой картины. И это не значит, что художник сознательно наделил их каким-то смыслом. Они являются просто неизбежным и несущественным побочным продуктом главного события. Возможно, то же самое относится и к физическими изменениям нашей ДНК.

Многие скептически отнеслись к заявлениям участников проекта ENCODE еще и из-за чувствительности использовавшихся методов. В распоряжении ENCODE оказались значительно более чувствительные методы по сравнению с теми, которые применялись, когда наука только начала изучать геном. Это позволило исследователям обнаруживать чрезвычайно малые количества РНК. Критики опасаются, что применявшиеся методы слишком чувствительны и поэтому воспринимали даже фоновый геномный шум. Если вам достаточно много лет и вы еще застали аудиокассеты, вспомните, что происходило, когда вы сильно увеличивали громкость магнитофона. Обычно вы слышали при этом шипяще-свистящий шум на заднем плане. Но этот звук являлся не частью замысла музыкантов, а просто неизбежным побочным продуктом технических ограничений записывающей системы. Критики проекта ENCODE полагают: что-то подобное может происходить и в клетках. Иными словами, не исключена фоновая экспрессия каких-то случайных молекул РНК в активных участках генома. Происходит своего рода утечка РНК. Согласно данной модели клетка не занимается активным включением этих РНК: они просто случайным образом копируются в весьма небольших количествах. Это происходит из-за того, что поблизости идет массированное копирование. Прилив поднимает все лодки, а заодно и все щепки, деревянные обломки и выброшенные пластиковые бутылки, которые окажутся в это время в воде.

Проблема кажется довольно серьезной. Ведь в некоторых случаях исследователи обнаруживали в среднем меньше одной молекулы определенной РНК на одну клетку. Ну да, клетка не может обеспечивать уровень экспрессии какой-то молекулы РНК между нулем и единицей — между уровнем «ни одной копии» и уровнем «одна копия». Отдельная клетка либо вообще не производит никаких копий определенной РНК, либо делает одну ее копию или большее количество таких копий. Всё прочее — гипотетические ситуации типа «чуть-чуть беременна». Вы либо беременны, либо нет, промежуточной ситуации не бывает.

Впрочем, это еще не свидетельство того, что использовавшиеся методы оказались слишком чувствительными. Напротив: можно сделать вывод, что чувствительность наших методов пока недостаточна. Они еще не позволяют нам выделять отдельные клетки и анализировать все молекулы РНК в ней. Вместо этого приходится полагаться на выделение множества клеток, анализ всех имеющихся в них молекул РНК и последующий расчет, сколько молекул РНК в среднем находится в каждой клетке.

Проблема в том, что в результате мы не можем увидеть разницу между ситуацией, когда среди значительной доли клеток в пробе каждая клетка экспрессирует небольшое количество определенной РНК, и ситуацией, когда среди незначительной доли клеток в пробе каждая клетка экспрессирует большое количество определенной РНК. Эти два сценария показаны на рис. 14.4.

Рис. 14.4. Каждый маленький квадратик изображает одну клетку. Цифры в квадратике — число молекул определенной РНК, вырабатываемых этой клеткой. Из-за ограниченной чувствительности методов определения исследователь анализирует целый набор клеток в совокупности. А значит, он может узнавать лишь общее число молекул РНК в этом наборе и не в состоянии провести различие между ситуацией, когда в каждой из 36 клеток содержится по две молекулы РНК (слева), и ситуацией, когда лишь две клетки (из совместно анализируемых 36) содержат по 36 молекул РНК (справа), — или любой другой комбинацией, когда общее число обнаруживаемых таким путем молекул РНК равно 72.

Еще одна трудность состоит в том, что нам нужно убить все клетки, чтобы проанализировать их молекулы РНК. А значит, мы получаем лишь «моментальные снимки» экспрессии РНК, хотя в идеальном случае нам хотелось бы получить что-то вроде фильма, чтобы мы могли увидеть, как протекает экспрессия РНК в режиме реального времени. Эта проблема схематически показана на рис. 14.5.

Разумеется, в идеальном случае мы должны бы иметь возможность проверить находки ENCODE при помощи прямых экспериментов. Но этих находок так много! Как решить, какие именно области или молекулы РНК подвергнуть более пристальному рассмотрению? Еще одна трудность состоит в том, что многие из свойств, выявленных участниками проекта (и описанных ими в статьях), являются частью обширных и сложных сетей взаимодействий. Возможно, каждый компонент оказывает лишь ограниченное влияние на общую картину. В конце концов, если вы разрежете один узел рыболовной сети, вы не нарушите работу сети в целом. Появившаяся дырка, может быть, и позволит случайно ускользнуть какой-то рыбешке, но потеря одной маленькой рыбки не окажет большого влияния на общий размер вашего улова. Однако это не значит, что отдельные узлы не играют важной роли. Все они важны, поскольку действуют сообща.

Рис. 14.5. Экспрессия определенной РНК в клетке может проходить циклически. Квадратики на кривой показывают те моменты, когда экспериментатор отбирает пробы клеток, чтобы измерить экспрессию данной РНК. Результаты могут очень отличаться при сравнении разных наборов клеток (скажем, взятых из разных тканей), но это может отражать лишь колебания во времени (темпоральные флуктуации), а не ка-кие-то биологически значимые вариации.

Эволюционное поле битвы

Авторы работ, проведенных в рамках проекта ENCODE, и авторы сопутствующих комментариев использовали полученные данные и для новых теорий эволюции человеческого генома. Итак, если 80% человеческого генома обладает какими-то функциями, можно ожидать значительного сходства между геномом человека и, по крайней мере, геномами других млекопитающих. Проблема в том, что лишь около 5% человеческого генома — общие для всего класса млекопитающих, причем в основном эти области кодируют белки^12. Чтобы преодолеть эту явную нестыковку, ученые предположили, что регуляторные области возникли, по эволюционным меркам, очень недавно, причем главным образом лишь у приматов. Используя данные широкомасштабного исследования вариаций ДНК-последовательности у различных человеческих популяций, исследователи пришли к выводу, что у людей регуляторные области отличаются сравнительно небольшим разнообразием, тогда как у областей, где вообще нет никакой активности, разнообразие гораздо выше. В одном из комментариев дается по этому поводу такое рассуждение. Последовательности, кодирующие белки, в ходе эволюции сохранялись почти неизменными, поскольку тот или иной белок часто используется более чем в одном типе тканей или клеток. Если изменить последовательность, кодирующую белок, изменится и сам белок. Возможно, такой измененный белок будет лучше функционировать в определенной ткани. Однако та же самая трансформация может оказать разрушительное действие на другую ткань, которая также связана с работой данного белка. Поэтому эволюция не трогает последовательность, кодирующую белки.

Но регуляторные РНК не кодируют белки, и их специфичность по отношению к конкретным тканям обычно выше. А значит, они находятся под меньшим эволюционным давлением, поскольку, как правило, лишь один тип ткани основан на работе той или иной регуляторной РНК, к тому же, вероятно, лишь в течение определенных периодов жизни или в ответ на определенные изменения в окружающей среде. Это устранило эволюционные тормоза для регуляторных РНК и позволило нам (в том, что касается этих областей генома) отделиться на эволюционном древе от наших родичей-млекопитающих. Но в человеческих популяциях эволюционное давление заставляет поддерживать оптимальную нуклеотидную последовательность этих регуляторных РНК^13.

Биологи, когда дело доходит до научных разногласий, как правило, ведут себя довольно сдержанно. Иногда на какой-нибудь конференции случается агрессивный обмен вопросами и ответами после какого-нибудь доклада, но обычно публичные заявления формулируются аккуратно. Особенно это относится к тому, что публикуется (а не только произносится в ходе выступлений или научных прений). Конечно, все мы владеем искусством читать между строк (см. рис. 14.6), но тексты, предназначенные для печати, обычно характеризуются взвешенным тоном. Вот почему споры вокруг результатов, полученных командой ENCODE, оказались необычайно занимательными для научного сообщества.

Рис. 14.6. В публичных выступлениях ученые часто вежливы (высказывания слева), но иногда их слова — лишь плохо замаскированное неприятие (мысли справа)...

Наиболее откровенные и решительные отклики последовали главным образом от специалистов по эволюционной биологии. И неудивительно. Эволюционные исследования — та часть биологии, где эмоции обычно бурлят сильнее всего. Чаще всего огонь ведется по креационистам, но некоторые пулеметы могут поворачиваться и в сторону других ученых. Эпигенетики, изучающие передачу приобретенных характеристик от родителей потомству, наверняка испытали облегчение, когда ENCODE на некоторое время вывел их из-под обстрела главными силами противника^14.

Самый сердитый критический отзыв об ENCODE включал в себя такие милые выражения, как «логическая несостоятельность», «абсурдное умозаключение», «слишком поспешная игра, окончившаяся закономерным проигрышем» и «неправильное использование неправильного определения». На случай, если у читателя все-таки остаются сомнения насчет того, к чему клонят авторы, они завершают статью следующим сокрушительным ударом: «Один из участников проекта предсказал, что результаты, полученные ENCODE, заставят переписать учебники. Что ж, мы согласны. Многие учебники по маркетингу, рекламе в СМИ и пиару, возможно, и в самом деле придется переработать»15.

Основная критика в этом яростном отзыве сосредоточилась на определении того, что такое функция, на том, как участники ENCODE анализировали свои данные, и на выводах насчет эволюционного давления. Первая группа замечаний касается проблем, которые мы уже описывали, используя аналогии с творениями Джексона Поллока. В каком-то смысле эти проблемы во многом вытекают из трудностей, связанных с отделением математики от биологии. Данные ENCODE по большей части интерпретировали сами же участники проекта, используя статистические и чисто математические методы. Скептики утверждают, что это заводит нас в тупик, поскольку при такой интерпретации не учитываются биологические взаимосвязи, а ведь они играют здесь определяющую роль. Приводится очень удачная аналогия. Почему сердце имеет такое важное значение? Потому что это насос, качающий кровь и тем самым разносящий ее по телу. Вот вам биологически важная взаимосвязь. Но если мы проанализируем действия сердца, исходя лишь из полученной математическими методами карты его взаимосвязей с другими компонентами организма, мы придем к смехотворным выводам. В частности, можно решить, что сердце требуется для добавления телу дополнительной массы и для издавания глухого «тук-тук». Нет никаких сомнений, что сердце проделывает и то и другое, но это, честно говоря, не его функция. Это лишь сопутствующие факторы, дополнения к его основной роли.

Критики порицали методы анализа данных, поскольку чувствовали: разные научные группы, входившие в ENCODE, применяли свои алгоритмы по-разному. Одним из следствий этого расхождения стало то, что эффекты, наблюдаемые в каком-то обширном регионе генома, могли иногда восприниматься как неоправданно (и непропорционально) масштабные. К примеру, если блок из 600 пар нуклеотидных оснований классифицировали как функциональный, тогда как на самом деле всю работу выполняли только 10 из этих оснований, это могло сильно исказить определяемую учеными величину процентной доли генома, имеющей какую-то функцию.

Эволюционные возражения сводились к тому, что участники ENCODE игнорировали стандартную модель, согласно которой области с большим количеством вариаций являют собой отражение недостаточного эволюционного отбора, а это, в свою очередь, означает, что они имеют сравнительно небольшое значение. Если вам хочется перевернуть давно укоренившийся в науке принцип, вы должны иметь для этого очень веские основания. Но скептики заявляли: хотя публикации ENCODE содержали невероятное количество данных, в этих работах выводы об эволюции нуклеотидных последовательностей у человека и других приматов делались на основе анализа недопустимо малого числа областей генома.

С обеих сторон приводились интересные научные доводы. Но только лицемеры могли бы заявить, что весь накал страстей вокруг ENCODE возник исключительно по научным причинам. Нельзя игнорировать и другие факторы, самые что ни на есть человеческие. ENCODE стал одним из проявлений Большой науки. А в ней обычно фигурируют огромные международные проекты стоимостью во многие миллионы долларов. Общий научный бюджет не безграничен. Когда средства тратятся на такие инициативы Большой науки, остается меньше финансирования для менее масштабных исследований, в большей степени основанных на гипотезах и предположениях.

Организации, осуществляющие финансирование науки, изо всех сил стараются найти оптимальный баланс между этими двумя типами исследований. Во многих случаях вложения в Большую науку осуществляются при условии, что она генерирует некий ресурс, служащий хорошим стимулом для других ученых. Отличный пример — первое секвенирование человеческого генома (хотя следует признать, что и здесь не обошлось без критики). Но проект ENCODE вызвал противоречивую реакцию не вокруг полученных им «сырых» (исходных) данных, а вокруг их интерпретации. По мнению скептиков, она-то и порождает принципиальное отличие ENCODE от чисто инфраструктурного инвестиционного проекта.

Когда подсчитали, во что обошлись все этапы и аспекты ENCODE, общая сумма оказалась равной примерно четверти миллиарда долларов. Такого количества денег хватило бы по меньшей мере на 600 грантов средних размеров, нацеленных на исследования по проверке отдельных гипотез. Выбирая, как распределять финансирование, нужно стараться поддерживать равновесие, но при таких размерах денежных вливаний вас наверняка ждет раскол в научном сообществе (или хотя бы «глубокая озабоченность», которую высказывают обойденные вниманием и финансированием).

В компании Gartner построили график восприятия новых технологий. Называется он «Цикл шумихи». Поначалу все очень возбуждены: это «пик раздутых ожиданий». Когда же выясняется, что новая технология не способна в одночасье переменить все в вашей жизни, на графике возникает резкий спад (обусловленный крахом иллюзий), и мы скатываемся в «траншею разочарования». В конце концов все успокаиваются, и начинается постепенный и неуклонный рост рационального понимания новой технологии, выводящий на «плато продуктивного отношения».

Для проектов типа ENCODE этот цикл невероятно сжат во времени — из-за резкой поляризации научных групп. Ученые с завышенными ожиданиями действуют одновременно с теми, кто сидит в траншее разочарования. Почти все остальные настроены прагматично и используют результаты ENCODE, когда те могут принести пользу — к примеру, помочь прояснить некий вопрос, волнующий какого-то ученого.

Глава 15. Обезглавленные королевы, странные коты, жирные мыши

Консорциум ENCODE выявил чудовищное изобилие потенциально функциональных элементов в геноме человека. При таком колоссальном количестве трудно выработать разумную стратегию выбора того, с каких областей генома начать экспериментальную проверку этих кандидатов. Однако задача может оказаться не такой тяжелой, как представляется на первый взгляд. Природа, как всегда, словно бы решила сама указать нам путь. В последние годы ученые начали выявлять заболевания человека, причиной которых становятся очень небольшие изменения в регуляторных областях генома. Раньше такие изменения, возможно, просто не рассматривали, считая их безобидными случайными вариациями в мусорной ДНК. Но теперь известно, что в некоторых случаях изменение одной-единственной пары нуклеотидных оснований в (казалось бы) совершенно несущественной области генома способно оказывать заметное воздействие на конкретного человека. А в редких случаях эффект оказывается попросту несовместимым с жизнью.

Начнем с не самого трагического примера. Вернемся вспять на пять веков, во времена, когда Англией правил Генрих VIII. Большинство британских школьников знают полезную считалку, помогающую запомнить, что случилось с шестью женами этого печально знаменитого монарха:

Развод, без головы, скончалась,

Развод, без головы, спаслась.

(Не забудьте прислать мне благодарственный мейл, когда это удобное двустишие поможет вам на какой-нибудь викторине.)

Первой из обезглавленных жен венценосца стала Анна Болейн, мать будущей королевы Елизаветы I. После ее смерти тюдоровские специалисты по работе с общественным мнением запустили грязную кампанию, в результате которой Анна Болейн стала похожа на настоящую ведьму. В описании тогдашних полит-технологов у нее торчащий изо рта зуб, большое родимое пятно под подбородком и шесть пальцев на правой руке. Подробность насчет лишнего пальца ушла в фольклор, хотя достоверных подтверждений этого факта практически нет (а может, их и вовсе не существует)1.

Возможно, одной из причин того, что эту выдумку все-таки приняли на веру, стало то, что она не казалась современникам слишком уж нелепой и смехотворной. Ведь хронисты не утверждали, будто у покойной королевы имелось три ноги. Иногда появляются на свет младенцы с лишними пальцами, хотя обычно у них по шесть пальцев на каждой руке, а не на одной.

В правильном развитии кистей рук и ступней играет важнейшую роль один ген, кодирующий белок[44], который действует как морфоген. Иными словами, он определяет характер развития тканей. Влияние белка сильно зависит от его концентрации. В развивающемся эмбрионе он распределен неравномерно: в одной области его содержание может быть высоким, а в прилегающих тканях — все ниже по мере удаления от этой области.

Перчатки и котятки

Количество пальцев на руках — одна из характеристик, контролируемых этим морфогеном. Если уровни экспрессии данного белка не те, какие надо, ребенок появляется на свет с лишними пальцами. Более десятка лет назад ученые обнаружили, что некоторые случаи излишней многопалости вызваны весьма небольшим генетическим изменением. Оно затрагивает не сам ген, кодирующий морфоген, а участок мусорной ДНК, находящийся примерно за миллион пар нуклеотидных оснований от него. Исследователи выявили это изменение в огромном голландском семействе, где наличие лишних пальцев явно наследовалось из поколения в поколение как генетическая черта. У всех 96 человек, которых затронула эта аномалия, оказалось измененным (точнее, замененным) лишь одно-единственное нуклеотидное основание мусорной ДНК. Вместо основания Ц у этих людей обнаружилось основание Г. При этом среди их родственников с нормальным числом пальцев никто не мог похвастаться наличием основания Г в этой же позиции. Изменения одного нуклеотидного основания также обнаружились у других семей, где отмечались случаи шестипалости. Эти изменения отмечались в том же регионе генома, что и у вышеописанной голландской семьи, но на расстоянии 200-300 пар^2.

Мусорный регион, где обнаруживаются эти единичные изменения оснований, — энхансер этого морфогенного гена[45]. Чтобы тело формировалось правильно, осуществляется жесткий пространственный и временной контроль данного морфогена при помощи целого набора регуляторов. У людей с упомянутой мутацией и с лишним пальцем деятельность энхансера, как выяснилось, не совсем соответствовала норме. Влияние этого крохотного изменения на один-единственный регулятор показывает, как тонко настроен механизм контроля и какую важную роль он играет.

Вот вам подсказка для еще одной викторины. Какая связь существует между шестипалыми голландцами, которые испытывают затруднения при покупке перчаток, и одной из величайших фигур в американской литературе XX столетия? Ну? Сдаетесь? Видите ли, в 1930-е годы один капитан подарил Хемингуэю котенка. На передних лапах у него оказалось не по 5 пальцев, а по 6. В доме Хемингуэев теперь живет около 40 потомков этого котенка, и примерно у половины из них 6 пальцев на каждой из передних лап. В Сети полно фотографий этих симпатяг^3. Выглядят они одновременно и очень мило, и слегка устрашающе. Лишний отросток напоминает большой палец человеческой руки, и из-за него кошки приобретают какой-то неприятно-пронырливый вид.

Та же научная группа, выявившая изменение в энхансерной области генома шестипалых людей, показала: эта же область изменена и у хемингуэевских кошек. Встраивая данный энхансер в геном другого зверька, они подтвердили, что такое изменение сказывается на экспрессии упомянутого морфогена. У подопытного животного наблюдалась сверхэкспрессия морфогена, и на каждой передней лапе формировался лишний палец. Забавно: эффект продемонстрировали, встроив кошачью ДНК в мышиный эмбрион. Оригинальная игра в кошки-мышки^4.

Кошки с избыточным количеством пальцев на передних лапах обнаруживались и в других странах, не исключая и Великобритании. У британских кошек-шестипалок наблюдается изменение в том же энхансере, однако это несколько иное изменение. Оно располагается за две пары нуклеотидных оснований от «хемингуэевского» и затрагивает мотив из трех пар нуклеотидных оснований, сохраняющийся практически неизменным в ходе эволюции. Энхансерная область, влияющая на возникновение лишних пальцев на передних/верхних конечностях кошек и людей, имеет в длину примерно 800 пар нуклеотидных оснований, и основная ее часть почти неизменна на всем протяжении эволюционного древа от рыб до человека. Это заставляет предположить, что система контроля развития конечностей — очень древняя.

Морфогены и развитие лица

Морфоген, отвечающий за формирование пальцев, играет важнейшую роль и в других процессах развития. Среди них — формирование структуры лица и передней части мозга. Эффект каких-то нарушений здесь может оказаться сравнительно слабым, приведя всего лишь к возникновению заячьей губы. Однако при более серьезном нарушении экспрессии данного морфогена лицо и мозговые структуры будут складываться совершенно аномальным образом. В наиболее острых случаях младенцы появляются на свет с единственным глазом, который к тому же расположен посреди лба, и в их мозге присутствуют опаснейшие дефекты. Такие дети не выживают.

Весь этот спектр симптомов описывается как проявление болезни, именуемой голопрозэнцефалией^5. Показано, что в семьях, где наблюдается этот недуг, мутации подверглись разные гены, кодирующие белки. Многие из этих генов участвуют в процессах регуляции морфогена, который требуется для нормального пальцеобразования. В отдельных случаях мутирует сам ген, кодирующий белок-морфоген. Развивающийся эмбрион вырабатывает лишь половину нормального количества морфогена, поскольку функционирующий белок синтезируется лишь одной хромосомой, а не двумя. Аномалии, наблюдаемые у больных этим недугом, показывают: очень важно, чтобы уровни содержания морфогена достигали определенных пороговых значений в ключевые моменты развития эмбриона.

Не все мутации, вызывающие голопрозэнцефалию, удалось идентифицировать. Специалисты изучили ДНК примерно 500 страдающих этим заболеванием. Они обнаружили неожиданное изменение в одной из областей мусорной ДНК у одного младенца с острой формой этой болезни. Речь идет об изменении единственного основания (с Ц на Т) в области, которую отделяют от упомянутого морфогенного гена более чем 450 тысяч пар нуклеотидных оснований^6.

Эта замена Ц на Т произошла в блоке из 10 пар нуклеотидных оснований, который не менялся очень долго, с тех пор, как наши давние предки отделились от предков лягушек более 350 миллионов лет назад. А значит, можно заключить, что этот «мусорный» фрагмент, явно имеет какую-то функцию. В данном энхансере основание Ц связывает белок, служащий транскрипционным фактором[46]. Транскрипционные факторы — белки необычные: они умеют распознавать определенные ДНК-последовательности (обычно в промоторах) и связываться с ними. Связывание транскрипционных факторов с промотором играет важнейшую роль при включении гена. Ключевой транскрипционный фактор для энхансера может соединяться с упомянутым мотивом из 10 пар нуклеотидных оснований, когда ДНК содержит Ц в нужном положении — но не когда в этом положении оказывается основание Т.

Такая замена Ц на Т, происходящая в данном энхансере, не наблюдалась в контрольной группе из 450 здоровых добровольцев. Вполне возможно, что именно это изменение стало причиной проблем у пациента, о котором шла речь выше. Однако важно помнить, что оно наблюдалось лишь один раз среди примерно такого же количества пациентов, страдающих этим заболеванием. Болезнь не коснулась матери ребенка. Как и ожидалось, в обеих хромосомах матери основание Ц занимало свое нормальное положение. Как ни странно, у отца младенца имелась такая же генетическая последовательность в данном энхансере, как и у ребенка. Иными словами, в одной хромосоме на обсуждаемом нами месте находилось основание Ц, а в другой — основание Т. Однако отец ребенка не демонстрировал никаких симптомов голопрозэнцефалии.

Это может показаться сильным доводом против гипотезы о значимости замены Ц на Т, но ситуация не настолько очевидна. У членов семьи, где наблюдается голопрозэнцефалия, часто проявляются немалые различия в симптомах, даже если вызвавшая их мутация затронула сам морфогенный ген. До 30% членов семей, где наблюдается такая мутация, не демонстрируют вообще никаких симптомов данной болезни, а у остальных симптомы могут быть весьма различны в зависимости от конкретного больного. Первая ситуация называется вариабельным проникновением, а вторая — вариабельной экспрессивностью.

К сожалению, это классические примеры того, как биологи идентифицируют явление, дают ему красивое название и перестают о нем думать. Да, ученые описали наблюдаемые явления при помощи тех фраз, которые приведены выше. Только вот пока не очень-то понятно, почему это происходит. В этой удивительной сфере мы пока еще разбираемся слабо. Возможно, существуют другие тонкие геномные вариации, компенсирующие у некоторых людей влияние таких изменений ДНК. Возможно, при таких вариациях активизируются другие энхансеры, тем самым резко усиливая экспрессию морфогена. Возможно, у некоторых людей происходит и своего рода эпигенетическая компенсация, как бы подталкивающая экспрессию ключевых генов в нужном направлении. А возможно, речь идет о комбинации перечисленных факторов — и других, которые мы пока не выявили.

Однако если мы имеем дело с неопределенной ситуацией такого рода (один из родителей и ребенок имеют одно и то же генетическое изменение, но проявляют разные симптомы), жизненно необходимо выстроить дополнительные линии доводов в поддержку любой гипотезы, касающейся влияния такой замены нуклеотидного основания. Исследователи, выявившие замену Ц на Т в энхансере, именно это и проделали. Они проверили эффект замены на мышах. Удалось показать: когда Ц находится в упомянутом положении, соответствующий участок мусорной ДНК действует как энхансер экспрессии морфогена. Но когда на смену Ц приходит Т, эта область больше не действует как энхансер, и содержание данного морфогена в мозгу так и не достигает нужного уровня.

Морфогены и поджелудочная железа

Участие морфогена в формировании лишних пальцев или в развитии всевозможных форм голопрозэнцефалии — не единственный пример, когда причиной какого-то заболевания человека становится изменение в регуляторной области ДНК. Вот, к примеру, панкреатический агенез — болезнь, при которой поджелудочная железа развивается неправильно. У детей, родившихся с этим заболеванием, часто наблюдаются острые формы диабета^7. Дело в том, что именно поджелудочная железа вырабатывает инсулин — гормон, позволяющий нашему организму регулировать уровень сахара в крови.

В большинстве семей, где наблюдается панкреатический агенез, отмечается мутация одного определенного транскрипционного фактора[47],8, но у некоторого количества таких семей мутирует другой транскрипционный фактор[48],9. Однако известно много случаев, когда ребенок рождается с необъяснимым панкреатическим агенезом (то есть никого среди его родных это заболевание не коснулось). Как правило, мы считаем, что такие ситуации возникают случайно: может быть, вследствие какого-то нарушения развития, вызванного реакцией организма на воздействие не опознанного нами фактора среды. Но постепенно стало очевидно, что большинство таких ситуаций (казавшихся спорадическими) возникает в семьях, где родители больного ребенка являлись родственниками друг друга (обычно — двоюродным братом и сестрой). Значит, мы имеем дело с близкородственным браком и так называемым генетическим родством. Когда генетическое родство связано с повышенным уровнем заболеваемости наследственными недугами, мы обычно ищем какое-то генетическое изменение, причем такое, при котором обе копии хромосомы несут на себе одну и ту же вариацию. Причины, по которым такие заболевания более распространены у детей, рожденных в близкородственном браке, схематически показаны на рис. 15.1.

Рис. 15.1. Вверху показано, что для носителя редкой генетической мутации сравнительно мала (со статистической точки зрения) вероятность встретить другого носителя такой же мутации среди населения в целом. Однако в собственной семье куда вероятнее повстречать человека, который тоже унаследовал эту мутацию (ситуация проиллюстрирована внизу). Вот почему редкие рецессивные заболевания (такие, при которых каждый из родителей является бессимптомным носителем одного мутантного гена) встречаются чаще, когда родители пациента — близкие родственники (скажем, двоюродные брат и сестра).

Исследователи выделили ДНК пациентов со спорадической формой панкреатического агенеза и проанализировали все области, кодирующие белки. Им не удалось отыскать вариации в ДНК-последовательности, которые послужили бы объяснением данного заболевания. Поэтому они обратились к предсказанным регуляторным областям. Мы уже знаем, что таких областей в человеческом геноме несметное количество. Чтобы сузить зону поисков, ученые решили выяснить, что происходит, когда культивируемые в лаборатории стволовые клетки превращаются при дифференциации в клетки поджелудочной железы. Исследователям хотелось найти регуляторные области, которые несут в себе эпигенетические модификации, обычно ассоциируемые с функционированием энхансеров, а, кроме того, связывающие транскрипционные факторы, которые (как удалось предварительно установить) играют важную роль в развитии клеток поджелудочной железы.

Это сузило список участков-кандидатов всего до 6 тысяч с небольшим. Такое количество куда легче подвергнуть углубленному анализу. Оказалось, что у 4 пациентов А меняется на Г в предполагаемом энхансере — области из примерно 400 пар нуклеотидных оснований, располагающейся на хромосоме 10. Эта область размещается в 25 тысячах парах нуклеотидных оснований от одного из транскрипционных факторов, который (как опять-таки предварительно установили) мутирует у небольшой доли семей, страдающих панкреатическим агенезом. У 7 из 10 пациентов, не связанных близким родством, наблюдалось одно и то же изменение: энхансер на обеих копиях хромосомы 10 имел основание Г там, где обычно располагается основание А. При этом у восьмого и девятого пациентов мутации располагались поблизости от этого места, а десятый вообще, как выяснилось, утратил этот энхансер. Проанализировали также геном приблизительно 400 человек, которых не коснулось данное заболевание. Ни у кого из них не обнаружилось такой замены А на Г.

Исследователи показали, что область, которую они выявили, действует как энхансер в развивающихся панкреатических клетках — и что данная область перестает служить энхансером, когда в определенной позиции основание А в ней меняется на основание Г. Затем, в ходе дальнейших экспериментов, они стали изучать, как данный энхансер влияет на свой ген-мишень. Это влияние схематически показано на рис. 15.2. ДНК-последова-тельность образует петлю, тем самым приближая энхансер к гену-мишени. Обычно этот энхансер соединяется с транскрипционными факторами, которые помогают включать ген-мишень. Но транскрипционные факторы связываются лишь с определенными ДНК-последовательностями. Когда основание А меняется на основание Г, транскрипционные факторы не могут соединяться с этим участком, а значит, не могут и включать ген-мишень^10.

Рис. 15.2. I: расположение энхансера, промотора и тела гена на ДНК-последовательности. II: ДНК образует складку, приближая энхансер к промотору. Когда энхансер содержит в определенной позиции нуклеотидное основание А, он может присоединять к себе определенные белки из числа транскрипционных факторов. Эти белки, в свою очередь, могут активировать промотор и включать ген. III: вместо основания А в той же позиции энхансера находится основание Г, с которым эти транскрипционные факторы связываться не могут. Следовательно, они не могут активировать промотор, и ген не включается.

Тут как с рыбалкой. Забросьте в озеро крючок, на котором извивается сочный червяк, и на эту наживку охотно клюнет плотоядная рыба. Забросьте крючок, на который насажен кусок морковки, — и та же рыба даже не попробует наживку на вкус. А ведь все осталось тем же — крючок, леска, грузило, сама рыба. Однако изменение всего-навсего одного важнейшего компонента (наживки) резко меняет ваши шансы на хороший улов.

Вариации на тему

Напрашивается мысль, что любые изменения в областях мусорной ДНК, оказывающихся на самом деле регуляторами тех или иных процессов, имеют ужасающие последствия. Но так кажется лишь из-за того, что подчас легче изучать аномальные ситуации, чем нормальные. Особенно это касается оценки различий между болезнью и здоровьем. В вышеописанных случаях замена одного-единственного нуклеотидного основания в регуляторных областях оказывает сильнейшее воздействие на организм. Однако такие типы вариаций несут ответственность и за ситуации, так сказать, не столь драматические, а являющиеся вполне обыкновенным проявлением человеческого разнообразия.

Возьмем пигментацию. Это комплексная характеристика, то есть такая, на которую оказывает влияние множество генов, действующих сообща. В данном случае такое совместное действие приводит к появлению той или иной окраски глаз, волос и кожи. Все мы знаем по собственному опыту, что люди могут очень отличаться по этим параметрам внешности. В придачу к нескольким генам, влияющим на уровни пигментации, существуют различные варианты этих генов, что создает дополнительный потенциал для изменчивости и многообразия^11.

Одна из главных генетических вариаций такого рода — различие в одном нуклеотидном основании (бывает, что определенное положение занимает Ц, а бывает, что это же положение занимает Т). При этом Т-версия гена ассоциируется с более высокими уровнями темного пигмента, а Ц-версия — с более низким его содержанием[49]. Однако эта вариация происходит не в каком-то гене, кодирующем белок. Показано, что она влияет на пигментацию благодаря тому, что затрагивает энхансерную область, расположенную за 21 тысячу пар нуклеотидных оснований от гена-мишени. А уже этот ген-мишень кодирует белок, играющий важную роль в выработке пигмента. Мы знаем это, поскольку мутации в данном гене приводят к развитию формы альбинизма[50],12.

Эксперименты показали, что энхансер образует петлю, дабы сблизиться со своей мишенью. Транскрипционные факторы, контролирующие мишень, соединяются с ней, но эффективность этого соединения зависит от того, какое нуклеотидное основание занимает определенную позицию в энхансере — основание Ц или основание Т^13. Это очень похоже на ситуацию с панкреатическим агенезом, описанную выше. Здесь задействован почти тот же механизм, который схематически показан на рис. 15.2.

Вполне вероятно, что существует масса подобных взаимодействий между единичными заменами нуклеотидных оснований в мусорной ДНК и экспрессией генов, кодирующих белки. Это может сказаться на нашем понимании человеческого разнообразия, человеческого здоровья, человеческих болезней. Есть значительное количество недомоганий, для которых, как нам известно, генетика играет определенную роль. Однако здесь играет роль и среда. А иногда — просто везение или невезение.

Можно выявлять генетические болезни, изучая, сколь часто заболевание проявляется у членов определенной семьи. Особенно полезно анализировать близнецов. Вот, скажем, болезнь Хантингтона, губительное неврологическое заболевание, вызываемое мутацией в одном гене. Если у одного из близнецов есть этот недуг, он всегда проявляется и у его однояйцевого (идентичного) близнеца, если только другой близнец не погибнет в раннем возрасте от какой-то не связанной с этим недугом причины — к примеру, в автомобильной катастрофе. Болезнь Хантингтона обусловлена генетикой на 100%.

Но обратившись к шизофрении, мы увидим, что если один из близнецов страдает этим расстройством, то существует лишь 50%-ная вероятность того, что оно затронет и его идентичного близнеца. Ученые подсчитали эту вероятность, изучив множество пар близнецов и выявив частоту, с которой у обоих близнецов развивается этот недуг. Значит, генетика лишь примерно наполовину отвечает за риск развития шизофрении, прочие же факторы риска не связаны с геномом.

Можно распространить эти изыскания и на других родственников, поскольку нам известно, сколько генетической информации делят между собой члены семьи. Так, неидентичиые близнецы делят между собой 50% своей генетической информации. Точно такая же общая доля генетических сведений — между родителями и детьми. Двоюродные братья и/или сестры делят между собой лишь 12,5% генома. Вполне возможно использовать эти данные для того, чтобы рассчитать вклад генетических факторов в развитие широкого диапазона заболеваний и расстройств — от ревматоидного артрита до диабета, от рассеянного склероза до болезни Альцгеймера. При этих недугах (и при многих других) генетика и среда действуют вместе.

Найдя достаточное число подходящих семей, мы сможем проанализировать их геномы, чтобы выявить области, связанные с тем или иным заболеванием. Однако следует помнить, что данные, получаемые таким образом, существенно отличаются от данных, получаемых при исследовании сравнительно простой ситуации с чисто генетическим заболеванием — к примеру, с той же болезнью Хантингтона. При этой болезни 100% генетического вклада — это одна мутация в одном гене, кодирующем белок. Но для таких недугов, как шизофрения, те 50%, которые генетика вносит в развитие болезни, не ограничиваются изменениями лишь в одном гене. То же самое относится к большинству других расстройств, где играют роль и генетика, и среда. Возможно, существует 5 генов, каждый из которых вносит по 10% в общую величину риска развития шизофрении, или же 20 генов, каждый из которых вносит в эту величину по 2,5%, или же любые другие комбинации, какие только можно себе вообразить. Все это существенно затрудняет выявление соответствующих генетических факторов и доказательство того, что изменения в ДНК-последовательности действительно влияют на изучаемое заболевание.

Невзирая на все трудности, при помощи таких методик удалось картировать более 80 заболеваний и характеристик, тем самым предложив тысячи кандидатов на роль тех областей и вариаций, которые могут влиять на развитие этих недугов[51],14. Любопытно: в общей сложности около 90% областей, выявленных учеными, относятся к мусорной ДНК. Примерно половина из них — зоны между генами, а другая половина — мусорные зоны в самих генах^15.

Виновные в соучастии

Однако тут нужно быть очень осторожным и не думать, что если мы сумели обнаружить ДНК-вариацию, ассоциируемую с болезнью, это непременно означает, что данная вариация — одна из причин данного заболевания (или даже его единственная причина). Порой мы имеем дело с соучастниками преступления. Генетическим изменением, определяющим развитие болезни, иногда оказывается вариация, находящаяся поблизости, а нашего «кандидата» преступник просто прихватил с собой за компанию.

Пример такого соучастия — цирроз печени. Одна из методик оценки того, насколько человек подвергается воздействию сигаретного дыма, состоит в измерении содержания монооксида углерода (угарного газа) в выдыхаемом этим человеком воздухе. Десять лет назад, определяя содержание угарного газа в дыхании некурящих с циррозом печени, мы могли бы установить, что в дыхательных путях тех, кто страдает этим заболеванием, в среднем больше этого вещества, чем у тех, кто этой болезнью не страдает. Одной из возможных интерпретаций (хотя и не единственной) стала бы такая: пассивное курение увеличивает риск возникновения цирроза печени. Однако на самом деле такое изменение содержания монооксида углерода — типичный случай «виновности в соучастии». Эти изменения, скорее всего, просто отражают тот факт, что пациент, возможно, проводил много времени в пабах и барах, ведь избыточное потребление алкоголя — один из основных факторов риска развития этого заболевания. До того, как ввели запрет на курение в общественных пространствах многих крупных городов, пабы и бары традиционно представляли собой помещения, прямо-таки заполненные дымом.

Даже если исключить «виновность в соучастии» при анализе вклада генетической вариации в заболевание человека, все равно следует очень тщательно проверять гипотезы о функциональных последствиях наших находок, а иначе мы пойдем в совершенно неверном направлении.

Вариация, которая вносит вклад в пигментацию человека, на самом деле происходит в интронах — фрагментах мусорной ДНК между частями гена, кодирующими белок. Этот ген — штука весьма крупная. Варьируемая пара нуклеотидных оснований располагается аж в 86-м фрагменте мусорной ДНК, лежащем между участками гена, кодирующими белок. Однако сам по себе данный ген не играет никакой роли в пигментации. Вот вам явный случай, когда присяжные вынуждены признать: вариации в мусорных областях одного гена могут оказывать существенное воздействие на другие гены.

Проблемы ожирения — та сфера, где уже много лет ученые пытаются выявить генетические вариации, связанные с физическими изменениями. Около 80 различных областей человеческого генома так или иначе увязываются с ожирением или относящимися к нему параметрами (скажем, индексом массы тела)16.

Как показали многие исследования, вариация, проявляющая самую большую связь с ожирением, представляет собой замену единственной пары нуклеотидных оснований в гене-кандидате, кодирующем белок и расположенном на хромосоме 16[52],17,18. Унаследовавшие основание А в обеих копиях данного гена обычно приблизительно на 3 кг тяжелее по сравнению с теми, кто унаследовал основание Т в обеих копиях того же гена. (Как всегда в таких случаях, речь идет о нуклеотидных основаниях, занимающих строго определенное положение.) Это изменение происходит в мусорной области, располагающейся между двумя первыми участками данного гена-кандидата, кодирующими аминокислоты. Тот факт, что эту связь обнаружили в ходе более чем одного исследования, играет важную роль: похоже, мы рассматриваем действительно значимое событие.

Казалось, эта гипотеза находит дополнительные подтверждения: опыты на мышах вроде бы тоже показали, что этот ген контролирует массу тела. Генетически модифицированные мыши с искусственной сверхэкспрессией данного гена отличались чрезмерным весом, а при высокожировой диете проявляли симптомы диабета второго типа^19. Когда же этот ген у мышей отключали, у зверьков образовывалось меньше жировой ткани и они были стройнее, чем их собратья из контрольной группы. И когда такие мыши с отключенным геном ели больше, они все равно сжигали очень много калорий, даже если не проявляли особой физической активности^20.

Все это вызвало в среде ученых большое воодушевление. Вроде бы получалось, что если найти способ ингибирования активности этого гена у человека, то, возможно, удастся и создать лекарство от ожирения. Однако тут возникла некая проблема. Исследователи были не совсем уверены, чем же данный ген-кандидат занимается в клетках, а потому было не так-то просто разрабатывать эффективные лекарства, учитывающие его особенности. Но, во всяком случае, специалисты получили некую отправную точку. Результаты исследований людей и мышей, вроде бы указывали на то, что данный ген кодирует белок, играющий важную роль в развитии ожирения и в метаболических процессах. К этим результатам присовокупили вполне разумное предположение, что обсуждаемая вариантная пара нуклеотидных оснований, связываемая с ожирением, сама влияет на экспрессию обсуждаемого гена.

Однако здесь стоит вспомнить бессмертные слова Митча Хенесси, персонажа фильма «Долгий поцелуй на ночь», которого играет Сэмюэл Л. Джексон. Эти слова мы здесь скромно переведем так: «Слово „предположение“ явно происходит от слова „ложь“». Разумеется, задним числом мы все мудрецы. Незачем проявлять насмешливое снисхождение к ученым, которые исследовали роль этого белка. Просто такое ощущение, что природа всегда ухитряется поставить нам подножку.

Вот истинная причина, по которой эта вариация в единичной паре нуклеотидных оснований вносит изменения в физиологию человека. Существует другой ген, кодирующий белок и расположенный в полумиллионе пар нуклеотидных оснований от вышеописанного места ключевого изменения пары оснований[53]. Мусорная область первого гена взаимодействует с промотором второго гена, меняя картину его экспрессии. В сущности, эта мусорная область действует как энхансер. Ее воздействие наблюдают у человека, мышей и рыб. А значит, логично предположить, что это древнее взаимодействие, имеющее большое значение.

Исследователи проверили уровень экспрессии этого второго гена в более чем 150 образцах человеческого мозга. Удалось выявить четкую корреляцию между вариацией в упомянутой паре нуклеотидных оснований, находящихся в данной мусорной области-энхансере, и уровнем экспрессии второго гена. Однако не удалось выявить никакой корреляции между вариацией в этой паре оснований и уровнем экспрессии первоначального кандидата (в котором и находится данная вариация).

Подавив у мышей экспрессию этого второго гена, ученые обнаружили, что такие зверьки худее мышей контрольной группы, у них меньше жировая прослойка, а базовая скорость метаболизма выше. Так стало ясно, что именно этот второй ген влияет на метаболизм^21.

Перед нами модель, очень похожая на ту, с которой мы уже встречались при обсуждении человеческой пигментации и панкреатического агенеза. На самом деле существует целый ряд различных вариативных пар нуклеотидных оснований в мусорной области гена, который первоначально ассоциировали с ожирением. Многие из этих вариаций действительно оказались связаны с ожирением. Поэтому, возможно, все эти вариации оказывают такое же воздействие, то есть изменяют активность энхансера, а значит, и уровень экспрессии гена-мишени, находящегося на расстоянии полумиллиона пар нуклеотидных оснований.

Разумеется, опыты с мышами позволяют предположить, что первый ген (тот, мусорная ДНК которого как раз и содержит эти вариации) также способен и сам по себе влиять на ожирение и метаболизм. Мы могли бы задаться вопросом: так ли это важно с практической точки зрения, каким образом изменение одной пары нуклеотидных оснований вызывает подобный эффект? Оказывается, это очень существенно для разработки новых лекарственных препаратов.

Одна из множества проблем в этой сфере состоит в том, что зачастую одни пациенты реагируют на лекарство, а другие — нет. Это повышает затраты на разработку препаратов, ибо в таких случаях фармацевтические компании вынуждены проводить весьма широкомасштабные клинические испытания, чтобы выяснить, работает ли их новое изобретение: ведь его следует проверять на как можно большем числе испытуемых. Кроме того, такое средство дорого применять в клинической практике: врач выписывает его всем, кто страдает соответствующим заболеванием, но действует оно лишь на некоторых.

В наши дни фармацевтические компании пытаются создавать так называемые «персонифицированные средства». Иными словами, они стремятся разрабатывать лекарства для тех ситуаций, когда на самой ранней стадии уже известно, каких именно пациентов предполагается лечить. Обычно это знание основано на генетических особенностях пациента. Такой подход может оказаться весьма эффективным: он удешевит процесс разработки лекарств и в целом ускорит их лицензирование. Подобные препараты будут прописывать лишь тем пациентам, которым они почти наверняка принесут пользу. Существенное облегчение для системы здравоохранения — не будут тратиться деньги на лечение тех, кому это лечение не показано, что принесет дополнительную пользу и пациентам: все лекарства способны вызывать побочные эффекты, и незачем рисковать, если вероятность пользы от данного препарата мала^22. Такой подход уже сейчас во многих случаях оказался по-настоящему успешным. Самые яркие примеры связаны с препаратами для лечения рака груди^23, рака крови^24, а совсем недавно — и рака легких^25.

Важнейший этап при разработке персонифицированных препаратов — выявление надежного биомаркера. Биомаркер показывает, кто из потенциальных пациентов будет должным образом реагировать на лекарство. Конечно, всегда хотелось бы добиться идеальной ситуации, когда 100% носителей соответствующего биомаркера будут реагировать на препарат как полагается. Проблемы начинаются, когда у врачей есть нужный биомаркер для данной болезни, но связывают его с неподходящей мишенью. Фармакологи создают препарат, а потом недоумевают, отчего пациенты, которым «положено» реагировать на него, совсем к нему невосприимчивы. Причина такой невосприимчивости — разрыв цикла взаимосвязей.

Действенные лекарства от ожирения могут отхватить очень жирный кусок рынка (извините за каламбур). Вероятно, некоторые компании уже начали программы разработки препаратов, нацеленных на первую из мишеней, описанных выше. Теперь придется прекратить эти работы или попытаться хоть как-то использовать уже полученные в ходе этих работ результаты. Пока же лучший путь для нас — поменьше есть плюс физические упражнения.

Глава 16. Потеряно без перевода

Ничего нет хуже намеренного причинения вреда ребенку. Во многих странах персонал отделений неотложной помощи специально учат проверять, нет ли у юного пациента необъяснимых травм. В их числе — трещины в костях у совсем маленьких детей. Иногда обнаружение таких повреждений приводит к тому, что дети попадают в распоряжение органов опеки, к ним почти не допускают родителей (порой не допускают вообще), а затем кто-то из родителей (или оба) выслушивает приговор суда и после этого зачастую садится в тюрьму.

Конечно же, защита детей превыше всего. Но представьте, каким кошмаром вся вышеописанная процедура обернется для родителей, если они при этом совершенно невиновны, поскольку травмы ребенка вызваны недиагностированным заболеванием!1 Хотя количество несправедливых решений суда ничтожно по сравнению с количеством реальных случаев издевательств родителей над своими отпрысками, воздействие такого ошибочного судебного решения на семью совершенно разрушительно. Здесь и потеря свободы, и разрыв брачных уз, и общественное презрение, и (что едва ли не печальнее всего) утрата контакта между родителями и детьми.

К ложному выводу о том, что родители избивали ребенка, может привести (и не раз приводило) одно генетическое заболевание. Называется оно несовершенным остеогенезом, но в основном его знают как «болезнь хрупких костей» (или болезнь «хрустального человека»)2. У страдающих этим недугом трещины в костях появляются очень легко, иногда просто в результате незначительных травм, которые у здорового ребенка мог вызвать разве что небольшой синяк. Кроме того, кости неоднократно ломаться и затем неправильно срастаться, так что физические возможности больного со временем неуклонно уменьшаются.

Казалось бы, распознать эту болезнь очень просто. Даже странно, что родителей таких детей иногда неправомерно обвиняют в избиениях. Однако существует целый ряд факторов, осложняющих дело. Начнем с того, что болезнь хрупких костей затрагивает в среднем 6-7 детей из каждых 100 тысяч. Врач, осматривающий ребенка, может, просто никогда раньше не сталкивался с этим недугом, особенно если сравнительно недавно работает в отделении неотложной помощи. Но, к сожалению, даже самые неопытные врачи в этом отделении наверняка встречались с последствиями избиения детей, так что они более склонны поставить именно этот привычный и печальный диагноз.

Диагностирование болезни хрупких костей затруднено еще и из-за того, что существует по меньшей мере 8 типов этого заболевания, различных по остроте и по конкретным особенностям. В наиболее ярко выраженном случае у младенца могут появляться трещины в костях еще до рождения. Различные формы болезни вызываются мутациями различных генов. Наиболее распространенные случаи связаны с дефектами в коллагенах — белках, играющих важную роль в обеспечении гибкости костей. Хотя мы часто представляем себе кости как нечто очень жесткое и твердое, они должны обладать некоторой гибкостью, чтобы не ломаться, а гнуться в ответ на давление. Вот почему мы учим детей не залезать на высохшие, мертвые деревья: негибкие, сухие сучья сломаются с большей вероятностью, чем упругие зеленые ветви живого дерева.

В большинстве случаев при болезни хрупких костей мутантной оказывается лишь одна копия гена. Другая его копия (если помните, мы наследуем по одной копии гена от каждого из родителей) пребывает в отличном состоянии. Но при этой болезни, к сожалению, недостаточно наличия одной нормальной копии. Когда болезнь выявлена, логично ожидать, что заболевание коснулось не только ребенка, но и кого-то из его родителей — того, кто и передал заболевание по наследству. Однако если мы имеем дело с новой мутацией, то есть с мутацией, возникшей при выработке яйцеклеток или сперматозоидов, ребенок может получить болезнь, даже когда у его родителей нет никаких ее симптомов. Как правило, особенно часто это происходит при острых формах болезни хрупких костей, вот почему медикам, работающим в отделениях скорой помощи, еще труднее понять, что они имеют дело с заболеванием, вызванным мутацией.

Но если врачи все-таки заподозрили, что к ним попал ребенок, страдающий болезнью хрупких костей, они могут заказать генетические тесты и попытаться подтвердить свой первоначальный диагноз. Генетическая диагностика потребует анализа ДНК-последовательностей генов, которые (как удалось предварительно установить) оказываются мутантными при болезни хрупких костей. Исследователи будут секвенировать гены в определенном порядке — в зависимости от конкретных особенностей симптомов у пациента и от того, какую форму болезни хрупких костей эти особенности, по мнению ученых, предопределяют. Гены, которые могут скорее всего влиять на болезнь, будут секвенироваться первыми. В них будут искать мутации, изменяющие белки, что требуются для развития крепких и здоровых костей.

Обычно такой подход срабатывает. Но неизбежно обнаруживаются пациенты со всеми симптомами болезни хрупких костей, однако без каких-либо мутаций, меняющих аминокислотную последовательность у белков, которые (как удалось выяснить) играют роль в развитии данного заболевания. Именно с такими трудностями столкнулись ученые, попытавшиеся разобраться в причинах особого типа болезни хрупких костей[54], наблюдаемого в небольшом количестве корейских семей. При болезни такого типа характер распределения трещин имеет свои особенности, но главное — весьма странные последствия, к которым эти трещины приводят. Либо сама трещина, либо медицинское вмешательство, к которому прибегают для ее лечения, вызывает необычную реакцию со стороны организма пациента: организм создает слишком мощные отложения кальция вокруг места повреждения. На рентгеновских снимках они видны как недвусмысленные размытости.

Одновременно другая группа ученых обследовала ребенка из немецкой семьи, у которого также обнаружился этот весьма необычный тип болезни хрупких костей. Любопытно, что и в корейском, и в немецком случае причиной болезни оказалась одна и та же мутация. Как выяснилось, изменена лишь одна пара нуклеотидных оснований среди 3 миллиардов, унаследованных больными детьми от каждого из своих родителей. Причем изменение, вызвавшее болезнь, происходило не в области гена, кодирующей аминокислоты. Оно происходило в мусорной ДНК.

Начало и конец

Эта мутация кроется в мусорной области, с которой мы уже встречались. В главе 2 мы видели, как гены, кодирующие белки, собираются в модули. Все эти модули вначале копируются в информационную РНК, а затем объединяются (это может происходить по-разному). Участки, не кодирующие белки, в ходе этого процесса сплайсинга удаляются (см. рис. 2.4).

Но два участка мусорной ДНК всегда остаются в зрелой информационной РНК. Такие участки можно видеть на рис. 2.5 и на рис. 16.1. Поскольку области в начале и конце информационной РНК сохраняются при сплайсинге, но никогда не транслируются в белок, они называются нетранслируемыми областями[55]. Хотя они не вносят вклад в аминокислотную последовательность нормального белка, исследователи сейчас выявляют неведомые нам прежде пути, какими эти нетранслируемые области (напрямую не воздействующие на трансляцию, «перевод» с языка ДНК на язык РНК) могут влиять на экспрессию белков, а значит, и на состояние здоровья человека.

Корейские исследователи проанализировали ДНК-последовательности у 19 больных. Тринадцать из пациентов принадлежали к 3 семьям, которых затронул недуг, остальные же 6 больных представляли единичные случаи. Как выяснилось, у каждого из этих 19 человек наблюдается замена нуклеотидного основания Ц на основание Т в нетранслируемой области, которая находится в начале кодирующей белок зоны определенного гена[56]. Замена происходит всего за 14 нуклеотидных оснований от начала кодирующей белок зоны, которая находится в соответствующей информационной РНК. Такую замену Ц на Т не обнаружили ни у тех членов изучаемых семей, которых не коснулась болезнь, ни у 200 человек того же этнического происхождения, не связанных с испытуемыми близким родством^3.

Рис. 16.1. Даже после того, как в результате сплайсинга объединяются участки информационной РНК, кодирующие белки, в молекуле остаются мусорные области — в начале и в конце.

Примерно в то же время ученые, работавшие в 5 тысячах миль от Кореи, в Германии, выявили такую же мутацию у девочки с тем же типом болезни хрупких костей и у пациента, не связанного с ней близким родством. В обоих случаях речь шла о новой мутации. У родителей пациентов она отсутствовала, а значит, возникла при выработке яйцеклеток или сперматозоидов^4. Ученые проанализировали этот регион генома у более чем 5000 человек, не страдающих болезнью, и ни у кого не нашли такого изменения.

Когда мы смотрим на схематическое изображение информационной РНК (рис. 16.1), у нас может возникнуть представление, что зоны, кодирующие белок, и нетранслируемые области сильно отличаются друг от друга. Однако они нарисованы так исключительно для удобства восприятия, и в клетке выглядят по-другому. На уровне нуклеотидной последовательности они весьма схожи, ибо и те, и другие участки состоят лишь из нуклеотидных оснований РНК.

Для любого, кто хорошо понимает написанный по-английски текст, не составит труда расшифровать следующую строку:

Iwanderedlonelyasacloud[57]

Хотя все буквы образуют слитную цепочку без пробелов, нетрудно распознать, где начинаются и оканчиваются слова. То же самое и с клеткой: она способна различать нуклеотидные последовательности в нетранслируемых областях информационной РНК и в ее участках, кодирующих аминокислоты.

Трансляция информационной РНК для создания белка осуществляется в рибосомах (мы познакомились с этим процессом в главе 11). Информационная РНК пропускается через рибосому, причем первым, как нетрудно догадаться, в рибосому попадает начало этой молекулы. Ничего особенного не происходит, пока рибосома не прочтет определенную последовательность из тройки нуклеотидных оснований — АУГ (как упоминалось в главе 2, основание Т, имеющееся в ДНК, всегда заменяется в РНК на У — основание несколько иного состава[58]). Эта триада сигнализирует рибосоме: пора приступать к соединению аминокислот друг с другом, чтобы в итоге создать белок.

Иными словами, перед нами окажется подобие какого-нибудь такого куска текста (воспользуемся строчкой, приведенной выше):

dbfuwjrueahuwstqhwIwanderedlonelyasacloud

Прописная буква I — сигнал, что мы должны начать чтение нормальных слов. Она играет такую же роль, как и триплет АУГ, сигнализирующий, что пора начинать трансляцию.

У вышеупомянутых корейских и немецких пациентов, страдающих болезнью хрупких костей, в генах имеется участок, где нормальная ДНК-последовательность в нетранслируемой области изменена с АЦГ на АТГ (в РНК триплет АТГ отображается как АУГ). В результате рибосомы слишком рано приступают к созданию белковой цепочки. Это схематически показано на рис. 16.2.

Рис. 16.2. Мутация в нетранслируемой мусорной области в начале информационной РНК вводит рибосому в заблуждение. Рибосома слишком рано приступает к соединению аминокислот, создавая белок, в начале которого появится лишняя аминокислотная последовательность.

Это приводит к странному явлению: мусорная РНК становится РНК, кодирующей белок. Такой процесс добавляет 5 лишних аминокислот к началу нормального белка (см. рис. 16.3). Белок, играющий роль в развитии этого типа болезни хрупких костей, частично расположен внутри клетки, а частично — снаружи. Изменение в мусорной ДНК добавляет 5 лишних аминокислот к той части белка, которая находится вне клетки.

Пока не совсем ясно, почему эти 5 аминокислот вызывают симптомы данной болезни. Эксперименты, проведенные ранее на мышах, показали, что избыток или нехватка указанного белка приводят к дефектам в скелете. А значит, вполне очевидно: в организме должно вырабатываться строго необходимое его количество^5. Пять лишних аминокислот пристроены к той части белка, которая, по-видимому, соединяется с другими белками — или с какими-то молекулами, подающими сигналы костным клеткам. Возможно, обладание лишними аминокислотами мешает мутантному белку правильно реагировать на эти сигналы, как если бы кто-нибудь залепил жевательной резинкой сенсор дымового датчика.

Рис. 16.3. Справа: U-образный белок с 5 лишними аминокислотами в начале (изображены звездочками). Вероятно, эти лишние аминокислоты оказывают влияние на то, какие еще молекулы могут взаимодействовать с данным белком.

Болезнь хрупких костей — не единственное заболевание человека, вызываемое мутациями в нетранслируемых областях, расположенных в начале гена. Мощный генетический компонент выявлен примерно в 10% случаев меланомы — агрессивной формы рака кожи. В ряде таких генетически мотивированных случаев удалось идентифицировать мутацию, которая по характеру действия очень напоминает мутацию, вызывающую болезнь хрупких костей. Упрощенно говоря, изменение единственного нуклеотидного основания в нетранслируемой области, расположенной в начале гена, порождает аномальный АУГ-сигнал в информационной РНК. Это, опять-таки, приводит к тому, что рибосома слишком рано приступает к формированию белковой цепочки. Появляется белок с лишними аминокислотами в начале. Он ведет себя аномально и повышает риск возникновения рака^6.

Как всегда, нам следует опасаться нашей склонности видеть определенный рисунок явлений, исходя из слишком малого количества данных. Не все мутации в нетранслируемой области, находящейся в начале гена, порождают новые аминокислотные последовательности. Существует другой тип рака кожи, обычно гораздо менее агрессивный, чем меланома. Он называется базальной карциномой и также имеет значительную генетическую составляющую. У отца и дочери с этой разновидностью злокачественной опухоли выявили редкую мутацию.

Нетранслируемая область в начале определенного гена обычно содержит последовательность ЦГГ, повторенную 7 раз подряд. У отца и дочери имелась лишняя копия этого триплета ЦГГ. Наличие 8 повторов вместо обычных 7 вызвало предрасположенность к базальной карциноме. Данная мутация не изменила аминокислотную последовательность белка, кодируемого этим геном. Судя по всему, тройка лишних нуклеотидных оснований вносила изменения в то, как рибосома обрабатывает соответствующую информационную РНК. Характер этих изменений пока не выяснен, но понятен их конечный результат: больные клетки экспрессируют гораздо меньше определенного белка, чем нормальные^7.

Рак — заболевание многостадийное, и хотя эта мутация в не-транслируемой области, находящейся в начале определенного гена, создала у пациентов предрасположенность к злокачественным новообразованиям, в клетках наверняка происходили и другие события, повлекшие за собой полномасштабный рак.

В начале была мутация

Однако мы уже знакомы с заболеванием, при котором наследуемая мутация в нетранслируемой области, расположенной в начале гена, напрямую приводит к патологии. Речь идет об умственной отсталости, вызываемой синдромом ломкой X-хромосомы (см. главу 1). Напомним, что это необычная мутация. При данной мутации ЦЦГ, последовательность из 3 пар нуклеотидных оснований[59], повторяется гораздо многократнее, чем следует. Менее 50 копий этого триплета, следующих подряд, считаются нормой; 50-200 копий обычно не ассоциируются с болезнью, но когда число повторов попадает в этот диапазон, ситуация становится весьма нестабильной. Биологическая аппаратура, копирующая ДНК в ходе подготовки к делению клетки, словно бы испытывает трудности при подсчете такого большого числа повторов. В результате добавляются новые повторы. Если такое происходит в гаметах, у ребенка, появившегося затем на свет, могут иметься многие сотни или даже тысячи повторов в соответствующем гене, и несчастное дитя будет отягощено синдромом ломкой X-хромосомы^8.

Чем больше число повторов, тем ниже экспрессия гена, чья работа нарушается при синдроме ломкой X-хромосомы. Как вы уже видели, это происходит из-за взаимодействия гена с эпигенетической системой. Там, где в нашем геноме за Ц следует Г, к основанию Ц может пристраиваться небольшая модифицирующая группа. Обычно это происходит в тех зонах, где такой ЦГ-мотив присутствует в высоких концентрациях. Аномально огромное число повторов триплета ЦЦГ в «расширении» (зоне экспансии) гена синдрома ломкой X-хромосомы создает как раз такую среду. Нетранслируемая область перед ДНК-последовательностью этого гена становится у больных этим недугом обильно модифицированной, что и отключает ген. Организм пациента не вырабатывает никаких молекул информационной РНК на основе данного гена, а значит, ген не порождает никакого белка.

У пациентов с этой патологией наблюдается умственная отсталость, а также некоторые признаки, напоминающие симптомы аутизма (в частности, они испытывают проблемы с социальным взаимодействием). Одни больные гиперактивны, а у других периодически случаются припадки.

Разумеется, это заставляет задуматься, чем же обычно занимается в организме данный белок. Клиническая картина вырисовывается довольно сложная, а значит, этот белок, по всей видимости, вовлечен в действие самых разных биофизиологических процессов. Опыты показывают, что это, вероятно, так и есть.

Как мы видели в главе 2, белок, чье функционирование нарушается при синдроме ломкой X-хромосомы (для простоты будем называть его просто белком синдрома ломкой X-хромосомы), обычно образует комплекс с молекулами РНК, находящимися в мозге. Белок таргетирует около 4% молекул информационной РНК, экспрессируемых нейронами^9. Связываясь с этими молекулами РНК, он действует как тормоз процесса их трансляции в белки. А это, в свою очередь, не позволяет рибосомам вырабатывать слишком много белковых молекул на основании данных, содержащихся в информационной РНК^10.

По-видимому, такой дополнительный уровень контроля генетической экспрессии играет особенно важную роль в мозге. Мозг — чрезвычайно сложно устроенный орган. Среди всех типов его клеток наибольший интерес представляют нейроны. Их обычно и имеют в виду, говоря о клетках мозга. В человеческом мозге содержится несметное количество нейронов: по самым свежим оценкам, их чуть больше 85 миллиардов^11. Иными словами, количество нейронов в мозге каждого из нас в 12 раз больше количества людей на Земле. Нейроны связаны между собой самым затейливым образом — подобно тому, как людей связывают сложные сети дружб, враждебностей, знакомств, любовных увлечений, семейных отношений. Поразительнее всего сам уровень взаимосвязанности этих миллиардов нейронов. Они выпускают специальные отростки для общения с собратьями, образуя громадные сети, в которых постоянно воздействуют на реакции и деятельность друг друга. Точное число таких контактов очень трудно оценить. Вероятно, каждый нейрон образует не меньше тысячи связей с другими нейронами, а значит, наш мозг содержит не меньше 85 триллионов различных точек контакта^12. Фейсбук по сравнению с этим кажется чем-то глубоко провинциальным.

Для мозга правильное установление таких контактов — титаническая задача. Представьте себе, что вам нужно часто встречаться с друзьями, но при этом избегать того чудика, с которым вы мельком познакомились во время своей первой недели в колледже. Контакты между нейронами завязываются, а затем усиливаются либо пресекаются — в рамках комплексных реакций на среду и на деятельность других нейронов сети. Многие из информационных РНК-мишеней, соединяющихся с белком синдрома ломкой X-хромосомы, при нормальных условиях вовлечены в поддержание пластичности нейронов, которая позволяет им должным образом укреплять или обрывать связи^13. Если белок синдрома ломкой X-хромосомы не экспрессируется, информационные РНК-мишени транслируются в белок чересчур активно. Это мешает поддержанию нормального уровня пластичности нейронов, что приводит к неврологическим проблемам.

Недавно ученые продемонстрировали, что могут воспользоваться этой информацией для лечения синдрома ломкой X-хромосомы — по крайней мере, у генетически модифицированных животных. Мыши с нехваткой белка синдрома ломкой X-хромосомы испытывают затруднения с пространственной памятью и с социальными взаимодействиями. Мышь, не знающая, куда ей бежать, и не понимающая, как реагировать на сородичей, долго не протянет. Исследователи применили генетические технологии для того, чтобы понизить у таких мышей экспрессию одной из ключевых информационных РНК. Эту РНК обычно контролирует белок синдрома ломкой X-хромосомы. Проделав это, ученые обнаружили, что состояние мышей заметно улучшилось. Пространственная память у зверьков стала крепче, к тому же они теперь отлично ладили с другими мышами. Кроме того, они оказались меньше подверженными приступам по сравнению с обычными мышами, имеющими синдром ломкой X-хромосомы.

Такое ослабление симптомов вполне отвечало глубинным изменениям, которые экспериментаторам удалось обнаружить в мозге подопытных грызунов^14. Нейроны нормального мозга обладают небольшими грибовидными отростками, характерными для прочных и зрелых связей. А вот у нейронов тех людей и мышей, которые страдают синдромом ломкой X-хромосомы, подобных отростков меньше, зато больше длинных и тонких. После генетического лечения прибавилось число грибовидных отростков и уменьшилось количество вытянутых.

Все это вызвало большое воодушевление. Особенно вдохновляло то, что теперь, как казалось многим, специалисты наконец получат возможность улучшать функционирование нейронов даже после развития симптомов заболевания. Мы не можем применять этот генетический подход к человеку, но полученные данные побуждают ученых искать лекарства, которые оказывали бы схожее действие и, следовательно, послужили бы средством для борьбы с синдромом ломкой X-хромосомы. Этот синдром — самая распространенная из наследуемых форм умственной отсталости, так что создание реальной методики его лечения принесло бы колоссальную пользу и пациентам, и обществу в целом.

А теперь зайдем с другого конца

Как мы уже отмечали в начале книги, увеличение количества триплетных повторов (их экспансия) на другом конце гена также может вызывать генетические заболевания человека. Наиболее известный пример — миотоническая дистрофия. Ее причиной служит экспансия ЦТГ-повтора в нетранслируемой области на конце гена. Повторы, которые состоят из 35 таких единиц, следующих одна за другой (или из большего их количества), связываются с заболеванием. Чем больше число повторов, тем острее симптомы^15.

Миотоническая дистрофия — пример мутации с приобретением функции. Основное воздействие экспансии в гене ломкой X-хромосомы сводится к остановке выработки его информационной РНК. С миотонической дистрофией дело обстоит иначе. Включается мутантная версия гена миотонической дистрофии, порождающая информационные РНК с обширными зонами экспансии (участками с большим количеством повторов) на конце молекулы. Причина возникновения симптомов — именно эти многочисленные копии триплета ЦУГ в информационной РНК (как мы помним, в РНК основание Т везде заменено на У). Если мы взглянем на рис. 2.6, то увидим, пускай и в схематичном виде, как это происходит. Зоны с увеличенным числом повторов служат как бы молекулярной губкой, впитывающей определенные белки, способные соединяться с этими нуклеотидными последовательностями.

Мусорная ДНК играет существенную роль при миотонической дистрофии. Это показано на рис. 16.4. ЦТГ-экспансия в мусорной нетранслируемой области связывает аномально высокие количества ключевого белка[60]. При нормальных обстоятельствах он участвует в удалении мусорной ДНК, которая обнаруживается между кодирующими белок зонами, когда ДНК впервые копируется в РНК. Поскольку при миотонической дистрофии такое большое количество белка потрачено на связывание с увеличенным количеством нетранслируемых повторов, этот белок не может нормально выполнять свою функцию. А следовательно, множество молекул РНК, вырабатываемых различными генами, не получают должной регуляции.

Рис. 16.4. Избыточное связывание белков с увеличенным при миотонической дистрофии количеством повторов определенного триплета в информационной РНК приводит к тому, что белки отбираются от других молекул информационной РНК, которые эти белки должны регулировать (происходит так называемая секвестрация белков). Другие информационные РНК перестают обрабатываться должным образом, что нарушает процесс производства белков, которые они должны помогать синтезировать.

Это своеобразное титрование связывающегося белка, происходящее при многих недомоганиях, когда экспрессируется и такой белок, и ген миотонической дистрофии, очень помогает объяснить, почему одно и то же заболевание подобного рода порой по-разному проявляется у разных пациентов. Здесь не идет речь о ситуации из разряда «все или ничего». Какая-то доля связывающегося белка может оставаться свободной для того, чтобы все-таки регулировать свой ген-мишень. И эта доля может оказаться разной — в зависимости от размеров зоны экспансии и от соотношения количества имеющейся в клетке информационной РНК миотонической дистрофии и связывающегося белка^16.

Не помешает чуть пристальнее рассмотреть те белки, на которые в конечном счете влияет такая нехватка (на рис. 16.4 это условные белки А, В и С). Пока больше всего подтверждений в этом смысле получили инсулиновый рецептор^17, один из сердечных белков^18, а также белок скелетных мышц, служащий переносчиком хлорид-ионов через мембраны^19. Инсулин требуется для поддержания мышечной массы. Если мышечные клетки не экспрессируют достаточно рецептора, связывающего инсулин, мышцы начинают атрофироваться. Сердечный белок, о котором идет речь, играет важную роль в обеспечении нужных электрических характеристик сердца (об этом известно уже сравнительно давно)20. Перенос хлорид-ионов через мембраны в скелетных мышцах — немаловажная стадия циклов мышечного сокращения и релаксации. Поэтому нарушения в процессах обработки информационных РНК, кодирующих эти белки, вполне согласуются с некоторыми из основных симптомов миотонической дистрофии: увяданием мышц, внезапной летальной остановкой сердца из-за губительных аномалий в сердечном ритме, а также трудностями при расслаблении мышц после их сокращения.

Миотоническая дистрофия — весьма показательный пример того, насколько важна мусорная ДНК для здоровья человека. Хотя мутация происходит в информационной РНК, производимой на основе гена, кодирующего белок, данная мутация практически не влияет на сам этот белок. Мутантная область РНК сама становится патологическим агентом и вызывает заболевание, изменяя характер обработки мусорных областей других информационных РНК.

Скажите «ААААААААА»

При нормальных обстоятельствах нетранслируемые области в конце информационных РНК, кодирующих белки, обладают целым рядом функций. Одна из самых важных связана с процессом, затрагивающим все информационные РНК. «Голые» молекулы информационной РНК могут очень быстро расщепляться в клетке посредством процесса, который возник в нашем организме в ходе эволюции. Его цель — поживее избавлять нас от определенных типов вирусов. Чтобы не расщеплялись нужные молекулы и чтобы обеспечить информационным РНК достаточно долгую жизнь (они должны успеть транслироваться в белок); эти молекулы-посланницы модифицируются почти сразу же после возникновения: к концу информационной РНК добавляется множество следующих подряд нуклеотидных оснований А. Схематически это показано на рис. 16.5. На конце информационной РНК млекопитающих обычно находится около 250 нуклеотидных оснований А. Они нужны для сохранения стабильности молекулы и того, чтобы гарантировать: информационная РНК будет выведена за пределы ядра, где она произведена, и затем будет доставлена в рибосомы, где она транслируется в белок.

Рис. 16.5. Нуклеотидная последовательность в нетранслируемой области на конце информационной РНК привлекает фермент (обозначен ножницами), который связывается с определенным сайтом и затем отрезает молекулу чуть ближе к ее краю. Множество нуклеотидных оснований А пристраивается к этому укороченному концу молекулы информационной РНК, хотя эти основания не закодированы в исходной ДНК-последовательности.

В конце нетранслируемой области информационной РНК имеется важнейший нуклеотидный мотив (характерная нуклеотидная последовательность). На рис. 16.5 он обозначен треугольничком. Он называется сигналом полиаденилирования (основание А — аденин, поэтому добавление множества оснований А именуется полиаденилированием). Это последовательность из 6 оснований (ААУААА) среди мусора нетранслируемой области. Она служит сигналом для фермента, обрабатывающего информационную РНК (напомним, такая обработка называется процессингом). Распознав этот мотив, состоящий из 6 оснований, фермент отрезает информационную РНК чуть ближе к краю по отношению к тому месту, где располагается мотив (обычно в 10-30 основаниях от него). И затем уже другой фермент может пристроить множество оснований А к оставшейся части информационной РНК[61].

Тот же мотив из 6 нуклеотидных оснований часто встречается в одной той же нетранслируемой области многократно. Пока не совсем ясно, как клетка «выбирает», каким именно мотивом воспользоваться в том или ином случае. Но раз уж у нее есть выбор из множества мотивов, может иметься и множество информационных РНК, кодирующих один и тот же белок, однако содержащих нетранслируемую область разной длины непосредственно перед этими множественными основаниями А, идущими подряд. Эти информационные РНК разной длины будут обладать разной стабильностью, а значит, вырабатывать разное количество белка. Вероятно, благодаря этому организм получает дополнительную возможность осуществлять тонкую подстройку вырабатываемого количества белка^21.

Существует весьма необычная и редкая генетическая болезнь, именуемая IPEX-синдромом[62]. Это смертельное аутоиммунное заболевание, при котором организм атакует и разрушает собственные ткани. В частности, атаке подвергаются клетки, выстилающие внутреннюю поверхность кишечника, что приводит к острой диарее у младенцев и препятствует их нормальному развитию. Атаке могут подвергаться также железы, вырабатывающие гормоны, что приводит к таким болезням, как диабет первого типа (при котором организм пациента не в состоянии вырабатывать инсулин). Под ударом может оказаться и щитовидная железа, что приводит к снижению общего уровня активности организма^22.

Все немногочисленные случаи проявлений IPEX-синдрома вызваны мутацией сигнала полиаденилирования. В нормальной последовательности ААУААА происходит замена одного основания, в итоге она выглядит как ААУГАА и больше не служит мишенью для режущего фермента^23.

Ген, в котором происходит это изменение, кодирует белок, способный включать другие гены[63]. Белок требуется для контролирования определенного типа иммунных клеток[64]. В некоторых генах такое изменение одного мотива, состоящего из 6 нуклеотидных оснований, может не представлять слишком уж серьезной проблемы, поскольку в таком случае клетка воспользуется другими, нормальными последовательностями из 6 оснований, находящимися поблизости в той же нетранслируемой области. Изменение может слегка нарушать процесс тонкой настройки, но все-таки странно, что оно способно привести к такой опасной болезни, как IPEX-синдром. Проблема разрастается до такого недуга из-за того, что нетранслируемая область в данном гене больше не содержит почти никаких подходящих шестиосновных мотивов, способных действовать как сигналы полиаденилирования. Мутация в нетранслируемой области означает, что информационная РНК не разрезается должным образом, нуклеотидные основания А не добавляются, и информационная РНК в результате оказывается очень нестабильной. Поэтому клетки почти не вырабатывают нужный белок. В сущности, воздействие мутации в этом мусорном мотиве столь же губительно, как если бы оно непосредственно нарушало деятельность зоны, кодирующей белок.

Лишь сравнительно недавно, с удешевлением технологий секвенирования, ученые начали по-настоящему исследовать нетранслируемые области молекул информационной РНК, чтобы выявлять мутации, вызывающие редкие и опасные заболевания. Можно с уверенностью сказать, что в ближайшие несколько лет мы наверняка увидим множество других работ подобного рода. Мы оптимистичны в своем предсказании еще и потому, что ученые, возможно, уже выявили еще один такой пример.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) называемый также болезнью моторных нейронов или болезнью Лу Герига, — недуг разрушительный. Он характеризуется тем, что нейроны головного и спинного мозга, контролирующие движения мышц, постепенно отмирают. Больные испытывают растущее истощение и прогрессивный паралич. Они не способны нормально говорить, глотать, дышать^24. Знаменитый космолог Стивен Хокинг страдает БАС, хотя его случай не совсем типичный. Страшный диагноз ему поставили, когда Хокингу был всего 21 год, тогда как у большинства страдающих БАС первые симптомы проявляются лишь в среднем возрасте. Профессор Хокинг вот уже больше полувека живет с этим заболеванием. Но, к сожалению, большинство таких пациентов умирает в течение первых 5 лет после постановки диагноза. Впрочем, иногда болезнь можно затормозить благодаря эффективному медицинскому вмешательству.

Ученые ещё далеко не всё понимают о БАС. Менее 10% случаев можно счесть наследственными. В остальных 90% случаев какие-то вариации в ДНК, возможно, вызывают предрасположенность к заболеванию, если носитель вариации встретится с каким-то триггером среды (пока эти провоцирующие факторы выявить не удалось). Возможно, у некоторых пациентов имеется мутация, которой уже достаточно для того, чтобы вызвать недуг, даже если среди близких пациента он никого не затронул. К примеру, такая мутация могла бы возникнуть в яйцеклетках или сперматозоидах родителей пациента^25.

Специалисты полагают, что один из генов, связанных с БАС, несет ответственность за 4% случаев, когда болезнь передается по наследству, и за 1% случаев, когда болезнь не обусловлена семейными факторами[65],26,27,28. Во всех первоначально изучавшихся случаях, связанных с этим геном, мутации наблюдались в его зонах, кодирующих белок. Теперь ученые сумели выявить 4 различных вариации в нетранслируемой области на конце данного гена. Их обнаружили у пациентов с БАС, не обладавшими никакими другими известными мутациями. Хотя вариации могут оказаться совершенно безобидными, в клетках, взятых у пациентов, выявлено аномальное распределение соответствующего белка и аномальные уровни его экспрессии. Эти находки заставляют предположить хотя бы то, что изменения в нетранслируемой области приводят к нарушениям в процессинге и трансляции самого белка, что и вызывает заболевание^29.

Глава 17. Почему «Лего» лучше, чем «Эйрфикс»

Многим детям (и немалому числу взрослых) нравится строить модели. Это можно делать самыми разными способами. Но давайте рассмотрим крайние варианты. Одним из самых популярных наборов-конструкторов в Великобритании стал в последние 30 с лишним лет «Эйрфикс» (Airfix). Маленькие пластмассовые детали самолетов, кораблей, танков и вообще почти всего, что вам может прийти в голову (как насчет бенгальских улан[66]?), предлагаются любителям моделирования вместе с подробными инструкциями. Моделист склеивает эти части, раскрашивает их, помещает на них переводные картинки и затем может наслаждаться законченным творением своих рук еще долгие годы.

Другая крайность — универсальная датская игрушка, которую я очень люблю. Речь идет, конечно же, о «Лего». Сейчас продается масса специализированных наборов «Лего», но основная идея в них всегда остается неизменной. Имеется сравнительно небольшое количество разновидностей компонентов, и эти детали можно соединять в любых сочетаниях по желанию пользователя. Построенную модель легко снова разобрать на исходные кирпичики, а затем использовать для создания чего-нибудь еще.

Примитивные организмы вроде бактерий тяготеют скорее к эйрфиксовскому пути. Их гены распределены четко и справедливо: каждый кодирует лишь один белок. Но чем сложнее становится организм, тем больше его геном начинает походить на «Лего»: значительно возрастает степень гибкости возможного использования компонентов. Когда мы задумываемся о том, какие же мы, люди, необыкновенные существа, можно даже воскликнуть, что на геномном уровне у нас «все потрясающе» (как сказано в известном фильме про «Лего»[67]).

Крайнее проявление этого феномена — сплайсинг, процесс, посредством которого наши клетки создают множество родственных друг другу белков на основе одного гена (см. рис. 2.5). Такое умение использовать компоненты гена множеством различных способов порождает невероятную биологическую гибкость и дарит организму дополнительные возможности. Мы получим некоторое представление о степени этой потенциальной вариативности обратившись к цифрам. Каждый ген человека содержит в среднем по 8 участков, кодирующих белки, и каждый из этих участков отделен от других областями мусорной ДНК[68]. Показано, что по меньшей мере 70% генов человека создают не менее чем по паре белков^1. Это достигается благодаря объединению различных участков, кодирующих аминокислоты. В очередной раз воспользуемся нашим примером со словом БЛЕДНОСТЬ (см. все тот же рис. 2.5). Оно позволяет нам синтезировать не только белок, обозначаемый как ЛЕНОСТЬ, но и белок, обозначаемый как ДНО. Способность создавать разные белки таким путем называется альтернативным сплайсингом.

Участки, кодирующие аминокислоты, сравнительно коротки по сравнению с мусорными областями, которыми они перемежаются. Средняя длина нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислоты, составляет около 140 пар нуклеотидных оснований, однако эти участки могут быть окружены мусорными областями длиной по несколько тысяч пар оснований^2. Около 90% пар нуклеотидных оснований в гене принадлежат этим промежуточным последовательностям (назовем их так), а не участкам, кодирующим аминокислоты. Представив это как подобие текста на английском языке, мы сразу же увидим некоторые проблемы, с которыми сталкивается клетка.

Вообразите, что вы встретили юношу (или девушку), и он (она) вас совершенно очаровал (очаровала). И тут вы, узнав, что он (она) обожает поэзию, решили прямо-таки потрясти предмет вашего нового увлечения — прочесть стихи. Но, поскольку в школе вы всегда прогуливали уроки литературы, ваш приятель снабдил вас листком, на котором написана просто убийственная первая строчка стихотворения, способная сразить наповал. Но вдруг, в самый неподходящий момент, выясняется: почему-то ваш друг (возможно, страдающий легкой формой социопатии) спрятал слова этой строчки среди гигантского количества бессмысленных сочетаний букв. А у вас есть всего несколько секунд на то, чтобы отыскать запрятанные слова, произнести их вслух и покорить сердце вашего объекта обожания (или хотя бы привлечь его внимание). Ну как, удастся вам это сделать? Проверьте себя. Быстренько взгляните на рис. 17.1.

Где-то здесь спрятана замечательная поэтическая строка

Рис. 17.1. Бросьте всего один взгляд на этот устрашающий текст. Найдете в нем строчку, способную завоевать кое-чье сердце?

А ведь наши клетки проделывают это все время, постоянно, много раз в течение каждогодня нашей жизни. Клеточная аппаратура анализирует длинную цепочку явной абракадабры, почти мгновенно находит скрытые в ней слова и соединяет их вместе. Ладно уж, теперь можете посмотреть на рис. 17.2 и выяснить, удалось ли вам потягаться с неразумными белками, благодаря которым вы, между прочим, до сих пор живы.

Одна из самых романтичных и обольстительных первых строчек среди всех стихотворных текстов, когда-либо написанных по-английски: «Had we but world enough and time» (Когда бы времени хватило нам и мира)

(Эндрю Марвелл, «К стыдливой возлюбленной»)

Рис. 17.2. Читайте только то, что выделено жирным и подчеркнуто.

В любой длинной последовательности случайных букв всегда обнаружатся еще и комбинации, из которых, опять-таки, чисто случайно складываются слова. Если при ухаживании (интересно, в наши дни кто-нибудь еще ухаживает?) вы по ошибке произнесете именно эти слова, вы можете разрушить свой единственный шанс обрести счастье. Рисунок 17.3 покажет вам, как это может произойти.

При выборе определенной комбинации правильных и неправильных слов вы явно выразите совсем другое чувство: «Had we but had enough to drink» («Когда б хватило нам хмельного здесь напитка»).

Рис. 17.3. Нет! Комбинация неудачная!

Используя этот несколько причудливый пример, можно лучше понять некоторые чисто механистические проблемы, с которыми сталкиваются наши клетки, пытаясь должным образом провести сплайсинг молекул РНК. Если бы мы сами разрабатывали такой процесс, он бы, наверное, состоял из компонентов, показанных на рис. 17.4^3. Но компоненты, представленные на схеме, дают лишь упрощенную картину. Важно осознавать, что различные клетки будут по-разному обращаться с одним и тем же геном — в зависимости от типа клетки и от того, что происходит с ней в данный момент. А значит, все стадии процесса нужно соответствующим образом регулировать и интегрировать, чтобы вырабатывать именно такие вариации белков, которые лучше всего подходят к конкретной ситуации (то есть лучше всего удовлетворяют нуждам организма в данный момент).

Рис. 17.4. Сверху вниз: последовательность действий, которые должна уметь выполнять сплайсинговая аппаратура клетки, чтобы соединить все нужные участки, кодирующие аминокислоты, в зрелую РНК требуемого строения и состава.

Сплайсинг как образ жизни

Такой сплайсинг длинных РНК с целью создания более коротких информационных РНК, несущих в себе сведения об определенных белках, является по-настоящему комплексным процессом. Система эта очень древняя. Ее компоненты и стадии сохраняются практически неизменными на всем протяжении эволюции — от дрожжей до царства животных. Работу проводит гигантский конгломерат молекул, который называется сплайсосомой и который как раз и представляет собой аппаратуру для сплайсинга. Сплайсосома состоит из сотен белков, а также некоторых мусорных РНК. Чем-то это напоминает рибосомы, действующие как фабрики по производству белков^4.

Одна из определяющих стадий процесса — обвивание сплайсосомы вокруг промежуточных последовательностей, которые требуется удалить из молекулы РНК. Сплайсосома вытесняет их и затем объединяет участки, кодирующие аминокислоты. Это чудовищно сложный многостадийный процесс. Мы знаем, что один из его первых ключевых этапов — распознавание промежуточных областей сплайсосомой. Ей ведь явно приходится начинать именно с этого, чтобы затем соединиться с ними и удалить их.

Начала и концы промежуточных последовательностей всегда отмечены определенными элементами из 2 нуклеотидных оснований. Молекулы мусорной РНК сплайсосомы могут соединяться с этими двухосновными последовательностями. Во многом это похоже на то, как две нити ДНК соединяются в наших генах с помощью пар таких же нуклеотидных оснований.

Однако в РНК (как и в ДНК) лишь 4 разных нуклеотидных основания, а значит, возможно лишь 16 комбинаций из двух оснований (АЦ и ЦА, как и все подобные симметричные сочетания, считаются разными парами). Следовало бы ожидать, что двухосновные элементы, обозначающие начала и концы промежуточных областей, будут представлены и в других местах этих областей, а также в участках, кодирующих аминокислоты. Так и есть. Поэтому, хотя эти двухосновные последовательности необходимы для сплайсинга, их наличия еще недостаточно для того, чтобы направлять процесс должным образом. Требуются и другие последовательности (см. рис. 17.5).

Последовательности, влияющие на выбор того, как будет осуществляться сплайсинг, находятся и в промежуточных мусорных областях, и в участках, кодирующих аминокислоты. Одни влияют на сплайсинг очень сильно, другие гораздо слабее и тоньше. Одни повышают вероятность акта сплайсинга, другие понижают его. Все они работают в системах комплексного партнерства. Суммарное воздействие, которое они оказывают на окончательную картину сплайсинга, определяется и другими событиями, происходящими в клетке, и ее свойствами в данный момент, например, конкретным составом белков в сплайсосоме. Эти модифицирующие последовательности обычно описываются с применением эпитетов типа «головокружительный» или «ошеломляющий». В речи энтузиастов науки они часто означают «невероятно сложный и запутанный, в данный момент далеко превышающий возможности нашего скромного разума или даже прогностических компьютерных алгоритмов, созданных специально для таких случаев».

Рис. 17.5. Множество различных нуклеотидных последовательностей взаимодействуют в молекуле РНК, направляя сплайсинг в нужном направлении. Отмеченные буквами мотивы, состоящие из двух оснований, необходимы, но сами по себе недостаточны для того, чтобы регулировать всю тонкую настройку процесса. В ней участвуют и другие сайты, оказывающие влияние различной силы, что показано отличиями в толщине и длине стрелок.

Сплайсинг и болезни

Чтобы хоть как-то ощутить, представить степень этой сложности, рассмотрим одну группу генетических заболеваний. В их числе — форма слепоты, именуемая пигментным ретинитом и затрагивающая примерно одного человека из каждых 4 тысяч. Как правило, все начинается в подростковые годы, с ухудшения ночного зрения. С годами зрение быстро падает. Это происходит оттого, что постепенно отмирают клетки глаза, воспринимающие свет^5. В среднем 1 из 12 случаев обусловлен мутацией в каком-то из 5 белков, участвующих в определенной стадии сплайсинга6,7,8,9. Данная мутация вызывает нехватку лишь клеток сетчатки, а не других клеток организма, которые также полагаются на процесс сплайсинга. Это показывает, что процессы контроля сплайсинга обладают высокой специфичностью по отношению к клеткам и генам. Пока механизмы, лежащие в основе этой специфичности, нам не понятны.

Врачам известна весьма острая форма карликовости, при которой носителю отклонения свойственны и другие не совсем обычные характеристики и особенности — слишком сухая кожа, слишком редкие волосы, склонность к припадкам, затруднения при обучении. Дети с таким заболеванием почти всегда умирают, не дожив до 4 лет^10. Оно является весьма редким практически везде, кроме общины амишей штата Огайо: 8% членов общины — носители этой болезни. Дело в том, что мутация, вызывающая данное заболевание, имелась у того небольшого количества семейств, которое и основало когда-то общину. Эту болезнь не обнаруживают в других группах амишей (скажем, в Пенсильвании), основанных другими семьями. Когда удалось выявить мутацию, вызывающую это заболевание, исследователи сначала решили, что она изменяет нуклеотидную последовательность гена, кодирующего какой-то белок, который образуется в результате сплайсинга. Однако теперь известно, что на самом деле это изменение нарушает трехмерную структуру той мусорной ДНК, которая образует часть сплайсосомы^11. В отличие от ситуации с пигментным ретинитом, такой дефект в функционировании сплайсосомы вызывает весьма широкий диапазон симптомов. Вероятно, при этом происходит ошибочный сплайсинг множества различных генов.

Заболевания у человека происходят не только из-за неполадок в аппаратуре сплайсинга. Недуги могут возникать и из-за того, что сами гены, кодирующие белки, обладают мутациями в местах (сайтах), которые играют важную роль при контролировании сплайсинга РНК данного конкретного гена. Некоторые ученые настаивают, что до 10% наследственных болезней человека обусловлены мутациями в этих сплайсинговых сайтах (такие сайты показаны на рис. 17.5 как последовательности из двух нуклеотидных оснований)12.

Вот пример действия такого механизма. В одной семье у двух младенцев возникла неизлечимая диарея уже в первые дни после рождения. Медперсоналу как-то удалось стабилизировать ситуацию, но диарея продолжалась много месяцев, и один из детей умер в семнадцати месячном возрасте. Когда геномы детей секвенировали, обнаружилась мутация в сплайсинговом сайте гена, меняющая одну из ГУ-последовательностей, показанных на рис. 17.5. В результате клеточная сплайсинговая аппаратура без необходимости «пропускала» один из участков, кодирующих аминокислоты. По сути, этот участок просто исключался из процесса синтеза белка, и получающийся белок больше не мог выполнять свою работу^13.

Саркома Капоши — форма рака, которая впервые привлекла внимание общественности, когда обнаружилось, что она широко распространена среди больных СПИДом. СПИД вызывется вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) — (HIV, the human immunodeficiency virus). Инфицирование этим вирусом приводит к подавлению иммунной системы. Саркому Капоши вызывает другой вирус. Он получил название HHV-8. Обычно наша иммунная система держит этот вирус под контролем, но если ее функционирование серьезно нарушено, HHV-8 может утвердиться в организме и спровоцировать саркому Капоши.

Вирус HHV-8 широко распространен среди жителей Средиземноморья, однако у них редки случаи саркомы Капоши, а у маленьких детей ее почти никогда не обнаруживали. Поэтому медики очень удивились, когда одна турецкая семья привела врачам двухлетнюю дочку, на губе у которой имелись образования, характерные для данной разновидности рака. Они быстро и агрессивно росли, и девочка умерла всего спустя 4 месяца после того, как ей впервые поставили диагноз.

Все тесты девочки на ВИЧ давали отрицательный результат. Ее родители были близкими родственниками — двоюродным братом и сестрой. Ученые принялись искать генетические причины, которые могли бы объяснить нарушение иммунного отклика на HHV-8 у этой девочки.

Проведя секвенирование ДНК образцов биоматериала, полученных у умершей, специалисты выявили мутацию в сайте сплайсинга, находящемся в определенном гене. Мутация меняла АГ на АА, а значит, сплайсосома больше не могла определить, в каком месте она должна разрезать молекулу РНК. В результате мусорная область, которую следовало удалить, оставалась в составе молекулы информационной РНК. Это нарушало нуклеотидную последовательность, создавая стоп-сигнал на значительно более «раннем» отрезке информационной РНК, чем необходимо, что, в свою очередь, не позволяло рибосоме сделать белок требуемой длины (он получался гораздо короче). А поскольку данный белок как раз и нужен для поддержания эффективной иммунной реакции на вирусы наподобие HHV-8, ребенок с такой мутацией оказался весьма подверженным саркоме Капоши^14.

Хотя мутации сплайсинг-сайтов встречаются сравнительно часто, причиной генетических заболеваний чаще становятся мутации тех участков генов, которые кодируют аминокислоты. Одни мутации вызывают проблемы из-за того, что вводят стоп-сигналы, мешающие рибосомам синтезировать белки нужного размера на основе матриц информационной РНК. Другие мутации способны изменять генетический код, побуждая ген кодировать не ту аминокислоту, какую следует. К примеру, триплет ЦАЦ кодирует аминокислоту гистидин, а триплет ЦАГ — глутамин, другую аминокислоту. Но ученые предполагают, что до 25% мутаций, вызывающих замену аминокислоты таким путем, влияют также и на сплайсинг ближайших участков информационной РНК. В некоторых случаях причиной болезни может служить не единичная замена аминокислоты сама по себе, а то изменение, которое вносит исходная нуклеотидная замена в характер сплайсинга информационной РНК.

Однако в большинстве случаев очень трудно продемонстрировать, что это действительно так. Даже если ученые сумеют показать, что изменение в РНК приводит и к нарушению картины сплайсинга, и к замене аминокислоты, как определить, какой из этих эффектов вызывает симптомы болезни? Что служит их причиной — сам белок, где в определенном месте одна аминокислота заменена на другую, или еще и то, что белок возник в результате непривычного сплайсинга?

Природа сама предоставила нам свидетельства того, что иногда мутация в кодирующем участке способна вызывать болезнь посредством влияния на сплайсинг, а не посредством замены аминокислоты. Существует весьма необычное заболевание, названное прогерией Хатчинсона-Гилфорда в честь двух ученых, которые впервые его выявили. Слово «прогерия» означает «раннее старение», и эта ее форма невероятно опасна. Она встречается крайне редко, затрагивая примерно одного ребенка из 4 миллионов^15.

Родившиеся с этим недугом поначалу кажутся совершенно здоровыми, но уже в течение первого года жизни их рост резко замедляется, а потом и вовсе останавливается. У детей начинают проявляться многие симптомы старости: редеют волосы, наступает облысение, тело становится жестче. Хотя у них все-таки не развиваются некоторые заболевания, свойственные пожилому возрасту (скажем, болезнь Альцгеймера), зато возникают серьезные сердечно-сосудистые заболевания. Именно от них несчастные дети умирают еще в раннем подростковом возрасте: летальный исход становится следствием инфаркта или обширного инсульта.

В 2003 году специалисты выявили генетическую мутацию, которая вызывает прогерию Хатчинсона-Гилфорда. У каждого из обследованных пациентов обнаружилась новая мутация (мутация de novo), то есть такая, которая спонтанно возникла в яйцеклетке или сперматозоиде кого-то из родителей. Невероятно: у 18 пациентов, не связанных близким родством (всего обследовали 20) мутация оказалась совершенно одинаковой^16.

Последовательность ГГЦ в определенном гене мутировала и в результате сменилась на ГГТ. Этой мутации подверглась одна из тех областей гена, которые занимаются кодированием аминокислот. Может показаться, что перед нами сравнительно обычный, «лобовой» случай мутации, заменяющей одну из аминокислот в белке. Так что первым делом, разумеется, следует посмотреть на генетический код и выяснить, что же кодируют эти две последовательности. ГГЦ, нормальная последовательность, кодирует простую аминокислоту глицин. Однако ГГТ, мутантная последовательность, кодирует (внимание!) глицин же. Да-да, ту же самую аминокислоту!

Дело в том, что генетический код наделен определенной избыточностью. Как мы уже знаем, наш геном записан при помощи всего четырех букв — А, Г, Т и Ц (в РНК вместо буквы Т — буква У). Блоки из 3 букв (триплеты) используются для кодирования той или иной аминокислоты. Из 4 букв можно составить 64 трехбуквенные комбинации. Три из этих комбинаций — стоп-сигналы, приказывающие рибосоме больше не добавлять аминокислоты в белковую цепочку, которую она выстраивает. Остается 61 комбинация для кодирования аминокислот. Но наши белки содержат в общей сложности лишь 20 различных аминокислот. Поэтому некоторые аминокислоты можно кодировать несколькими различными трехбуквенными наборами. Одна крайность: глицин кодируется триплетами ГГА, ГГЦ, ГГГ и ГГТ (ГГУ). Противоположная крайность: аминокислоту метионин кодирует лишь комбинация АТГ (АУГ).

Но если при прогерии Хатчинсона-Гилфорда не меняется аминокислотная последовательность, кодируемая мутантным геном, что же вызывает такое резкое изменение фенотипа при этом заболевании? Вновь обратимся к рис. 17.5. Последовательность из двух нуклеотидных оснований, находящаяся в начале каждой промежуточной области гена, такова: ГТ. Но у страдающих этой болезнью нормальный триплет ГГЦ меняется на ГГТ, и участок, кодирующий аминокислоту, получает ненужный дополнительный сигнал сплайсинга. На фоне всех остальных сигналов сплайсинга в этой области генома такое неверное размещение ГТ действует весьма сильно. Сплайсосома разрезает информационную РНК в области, кодирующей аминокислоты, а не в мусорной области. Участки, кодирующие аминокислоты, соединяются неправильно, что приводит к потере примерно 50% аминокислот, которые должны располагаться на конце синтезируемого белка. В результате сам белок не обрабатывается должным образом и начинает вносить сумятицу в работу клеток. Мы пока точно не знаем, каким образом это приводит к необычному старению, которое мы наблюдаем у детей, страдающих данным заболеванием. Наиболее убедительное предположение на данный момент: в ходе таких процессов нарушается механизм поддержания нормального функционирования клеточного ядра. Это может приводить к изменениям в экспрессии генов и к разрушению ядра. Вероятно, некоторые гены и некоторые типы клеток чувствительнее к таким процессам, чем другие.

Есть еще одно детское заболевание — спинальная мышечная атрофия. При этой болезни нервные клетки, управляющие мышцами, постепенно отмирают, что приводит к деградации мышц и утрате подвижности. Существует целый ряд различных форм этого заболевания. При самой острой его разновидности средняя ожидаемая продолжительность жизни детей с этим недугом очень мала — меньше 18 месяцев^17. Для генетического заболевания оно распространено сравнительно широко: в Великобритании примерно один человек из 40 является его носителем, а значит, около полутора миллионов британцев несут в себе одну дефектную копию соответствующего гена. По счастью, для развития симптомов болезни требуются две мутантные копии гена, а не одна^18.

Спинальная мышечная атрофия возникает в результате удаления (делеции) гена SMN1 или прекращения его нормального функционирования. Если мы посмотрим на человеческий геном, нас может удивить, что такое изменение способно вызвать столь мощный эффект, поскольку в геноме имеется и другой ген, кодирующий тот же белок. Этот ген именуется SMN2. Отсюда очевидный вопрос: раз уж они кодируют один и тот же белок, почему ген SMN2 не может служить компенсацией поврежденного или утраченного гена SMN1 ?

Тут почти такая же история, как с прогерией Хатчинсона-Гилфорда. Видите ли, ген SMN2 слегка отличается от гена SMN1. Речь идет об изменении в ДНК-последовательности одного из участков, кодирующих аминокислоты. Аминокислотная последовательность из-за этого не меняется, поскольку речь идет об одном из триплетов, которые кодируют аминокислоты по принципу избыточности (то есть о тех случаях, когда одну аминокислоту может кодировать не один триплет). Зато меняется один из сайтов, помогающих рибосомам определять, в каком месте проводить сплайсинг молекулы информационной РНК^19. Нет, сам сплайсинг-сайт не меняется. Меняется один из сайтов, влияющих на то, где происходит сплайсинг. В результате возникает «пропуск» на участке, кодирующем аминокислоту, и синтезируется белок, не обладающий нужными функциями. Поэтому ген SMN2 не может стать компенсацией гена SMN1, чья работа нарушена. Белок, вырабатываемый при нормальной деятельности гена SMN1, требуется для нормальной работы сплайсосом. В сущности, мутация в одном гене приводит к общим проблемам в сплайсинге информационных РНК, которые удалось бы преодолеть, если бы потенциальный ген-компенсатор не имел собственных проблем со сплайсингом.

Манипулирование сплайсингом в лечебных целях

Как мы видели в главе 7, при мышечной дистрофии Дюшенна, заболевании, быстро истощающем мышцы и переносимом в X-хромосоме, мутирует ген, кодирующий белок дистрофин. Этот ген имеет необычайно большие размеры — почти 2,5 миллиона пар нуклеотидных оснований. В нем около 80 участков, кодирующих аминокислоты. Эти участки должны положенным образом проходить сплайсинг и процессинг. Особенно важно это из-за того, что дистрофин — белок долгоживущий, а значит, любое изменение, которое повышает вероятность его неверного сплайсинга, будет влиять на клетку в течение длительного времени. Но наличие 78 интронов в этом массивном гене означает, что для него высок риск как спонтанных, так и наследуемых мутаций, способных влиять на сплайсинг. Почему? Просто из-за того, что сама немалая величина гена и большое количество в нем промежуточных областей создают для таких мутаций массу возможностей: попросту говоря, есть масса мест, где могут происходить мутации. В одном обзоре это описано довольно ярко и при этом информативно: «Массивный ген дистрофина (2,4 Мб), основную часть которого составляют его 78 интронов, так и напрашивается на неприятности со сплайсингом, которые и происходят у одного младенца из каждых 3 тысяч, рождающихся живыми»20.

Итак, в некоторых случаях причиной мышечной дистрофии Дюшенна становятся погрешности сплайсинга. Однако часто это заболевание вызвано попросту отсутствием важнейших областей гена, а значит, и молекул белка, в нем закодированного. Впрочем, в последние годы забрезжила надежда на создание эффективных методик лечения этого пока неизменно летального недуга. Как ни странно, речь идет о разработке препаратов, способствующих аномальному сплайсингу дистрофинового гена у мальчиков с этим заболеванием.

Белок дистрофин действует в клетках мышечной ткани как своего рода амортизатор. Его молекулы можно представить себе как пружины матраса. Чтобы матрас поддерживал тело, пружины нужно прикрепить к его верхней и нижней части. Если вследствие производственного брака в пружине нет последних 10 сантиметров, ее не удастся прикрепить к верхней половине матраса. Чем чаще вы будете пользоваться таким матрасом, там хуже он будет поддерживать ваше тело и тем больше будет искажаться его внутренняя структура.

Мышечную дистрофию Дюшенна довольно часто вызывает потеря внутренних областей дистрофинового гена. Когда ген копируется в РНК, оставшиеся области в ходе сплайсинга остаются скрепленными вместе. Поэтому такой мутантный ген, в отличие от нормального, не обеспечивает появление некоторых аминокислот во внутренней части белка. Однако главную проблему вызывает не это (см. рис. 17.6).

Рис. 17.6. Схематическое изображение ключевой области, где мутация в дистрофиновом гене может приводить к появлению существенно укороченной белковой молекулы из-за сдвига в системе аминокислотного считывания. Этот сдвиг (в данном случае) происходит, когда ДНК утрачивает кодирующие аминокислоты участки, обозначенные номерами 48-50. Чтобы поддерживать нужный характер считывания, каждое число, написанное под каждой границей участков, должно делиться на 3. Если добиться того, что в мутантном гене будет пропускаться при считывании и участок 51, нормальную последовательность считывания удастся восстановить. Для простоты все участки, кодирующие аминокислоты, показаны как прямоугольники одного размера, хотя на самом деле они отличаются по размерам.

Как мы уже знаем, генетический код, задающий аминокислоты, считывается блоками по 3 нуклеотидных основания. Когда, как это происходит в нормальном гене, нужные участки, кодирующие аминокислоты (эти участки, если помните, называются экзонами), соединяются вместе, они порождают длинную молекулу информационной РНК, кодирующую множество аминокислот. Но если соединятся вместе не те экзоны, триплеты оснований перестанут читаться правильно. Вот вам простой пример:

БЕЗ ВАС НАШ САД ТРИ ДНЯ БЫЛ ДЛЯ НИХ КАК ЛЕС

Читая по три буквы, мы легко поймем смысл этой фразы. Но если одна буква выпадет, мы при таком же чтении по три буквы быстро начнем утрачивать и смысл:

БЕЗ ВАН АШС АДТ РИД НЯБ ЫЛД ЛЯН ИХК АКЛ ЕС

Это так называемый сдвиг рамки считывания. В информационной РНК такое явление первым делом приводит к тому, что в растущую белковую цепочку встраиваются неподходящие аминокислоты. Но вскоре происходит еще более резкое изменение. Встречается сочетание 3 букв, которое действует как стоп-сигнал. Рибосома тут же прекращает добавление аминокислот, и получается мутантный белок, длина которого меньше, чем у нормального.

Это происходит у пациентов с делециями определенных областей дистрофинового гена. На рис. 17.6. рамка считывания триплетов обозначена номерами под прямоугольничками. Пока номера на границе соседних прямоугольников делятся на 3, рибосома может считывать информационную РНК. Но когда происходит наиболее распространенная при этом заболевании деления, это приводит к сдвигу рамки считывания, быстро порождая чтение стоп-сигнала и появление сильно укороченной белковой цепочки.

Чтобы обойти эту проблему, можно попытаться, к примеру, заставить клетку «пропустить» один из участков, кодирующих аминокислоты и расположенных после места делении: это восстановило бы нормальный характер считывания. В результате появился бы белок с некоторой нехваткой аминокислот во внутренних частях, однако все равно способный неплохо функционировать. Это могло бы замедлить развитие симптомов. Используя аналогию с кроватными пружинами, мы схематически изобразили такой процесс на рис. 17.7. Молекула дистрофина сохранит способность соединить между собой нужные белки, находящиеся на противоположных ее концах. Конечно, она будет не таким хорошим амортизатором, как белок нормальной длины. Однако она будет работать куда лучше, чем белок, вообще не способный прикрепиться к нужным клеточным структурам.

Рис. 17.7. Здесь схематически показан мутантный белок дистрофин, не способный прикрепляться к двум поверхностям клеточной мембраны. Версия мутантного белка, в которой пропущены некоторые внутренние аминокислотные последовательности, может прикрепляться к двум поверхностям мембраны. Она короче, поэтому служит не таким хорошим амортизатором, как нормальный белок, однако работает гораздо эффективнее, чем исходная мутантная версия.

Свидетельства в пользу данной гипотезы выглядели убедительно, и биотехнологические компании запустили ряд проектов, дабы попытаться найти способ ее практического применения. Так, компания Prosensa разработала препарат, помогающий мышечным клеткам «пропускать» 51-й участок, кодирующий аминокислоты. Впоследствии она уступила права на этот препарат фармацевтическому гиганту GlaxoSmithKline. В апреле 2013 года GlaxoSmithKline опубликовал результаты испытания препарата на небольшой выборке, состоявшей из 53 мальчиков с подходящей формой дюшенновской мышечной дистрофии. Этих мальчиков случайным образом разделили на две группы. Одна группа получала экспериментальный препарат, другая проходила те же самые процедуры, но без него. Подобная проверка так называемым методом плацебо — очень полезный способ выявления эффектов лекарств, проходящих клинические испытания. Мальчиков обследовали через 24 недели и через 48 недель после начала эксперимента — определяли, сколько они смогут пройти за б минут.

Через 24 недели после начала опытов самочувствие мальчиков, получавших плацебо («пустышку»), ухудшилось, чего и следовало ожидать при такой болезни. Они не могли пройти за 6 минут даже столько, сколько проходили в начале эксперимента. Но мальчики, получавшие лекарство, сумели пройти на 30 метров больше, чем в первый день испытаний. По прошествии 48 недель после начала эксперимента провели еще одну проверку. В контрольной группе (той, что получала плацебо) дела шли еще хуже, чем раньше. За 6 минут ее участники проходили почти на 25 метров меньше, чем в первый день опытов. А вот мальчики, получавшие лекарство, смогли улучшить свой первоначальный результат более чем на 11 метров^21.

Впрочем, эти данные показывают, что со временем даже у мальчиков, получавших лекарство, состояние ухудшается (обратите внимание на разницу в результатах ходьбы по истечении 24 и 48 недель с начала эксперимента). Однако это ухудшение шло значительно медленнее, чем у тех, в чьем организме заболевание развивалось своим чередом.

Итоги эксперимента вызвали необычайное воодушевление. Даже если методика не исцелит пациентов полностью, она существенно замедлит развитие необратимых симптомов. Ну да, для всех форм дюшенновской мышечной дистрофии такой подход в любом случае не годился бы, но 10-15% пациентов вполне могли бы надеяться на облегчение.

Однако прошло всего 6 месяцев, и эти надежды развеялись в пух и прах. GlaxoSmithKline провел более масштабные испытания и на сей раз не обнаружил никакой существенной разницы между контрольной группой и группой, получавшей препарат^22. Результаты масштабных испытаний надежнее тех, что получают при анализе более узкой выборки, поскольку здесь меньше вероятность, что на итоги эксперимента повлияют всякого рода необычные реакции, которые выглядят как отклик на лекарство, однако на самом деле им не являются. GlaxoSmithKline передал препарат обратно в компанию Prosensa и гордо удалился. Сейчас Prosensa продолжает клинические исследования, хотя цена ее акций резко упала после того, как из проекта вышел GlaxoSmithKline. Это падение обусловлено тем, что специалисты и биржевые аналитики полагают, что проект, возможно, обречен.

Еще одна компания, Sarepta, тоже пытается использовать особенности сплайсинга для того, чтобы «перескочить» трудный участок в дистрофиновом гене у некоторых групп больных. При разработке методик лечения ее сотрудники применяют подход, схожий с вышеописанным. Хотя компания высказывает большой оптимизм касательно своих препаратов, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США сомневается в степени представительности проводимых ею испытаний. К примеру, в одном из таких тестов, где удалось показать резкое различие между контрольной группой и группой, получавшей лекарство, участвовало всего-навсего 12 пациентов!

После всего вышеизложенного можно решить, что сплайсинг — это вообще овчинка, не стоящая выделки. Ведь похоже, что здесь мы имеем дело с очередным проявлением печально известного закона Сода: «Если неприятность может произойти, она непременно случится». Но ведь на самом деле то же самое относится и к почти любому биологическому процессу. Миллиарды нуклеотидных оснований, тысячи генов, триллионы клеток, миллиарды людей... Мы с вами вовлечены в хитрую лотерею. Не может быть, чтобы в ней каждый раз все шло как нам хочется. Однако следует вспомнить, что этот процесс объединения расщепленных генов сохраняется практически неизменным на протяжении сотен миллионов лет эволюционной истории, используя систему, которая все это время остается почти одной и той же. Сам этот факт ясно дает понять, что преимущества усложненного устройства, наличия дополнительной информации и просто общей гибкости и адаптивности в полной мере окупятся, когда настанет черный денек.

Глава 18. Маленькие, но могучие

Мы с вами — довольно крупные животные. Вероятно, поэтому нас обычно сильнее всего впечатляют животные, которые крупнее и сильнее нас. Что ж, оно и понятно. В конце концов, большая кошка вроде ягуара — и правда, создание весьма впечатляющее. Да к тому же ягуар — охотник, плотоядный зверь. А вот муравей по сравнению с ягуаром выглядит довольно жалко, даже если он принадлежит к кочевым муравьям — разновидности, широко распространенной в Центральной и Южной Америке. Конечно, есть в этих насекомых некое мрачное обаяние, но все равно человек не станет бояться того, кого запросто можно раздавить легким движением туристского сапога.

А вот целая колония муравьев-кочевников — совсем иное дело. Пожалуй, такая колония пожирает не меньше плоти, чем один ягуар. Увидев, как такие существа плотным потоком движутся на вас, сразу захочется удрать от них подальше.

Так же и с нашим геномом. В нем тысячи разновидностей молекул очень маленькой мусорной нуклеиновой кислоты особого типа^1. Каждая разновидность играет освою роль в тонкой настройке генетической экспрессии. По отдельности их воздействия слабы. Но если мы посмотрим на общий результат, то окажется, что мы имеем дело с весьма впечатляющей армией.

Добро пожаловать в мир малых РНК, могучего войска кочевых муравьев нашего генома. Эти молекулы РНК имеют небольшие размеры: обычно — лишь от 20 до 23 нуклеотидных оснований в длину. Их можно представлять себе как «подталкивающие» молекулы, способные придавать дополнительную тонкую настройку процессам контроля генетической экспрессии.

На рис. 18.1 схематически показано, как вырабатываются эти малые РНК и как они действуют. Их порождают двунитевые молекулы РНК. Затем малые РНК соединяются с нетранслируемыми областями на концах информационных РНК, создавая новую двухцепочечную РНК. Появление этой двунитевой структуры, зависящее от взаимодействия одной мусорной последовательности с другой, оказывает на информационную РНК либо одно, либо другое воздействие. Новая структура может либо таргетировать информационную РНК, чтобы ее разрушить, либо затруднить для рибосом трансляцию нуклеотидной последовательности этой информационной РНК в белки. В обоих случаях результат, по сути, один и тот же: резко падает количество белка, синтезируемого на основе данной информационной РНК[69],2.

Рис. 18.1. Схема упрощенно показывает, как клетка создает два разных типа малых РНК из более длинных молекул РНК. Эти два типа малых РНК подавляют генетическую экспрессию по-разному, как показано в нижней части схемы.

Малые РНК, служащие триггерами разрушения молекул и информационной РНК, должны идеально соответствовать своим мишеням. Те же, которые лишь ингибируют трансляцию информационных РНК, гораздо более легкомысленны. Они соединяются с информационной РНК, даже если на ней соответствуют нужной мишени всего 6-8 нуклеотидов, расположенных подряд (это так называемая «посадочная последовательность», seed sequence[70]). В результате одна малая РНК может соединяться более чем с одним типом информационных РНК, замедляя трансляцию. Еще одно потенциальное следствие такой неразборчивости в связях: относительное содержание различных информационных РНК в клетке будет влиять на степень контроля каждой из них со стороны той или иной малой РНК. А значит, каждая малая РНК будет оказывать свое особое действие — в зависимости от того, какие из ее мишеней экспрессированы в клетке и каково соотношение количеств этих молекул-мишеней.

Малые РНК: польза и вред

Существует отдельный кластер малых РНК, играющий важную роль в регуляции определенного типа клеток иммунной системы. Если у мышей этот кластер претерпевает сверхэкспрессию, то зверьки испытывают летальную сверхактивацию иммунной системы3,4. С другой стороны, те мыши, у которых вообще отсутствует данный кластер, умирают либо незадолго до появления на свет, либо вскоре после рождения. У человека потеря одной копии этого кластера приводит к некоторым формам редкого заболевания — синдрома Файнгольда^5. Симптомы могут быть весьма различными. Нередко в их число входят деформации скелета, проблемы с почками, кишечная непроходимость, а также затруднения при обучении (средней степени)6.

Следствия нарушения экспрессии данного кластера, состоящего всего из 6 малых РНК, кажутся странно разнообразными. Впрочем, удивляться такому разнообразию не стоит. По подсчетам специалистов, один только этот кластер может осуществлять таргетирование более тысячи генов, кодирующих белки^7.

Мусорные последовательности, кодирующие малые РНК, зачастую расположены внутри других мусорных областей — например, в генах, отвечающих за выработку длинных некодирующих РНК^8. Существует заболевание, именуемое гипоплазией развития хрящевой ткани и волосяного покрова человека (или просто гипоплазией хрящей и волос). Впервые его выявили в одной общине амишей, где каждый десятый оказался носителем мутации, вызывающей данную болезнь. Это невероятно высокая доля носителей. Она почти наверняка свидетельствует о том, что общину некогда основало небольшое число семей. У детей, страдающих этой болезнью, наблюдаются отклонения в формировании скелета, что приводит к форме карликовости, которая характеризуется укороченными конечностями. У них тонкие и редкие волосы. Кроме того, обычно у них встречается целый набор других дефектов (зачастую различный у разных пациентов).

Мутации, вызывающие это заболевание, происходят в гене, который отвечает за создание длинной некодирующей РНК. Но этот РНК-ген, сам по себе длинный, включает в себя и два гена малых РНК, мусор внутри мусора, и многие мутации влияют как раз на эти два меньших гена. В результате мутационных изменений разрушается структура малых РНК, так что они неправильно обрабатываются режущим ферментом (на рис. 18.1 он изображен в виде ножниц). А следовательно, они не экспрессируются на нормальном уровне. Эти две малые РНК осуществляют регуляцию в общей сложности более чем 900 генов, кодирующих белки. В числе таких регулируемых генов — те, о которых известно, что они влияют на развитие скелета и рост волос, однако они задействованы и в ряде других систем организма. Вероятно, именно поэтому те мутации, которые воздействуют на уровень экспрессии и функционирование этих малых РНК, также могут приводить к нарушениям в самых разных системах органов больных детей^9.

С учетом того, какую важную роль играют малые РНК в тонкой настройке генетической экспрессии, неудивительно, что эти мусорные молекулы, как выясняется, оказывают весьма существенное влияние на процессы развития организма. На этой стадии жизни даже, казалось бы, незначительные флуктуации генетической экспрессии могут отзываться серьезными последствиями. Помните пружину-«слинки», которая от малейшего толчка принимается шагать вниз по лестнице?

Малые РНК и стволовые клетки

Отличная демонстрация важности малых РНК — процесс перепрограммирования клеток человеческих тканей, в ходе которого эти клетки становятся плюрипотентными стволовыми клетками, обладающими возможностью создавать практически любую ткань. С этой технологией мы познакомились в главе 12, где она схематически показана на рис. 12.1. Хотя первоначальная работа, с такой необычайной быстротой награжденная Нобелевской премией, действительно принадлежит к числу выдающихся, у предложенного подхода имеется ряд ограничений. Да, главные белки-регуляторы могут загнать «слинки» процессов развития обратно, вверх по лестничному пролету, но они делают это довольно-таки неэффективно. Удавалось «обратить» лишь незначительную долю клеток, и сам процесс занимал долгие недели. Через 5 лет после этих революционных открытий другие ученые усовершенствовали данную методику. Они обрабатывали зрелые клетки теми же главными регуляторами, которые использовались в первоначальных экспериментах, но добавили и кое-что новое. Они добивались сверхэкспрессии кластера малых РНК, который, как удалось показать ранее, имеет высокий уровень экспрессии в нормальных эмбриональных стволовых клетках. Ученые обнаружили, что при такой искусственно вызванной совместной сверхэкспрессии этих малых РНК и исходных главных регуляторов зрелые клетки снова становятся плюрипотентными стволовыми клетками, как мы и могли бы предполагать. Но доля клеток, трансформировавшихся в стволовые, оказалась более чем в 100 раз выше, чем при использовании одних только главных регуляторов. Кроме того, весь процесс шел теперь гораздо стремительнее. И наоборот, если исследователи задействовали главные регуляторы, но подавляли экспрессию эндогенного кластера малых РНК в зрелых клетках, эффективность перепрограммирования таких клеток резко падала. Так удалось показать, что данный кластер малых РНК действительно играет ключевую роль в способствовании регулированию сигнальных сетей, которые определяют, какой станет клетка10,11.

Зрелые ткани тоже содержат стволовые клетки, которые, в свою очередь, способны создавать клетки именно тех тканей, где они находятся, а не трансформироваться в произвольные типы клеток. Они играют важную роль при росте организма, когда мы постепенно превращаемся из ребенка во взрослого, а кроме того, нужны для ремонта изношенных частей. В некоторых тканях сохраняется весьма активная популяция стволовых клеток даже в сравнительно поздние годы жизни. Классический пример — костный мозг: он постоянно создает клетки, необходимые нам для борьбы с инфекциями и для патрулирования организма в поисках клеток, которые могут стать раковыми. Одна из причин, по которым очень пожилые люди особенно подвержены инфекциям и онкологическим заболеваниям, как раз и состоит в том, что запас стволовых клеток в их костном мозге в конце концов истощается, и в иммунных баррикадах их организма возникают бреши.

Есть данные, показывающие, что в тканях организма человека стволовые клетки и зрелые клетки обладают разной картиной экспрессии малых РНК. Но информацию об экспрессии всегда трудно интерпретировать из-за досадной проблемы с причинно-следственной связью. Различие в характере экспрессии малых РНК порождает различия в активности и функционировании клетки? Или же эти различия в экспрессии — просто побочный результат клеточных изменений? Оказывается, на протяжении эволюции практически в неизменности сохраняются предсказанные нами процессы образования пар между нуклеотидными последовательностями некоторых малых РНК и нуклеотидными последовательностями нетранслируемых областей по меньшей мере половины всех молекул информационных РНК. Этот факт заставляет предположить, что какая-то причинно-следственная связь здесь все-таки есть^12. Чтобы взяться за решение этой проблемы, ученые частенько обращались к нашим близким родичам — мышкам.

Специалисты разработали способы выключения генов лишь в зрелых тканях, но и эти методики послужили весьма мощным исследовательским инструментом. Мышиный организм при этом развивается обычным порядком, поэтому нам не приходится беспокоиться о том, что причиной симптомов являются биологические пути и сети, в которых в ходе развития что-то пошло не так. Данный подход использовался и для выяснения того, что же происходит, если фермент, требуемый для производства малых РНК (на рис. 18.1, напомним, его изображают ножницы), в зрелых клетках инактивирован. Такая инактивация помешает производству всех малых РНК, а значит, покажет, где они играют важную роль. Однако таким путем мы не сумеем узнать, какие именно малые РНК задействованы.

Выключив режущий фермент во всех тканях взрослых мышей, ученые обнаружили дефекты в костном мозге, а кроме того, в селезенке и тимусе. Все эти три вида тканей производят клетки, необходимые для борьбы с инфекцией. Ожидалось, что в этих тканях обнаружится значительная популяция стволовых клеток. Полученные результаты подтверждали, что системы малых РНК играют заметную роль в управлении стволовыми клетками. Все подопытные мыши скоро передохли, но их гибель произошла из-за массированного разрушения кишечного тракта. Впрочем, это также подтверждало роль малых РНК в работе стволовых клеток. Наш кишечник постоянно теряет клетки, которые отшелушиваются от его внутренней поверхности в ходе непрестанной деятельности пищеварительной системы. Эти клетки должны ежедневно заменяться новыми. Поэтому вполне можно ожидать, что там будет иметься весьма активная популяция стволовых клеток^13. Однако ученые так и не смогли толком понять, каким образом утрата режущего фермента приводит к столь значительному повреждению кишечника. Возможно, это связано с какими-то аномалиями в обработке мышиным организмом жиров пищи.

Да, эффекты оказались весьма серьезными, но это не значит, что малые РНК играют важную роль лишь в перечисленных нами тканях. Сравнительно быстрая гибель подопытных мышей могла замаскировать более тонкие симптомы, возникавшие в других тканях. Чтобы изучить этот вопрос, можно воспользоваться более избирательной методикой подавления экспрессии в зрелых тканях. С ее помощью удается инактивировать ген, отвечающий за выработку режущего фермента (назовем его для простоты режущим геном), лишь в выбранных экспериментаторами тканях взрослой мыши.

Многие результаты, полученные таким способом, вполне отвечали гипотезе о мощном влиянии малых РНК на популяции стволовых клеток. Так, когда режущий ген инактивировали в клетках волосяного фолликула взрослой мыши, мех у нее после выдергивания не отрастал как полагается^14.

Есть искушение предположить на основании этих данных, что сети малых РНК требуются для того, чтобы стволовые клетки нормально выполняли свою работу по возмещению утраченных специализированных клеток. Но это чересчур упрощенный вывод. Все мы обычно стараемся растянуть полученное жалованье до ближайшего дня зарплаты. Вот и наш организм должен устроить так, чтобы стволовые клетки не расходовались чересчур поспешно. Они драгоценны. И если они исчезают, то исчезают навсегда. Вот почему некоторые сети малых РНК как раз и препятствуют стволовым клеткам необратимо превращаться в зрелые клетки тканей. Здесь надо поддерживать равновесие (см. рис. 18.2).

Рис. 18.2. При делении стволовая клетка может породить либо другую стволовую (которая также продолжит делиться, образуя новые стволовые клетки), либо дифференцированную клетку (которая уже не даст новых стволовых клеток).

Скелетные мышцы содержат стволовые клетки[71], которые надлежит почти все время держать в состоянии покоя, чтобы не истратить их слишком рано. Подобное истощение запаса стволовых клеток служит одной из причин некоторых форм потери мышечной массы: мы уже встречались с ними, обсуждая такие заболевания, как мышечная дистрофия Дюшенна. В стволовых клетках мышц имеются белки, которые при нормальных условиях мешают им превратиться в зрелые мышечные клетки. Однако если у здорового человека происходит серьезная травма или при дистрофическом заболевании теряются мышечные клетки, экспрессия таких белков понижается. Как организм этого достигает? Благодаря включению определенных малых РНК (или, по крайней мере, отчасти благодаря этому процессу). Малые РНК связываются с информационными РНК, несущими в себе код для указанных белков, и в результате вырабатывается меньше белка. А значит, со стволовых клеток снимаются тормоза, и эти клетки превращаются в зрелые мышцы15,16.

В сердце наблюдается похожий эффект. Сердечная мышца взрослого человека все-таки содержит некоторые стволовые клетки, хотя их число не очень велико и их трудно превратить в зрелую сердечную ткань. Это одна из причин, по которым инфаркт наносит такой большой ущерб организму. При инфаркте ткань сердечной мышцы отмирает, и нашему организму очень трудно создать ткань в замену отмершей, поэтому на сердце появляются рубцы, и этот важнейший орган больше не работает как полагается. Вот почему люди, перенесшие инфаркт чаще всего так никогда и не обретают здоровье в полной мере.

Может показаться, что это отличная идея — научиться активировать стволовые клетки сердечной мышцы, заставить их производить новую мышечную ткань. Но опыты на мышах вынуждают предположить, что ситуация здесь не столь проста и однозначна. Казалось бы, это малые РНК, присутствующие в сердце, мешают стволовым клеткам превращаться в ткань сердечной мышцы, и если режущий фермент, производящий малые РНК, во взрослом сердце отключить, оно начнет расти. К сожалению, это не так уж безопасно, поскольку такой процесс иногда приводит к заболеванию, именуемому гипертрофией сердца. Нет, при этом не развивается замечательно сильная сердечная мышца, отличающая знаменитых спортсменов. Напротив, при этом аномально утолщается сердечная стенка, как у людей с повышенным кровяным давлением. Похоже, это происходит из-за того, что отключение режущего фермента заставляет стволовые клетки перестать вести себя как зрелые клетки и запускает картину генетической экспрессии, больше напоминающую ту, что наблюдается в организме при его развитии^17.

Может показаться странным, что реактивирование стволовых клеток сердца не помогает организму. Но тут, возможно, имеет место некий компромисс. С эволюционной точки зрения главная забота животных — прожить достаточно долго, чтобы успеть размножиться и передать свой генетический материал потомству. Естественный контроль развития сердца как раз и направлен на гарантирование того, что наше сердце будет в течение нужного времени находиться в хорошем состоянии, дабы мы могли дотянуть до этого ключевого момента. А если в старости мы не сможем естественным путем чинить собственное сердце, так эволюции на это, в общем, плевать. Это уж проблема человека, коль скоро мы почему-то предпочитаем жить дольше того срока, который эволюция считает для нас строго необходимым.

Малые РНК и мозг

Хотя мы обычно считаем, что у взрослого человека мозг уже полностью сформировался, недавно полученные данные показывают: даже в этом органе имеются кое-какие стволовые клетки. У животных, полагающихся на хорошо развитое обоняние, эти стволовые клетки могут активироваться, чтобы формировать нейроны, способные откликаться на новые запахи. Это позволяет животному более избирательно реагировать на улавливаемые ароматы. Один из белков стволовых клеток вынуждает их дифференцироваться, превращаясь в определенный тип нейрона восприятия и отклика. Экспрессию этого белка обычно держит под контролем одна из малых РНК. Когда исследователи подавили экспрессию этой малой РНК у мышей, белок стал экспрессироваться активнее, и стволовые клетки мозга начали специализироваться, превращаясь в обонятельные нейроны^18. По-видимому, экспрессия этой малой РНК в естественных условиях подавляется, едва мышь почует что-нибудь новое. Впрочем, сигнальные пути, которые вызывают такое подавление, пока не выявлены.

Малые РНК участвуют в повседневной деятельности клеток, производя тонкую подстройку реакций организма под условия постоянно меняющейся среды. Похоже, не так-то просто будет разобраться в механизме этой подстройки, ибо каждая отдельная малая РНК оказывает на систему сравнительно небольшое воздействие. Самое важное свойство таких молекул — именно общее воздействие многочисленных малых РНК, работающих сообща в рамках чрезвычайно обширных, однако не очень заметных сетей. Уже сейчас удается получать достаточное количество интригующих данных, чтобы мы могли с уверенностью сказать: да, этот класс миниатюрных мусорных элементов оказывает реальное воздействие на организм.

Похоже, мозг особенно чувствителен к пертурбациям в ландшафте малых РНК. Влияние таких изменений может оказаться весьма различным в зависимости от затронутой области мозга и от конкретного времени. Вероятно, это отражает важную роль общения между всеми разнообразными малыми РНК, всеми информационными РНК и белками, чья экспрессия находится под жестким контролем мозга.

Поразительный пример такой роли обнаружили, инактивируя режущий фермент в переднем мозге взрослой мыши^19. Экспрессия малых РНК при этом подавляется. Поначалу кажется, что для зверьков это даже хорошо. Примерно в течение 3 месяцев грызуны даже смышленее, чем обычно. Они лучше выполняют тестовые задания, основанные и на опасении наказания, «кнута», и на ожидании вознаграждения, «пряника». Навыки, связанные с памятью, у них значительно усовершенствуются. Но если кому-нибудь вдруг захочется попробовать проделать это в домашних условиях (в наши дни многие очень серьезно готовятся к экзаменам), имейте в виду: тут не все так безоблачно. Интеллектуальное созвездие поумневших мышей сияло ярко, но недолго. На четвертый месяц после того, как мышкам инактивировали режущий фермент, мозг маленьких пушистых умников начал деградировать.

Подобного рода отсроченную реакцию обнаружили и в другом случае, когда также удалось показать, что малые РНК играют важную роль в мозгу. (Возможно, это означает, что малые РНК мозговых клеток довольно стабильны и отмирают не сразу.) Инактивировали режущий фермент в клетках мозга двухнедельной мыши — в зоне мозга, участвующей в процессах контроля движения. Как и ожидалось, это привело к сильному падению экспрессии малых РНК. Поначалу, казалось, мыши пребывали в отличном состоянии. Но через 11 недель у них появились двигательные расстройства. Анализ мозга подопытных грызунов показал, что у них отмерли нейроны, утратившие способность вырабатывать малые РНК^20.

Малые РНК могут играть роль в самых неожиданных ситуациях. Одна из мишеней алкоголя в нашем мозгу — белок, который регулирует характер прохождения сигналов через клеточные мембраны[72]. Информационная РНК для этого белка может встречаться в виде множества разных вариаций, в зависимости от того, каким образом при сплайсинге объединяются вместе участки, кодирующие аминокислоты. Алкоголь вызывает экспрессию определенной малой РНК, которая способна связываться с нетранслируемой областью на конце некоторых из этих вариантных информационных РНК. Это приводит к избирательному разрушению информационных РНК, кодирующих определенные вариации белков. Такое изменение в составе популяции белков приводит к искажению картины отклика нейронов на алкоголь. Оно существенно влияет на устойчивость организма к воздействию алкоголя, а эта устойчивость во многом определяет степень алкогольной зависимости^21. Соответствующий механизм схематически показан на рис. 18.3. Есть предположения, что малые РНК играют роль и в реакции организма на другие вещества, вызывающие привыкание: например, на кокаин^22.

Малые РНК и рак

Как полагают ученые, неверная экспрессия малых РНК служит одной из причин целого ряда заболеваний, очень серьезно влияющих на здоровье множества людей во всем мире. В числе таких заболеваний — сердечно-сосудистые^23 и онкологические^24. Что касается последних, то это неудивительно: рак свидетельствует об аномалиях в развитии клеток и в их судьбе, а малые РНК играют важнейшую роль в соответствующих процессах. Вот один из весьма показательных примеров огромного влияния, которое малые РНК оказывают на организм при онкологических заболеваниях. Речь идет о злокачественной опухоли, для которой характерна неверная экспрессия тех генов, которые действуют в период первоначального развития организма, а не в постнатальный период. Это разновидность детской опухоли мозга, обычно появляющаяся еще до двухлетнего возраста. Увы, это очень агрессивная форма рака, и прогноз здесь неблагоприятен даже при интенсивном лечении[73]. Онкологический процесс развивается вследствие неправильного перераспределения генетического материала в клетках мозга. Промотор, который обычно вызывает сильную экспрессию одного из генов, кодирующих белки, претерпевает рекомбинацию с определенным кластером малых РНК. Затем весь этот перестроенный участок проходит амплификацию: иными словами, создается множество его копий в геноме. А следовательно, малые РНК, расположенные «ниже по течению», чем перемещенный промотор, экспрессируются гораздо сильнее, чем следует. Уровень содержания активных малых РНК при этом примерно в 150-1000 раз выше нормы.

Рис. 18.3. Малые РНК, активированные алкоголем, могут соединяться с информационными РНК, не влияющими на устойчивость организма к воздействию алкоголя. Но эти малые РНК не соединяются с молекулами информационной РНК, способствующими такой устойчивости. Это приводит к относительному преобладанию доли молекул информационной РНК, кодирующих вариации белка, связанные с устойчивостью к алкоголю.

Данный кластер кодирует более 40 различных малых РНК. Собственно, это вообще самый крупный из подобных кластеров, имеющихся у приматов. Обычно он экспрессируется лишь на ранней стадии человеческого развития, в первые 8 недель жизни эмбриона. Сильная активация его в мозгу младенца приводит к катастрофическому воздействию на генетическую экспрессию. Одно из последствий — экспрессия эпигенетического белка, добавляющего модификации к ДНК. Это приводит к широкомасштабным изменениям во всей картине метилирования ДНК, а значит, и к аномальной экспрессии всевозможных генов, многие из которых должны экспрессироваться, лишь когда незрелые клетки мозга делятся в ходе ранних этапов развития организма. Так в клетках младенца и запускается раковая программа^25.

Подобное общение между малыми РНК и эпигенетической аппаратурой клетки может оказывать существенное влияние и на другие ситуации, когда в клетках развивается предрасположенность к раку. Данный механизм, вероятно, приводит к тому, что воздействие нарушения экспрессии малых РНК усиливается путем изменения эпигенетических модификаций, которые передаются дочерним клеткам от материнской. Так может складываться схема потенциально опасных изменений в характере экспрессии генов.

Пока ученые разобрались не во всех этапах взаимодействия малых РНК с эпигенетическими процессами, но кое-какие намеки на особенности происходящего все-таки удается получить. К примеру, выяснилось, что определенный класс малых РНК, усиливающий агрессивность рака груди, таргетирует в информационных РНК определенные ферменты, удаляющие ключевые эпигенетические модификации. Это изменяет картину эпигенетических модификаций в раковой клетке и еще больше нарушает генетическую экспрессию^26.

Многие формы рака отслеживать у пациента довольно трудно. Онкологические процессы могут идти в труднодоступных местах, что осложняет процедуру отбора проб. В таких случаях врачу нелегко следить за развитием ракового процесса и реакцией на лечение. Часто медики вынуждены полагаться на косвенные измерения — скажем, на томографическое сканирование опухоли. Некоторые исследователи полагают, что молекулы малых РНК могли бы помочь создать новую методику наблюдения за развитием опухоли, позволяющую также изучать ее происхождение. Когда раковые клетки погибают, при разрыве клетки ее покидают малые РНК. Эти небольшие мусорные молекулы часто образуют комплексы с клеточными белками или же завертываются во фрагменты клеточных мембран. Благодаря этому они очень стабильны в жидких средах организма, а значит, такие РНК можно выделить и проанализировать. Поскольку их количества невелики, исследователи вынуждены будут использовать весьма чувствительные методы анализа. Впрочем, тут нет ничего невозможного: чувствительность секвенирования нуклеиновых кислот постоянно повышается^27. Опубликованы данные, подтверждающие перспективность такого подхода применительно к раку груди^28, раку яичников^29 и ряду других онкологических заболеваний. Анализ малых циркулирующих РНК у больных раком легких показал, что эти РНК помогают провести различие между пациентами с одиночным легочным узелком (не требующие терапии) и пациентами, у которых образуются злокачественные узелки-опухоли (требующие лечения)30.

Мертвые лошади и умолкшие гены

Итак, малые РНК проявляют себя в самых неожиданных ситуациях. Существует ужасное заболевание, возбудитель которого — вирус восточного североамериканского лошадиного энцефалита. Болезнь передается через укусы комаров. Вирус заражает лошадь, после чего животное умирает. С людьми ситуация ненамного лучше: человеческая смертность от этого заболевания составляет 30-70%. Больные умирают из-за того, что вирус проникает в центральную нервную систему и вызывает острое воспаление мозговых оболочек^31. Геном вируса, вызывающего инфекцию, состоит не из ДНК, а из РНК.

Когда вирус при укусе комара попадает в кровеносную систему человека, за него берутся белые кровяные тельца, лейкоциты. Это первый рубеж обороны организма, призванный отслеживать возможных захватчиков. Но затем происходит нечто странное. Малая РНК, которую обычно вырабатывают лейкоциты, соединяется с концом РНК-генома вируса и мешает ему кодировать белок.

Может показаться, что это хорошо. На самом деле все обстоит иначе. Обычно наши лейкоциты умеют определять, попал ли к нам нежданный гость, вирус. В результате клетки запускают целую серию реакций: температура тела повышается, вырабатываются разнообразные антивирусные вещества. Все это позволяет отвадить крошечных агрессоров.

Но когда малая РНК белых кровяных телец соединяется с геномом вируса лошадиного энцефалита, вирус затихает. А следовательно, иммунная система не замечает, что в организм вторгся враг. Поэтому все аналогичные вирусные частицы могут преспокойно циркулировать в организме. Если некоторые из них доберутся до центральной нервной системы, они могут спровоцировать летальную реакцию в тканях мозга^32.

Исследователи описали процесс так: вирус перехватывает управление малой РНК. Судя по всему, данный процесс — не единственный пример такого перехвата. Вирус гепатита С также имеет РНК-геном. Когда этот вирус заражает клетки печени, вирусная РНК связывается с малой РНК, естественным образом экспрессируемой этими клетками. В данном случае такое связывание стабилизирует вирусный геном, затрудняя его разрушение. А значит, вырабатывается больше вирусных белков, и инфекция становится более опасной и агрессивной^33.

Теперь уже вполне очевидно, что малые РНК играют роль в человеческих патологиях самого широкого диапазона, от инфекций до рака, от проблем развития до нейродегенерации. Отсюда, разумеется, вытекает интересный вопрос: если мусорная ДНК может вызывать заболевания (или, по крайней мере, способствовать им), то ее, может быть, удастся использовать и для борьбы с распространенными недугами человека?

Глава 19. Иногда лекарства все-таки действуют

Миллиарды долларов каждый год расходуют фармацевтические компании на создание новых лекарств для борьбы с заболеваниями человека. Ученые надеются отыскать способы лечения пока неизлечимых болезней и помочь пациентам справиться с их тяжелыми недугами. А больных людей становится все больше, поскольку средний возраст жителей Земли неуклонно растет. Революционные открытия, позволившие глубже понять воздействие мусорной ДНК на генетическую экспрессию и развитие заболеваний, привели к возникновению массы новых фармкомпаний, жаждущих освоить эту сферу. Большинство этих новых исследований направлены на использование в качестве лекарств самих РНК, не кодирующих белки. Основная идея такова: мусорную РНК (длинную некодирующую, малую или еще одну их разновидность — антисмысловую РНК) будут давать больному для воздействия на генетическую экспрессию и для того, чтобы управлять течением болезни, а то и вовсе вылечить пациента.

Сейчас мы лечим болезни совсем не так. С давних пор большинство медикаментов представляет собой так называемые малые молекулы. Они синтезируются искусственно и сравнительно просты по структуре и форме. Примеры этих веществ, служащих основой широко распространенных лекарственных препаратов, приведены на рис. 19.1.

Рис. 19.1. Структурные формулы некоторых малых молекул, применяемых в медицине (под ними — названия лекарств, действующим началом которых они являются).

Не так давно ученые научились использовать белки в качестве лекарств. Вероятно, наиболее известный пример — инсулин, тот самый гормон, посредством которого диабетики регулируют уровень сахара в крови. Антитела — еще один тип белковых средств, оказавшихся весьма эффективными. Речь идет об искусственно измененных версиях молекул, которые наш организм производит для борьбы с инфекциями. Фармацевтические компании находят способы адаптировать их так, чтобы эти вещества соединялись с белками, проявляющими сверхэкспрессию, и нейтрализовали их действие. Самое популярное из таких антител позволяет весьма эффективно лечить ревматоидный артрит. Есть и другие, помогающие при лечении самых разных болезней и дефектов — от рака груди до слепоты^1.

Малые молекулы и антитела имеют свои достоинства и недостатки. Синтез малых молекул обычно стоит недорого. Их легко вводить в организм: зачастую их нужно просто проглотить. Однако их недостаток в том, что они не задерживаются в организме очень уж надолго, и пациент вынужден принимать их регулярно. Антитела же могут оставаться в организме неделями или даже месяцами. Но их должен вводить профессионал, и они очень дороги в производстве.

Имеются у таких средств и другие недостатки. Антитела эффективны лишь для борьбы с молекулами, которые присутствуют в телесных жидкостях (скажем, в крови) или на поверхности клеток. Эти лекарства не могут проникать внутрь клеток, чтобы выполнять там свою работу. А вот малые молекулы определенной структуры в случае необходимости это умеют. Но с их помощью, похоже, можно контролировать лишь ограниченное число разновидностей белков.

Малые молекулы работают как ключ в замке. Если вы находитесь в своем доме, проще всего помешать другим войти, заперев дверь изнутри и оставив ключ в замочной скважине. А если вам захочется навеки закрыть всем доступ в дом, вы можете даже использовать слегка дефектный ключ, который навсегда застрянет в замке.

Такой подход срабатывает, поскольку ключ входит в замок весьма плотно. А вот для блокировки какого-нибудь старомодного засова ключ бесполезен. Ему там просто не во что войти. Он будет лишь скользить по поверхности. То же самое относится и к нашим клеткам. Внутри у них имеется множество белков, которые мы и рады бы контролировать, только вот не можем создать для них подходящие малые молекулы — из-за структуры этих белков. В них попросту нет удобных щелей или карманов, куда можно было бы аккуратно вставить молекулу лекарства. У них обширные плоские поверхности, на которых негде приютиться малой молекуле.

Можно попытаться создать более крупные молекулы, способные покрыть всю такую поверхность. Проблема в том, что как только молекулы лекарства превысят определенный размер, они перестанут хорошо циркулировать в организме и вообще не смогут попасть в клетки, чтобы сделать свое дело.

Есть и еще одна проблема. Да, достаточно трудно создать лекарство, молекулы которого сумеют попасть в клетку, соединиться с определенным белком и остановить его работу. Однако неизмеримо труднее создать лекарство, молекулы которого сумеют попасть в клетку, соединиться с определенным белком и затем вынудить его работать интенсивнее, или быстрее, или лучше. Практически невозможно разработать лекарство традиционного типа, которое усиливало бы экспрессию одного определенного белка или включало бы лишь один-единственный ген.

Может ли нас спасти мусорная ДНК?

Вот почему поиск новых подходов к медикаментозному лечению вызывает такой большой интерес. Вот почему так важно все больше узнавать о мусорной ДНК. Используя длинные некодирующие РНК или малые РНК, теоретически возможно избирательно воздействовать на биологические пути, на которые нельзя повлиять с помощью традиционных препаратов, где основой служат малые молекулы или антитела. И неважно, что мишени воздействия таятся внутри клеток и имеют обширные плоские поверхности. Неважно, что нам понадобится — усиливать экспрессию или менять особенности функционирования белка или гена. Можно применить этот новый подход для работы с любым типом клеточных мишеней.

Теоретически.

В том-то и дело. Теоретически. Идеи встречаются часто, а вот их успешное воплощение — куда реже. Так что имеет смысл хорошенько разобраться в реальном положении вещей, прежде чем все мы начнем вкладывать свои сбережения в какую-нибудь новомодную биотехнологическую компанию, орудующую в этой сфере. Уже сейчас здесь происходит очень много всего^2, поэтому сосредоточимся на некоторых наиболее выдающихся примерах.

Печень вырабатывает белок, отвечающий за распространение по организму ряда других молекул. Во всем мире живет около 50 тысяч человек, унаследовавших мутацию гена, кодирующего этот белок. Собственно, встречается масса разновидностей такой мутации, но все они, судя по всему, дают схожий эффект — изменяют особенности функционирования белка, да так, что он начинает служить переносчиком не тех молекул[74],3.

Когда такое происходит, в тканях постепенно скапливаются отложения, состоящие из смеси нормального и мутантного белка. Больные страдают от целого ряда симптомов — в зависимости от того, какие ткани затронуты. Примерно в 80% известных случаев сильнее всего затронуто сердце, что приводит к потенциально летальным сердечным дефектам. В остальных 20% случаев отложения часто скапливаются в нервах и спинном мозге. Это может приводить к нарушению функционирования самых разных органов — в частности, к возникновению аномальных и болезненных реакций на слабые раздражители.

Компания Alnylam создала на основе малой РНК, прикрепленной к молекулам из группы сахаров, средство, которое можно вводить пациентам при помощи инъекций. Малая РНК связывается с нетранслируемой областью на конце информационной РНК, кодирующей белок, который мутирует при данном заболевании. Это обрекает данную информационную РНК на уничтожение.

В 2013 году компания обнародовала сведения о второй стадии клинических испытаний своего препарата. После введения средства у пациентов наблюдалось резкое падение уровня циркуляции мутантной и нормальной версий белка, причем этот пониженный уровень долгое время оставался неизменным^4. Обнадеживает. Но пока нельзя считать, что новое средство исцеляет от данной болезни. Есть предположения, что такое резкое снижение уровня циркуляции белка приведет к тому, что отложения в тканях будут накапливаться медленнее, что должно привести по крайней мере к замедлению развития заболевания. Но мы пока не знаем, так ли это на самом деле. Требуются более масштабные испытания, в ходе которых будут отслеживаться реальные симптомы и реальное развитие болезни. Только если окажется, что новое лекарство влияет и на то, и на другое, препарат можно будет считать эффективным.

Еще одна компания, Mirna Therapeutics, создала малую РНК, которая подражает действию другой, играющей важную роль в онкологических процессах. Эндогенная малая РНК, естественным путем вырабатываемая в организме, подавляет развитие злокачественных опухолей. Ее функция состоит в том, чтобы сдерживать размножение клеток. Она добивается этого, ослабляя экспрессию по меньшей мере 20 других генов, пытающихся заставить клетку делиться. Экспрессия этой малой РНК часто ослаблена у больных раком (или вообще сведена к нулю), что снимает тормоза с процессов клеточного деления. Исследователи надеются, что при введении аналога этой РНК в клетки больных удастся восстановить нормальную картину генетической регуляции, и раковые клетки перестанут размножаться так стремительно.

Компания испытала свою РНК на больных раком печени. Пока проводятся лишь испытания, цель которых — показать, какие дозы лекарства пациент способен перенести. Пройдет еще некоторое время, прежде чем мы узнаем, принесет ли эта методика положительные клинические результаты^5.

В препаратах, разрабатываемых компаниями Alnylam и Mirna Therapeutics, кроется одна хитроумная идея. Среди проблем, с которыми прежде сталкивались фармацевтические фирмы, пытаясь разработать лекарства на основе нуклеиновых кислот, едва ли не самой большой проблемой считалась детоксикационная способность самого организма. Впрочем, с традиционными лекарствами часто та же история. Упрощенно говоря, когда в организм попадает новое вещество любого типа, весьма вероятно, что оно отправится в печень. Одна из главных задач этого чрезвычайно энергичного органа — проводить детоксикацию всего, чей вид ему не нравится. На протяжении всей нашей эволюционной истории этот процесс нам очень помогал, защищая нас от токсинов, которые могут содержаться в пище. Однако проблема в том, что печень не обладает инструментами, позволяющими ей отличать яды, которых мы хотели бы избежать, от лекарств, которые мы пытаемся использовать. Печень просто затащит их в себя и попытается уничтожить — вне зависимости от того, с ядом или с лекарством она имеет дело.

Alnylam и Mirna Therapeutics, если использовать старинное изречение, обратили неизбежность в доблесть[75]. Alnylam таргетирует экспрессию белка, который вырабатывается в печени. Mirna Therapeutics разрабатывает средства для лечения рака печени. В том и в другом случае молекулы лекарств будут захватываться как раз тем органом, в который их и хотят ввести. Компании подбирают особенности структуры и упаковки этих молекул так, чтобы после попадания в печень молекулы просуществовали достаточно долго и успели выполнить свою работу. Для ряда других заболеваний также предлагались методики лечения, связанные с малыми РНК. Предварительные эксперименты, которые проводятся на выращиваемых в лаборатории клетках или на животных, часто демонстрируют обнадеживающие результаты. Но для заболеваний, при которых нуклеиновые кислоты должны избегать печени и сразу захватываться мозгом (например, при боковом амиотрофическом склерозе^6), пока не совсем понятно, сумеет ли медицина успешно применить такую технологию на практике.

В главе 17 мы видели, как померкли надежды на успешное внедрение многообещающего метода лечения мышечной дистрофии Дюшенна после того, как неожиданно окончились неудачей клинические испытания, проводившиеся на пациентах, чья болезнь достигла поздней стадии. При разработке этого подхода использовали особую разновидность мусорной ДНК — антисмысловую.

Мусорные антисмысловые РНК, вероятно, распространены в нашем геноме очень широко, и причина здесь — в двунитевом строении ДНК. Мы уже затрагивали этот вопрос в главе 7, где обсуждали Xist и его антисмыслового двойника — Tsix. (Мы использовали аналогию со словом ТОРГ, которое можно прочесть задом наперед, получив слово ГРОТ.) Все зависит от того, как ферменты, делающие РНК-копии на основе ДНК, будут вести считывание: будут они считывать определенную нить слева направо или противоположную ей нить справа налево.

Однако большинство слов нельзя читать в обоих направлениях, оба раза получая что-то осмысленное. К примеру, слово БИОЛОГИЯ, прочитанное задом наперед, дает бессмысленное ЯИГОЛОИБ. Точно так же и информационная РНК, считанная с генома в одном направлении, может кодировать белок, но копирование того же участка ДНК задом наперед может породить какую-то мусорную РНК, которую нельзя транслировать в белок. Иногда это приводит к образованию саморегулирующихся петель в наших клетках. Такие петли ограничивают экспрессию определенных генов (см. пример на рис. 19.2).

По оценкам ряда ученых, примерно треть генов, кодирующих белки, также производят мусорную РНК на основе своей антисмысловой цепи. Однако антисмысловые молекулы обычно вырабатываются в меньших объемах, чем смысловая РНК: зачастую их не более 10% от ее общего количества^7. Иногда антисмысловая область — просто короткая внутренняя секция гена. Иногда смысловая и антисмысловая области могут начинаться и кончаться в разных местах, так что они хоть и перекрываются, но и имеют свои уникальные участки. Иногда клеточная аппаратура, копирующая смысловую нить ДНК в смысловую РНК, врезается в аппаратуру, которая движется в противоположном направлении и создает антисмысловую РНК. Оба набора белков сваливаются с ДНК, и обе строящиеся молекулы РНК оказываются заброшенными. Существуют даже антисмысловые нити для некоторых длинных некодирующих РНК.

Рис. 19.2. В некоторых частях генома обе цепочки ДНК могут копироваться в РНК — при их считывании в противоположных направлениях. Нити, кодирующие белковые последовательности, называются смысловыми. Нити, не кодирующие белковые последовательности, называются антисмысловыми. Молекула антисмысловой РНК может соединяться с молекулой смысловой РНК, влияя на ее функционирование. В данном примере она ингибирует экспрессию белка, синтезируемого на основе матрицы смысловой информационной РНК.

Связывание антисмысловой РНК с ее смысловым РНК-партнером может приводить к весьма разнообразным последствиям. На рис. 19.2 показан случай, когда это связывание мешает трансляции смысловой информационной РНК в белок. Возможны и ситуации, при которых такое связывание стабилизирует информационную РНК, в конечном счете приводя к повышению уровня экспрессии белка^8.

В рамках экспериментов с дюшенновской мышечной дистрофией, поначалу казавшихся столь перспективными, пациентам вводили антисмысловую молекулу, которая способна распознавать информационную РНК, кодирующую дистрофин, и соединяться с ней. Антисмысловую молекулу химически модифицировали, чтобы в организме она не распадалась слишком быстро. Соединяясь с информационной РНК, кодирующей дистрофин, она не позволяла сплайсинговой аппаратуре клетки осуществлять нормальное связывание. Это, в свою очередь, приводило к изменениям в сплайсинге данной информационной РНК. Ее кодирующие участки соединялись иначе, нежели при нормальном сплайсинге. В итоге удавалось избавиться от участка, который вызывал основные проблемы при выработке мутантного белка.

Иногда все кончается хорошо

Да, те эксперименты с дюшенновской мышечной дистрофией в конце концов провалились, но это отнюдь не бросает тень на всю сферу применения антисмысловых компонентов. Тут все-таки удалось добиться кое-каких успехов. Так, в 1998 году одно антисмысловое лекарство лицензировали для лечения больных с нарушениями иммунной системы, которым угрожает потеря зрения из-за вирусной инфекции сетчатки[76]. Антисмысловая молекула соединялась с одним из вирусных генов, тем самым препятствуя размножению вируса^9. Лекарство оказалось эффективным. Возникает два вопроса. Во-первых, почему оно так хорошо действовало? А во-вторых, раз уж оно так хорошо действовало, почему производитель в 2004 году прекратил его продажу?

Оба ответа довольно прямолинейны. Лекарство хорошо действовало, поскольку его посредством инъекции вводили непосредственно в глаз. Проблемы, что его захватит печень, попросту не существовало. Оно таргетировало вирус, к тому же в пределах одной довольно-таки самодостаточной части тела, что снижало риск широкомасштабных взаимодействий вводимого препарата с генами человека.

Но почему же производитель в 2004 году прекратил продажу этого чудодейственного средства? Препарат разработали для людей с чрезвычайно ослабленным иммунитетом. У подавляющей части таких людей СПИД. Между тем к 2004 году на рынке появились лекарства, неплохо позволяющие держать в узде ВИЧ, тот самый вирус, который и является причиной СПИДа. Состояние иммунной системы пациентов, принимавших эти лекарства, значительно улучшилось, и больные просто перестали подхватывать вирусные инфекции сетчатки.

Более недавние события показали, что использование антисмысловой мусорной ДНК в лечебных целях все-таки имеет кое-какие перспективы. Есть серьезное заболевание с длинным названием — наследственная гиперхолестеринемия. По оценкам медиков, в одной только Великобритании сейчас около 120 тысяч больных этим недугом, хотя у многих из них, вероятно, он не выявлен. Генетическая мутация мешает им управляться с «плохим холестерином» должным образом. В результате от трети до половины таких больных примерно к 55 годам получают (или получат) серьезное заболевание коронарной артерии^10.

Стандартные лекарства, уменьшающие содержание липидов в организме (такие средства называются статинами), сегодня неплохо себя зарекомендовали — эти препараты существенно снижают риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. Чаще всего они приносят пользу тем, кто обладает лишь одной мутантной копией определенного гена, но при этом другая его копия остается нормальной. Однако статины оказываются неэффективными для лечения многих острых случаев, особенно если у больного обе копии определенного гена мутантные. Такие больные часто вынуждены один или два раза в неделю проходить плазмаферез — процедуру, в ходе которой кровь пациента пропускается через специальный аппарат и опасный холестерин из нее удаляется.

Если вы хотите, чтобы ванна не переполнялась, у вас есть два выхода. Или просто предоставьте воде вытекать в сливное отверстие, или прекратите добавлять новую воду, завернув краны.

Компания Isis создала антисмысловую молекулу, таргетирующую первичный белок липопротеинов низкой плотности — так называемого «плохого» холестерина[77]. Такое лечение наследственной гиперхолестеринемии при помощи антисмыслового препарата работает по принципу «закручивания кранов». Антисмысловая молекула лекарства связывается с информационной РНК, кодирующей белок «плохого» холестерина, и подавляет ее активность, в результате чего понижается экспрессия «плохого» холестерина и общий уровень его синтеза. Лицензию на этот препарат Isis продала более крупной компании, Genzyme, в рамках сделки стоимостью в сотни миллионов долларов.

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США выдало лицензию на использование данного лекарственного средства[78], но лишь применительно к больным, страдающим наиболее острой формой наследственной гиперхолестеринемии. Почему препарат так хорошо себя проявил, что даже сумел попасть на рынок (хотя стоимость лечения им одного пациента составляет, между прочим, более 170 тысяч долларов в год^11)? Одна из причин — в том, что ген, который он таргетирует, экспрессируется в... да, вы угадали: в печени. Однако и тут не обошлось без неувязок. Сообщалось, что использование препарата иногда приводит к гепатотоксическим эффектам (то есть он оказывается токсичным для печени). Все то же Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США потребовало от компании Sanofi (купившей Genzyme) обязательного мониторинга функционирования печени у всех пациентов, получающих такое лечение^12. Европейское медицинское агентство и вовсе отказалось лицензировать этот препарат^13.

Сотни миллионов долларов, которые компания Isis получила от Genzyme за свою методику терапии с помощью антисмыслового препарата, составляют немалую сумму. Но имейте в виду: на то, чтобы пройти путь от исходных исследований к выводу лекарства на рынок, ушло больше 20 лет, и весь процесс обошелся в три с лишним миллиарда долларов^14. Такие колоссальные инвестиции трудновато окупить.

Конечно же, невольно ожидаешь, что пионерские лекарства, особенно те, где используется сравнительно мало испытанный тип молекул, как раз и потребуют для своей разработки много времени и денег. Всегда есть надежда, что последующие проекты будут осуществляться быстрее и проще. Сейчас неуклонно множатся клинические испытания методик лечения, основанных на мусорной ДНК. Существует малая РНК человека, которую один вирус втягивает в свое черное дело, заставляя ее помогать ему заражать клетки. Мусор пытаются побороть с помощью мусора: сейчас проходит уже вторую стадию клинических испытаний антисмысловое лекарство, таргетирующее эту малую РНК^15.

Но вот что странно. В 2006 году фармацевтический гигант Merck более чем за миллиард долларов приобрел компанию, которая занималась созданием лечебных средств на основе малых РНК. А в 2014 году Merck сбыл ее с рук, причем по гораздо более низкой цене^16. Еще одна компания, Roche, прекратила собственные исследования в этом направлении еще в 2010 году.

С недавних пор наблюдается мощный всплеск инвестиций в биотехнологические компании, занимающиеся малыми РНК. К примеру, RaNA Therapeutics (которая, как полагают специалисты, как раз сейчас разрабатывает лекарства, основанные на РНК и призванные воспрепятствовать взаимодействию длинных некодирующих РНК с клеточной эпигенетической аппаратурой) в 2012 году собрала свыше 20 миллионов долларов^17. Dicerna, создающая малые РНК для борьбы с некоторыми редкими заболеваниями и ранними признаками рака, сумела в 2014 году добыть 90 миллионов долларов^18. Это уже третий транш, который она получила, хотя и не дошла пока до клинических испытаний^19.

И все-таки тут есть одна странность. Вот прямо сейчас, когда я пишу эту главу (весной 2014 года), новостная рассылка принесла мне сообщение о том, что компания Novartis решила серьезно снизить темпы своих исследований в данной области^20. Фармацевтический гигант ссылается главным образом на проблемы с выяснением того, как доставлять малые РНК в нужные ткани. Собственно, это вообще главная трудность, с которой сталкиваются при создании таких методов лечения. Пока что-то не видно никаких революционных открытий, которые помогли бы справиться с этой проблемой.

Наверное, когда-нибудь наука сумеет интерпретировать все возможные эпигенетические модификации генома и точно предсказать их последствия для генетической экспрессии. Мы научимся улавливать углеродные выбросы и придумаем, как основать колонии на Марсе. Туберкулез станет туманным воспоминанием, и все мы будем отлично понимать, что такое бозон Хиггса. Но вот что касается того, сумеем ли мы разгадать, почему среди инвесторов надежда так часто одерживает верх над опытом... Ладно вам. Будем реалистами.

Глава 20. Луч света во тьме

Мы близимся к концу блужданий по темным закоулкам нашего генома. Внимательный читатель может заметить, что мы пока не рассмотрели тайну одного из заболеваний человека, впервые упомянутых еще в начале книги. Эта болезнь носит довольно неуклюжее название — плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия (ПЛЛМД). При этом недуге постепенно тают мышцы лица, плеч и предплечий.

Болезнь возникает, когда будущий пациент наследует меньшее, чем нужно, количество повторов определенной нуклеотидной последовательности водной из копий хромосомы 4. Мутацию выявили еще несколько лет назад, но до самого последнего времени оставалось совершенно непонятным, почему она вызывает заболевание. Ведь рядом с этим генетическим дефектом, похоже, попросту нет никакого гена, кодирующего белки.

Но мы наконец-то обрели понимание того, каким образом возникают симптомы болезни. История впечатляющая. Она сводит воедино многие темы, с которыми мы уже встречались. Сейчас вы увидите, как ДНК, эпигенетика, генетические реликты и аномальный процессинг РНК осуществляют неслыханный патологический заговор^1.

Небольшое напоминание. На каждой из нормальных копий хромосомы 4 указанная последовательность повторяется от 11 до 100 раз. Длина последовательности — чуть больше 3 тысяч пар нуклеотидных оснований. У больных ПЛЛМД число повторов меньше: на одной из копий хромосомы 4 у них встречается от одной до 10 таких последовательностей, расположенных подряд.

Здесь-то мы и сталкиваемся с первой сложностью. Есть люди, у которых число копий данного элемента ДНК составляет 10 или меньше, но при этом у них нет ПЛЛМД. Мышцы у них пребывают в совершенно здоровом состоянии. Малое количество повторов вызывает проблемы, лишь если оно наблюдается на копии хромосомы 4 и лишь если эта копия обладает особым свойством.

Чтобы осознать важность этого особого свойства, не помешает подробнее взглянуть на состав повторяющихся элементов. Оказывается, все они содержат некий ретроген[79]. Ретроген — одна из форм мусорной ДНК. Он возникает, когда информационная РНК нормального гена клетки копируется обратно в ДНК и снова встраивается в геном. Во многом это напоминает процесс, показанный на рис. 4.1. Он происходил еще давным-давно, в нашем эволюционном прошлом.

Поскольку ретрогены изначально создаются на основе матриц информационной РНК, в них часто отсутствуют регуляторные последовательности, свойственные нормальным генам. Ретрогены не содержат сплайсинговых сигналов (поскольку матрица информационной РНК уже прошла сплайсинг перед копированием в ДНК). У них нет областей-промоторов и областей-энхансеров. Но некоторые из ретрогенов все-таки могут использоваться для создания информационной РНК. Именно так обстоит дело с ретрогеном ПЛЛМД. Однако обычно это не имеет значения, ибо такая РНК не функционирует в клетке должным образом. Она не содержит в себе нужных сигналов, побуждающих клетку добавлять цепочку оснований А к концу информационной РНК (этот процесс показан на рис. 16.5). Поэтому такая информационная РНК нестабильна и не может использоваться как матрица для производства белка.

Но если человек обладает лишь небольшим количеством повторов ПЛЛМД-элемента и если на хромосоме 4 имеются все другие свойственные ей последовательности, «окончательная» копия ПЛЛМД-ретрогена может подвергаться сплайсингу, порождая еще одну — дополнительную — последовательность. В результате на конце информационной РНК появляется сигнал, который позволяет клеточной аппаратуре пристраивать череду оснований А к этому концу. Такое добавление оснований А, в свою очередь, стабилизирует данную информационную РНК. Она преспокойно доставляется в рибосомы, где служит матрицей для производства белка — того самого белка, который никогда не должен экспрессироваться в зрелых мышечных клетках.

ПЛЛМД-белок регулирует экспрессию других генов, соединяясь с определенными ДНК-последовательностями. Сам он обычно экспрессируется только в генеративной, зародышевой линии — в половых клетках, которые производят яйцеклетки и сперматозоиды. Пока не существует четкого и убедительного объяснения, почему экспрессия данного белка вызывает увядание мышц. Возможно, тут задействован целый ряд механизмов. Может быть, этот белок активирует гены, провоцирующие отмирание мышечных клеток. Или приводит к потере стволовых клеток мышечной ткани — вероятно, посредством активирования других ретрогенов и захватчиков генома, которых следует держать в пассивном состоянии. Есть интригующая возможность: не исключено, что мышечные клетки, экспрессирующие ПЛЛМД-белок, разрушаются собственной иммунной системой пациента.

Генеративная линия — ткань, которая считается иммунологически привилегированной, поскольку обычно она изолирована от клеток нашей иммунной системы. А значит, нашей иммунной системе так никогда и не удается проведать о том, что клетки иммунологически привилегированных зон являются нормальной составной частью нашего организма. Если белки генеративной линии экспрессируются в зрелых мышечных клетках, иммунная система может отреагировать на них как на чужеродные организмы и атаковать клетки, экспрессирующие эти компоненты, с которыми иммунная система прежде никогда не сталкивалась.

Таким образом, ПЛЛМД показывает, какую важную роль играет мусорная ДНК при заболеваниях. Генетический дефект приводит к изменению некоторого количества мусорной ДНК. Вследствие этого некий мусорный элемент экспрессируется, а затем и модифицируется путем добавления к нему какой-то мусорной последовательности. Мало того: ПЛЛМД-ретроген стабильно экспрессируется лишь при определенной картине эпигенетических модификаций.

В нормальных клетках ПЛЛМД-повторы обычно экспрессируются, когда клетки находятся в плюрипотентном состоянии (в таком состоянии находятся, к примеру, эмбриональные стволовые клетки). На данной стадии ПЛЛМД-повторы покрыты активирующими эпигенетическими модификациями. Однако при дифференциации клеток активирующие модификации заменяются репрессивными и данная область отключается. Но если плюрипотентные клетки создаются в организме больного ПЛЛМД, активирующие модификации не заменяются при дифференциации клеток и область повторов остается включенной.

Еще один аспект — общий контроль генетической зоны, содержащей ПЛЛМД-ген. Между областью повторов и остальной частью хромосомы 4 находится область-изолятор (инсулятор). Белок 11-FINGER (мы с ним уже знакомы) связывается с инсулятором, обеспечивая иную картину эпигенетических модификаций в зоне ПЛЛМД по сравнению с соседними частями хромосомы.

Мало того, трехмерная структура этих областей хромосомы 4 также оказывает влияние на экспрессию ПЛЛМД-ретрогена. Почти наверняка именно сочетание всех перечисленных факторов приводит к той картине неполной атрофии мышц, которую наблюдают у больных ПЛЛМД.

Механизм, посредством которого при ПЛЛМД изменение в одной из областей мусорной ДНК приводит к болезни, являет собой ошеломляющий пример комплексных и многослойных взаимодействий различных элементов нашего генома. Он показывает, что нам не следует, размышляя о происходящем в наших клетках, представлять себе какие-то линейные пути и связи. Ведь речь идет о сложной системе взаимозависимых процессов. Рисунок 20.1 наглядно это демонстрирует. Теперь мы видим, почему так бессмысленны споры о том, какой компонент нашего генома является самым важным. Нарушение хотя бы какого-то его аспекта приводит к неким последствиям, одни из них окажутся серьезнее, чем другие, но все они действуют совместно.

Разумеется, это не значит, что среди миллиардов наших нуклеотидных пар решительно каждая обладает какой-то функцией. Возможно, некоторые действительно представляют собой бесполезный геномный мусор, тогда как другие области являются мусорными лишь в том смысле, что организм мог бы давно их выбросить, однако нашел им применение^2.

Рис. 20.1. Лишь некоторые из взаимодействующих факторов, которые должны действовать совместно, чтобы создать сложнейший организм, то есть нас с вами.

Мы еще многого не знаем. В частности, мы пока не получили ответов на целый ряд вопросов, которые могут показаться очень простыми и прямолинейными. К примеру, мы не знаем, сколько же функциональных областей мусорной ДНК существует в клетке. Думаете, ответ дать легко? Взгляните-ка на рис. 20.2 и побыстрее ответьте: сколько квадратов на шахматной доске?

Рис. 20.2. Скорее отвечайте: сколько квадратов на шахматной доске?

Все неизменно выдают мгновенное инстинктивное «64». На самом деле квадратов 204, поскольку на доске можно выстраивать более крупные квадраты всевозможных размеров, основываясь на более очевидных для нас элементах — черных и белых клетках. С нашим геномом такая же история. Один и тот же отрезок ДНК может включать в себя кодирующий белки ген, длинные некодирующие РНК, малые РНК, антисмысловые РНК, сайты сплайсингового сигнала, нетранслируемые области, промоторы и энхансеры. Прибавьте к этому дополнительные слои — те воздействия, которые оказывает различие в ДНК-последовательностях разных людей; направленные и случайные эпигенетические модификации; изменчивые трехмерные взаимодействия. Плюс связывание с другими РНК и белками. И прибавьте еще те влияния, причиной которых является постоянно меняющаяся среда, где мы обитаем.

Устройство нашего генома невероятно сложно, а потому вряд ли стоит удивляться, что мы пока не разобрались во всех его особенностях. Невероятным триумфом можно считать уже то, что мы понимаем хотя бы что-то. Там, в темной геномной материи, всегда найдется нечто еще не изученное.

Примечания

Глава 1

1. Информацию об этом заболевании и его генетике см. в: www. omim.org record #160900.

2. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/myotonic-dystrophy.

3. Подробнее см. в: http://www.ninds.nih.gov/disorders/friedre-ichs_ataxia/detail_friedreichs_ataxia.htm.

4. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/facioscapulo-humeral-muscular-dystrophy.

Глава 2

1. http://www.escapistmagazine.com/news/view/113307-Virtual-Typewriter-Monkeys-Pen-Complete-Works-of-Shakespeare-Almost.

2. Campuzano V, Montermini L, Molto MD, Pianese L. Cossée M, Cavalcanti F, Monros E, Rodius F, Duclos F, Monticelli A, Zara F, Caftizares J, Koutnikova H, Bidichandani SI, Gellera C, Brice A, Trouilles P, De Michele G, Filla A, De Frutos R, Palau F, Patel PI, Di Donato S, Mandel JL, Cocozza S, Koenig M, Pandolfo M. Friedreich’s ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science. 1996 Mar 8; 271(5254):1423-7.

3. Bidichandani SI, Ashizawa T, Patel PI. The GAA triplet-repeat expansion in Friedreich ataxia interferes with transcription and may be associated with an unusual DNA. Am J Hum Genet. 1998 Jan; 62(1 ):111-21.

4. Babcock M, de Silva D, Oaks R, Davis-Kaplan S, Jiralerspong S, Montermini L, Pandolfo M, Kaplan J. Regulation of mitochondrial iron accumulation by Yfh1p, a putative homolog of frataxin. Science. 1997 Jun 13; 276(5319): 1709-12.

5. Kremer EJ, Pritchard M, Lynch M, YuS, Holman K, Baker E, Warren ST, Schlessinger D, Sutherland GR, Richards RI. Mapping of DNA instability at the fragile X to a trinucleotide repeat sequence p (CCG) n. Science. 1991 Jun 21; 252(5013):1711-4

6. Verkerk AJ, Pieretti M, Sutcliffe JS, Fu YH, Kuhl DP, Pizzuti A, Reiner O, Richards S, Victoria MF, Zhang FP, et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 1991 May 31; 65(5):905 14.

7. Pieretti M, Zhang FP, Fu YH, Warren ST, Oostra BA, Caskey CT, Nelson DL. Absence of expression of the FMR-1 gene in fragile X syndrome. Cell. 1991 Aug 23;66(4):817-22.

8. Qin M, Kang J, Burlin TV, JiangC, Smith CB. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. J Neurosci. 2005 May 18;25(20):5087-95.

9. Цит. по: Echeverria GV, Cooper TA. RNA-binding proteins in microsatellite expansion disorders: mediators of RNA. Brain Res. 2012 Jun 26; 1462:100-11.

Глава 3

1. http://www.genome.gov/11006943.

2. Если не оговорено обратное, основная часть информации в этой главе почерпнута из номера Nature, вышедшего 15 февраля 2001 года и содержащего результаты, полученные консорциумом, работавшим при помощи государственного финансирования, и их анализ. Прежде всего следует сослаться на текст «Initial sequencing and analysis of the human genome», автором которого является международный консорциум «Геном человека» (International Human Genome Sequencing Consortium). Дополнительные комментарии можно найти в том же номере Nature.

3. http://partners.nytimes.com/library/national/science/062700sci-genome-text.html.

4. http://news.bbc.co.uk/1/hi/sci/tech/807126.stm.

5. http://news.bbc.co.uk/1/hi/sci/tech/807126.stm.

6. http://www.genome.gov/sequencingcosts.

7. http://www.wired.co.uk/news/archive/2014-01/15/1000-dollar-genome.

8. Необыкновенные подробности этого случая см. в: Gura, Nature, 2012, Volume 483, 20-22.

9. http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/cancer-drugs/Crizotinib/crizotinib.

10. https://genographic.nationalgeographic.com/human-journey.

11. http://publications.nigms.nih.gov/insidelifescience/genetics-numbers.html.

12. Aparicio et al. Whole-genome shotgun assembly and analysis of the genome of Fugu rubripes. Science. 2002 Aug 23: 297(5585): 1301-10.

13. Baltimore D. Our genome unveiled. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):814-6.

14. Данные Американского онкологического общества: http://www.cancer.org/cancer/skincancer-melanoma/detailedguide/melanoma-skin-cancer-key-statistics.

Глава 4

1. Если не оговорено обратное, основная часть информации в этой главе почерпнута из номера Nature, вышедшего 15 февраля 2001 года и содержащего результаты, полученные консорциумом, работавшим при помощи государственного финансирования, и их анализ. Прежде всего следует сослаться на текст «Initial sequencing and analysis of the human genome», автором которого является международный консорциум «Геном человека» (International Human Genome Sequencing Consortium). Представляют интерес и комментарии, которые делают в том же номере David Baltimore, а также Li и др. Эти комментарии, пожалуй, наиболее приемлемы по стилю и содержанию.

2. Vlangos CN, Siuniak AN, Robinson D, Chinnaiyan AM, Lyons RH Jr, Cavalcoli JD, Keegan CE. Next-generation sequencing identifies the Danforth’s short tail mouse mutation as a retrotransposon insertion affecting Ptf1a expression. PLoS Genet. 2013;9(2):e1003205.

3. Bogdanik LP, Chapman HD, Miers KE, Serreze DV, Burgess RW. A MusD retrotransposon insertion in the mouse Slc6a5 gene causes alterations in neuromuscular junction maturation and behavioral phenotypes. PLoS One. 2012;7(1):e30217.

4. Schneuwly S, Klemenz R. Gehring WJ. Redesigning the body plan of Drosophila by ectopic expression of the homeotic gene Antennapedia. Nature. 1987 Feb 26 — Mar 4;325(6107):816-8.

5. Mortlock DP, Post LC, Innis JW. The molecular basis of hypodactyly (Hd): a deletion in Hoxa 13 leads to arrest of digital arch formation. Nat Genet. 1996 Jul; 13(3):284-9.

6. Rowe HM, Jakobsson J, Mesnard D, Rougemont J, Reynard S, Aktas T, Maillard PV, Layard-Liesching H, Verp S, Marquis J, Spitz F, Constam DB, Trono D. KAP1 controls endogenous retroviruses in embryonic stem cells. Nature. 2010 Jan 14;463(7278):237-40.

7. Young GR, Eksmond U, Salcedo R, Alexopoulou L, Stoye JP, Kassiotis G. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 2012 Nov 29;491(7426):774-8.

8. http://www.emedicinehealth.com/heart_and_lung_transplant/article_em.htm

9. Недавно вышел интересный обзор, посвященный ксенотрансплантации: Cooper DK. A brief history of cross-species organ transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 2012 Jan; 25(1):49-57.

10. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med. 1997 Mar; 3(3):282-6.

11. Di Nicuolo G, D’Alessandro A, Andria B, Scuderi V, Scognamiglio M, Tammaro A, Mancini A, Cozzolino S, Di Florio E, Bracco A, Calise F, Chamuleau RA. Long-term absence of porcine endogenous retrovirus infection in chronically immunosuppressed patients after treatment with the porcine cell-based Academic Medical Center bioartificial liver. Xenotransplantation. 2010 Nov — Dec; 17(6):431-9.

12. Недавно появился полезный обзор исследований эффектов такого удвоения сегментов генетического материала, в том числе и при аномальном кроссинговере: Rudd МК, Keene J, Bunke В, Kaminsky ЕВ, Adam MP, Mulle JG, Ledbetter DH, Martin CL. Segmentai duplications mediate novel, clinically relevant chromosome rearrangements. Hum Mol Genet. 2009 Aug 15;18(16):2957-62.

13. Подробнее об этом заболевании и его причинах см. в: http:// www.ninds.nih.gov/disorders/charcot_marie_tooth/detail_charcot_marie_tooth.htm.

14. Подробнее об этом заболевании и его причинах см. в: http:// www.nlm.nih.gov/mediineplus/ency/article/001116.htm.

15. Mombaerts Р. The human repertoire of odorant receptor genes and pseudogenes. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2001;2:493-510.

16. http://www.innocenceproject.org/know, по состоянию на 1 января 2014.

Глава 5

1. Сведения о сборах даются по: http://www.imdb.com.

2. Цит. по: Boxer LM, Dang CV. Translocations involving c-myc and c-myc function. Oncogene. 2001 Sep 20(40):5595-610.

3. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, Dani M, Deaven LL, Jones MD, Meyne J, Ratliff RL, Wu JR. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG) n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Sep; 85(18):6622-6.

4. Vaziri H, Schächter F, Uchida I, Wei L, Zhu X, Effros R, Cohen D, Harley CB. Loss of telomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. Am J Hum Genet. 1993 Apr; 52(4):661-7.

5. Hayfick L, Moorhead PS. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 1961 Dec; 25:585-621.

6. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 1990 May 31;345(6274):458-60.

7. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wright WE. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 1998 Jan 16;279(5349):349-52.

8. Полезное обсуждение проблемы см. в: Armanios M, Blackburn EH. The telomere syndromes. Nat Rev Genet. 2012 Oct; 13(10):693-704.

9. Полезный обзор см. в: Armanios М, Blackburn EH. The telomere syndromes. Nat Rev Genet. 2012 Oct; 13(10):693-704.

10. Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, Byrd W, Shay JW. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev Genet. 1996;18(2):173-9.

11. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994 Dec 23;266(5193):2011-5.

12. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/anatomyvideos/000104.htm.

13. Chiu CP, Dragowska W, Kim NW, Vaziri H, Yui J, Thomas ТЕ, Harley CB, Lansdorp PM. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone. Stem Cells. 1996 Mar; 14(2):239-48.

14. Vaziri H, Dragowska W, Allsopp RC, Thomas ТЕ, Harley CB, Lansdorp PM. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. Proc Natl Acad Set USA. 1994 Oct ll;91(21):9857-60.

15. Armanios M, Blackburn EH. The telomere syndromes. Nat Rev Genet. 2012 Oct; 13(10):693-704.

16. Armanios M, Blackburn EH. The telomere syndromes. Nat Rev Genet. 2012 Oct; 13(10):693-704.

17. Отличное клиническое описание и полезные иллюстрации см. в: Calado RT, Young NS. Telomere diseases. N Engl J Med. 2009 Dec 10;361(24):2353-65.

18. Alder JK, Chen JJ, Lancaster L, Danoff S, Su SC, Cogan JD, Vulto I, Xie M, Qi X, Tuder RM, Phillips JA 3rd, Lansdorp PM, Loyd JE, Armanios MY. Short telomeres are a risk factor for idiopathic pulmonary fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 2;105(35):13051-6.

19. Armanios MY, Chen JJ, Cogan JD, Alder JK, Ingersoll RG, Markin C, Lawson WE, Xie M, Vulto I, Phillips JA 3rd, Lansdorp PM, Greider CW, Loyd JE. Telomerase mutations in families with idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med. 2007 Mar 29;356(13):1317-26.

20. Tsakiri KD,CronkhiteJT, Kuan PJ, XingC, RaghuG, Weissler JC, Rosenblatt RL, Shay JW, Garcia CK. Adult-onset pulmonary fibrosis caused by mutations in telomerase. Proc Natl Acad Sei USA. 2007 May 1;104(18):7552-7.

21. Cronkhite JT, Xing C, Raghu G, Chin KM, Torres F, Rosenblatt RL, Garcia CK. Telomere shortening in familial and sporadic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2008 Oct 1;178(7):729-37.

22. Полезное описание см. в: see http://www.patient.co.uk/doctor/aplastic-anaemia.

23. de la Fuente J, Dokal I. Dyskeratosis congenita: advances in the understanding of the telomerase defect and the role of stem cell transplantation. Pediatr Transplant. 2007 Sep; 11(6):584-94.

24. Armanios M, Chen JL, Chang YP, Brodsky RA, Hawkins A, Griffin CA, Eshleman JR, Cohen AR, Chakravarti A, Hamosh A, Greider CW. Haploinsufficiency of telomerase reverse transcriptase leads to anticipation in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Nov 1;102(44):15960-4.

25. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en.

26. Alder JK, Guo N, Kembou F, Parry EM, Anderson CJ, Gorgy AI, Walsh MF, Sussan T, Biswal S, Mitzner W, Tuder RM, Armanios M. Telomere length is a determinant of emphysema susceptibility. Am J Respir Crit Care Med. 2011 Oct 15;184(8):904-12.

27. Цит. no: Sahin E, Depinho RA. Linking functional decline of telomeres, mitochondria and stem cells during ageing. Nature. 2010 Mar 25;464(7288):520-528.

28. Статистика дается по данным American Heart Association on Older Americans & Cardiovascular Diseases (Американской ассоциации изучения сердца пожилых американцев и сердечно-сосудистых заболеваний), 2013.

29. http://www.rcpsych.ac.uk/healthadvice/problemsdisorders/depressioninolderadults.aspx.

30. Valdes AM, Andrew T, Gardner JP, Kimura M, Oelsner E, Cherkas LF, Aviv A, Spector TD. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 2005 Aug 20-26;366(9486):662-4.

31. Cawthon RM, Smith KR, O’Brien E, Sivatchenko A, Kerber RA. Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet. 2003 Feb 1;361(9355):393-5.

32. Fitzpatrick AL, Kronmal RA, Kimura M, Gardner JP, Psaty BM, Jenny NS, Tracy RP, Hardikar S, Aviv A. Leukocyte telomere length and mortality in the Cardiovascular Health Study. J Gerontol A Biol Sci MedSci. 2011 Apr; 66<4):421-9.

33. Atzmon G, Cho M, Cawthon RM, Budagov T, Katz M, Yang X, Siegel G, Bergman A, Huffman DM, Schechter CB, Wright WE, Shay JW, Barzilai N, Govindaraju DR, Suh Y. Evolution in health and medicine Sackler colloquium: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jan 26;107 Suppl 1:1710-7.

34. Segerstrom SC, Miller GE. Psychological stress and the human immune system: a meta-analytic study of 30 years of inquiry. Psychol Bull. 2004 Jul; 130(4):601-30.

35. Epel ES, Blackburn EH, Lin J, Dhabhar FS, Adler NE, Morrow JD, Cawthon RM. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Dec 7; 101(49): 17312-5.

36. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/index.html.

37. Полезное введение в эту область см. в: Tennen RI, Chua KF. Chromatin regulation and genome maintenance by mammalian SIRT6. Trends Biochem Sci. 2011 Jan; 36(l):39-46.

38. Valdes AM, Andrew T, Gardner JP, Kimura M, Oelsner E, Cherkas LF, Aviv A, Spector TD. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 2005 Aug 20-26;366(9486):662-4.

39. UNFPA report on Ageing in The Twenty-First Century (Доклад Фонда ООН в области народонаселения «Старение в XXI веке»), 2012.

40. Jennings BJ, Ozanne SE, Dorling MW, Hales CN. Early growth determines longevity in male rats and may be related to telomere shortening in the kidney. FEBS Lett. 1999 Apr 1;448(1):4-8.

Глава 6

1. Из: The King and I («Король и я»), 1956, автор сценария Ernest Lehman, 20th Century Fox.

2. Хороший обзор типов центромер различных ветвей эволюционного древа см. в: Ogiyama Y, Ishii К. The smooth and stable operation of centromeres. Genes Genet Syst. 2012;87(2):63-73.

3. Полезный обзор: Verdaasdonk JS, Bloom K. Centromeres: unique chromatin structures that drive chromosome segregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011 May; 12(5):320-32.

4. Palmer DK, O’Day K, Wener MH, Andrews BS, Margolis RL. A 17-kD centromere protein (CENP-A) copurifies with nucleosome core particles and with histones. J Cell Biol. 1987 Apr; 104(4):805-15.

5. Takahashi К, Chen ES, Yanagida M. Requirement of Mis6 centromere connector for localizing a CENP-A-like protein in fission yeast. Science. 2000 Jun 23;288(5474):2215-9.

6. Blower MD, Karpen GH. The role of Drosophila CID in kinetochore formation, cell-cycle progression and heterochromatin interactions. Nat Cell Biot. 2001 Aug; 3(8):730-9.

7. Hori T, Amano M, Suzuki A, Backer CB, Welburn JP, Dong Y, McEwen BF, Shang WH, Suzuki E, Okawa K, Cheeseman IM, Fukagawa T. CCAN makes multiple contacts with centromeric DNA to provide distinct pathways to the outer kinetochore. Cell. 2008 Dec 12;135(6):1039-52.

8. Heun P, Erhardt S, Blower MD, Weiss S. Skora AD, Karpen GHïf-Mislocalization of the Drosophila centromere-specific histone CID promotes formation of functional ectopic kinetochores. Dev Cell. 2006 Mar; 10(3):303-15.

9. Van Hooser AA, Ouspenski II, Gregson HC, Starr DA, Yen TJ, Goldberg ML, Yokomori K, Earnshaw WC, Sullivan KF, Brinkley BR. Specification of kinetochore-forming chromatin by the histone H3 variant CENP-A. J Cell Sci. 2001 Oct; 114(Pt 19):3529-42.

10. Zuccolo M, Alves A, Galy V, Bolhy S, Formstecher E, Racine V, Sibarita JB, Fukagawa T, Shiekhattar R, Yen T, Doye V. The human Nupl07-160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 2007 Apr 4;26(7): 1853-64.

11. Palmer DK, O’Day K, Wener MH, Andrews BS, Margolis RL. A 17-kD centromere protein (CENP-A) copurifies with nucleosome core particles and with histones. J Cell Biol. 1987 Apr; 104(4):805-15.

12. Sekulic N, Bassett EA, Rogers DJ, Black BE. The structure of (CENP-A-H4) (2) reveals physical features that mark centromeres. Nature. 2010 Sep 16;467(7313):347-51.

13. Warburton PE, Cooke CA, Bourassa S, Vafa O, Sullivan BA, Stetten G, Gimelli G, Warburton D, Tyler-Smith C, Sullivan KF, Poirier GG, Earnshaw WC. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 1997 Nov 1;7(11):901-904.

14. Очень хороший анализ этой модели см. в: Sekulic N, Black BE. Molecular underpinnings of centromere identity and maintenance. Trends Biochem Sci. 2012 Jun; 37(6):220-229.

15. Подробнее об этом процессе и об эпигенетических модификациях, которые играют в нем свою роль, см. в: Gonzàlez-Barrios R, Soto-Reyes Е, Herrera LA. Assembling pieces of the centromere epigenetics puzzle. Epigenetics. 2012 Jan 1;7(1):3-13.

16. Из песенки «Что-то хорошее» киноверсии «Звуков музыки» (The Sound of Music) 1965, 20th Century Fox.

17. Особенно важен в этом отношении белок HJURP. Подробнее см. в: Sekulic N, Black BE. Molecular underpinnings of centromere identity and maintenance. Trends Biochem Sci. 2012 Jun; 37(6):220-9.

18. Palmer DK, O’Day K, Margolis RL. The centromere specific histone CENP-A is selectively retained in discrete foci in mammalian sperm nuclei. Chromosoma. 1990 Dec; 100(l):32-6.

19. Schiff PB, Fant J, HorwitzSB. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 1979 Feb 2;277(5698):665-7.

20. http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/ treatment/cancer-drugs/paclitaxel.

21. Цифра приведена в: Rajagopalan H. Lengauer С. Aneupioidy and cancer. Nature. 2004 Nov 18;432(7015):338-41.

22. Обзор на эту тему: Pfau SJ, Amon A. Chromosomal instability and aneupioidy in cancer: from yeast to man. EM BO Rep. 2012 Jun 1;13(6):515-27.

23. Rehen SK, Yung YC, McCreight MP, Kaushal D, Yang AH, Almeida BS, Kingsbury MA, Cabral KM, McConnell MJ, Anliker B, Fontanoz M, Chun J. Constitutional aneupioidy in the normal human brain. J Neurosci. 2005 Mar 2;25(9):2176-80.

24. Rehen SK, McConnell MJ, Kaushal D, Kingsbury MA, Yang AH, Chun J. Chromosomal variation in neurons of the developing and adult mammalian nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Nov 6;98(23):13361-6.

25. Kingsbury MA, Friedman B, McConnell MJ, Rehen SK, Yang AH, Kaushal D, Chun J. Aneuploid neurons are functionally active and integrated into brain circuitry. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Apr 26; 102(17):6143-7.

26. Melchiorri C, Chieco P, Zedda AI, Coni P, Ledda-Columbano GM, Columbano A. Ploidy and nuclearity of rat hepatocytes after compensatory regeneration or mitogen-induced liver growth. Carcinogenesis. 1993 Sep; 14(9):1825-30.

27. Замечательный рассказ о бурных спорах вокруг того, кто первым идентифицировал причину синдрома Дауна (эти споры не утихают и сейчас, полвека спустя): http://www.nature.com/news/down-s-syn-drome-discovery-dispute- resurfaces-in-france-1.14690.

28. Медицинские и социальные аспекты синдрома Дауна подробно обсуждаются во многих группах поддержки пациентов. См., напр.: http://www.downs-syndrome.org.uk.

29. http://www.nhs.uk/conditions/edwards-syndrome/Pages/Introduction.aspx.

30. http://www.cafamily.org.uk/medical-inforination/conditions/p/patau-syndrome.

31. Toner JP, Grainger DA, Frazier LM. Clinical outcomes among recipients of donated eggs: an analysis of the U. S. national experience, 1996-1998. Fertil Steril. 2002 Nov; 78(5):1038-45.

Глава 7

1. Statistical Bulletin from the Office for National Statistics, 8 August 2013 Annual Mid-year Population Estimates, 2011 and 2012.

2. Вероятно, впервые важная роль этого гена продемонстрировала в: Berta Р, Hawkins JR, Sinclair АН, Taylor A, Griffiths BL, Goodfellow PN, Fellous M. Genetic evidence equating SRY and the testis-determining factor. Nature. 1990 Nov 29;348(6300):448-50.

3. Yamauchi Y, Riel JM, Stoytcheva Z, Ward MA. Two Y genes can replace the entire Y chromosome for assisted reproduction in the mouse. Science. 2014 Jan 3;343(6166):69-72.

4. Ross MT et al., The DNA sequence of the human X chromosome. Nature. 2005 Mar 17;434(7031):325-37.

5. Brown CJ, Lafreniere RG, Powers VE, Sebastio G, Ballabio A, Pettigrew AL, Ledbetter DH, Levy E, Craig IW, Willard HF. Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in Xq13. Nature. 1991 Jan 3;349(6304):82-84.

6. Brown CJ, Ballabio A, Rupert JL, Lafreniere RG, Grompe M, Tonlorenzi R, Willard HF. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 1991 Jan 3;349(6304):38-44.

7. Brown CJ, Hendrich BD, Rupert JL, Lafrenière RG, Xing Y, Lawrence J, Willard HF. The human XIST gene: analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly localized within the nucleus. Cell. 1992 Oct 30;71(3):527-42.

8. Brockdorff N, Ashworth A, Kay GF, McCabe VM, Norris DP, Cooper PJ, SwiftS, Rastan S. The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus. Cell. 1992 Oct 30;71(3):515-26.

9. Lee JT, Strauss WM, Dausman JA, Jaenisch R. A 450 kb transgene displays properties of the mammalian X-inactivation center. Cell. 1996 Jul 12;86(1):83-94.

10. Всеобъемлющее описание данного процесса см. в: Lee JT. The X as model for RNA’s niche in epigenomic regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Sep; 2(9):a003749.

11. Xu N, Tsai CL, Lee JT. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 2006 Feb 24:311(5764):1149-52.

12. Удивительные подробности распространения гемофилии среди царствующих домов Европы см. в: http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=178&contentid=6.

13. Подробности об этом заболевании см. в: http://www.nhs.uk/con-ditions/Rett-syndrome/Pages/lntroduction.aspx.

14. Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 1999 Oct; 23(2):185-8.

15. Подробности об этом заболевании см. в: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000705.htm.

16. Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 1987 Dec 24;51(6):919-28.

17. Pena SD, Karpati G, Carpenter S, Fraser FC. The cllnicafconse^ quences of X'chromosome inactivation: Duchenne muscular dystrophy in one of monozygotic twins. J Neurol Scl. 1987 Jul; 79(3):337-44.

18. Shin T, Kraemer D, Pryor J, Liu L, Rugila J, Howe L, Buck S, Murphy K, Lyons L, Westhusin M. A cat cloned by nuclear transplantation. Nature. 2002 Feb 21;415(6874):859.

Глава 8

1. Schmitt AM, Chang H Y. Gene regulation: Long RNAs wire up cancer growth. Nature. 2013 Aug 29;500(7464):536-7.

2. Volders PJ, Helsens K, Wang X, Menten В, Martens L, Gevaert К, Vandesompele J, Mestdagh P. LNCipcdia: a database for annotated human long-noncoding RNA transcript sequences and structures. Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41(Database issue):D246-51.

3. ENCODE Project Consortium, Bernstein BE, Birney E, Dunham 1, Green ED, Gunter C, Snyder M. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74.

4. Tay Y, Rinn J, Pandolf PP. The multilayered complexity of ceRNA crosstalk and competition. Nature. 2014 Jan 16;505(7483):344-52.

5. Derrien T, Johnson R, Bussotti G, Tänzer A, Djebali S, Tilgner H, Guernec G, Martin D, Merkel A, Knowles DG, Lagarde J, Veeravalli L, Ruan X, Ruan Y, Lassmann T, Carninci P, Brown JB, Lipovich L, Gonzalez JM, Thomas M, Davis CA, Shiekhattar R, Gingeras TR, Hubbard TJ, Notredame C, Harrow J, Guigô R. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Res. 2012 Sep; 22(9): 1775-89.

6. Ulitsky I, Shkumatava A, Jan CH, Sive H, Bartel DP. Conserved function of HncRNAs in vertebrate embryonic development despite rapid sequence evolution. Cell. 2011 Dec 23;147(7): 1537-50.

7. Cabili MN, Trapnell C, Goff L, Koziol M, Tazon-Vega B, Regev A, Rinn JL. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 2011 Sep 15;25( 18): 1915-27.

8. Church DM, Goodstadt L, Hillier LW, Zody MC, Goldstein S, She X, Bult CJ, Agarwala R, Cherry JL, DiCuccio M, Hlavina W, Kapustin Y, Meric P, Maglott D, Birtle Z, Marques AC, Graves T, Zhou S, Teague B, Potamousis K, Churas C, Place M, Herschieb J, Runnheim R, Forrest D, Amos-Landgraf J, Schwartz DC, Cheng Z, Lindblad-Toh K, Eichler EE, Ponting CP. Mouse Genome Sequencing Consortium. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLoS Biol. 2009 May 5;7(5):el000112.

9. Necsulea A, Soumillon M, Warnefors M, Liechti A, Daish T, Zeller U, Baker JC, Grützner F, Kaessmann H. The evolution of long non-coding RNA repertoires and expression patterns in tetrapods. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):635-40.

10. Wahlestedt C. Targeting long non-coding RNA to therapeutically upregulate gene expression. Nat Rev Drug Dlscov. 2013 Jun; 12(6):433-46.

11. Mercer TR, Dinger ME, Sunkin SM, Mehler MF, Mattick JS. Specific expression of long noncoding RNAs in the mouse brain. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan 15;105(2):716-21.

12. Очень полезный обзор этого класса, объясняющий, какую роль он играет среди длинных некодирующих РНК, см. в: Ulitsky I, Bartel DP. lincRNAs: genomics, evolution, and mechanisms. Cell. 2013 Jul 3;154(1):26-46.

13. Guttman M, Donaghey J, Carey BW, Garber M, Grenier JK, Munson G, Young G, Lucas AB, Ach R, Bruhn L, Yang X, Amit I, Meissner A, Regev A, Rinn JL, Root DE, Lander ES. lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation. Nature. 2011 Aug 28;477(7364):295-300.

14. Wang КС, Yang YW, Liu B, Sanyal A, Corces-Zimmerman R, Chen Y, Lajoie BR, Protacio A, Flynn RA, Gupta RA, Wysocka J, Lei M, Dekker J, Helms JA, Chang HY. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature. 2011 Apr 7;472(7341): 120-4.

15. Li L, Liu B, Wapinski OL, Tsai MC, Qu K, Zhang J, Carlson JC, Lin M, Fang F, Gupta RA, Helms JA, Chang HY. Targeted disruption of Hotair leads to homeotic transformation and gene derepression. Cell Rep. 2013 Oct 17;5(1):3—12.

16. Du Z, Fei T, Verhaak RG, Su Z, Zhang Y, Brown M, Chen Y, Liu XS. Integrative genomic analyses reveal clinically relevant long noncoding RNAs in human cancer. Nat Struct Mol Biol. 2013 Jul; 20(7):908-13.

17. Полезный обзор этой области см. в: Cheetham SW, Gruhl F, Mattick JS, Dinger ME. Long noncoding RNAs and the genetics of cancer. Br J Cancer. 2013 Jun 25;108(12):2419-25.

18. Yap KL, Li S, Mufloz-Cabello AM, Raguz S, Zeng L, Mujtaba S, Gil J, Walsh MJ, Zhou MM. Molecular interplay of the noncoding RNA ANRIL and methylated histone H3 lysine 27 by polycomb CBX7 in transcriptional silencing of INK4a. Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):662-74.

19. Kotake Y, Nakagawa T, Kitagawa K, Suzuki S, Liu N, Kitagawa M, Xiong Y. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15 (INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 2011 Apr 21;30(16):1956-62.

20. Yang Z, Zhou L, Wu LM, Lai MC, Xie HY, Zhang F, Zheng SS. Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation. Ann Surg Oncol. 2011 May; 18(5):1243-50.

21. Ishibashi M, Kogo R. Shibata K, Sawada G. Takahashi Y, Kurashige J, Akiyoshi S, Sasaki S, Iwaya T, Sudo T, Sugimachi K. Mi mo r і K, Wakabayashi G, Mori M. Clinical significance of the expression of long non-coding RNA HOTAIR in primary hepatocellular carcinoma. Oncol Rep. 2013 Mar; 29(3):946-50.

22. Kim K, Jutooru I, Chadalapaka G, Johnson G, Frank J, Burghardt R, Kim S, Safe S. HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic activity in pancreatic cancer. Oncogene. 2013 Mar 8;32(13): 1616-25.

23. Gupta RA, Shah N, Wang КС, Kim J, Horlings HM, Wong DJ, Tsai MC, Hung T, Argani P, Rinn JL, Wang Y, Brzoska P, Kong B, Li R, West RB, van de Vijver MJ, Sukumar S, Chang HY. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 2010 Apr 15;464(7291): 1071-6.

24. Yang L, Lin C, Jin C, Yang JC, Tanasa B, Li W, Merkurjev D, Ohgi KA, Meng D, Zhang J, Evans CP, Rosenfeld MG. Long-noncoding RNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs. Nature. 2013 Aug 29;500(7464):598-602.

25. Prensner JR, Iyer MK, Sahu A, Asangani IA, Cao Q, Patel L, Vergara IA, Davicioni E, Erho N, Ghadessi M, Jenkins RB, Triche TJ, Malik R, Bedenis R, McGregor N, Ma T, Chen W, Han S, Jing X, Cao X, Wang X, Chandler B, Yan W, Siddiqui J, Kunju LP, Dhanasekaran SM, Pienta KJ, Feng FY, Chinnaiyan AM. The long noncoding RNA SChLAPl promotes aggressive prostate cancer and antagonizes the SWI/SNF complex. Nat Genet. 2013 Nov; 45 (11):1392-8.

26. Necsulea A, Soumillon M, Warnefors M, Liechti A, Daish T, Zeller U, Baker JC, Grützner F, Kaessmann H. The evolution of long-non-coding RNA repertoires and expression patterns in tetrapods. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):635-40.

27. Любопытные критические замечания на сей счет см. в: Fatica А, Bozzoni I. Long non-coding RNAs: new players in cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 2014 Jan; 15 (1):7—21.

28. Bernard D, Prasanth KV, Tripathi V, Colasse S, Nakamura T, Xuan Z, Zhang MQ, Sedel F, Jourdren L, Coulpier F, Triller A, Spector DL, Bessis A. A long nuclear-retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression. EMBO J. 2010 Sep 15;29(18):3082-93.

29. Pollard KS, Salama SR, Lambert N, Lambot MA, Coppens S, Pedersen JS, Katzman S, King B, Onodera C, Siepel A, Kern AD, Dehay C, Igel H, Ares M Jr, Vanderhaeghen P, Haussier D. An RNA gene expressed during cortical development evolved rapidly in humans. Nature. 2006 Sep 14;443(7108): 167-72.

30. http://www.who.int/mental_health/publications/dementia_report_2012/en.

31. Faghihi MA, Modarresi F, Khali) AM, Wood DE, Sahagan BG, Morgan ТЕ, Finch CE, St Laurent G 3rd, Kenny PJ, Wahlestedt C. Expression of a noncoding KNA is elevated in Alzheimer’s disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat Med. 2008 Jul; 14(7):723-30.

32. Modarresi F, Faghihi MA, Patel NS, Sahagan BG, Wahlestedt C, Lopez-Toledano MA. Knockdown of BACE1-AS Nonprotein-Coding Transcript Modulates Beta-Amyloid-Related Hippocampal Neurogenesis. Int. J. Alzheimers Die. 2011;2011:929042.

33. Zhao X, Tang Z, Zhang H, Atianjoh FE, Zhao JY, Liang L, Wang W, Guan X, Kao SC, Tiwari V, Gao YJ, Hoffman PN, Cui H, Li M, Dong X, Tao YX. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 2013 Aug; 16(8):1024-31.

34. Полезный обзор см., например, в: Wahlestedt С. Targeting long non-coding RNA to therapeutically upregulate gene expression. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun; 12(6):433-46.

35. Bird A. Genome biology; not drowning but waving. Cell. 2013 Aug 29;154(5):951-2.

Глава 9

1. Подробнее об этом см. в моей первой книге The Epigenetics Revolution.

2. Guttman M, Donaghey J, Carey BW, Garber M, Grenier JK, Munson G, Young G, Lucas AB, Ach R, Bruhn L, Yang X, Amit I, Meissner A, Regev A, Rinn JL, Root DE, Lander ES. lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation. Nature. 2011 Aug 28;477(7364):295-300.

3. Guil S, Soler M, Portela A, Carrère J, Fonalleras E, Gômez A, Villanueva A, Esteller M. Intronic RNAs mediate EZH2 regulation of epigenetic targets. Nat Struct Mol Biol. 2012 Jun 3;19(7):664-70.

4. Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M, Barrette TR, Kumar-Sinha C, Sanda MG, Ghosh D, Pienta KJ, Sewalt RG, Otte AP, Rubin MA, Chinnaiyan AM. The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature. 2002 Oct 10;419(6907):624-9.

5. Kleer CG, CaoQ, Varambally S, Shen R, Ota I, Tomlins SA, Ghosh D, Sewalt RG, Otte AP, Hayes DF, Sabel MS, Livant D, Weiss SJ, Rubin MA, Chinnaiyan AM. EZH2 is a marker of aggressive breast cancer and promotes neoplastic transformation of breast epithelial cells. Proc Natl Acad Set USA. 2003 Sep 30;100(20):11606-11.

6. Sneeringer CJ, Scott MP, Kuntz KW, Knutson SK, Pollock RM^-Richon VM, Copeland RA. Coordinated activities of wild type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human В-cell lymphomas. Proc Natl Acad Set USA. 2010 Dec 7;107 (49):20980-5.

7. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01897571?term=7438&rank=1.

8. Kotake Y, Nakagawa T, Kitagawa K, Suzuki S, Liu N, Kitagawa M, Xiong Y. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15 (INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 2011 Apr 21;30(16):1956-62.

9. Tsai MC, Manor 0, Wan Y, Mosammaparast N, Wang JK, Lan F, Shi Y, Segal E, Chang HY. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 2010 Aug 6;329(5992):689-93.

10. Недавно вышла программная статья на эту тему: Davidovich С, Zheng L, Goodrich KJ, Cech TR. Promiscuous RNA binding by Polycomb repressive complex 2. Nat Struct Mol Biol. 2013 Nov; 20(11):1250-7.

11. Статья, на которую дается ссылка выше, чуть более доступно изложена в: Goff LA, Rinn JL. Poly-combing the genome for RNA. Nat Struct Mol Biol. 2013 Dec; 20(12):1344-6.

12. Di Ruscio A, Ebralidze AK, Benoukraf T, Amabile G, Goff LA, Terragni J, Figueroa ME, De Figueiredo Pontes LL, Alberich-Jorda M, Zhang P, Wu M, D’Alô F, Melnick A, Leone G, Ebralidze KK, Pradhan S, Rinn JL, Tenen ЕЮ. DNMTl-interacting RNAs block gene-specific DNA méthylation. Nature. 2013 Nov 21;503(7476):371-6.

13. Обзор всех сложных стадий процесса см. в: Froberg JE, Yang L, Lee JT. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for long non-coding RNA function. J. Mol. Biol. 2013 Oct 9;425(19):3698-706.

14. Froberg JE, Yang L, Lee JT. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for long non-coding RNA function. J Mol Biol. 2013 Oct 9;425(19):3698-706.

15. Michaud EJ, van Vugt MJ, Bultman SJ, Sweet HO, Davisson MT, Woychik RP. Differential expression of a new dominant agouti allele (Aiapy) is correlated with méthylation state and is influenced by parental lineage. Genes Dev. 1994 Jun 15;8(12):1463-72.

Глава 10

1. Довольно современный обзор исследований в этой области, см. в: Surani МА, Barton SC, Norris ML. Experimental reconstruction of mouse eggs and embryos: an analysis of mammalian development. Biol Reprod. 1987 Feb; 36(1):1-16.

2. Онлайн-хранилище импринтированных ДНК-последовательностей мыши: http://www.mousebook.org/catalog.php?catalog=imprinting.

3. Полезный обзор см. в: Guenzl PM, Barlow DP. Macro long non-coding RNAs: a new layer of cis-regulatory information in the mammalian genome. RNA Biol. 2012 Jun; 9(6):731-41.

4. Недавний обзор, посвященный импринтингу у сумчатых: Graves JA, Renfree MB. Marsupials in the age of genomics. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2013;14:393-420.

5. Landers M, Bancescu DL, Le Meur E, Rougeulle C, Glatt-Deeley H, Brannan C, Muscatelli F, Lalande M. Regulation of the large (approximately 1000 kb) imprinted murine Ube3a antisense transcript by alternative exons upstream of Snurf/Snrpn. Nucleic Acids Res. 2004 Jun 29;32 (11):3480-92

6. Terranova R, Yokobayashi S, Stadler MB, Otte AP, van Lohuizen M, Orkin SH, Peters AH. Polycomb group proteins Ezh2 and Rnf2 direct genomic contraction and imprinted repression in early mouse embryos. Dev Cell. 2008 Nov; 15(5):668-79.

7. Wagschal A, Sutherland HG, Woodfine K, Henckel A, Chebli K, Schulz R, Oakey RJ, Bickmore WA, Feil R. G9a histone methyltransferase contributes to imprinting in the mouse placenta. Mol Cell Biol. 2008 Feb; 28(3):1104-13.

8. Nagano T, Mitchell JA, Sanz LA, Pauler FM, Ferguson-Smith AC, Feil R, Fraser P. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science. 2008 Dec 12;322(5908):1717-20.

9. Цит. no: Koerner MV, Pauler FM, Huang R, Barlow DP. The function of non-coding RNAs in genomic imprinting. Development. 2009 Jun; 136(11):1771—83.

10. Barlow DP. Methylationand imprinting: from host defense to gene regulation? Science. 1993 Apr 16;260(5106):309-10.

11. Цит. no: Skaar DA, Li Y, Bernal AJ, Hoyo C, Murphy SK, Jirtle RL. The human imprintome: regulatory mechanisms, methods of ascertainment, and roles in disease susceptibility. ILAR J. 2012 Dec; 53(3-4):341-58.

12. Описание действий этих белков в процессе метилирования материнской ОКИ см. в: Bourc’his D, Proudhon С. Sexual dimorphism in parental imprint ontogeny and contribution to embryonic development. Mol Cell Endocrinol. 2008 Jan 30;282(1-2):87-94.

13. Вот статья, продемонстрировавшая важную роль этого белка в поддержании материнского импринта: Hirasawa R, Chiba Н, Kaneda М, Tajima S. Li E, Jaenisch R, Sasaki H. Maternal and zygotic Dnmtl are necessary and sufficient for the maintenance of DNA methyl-ation imprints during preimplantation development. Genes Dev. 2008 Jun 15;22(12):1607-16.

14. Reinhart B, Paoloni-Giacobino A, Chaillet JR. Specific differentially methylated domain sequences direct the maintenance of méthylation at imprinted genes. Mol Cell Biol. 2006 Nov; 26(22):8347-56.

15. Skaar DA, Li Y, Bernal AJ, HoyoC, Murphy SK, Jirtle RL. The human imprintome: regulatory mechanisms, methods of ascertainment, and roles in disease susceptibility. ILAR J. 2012 Dec; 53(3-4):341-58.

16. Kawahara M, Wu Q, Takahashi N, Morita S, Yamada K, Ito M, Ferguson-Smith AC, Kono T. High-frequency generation of viable mice from engineered bi-maternal embryos. Nat Biotechnol. 2007 Sep; 25(9):1045-50.

17. Цит. no: Fatica A, Bozzoni I. Long non-coding RNAs: new players in cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 2014 Jan; 15(1):7-21.

18. Обзор данного аспекта проблемы см. в: Frost JM, Moore GE. The importance of imprinting in the human placenta. PLoS Genet. 2010 Jul 1;6(7):el001015.

19. Полное описание см. в: http://omim.org/entry/176270.

20. Полное описание см. в: http://omim.org/entry/105830.

21. de Smith AJ, Purmann C, Walters RG, Ellis RJ, Holder SE, Van Haclst MM, Brady AF, Fairbrother UL, Dattani M, Keogh JM, Henning E, Yeo GS, O’Rahilly S, Froguel P, Farooqi 1S, Blakemore AI. A deletion of the HBII-85 class of small nucleolar RNAs (snoRNAs) is associated with hyperphagia, obesity and hypogonadism. Hum Mol Genet. 2009 Sep 1;18(17):3257-65.

22. Duker AL, Ballif BC, Bawle EY, Person RE, Mahadevan S, Alliman S, Thompson R, Traylor R, Bejjani BA, Shaffer LG, Rosenfeld JA, Lamb AN, SahooT. Paternally inherited microdeletion at 15qll.2 confirms a significant role for the SNORD116 C/D box snoRNA cluster in Prader-Willi syndrome. EurJ Hum Genet. 2010 Nov; 18 (11):1196-201.

23. Sahoo T, del Gaudio D, German JR, Shinawi M, Peters SU, Person RE, Garnica A, Cheung SW, Beaudet AL. Prader-Willi phenotype caused by paternal deficiency for the HBII-85 C/D box small nucleolar RNA cluster. Nat Genet. 2008 Jun; 40(6):719-21.

24. Полное описание см. в: http://omim.org/entry/180860.

25. Полное описание см. в: http://omim.org/entry/130650.

26. Данные собраны в: Kotzot D. Maternal uniparental disomy 14 dissection of the phenotype with respect to rare autosomal recessively inherited traits, trisomy mosaicism, and genomic imprinting. Ann Genet. 2004 Jul-Sep; 47(3):251-60.

27. Kagami M, Sekita Y, Nishimura G, Irie M, Kato F, Okada M, Yamamori S, Kishimoto H, Nakayama M, Tanaka Y, Matsuoka K, Takahashi T, Noguchi M, Tanaka Y, Masumoto K, Utsunomiya T, Kouzan H, Komatsu Y, Ohashi H, Kurosawa K, Kosaki K, Ferguson-Smith AC, Ishino F, Ogata T. Deletions and epimutations affecting the human 14q32.2 imprinted region in individuals with paternal and maternal upd(14)-like phenotypes. Nat Genet. 2008 Feb; 40(2):237-242.

28. Подробный обзор, посвященный наследованию и клиническим особенностям различных заболеваний человека, связанных с импринтингом: Ishida М, Moore GE. The role of imprinted genes in humans. Mol. Aspects Med. 2013 Jul-Aug; 34(4):826-840.

29. Пресс-релиз Американского общества репродуктивной медицины от 14 октября 2013: http;//www.asrm.org/Five_Million_Babies Born with_Help_of_Assisted_Reproductive_Technologies.

30. Это довольно подробно обсуждается в: Ishida М, Moore GE. The role of imprinted genes in humans. Mol Aspects Med. 2013 Jul — Aug; 34(4):826-40.

Глава 11

1. Цит. no: Moss T, Langlois F, Gagnon-Kugler T, Stefanovsky V. A housekeeper with power of attorney: the rRNA genes in ribosome biogenesis. Cell Mol LifeSci. 2007 Jan; 64(1):29-49.

2. Что касается более подробных сведений о рибосомах и рРНК, то проще всего сослаться на хороший учебник молекулярной биологии. Например, на: Molecular Biology of the Cell, 5th Edition, авторы: Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts и Walter, 2012.

3. http://www.nobelprize.org/educational/medicine/dna/a/translation/trna.html.

4. http://www.bscb.org/?url=softcell/ribo.

5. Цит. no: Zentner GE, Saiakhova A, Manaenkov P, Adams MD, Scacheri PC. Integrative genomic analysis of human ribosomal DNA. Nucleic Acids Res. 2011 Jul; 39(12):4949-60.

6. Интересный, хотя и несколько провокативный обзор, посвященный заболеваниям, вызванным дефектам рибосомных белков: Narla А, Ebert BL. Ribosomopathies: human disorders of ribosome dysfunction. Blood. 2010 Apr 22;115(16):3196-205.

7. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001 Feb 15; 409(6822):860-921.

8. См., напр.: Hedges SB, Blair JE, Venturi ML, Shoe JL. A molecular timescale of eukaryote evolution and the rise of complex multicellular life. BMC Evol Biol. 2004 Jan 28;4:2.

9. Цит. no: Wilson DN. Ribosome-targeting antibiotics and mechanisms of bacterial resistance. Nat Rev Microbiol. 2014 Jan; 12(1):35—48.

10. http://www.genenames.org/rna/TRNA#MTTRNA.

11. Если хотите узнать об этом побольше, можете снова обратиться к упомянутому выше хорошему учебнику по молекулярной биологии: Molecular Biology of the Cell, 5th Edition, авторы: Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts и Walter, 2012.

12. McFarland R, Schaefer AM, Gardner JL, Lynn S, Hayes CM, Barron MJ, Walker M, Chinnery PF, Taylor RW, Turnbull DM. Familial myopathy: new insights into the T14709C mitochondrial tRNA mutation. Ann Neurol. 2004 Apr; 55 (4):478-84.

13. Zheng J, Ji Y, Guan MX. Mitochondrial tRNA mutations associated with deafness. Mitochondrion. 2012 May; 12 (3):406-13.

14. Qiu Q, Li R, Jiang P, Xue L, Lu Y, Song Y, Han J, Lu Z, Zhi S, Mo JQ, Guan MX. Mitochondrial tRNA mutations are associated with maternally inherited hypertension in two Han Chinese pedigrees. Hum Mutât. 2012 Aug; 33(8):1285-93.

15. Giordano C, Perli E, Orlandi M, Pisano A, Tuppen HA, He L, lerinô R, Petruzziello L, Terzi A, Au tore C, Petrozza V, Gallo P, Taylor RW, d’Amati G. Cardiomyopathies due to homoplasmic mitochondrial tRNA mutations: morphologic and molecular features. Hum Pathol. 2013 Jul; 44(7); 1262—70.

16. Lincoln TA, Joyce GF. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 2009 Feb 27;323(5918):1229-32.

17. Sczepanski JT, Joyce GF. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. Опубликовано онлайн 29 октября 2014.

Глава 12

1. Обзор, посвященный роли Мус и важному значению хромосомных реаранжировок, см. в: Ott G, Rosenwald A, Campo Е. Understanding MYC-driven aggressive В-cell lymphomas: pathogenesis and classification. Blood. 2013 Dec 5;122(24):3884-91.

2. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/001308.htm.

3. Whyte WA, Orlando DA, Hnisz D, Abraham BJ, Lin CY, Kagey MH, Rahl PB, Lee Tl, Young RA. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 2013 Apr 11;153(2):307-19.

4. Ostuni R, Piccolo V, Barozzi 1, PollettiS, Termanini A, BonifacioS, Curina A, Prospering E, Ghisletti S, Natoli G. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 2013 Jan 17; 152(1-2): 157-71.

5. Akhtar-Zaidi B, Cowper-Sal-lari R, Corradin O, Saiakhova A, Bartels CF, Baiasubramanian D, Myeroff L, Lutterbaugh J, Jarrar A, Kalady MF, Willis J, Moore JH, Tesar PJ, Laframboise T, Markowitz S, Lupien M, Scacheri PC. Epigenomic enhancer profiling defines a signature of colon cancer. Science. 2012 May 11;336(6082):736-9.

6. ENCODE Project Consortium, Bernstein BE, Birney E, Dunham I, Green ED, Gunter C, Snyder M. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74.

7. Описание этих типов длинных некоднрующих РНК см. в: Ørom UA, Shiekhattar R. Long noncoding RNAs usher in a new era in the biology of enhancers. Cell. 2013 Sep 12; 154(6): 1190—3.

8. Ørom UA, Derrien T, Beringer M, Gumireddy K, Gardini A, Bussotti G, Lai F, Zytnicki M, Notredame C, Huang Q, Guigo R, Shiekhattar R. Long noncoding RNAs with enhancer-like function in human cells. Cell. 2010 Oct 1;143(1):46-58.

9. De Santa F, Barozzi 1, Mietton F, Ghisletti S, Polletti S, Tusi BK, Muller H, Ragoussis J, Wei CL, Natoli G. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 2010 May 11;8(5):e1000384.

10. Hah N, Murakami S, Nagari A, Danko CG, Kraus WL. Enhancer transcripts mark active estrogen receptor binding sites. Genome Res. 2013 Aug; 23(8):1210-23.

11. Lai F, Ørom UA, Cesaroni M, Beringer M, Taatjes DJ, Blobel GA, Shiekhattar R. Activating RNAs associate with Mediator to enhance chromatin architecture and transcription. Nature. 2013 Feb 28;494(7438):497-501.

12. Risheg H, Graham JM Jr, Clark RD, Rogers RC, Opitz JM, Moeschler JB, Peiffer AP, May M, Joseph SM, Jones JR, Stevenson RE, Schwartz CE, Friez MJ. A recurrent mutation in MED12 leading to R961W causes Opitz-Kaveggia syndrome. Nat Genet. 2007 Apr; 39(4):451-3.

13. Роль суперэнхансеров в плюрипотентных клетках впервые выявлена в: Whyte WA, Orlando DA, Hnisz D, Abraham BJ, Lin CY, Kagey MH, Rahl PB, Lee TI, Young RA. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity. Cell. 2013 Apr 11;153(2):307-19.

14. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-676.

15. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2012.

16. Lovén J, Hoke HA, Lin CY, Lau A, Orlando DA, Vakoc CR, Bradner JE, Lee TI, Young RA. Selective inhibition of tumor oncogenes by disruption of super-enhancers. Celt. 2013 Apr 11 ; 153(2):320—34.

17. Обзор различных молекулярных причин см. в: Skibbens RV, Colquhoun JM, Green MJ, Molnar CA, Sin DN, Sullivan BJ, Tanzosh EE. Cohesinopathies of a feather flock together. PLoS Genet. 2013 Dec; 9(12):e1004036.

18. http://www.cdls.org.uk/information-centre.

19. Sanyal A, Lajoie BR. Jain G, Dekker J. The long-range interactionj-landscapeof gene promoters. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):109-13.

20. Jackson DA, Hassan AB, Errington RJ, Cook PR. Visualization of focal sites of transcription within human nuclei. EMBO J. 1993 Mar; 12(3):1059-65.

21. Отличный обзор на эту тему: Rieder D, Trajanoski Z, McNally JG. Transcription factories. Front Genet. 2012 Oct 23;3:221. doi: 10.3389/fgene.2012.00221.eCollection 2012.

22. Iborra FJ, Pombo A, Jackson DA, Cook PR. Active RNA polymerases are localized within discrete transcription «factories» in human nuclei. J Cell Set. 1996 Jun; 109(Pt 6):1427-36.

23. Jackson DA, Iborra FJ, Manders EM, Cook PR. Numbers and organization of RNA polymerases, nascent transcripts, and transcription units in HeLa nuclei. Mol Biol Cell. 1998 Jun; 9 (6):1523-36

24. Papantonis A, Larkin JD, Wada Y, Ohta Y, Ihara S, Kodama T, Cook PR. Active RNA polymerases: mobile or immobile molecular machines? PLoS Biol. 2010 Jul 13;8(7):e1000419.

25. Osborne CS, Chakalova L, Brown KE, Carter D, Horton A, Debrand E, Goyenechea B, Mitchell JA, Lopes S, Reik W, Fraser P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat Genet. 2004 Oct; 36(10):1065-71.

26. Osborne CS, Chakalova L, Mitchell JA, Horton A, Wood AL, Bolland DJ, Corcoran AE, Fraser P. Мус dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 2007 Aug; 5(8):e192.

Глава 13

1. Установить, кто впервые использовал это описание, трудно. См. обсуждение этого вопроса: http://engiish.stackexchange.com/questions/ 103851/where-does-the-phrase-of-boredom-punctuated-by-moments-of-terror-come-from.

2. Обзор на эту тему: Molto Е, Fernandez A, Montoliu L. Boundaries in vertebrate genomes: different solutions to adequately insulate gene expression domains. Brief Fund Genomic Proteomic. 2009 Jul; 8(4):283-96.

3. Ishihara K, Oshimura M, Nakao M. CTCF-dependent chromatin insulator is linked to epigenetic remodeling. Mol Celt. 2006 Sep 1;23(5):733-42.

4. Lutz M, Burke LJ, Barreto G, Goeman F, Greb H, Arnold R, Schultheiss H, Brehm A, Kouzarides T, Lobanenkov V, Renkawitz R. Transcriptional repression by the insulator protein CTCF involves histone deacetylases. Nucleic Acids Res. 2000 Apr 15;28(8):1707-13.

5. Lunyak W, Prefontaine GG, Nuftez E, Cramer T, Ju BG, Ohgi KAr|-Hutt K, Roy R, Garria-Dfaz A, Zhu X, Yung Y, Montoliu L, Glass CK, Rosenfeld MG. Developmentally regulated activation of a SINE B2 repeat as a domain boundary in organogenesis. Science. 2007 Jul 13;317(5835):248-51.

6. Цит. no: Kirkland JG, Raab JR, Kamakaka RT. TFIIIC bound DNA elements in nuclear organization and insulation. Biochim Biophys Acta. 2013 Mar—Apr; 1829(3-4):418-24.

7. Так называемый синдром Тёрнера. Подробнее см. в: http://www. nhs.uk/Conditions/Turners-syndrome/Pages/Introduction.aspx.

8. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/triple-x-syn-drome.

9. Так называемый синдром Клайнфельтера. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/klinefelter-syndrome.

10. Star Trek: First Contact [«Звездный путь. Первый контакт«] (1996). Несомненно, лучший фильм из всего цикла — во всяком случае, до того, как Дж.Дж. Адамс взялся за перезагрузку проекта.

11. См. https://ghr.nlm.nih.gov/gene/SHOX.

12. Hemani G, Yang J, Vinkhuyzen A, Powell JE, Willemsen G, Hottenga JJ, Abdellaoui A, Mangino M, Valdes AM, Medland SE, Madden PA, Heath AC, Henders AK, Nyholt DR, deGeusEJ, Magnusson PK, Ingelsson E, Montgomery GW, Spector TD, Boomsma DI, Pedersen NL, Martin NG, Visscher PM. Inference of the genetic architecture underlying BMI and height with the use of 20,240 sibling pairs. Am J Hum Genet. 2013 Nov 7;93(5):865-875.

Глава 14

1. Массу информации о проекте ENCODE, в том числе ряд интервью с некоторыми из его ведущих специалистов, см. в: http://www.nature.com/encode.

2. http://www.theguardian.com/science/2012/sep/05/genes-genome-junk-dna-encode.

3. http://edition.cnn.com/2012/09/05/health/encode-human-genome/index. html?hpt-hp_bn 12.

4. http://www.telegraph.co.uk/science/science-news/9524165/Worldwide-army-of-scientists-cracks-the-junk-DNA-code.html.

5. ENCODE Project Consortium, Bernstein BE, Birney E, Dunham I, Green ED, Gunter C, Snyder M. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74.

6. Mattick JS. A new paradigm for developmental biology. J Exp Biol. 2007 May; 210(Pt 9):1526-47.

7. Sanyal A, Lajoie BR, Jain G, Dekker J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):109-13.

8. Thurman RE, Rynes E, Humbert R, Vierstra J, Maurano MTif-Haugen E, Sheffield NC, Stergachis AB, Wang H, Vernot B, Garg K, John S, Sandstrom R, Bates D, Boatman L, Canfield TK, Diegel M, Dunn D, Ebersol AK, Frum T, Giste E, Johnson AK, Johnson EM, Kutyavin T, Lajoie В, Lee BK, Lee К, London D, Lotakis D, Neph S, Neri F, Nguyen ED, Qu H, Reynolds AP, Roach V, Saf A, Sanchez ME, Sanyal A, Shafer A, Simon JM, Song L, VongS, Weaver M, Yan Y, Zhang Z, Zhang Z, Lenhard B, Tewari M, Dorschner MO, Hansen RS, Navas PA, Stamatoyannopoulos G, Iyer VR, Lieb JD, Sunyaev SR, Akey JM, Sabo PJ, Kaul R, Furey TS, Dekker J, Crawford GE, Stamatoyannopoulos JA. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):75-82.

9. Djebali S, Davis CA, Merkel A, Dobin A, Lassmann T, Mortazavi A, Tänzer A, Lagarde J, Lin W, Schlesinger F, Xue C, Marinov GK, Khatiin J, Williams BA, Zaleski C, Rozowsky J, Röder M, Kokocinski F, Abdelhamid RF, Alioto T, Antoshechkin I, Baer MT, Bar NS, Batut P, Bell K, Bell I, Chakrabortty S, Chen X, Chrast J, Curado J, Derrien T, Drenkow J, Dumais E, Dumais J, Duttagupta R, Falconnet E, Fastuca M, Fejes-Toth K, Ferreira P, Foissac S, Fullwood MJ, Gao H, Gonzalez D, Gordon A, Gunawardena H, Howald C, Jha S, Johnson R, Kapranov P, King B, Kingswood C, Luo OJ, Park E, Persaud K, Preall JB, Ribeca P, Risk B, Robyr D, Sammeth M, Schaffer L, See LH, Shahab A, Skancke J, Suzuki AM, Takahashi H, Tilgner H, Trout D, Walters N, Wang H, Wrobel J, Yu Y, Ruan X, Hayashizaki Y, Harrow J, Gerstein M, Hubbard T, Reymond A, Antonarakis SE, Hannon G, Giddings MC, Ruan Y, Wold B, Carninci P, Guigô R, Gingeras TR. Landscape of transcription in human cells. Nature. 2012 Sep 6:489(7414): 101-8.

10. Впервые я употребила это описание в своем посте на Huffington Post, рассуждая о проекте ENCODE. Оно мне настолько понравилось, что я решила использовать его и здесь. Вот ссылка на блог: http://www. huffingtonpost.com/nessa-carey/the-value-of-encode_b_1909153.html.

11. Хороший пример такой фотографии: http://blog.art21.org/ 2009/03/06/on-representations-of-the-artist-at-work-part-2/#.UyDZjZZFDIU.

12. Ward LD, Kellis M. Evidence of abundant purifying selection in humans for recently acquired regulatory functions. Science. 2012 Sep 28:337(6102): 1675-8.

13. Ecker JR, Bickmore WA, Barroso I, Pritchard JK, Gilad Y, Segal E. Genomics: ENCODE explained. Nature. 2012 Sep 6;489(7414).

14. Потрясающий пример межпоколенческого эпигенетического наследования с передачей реакции страха от родителя к детенышам изложен в: Dias BG, Ressler KJ. Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations. Nat Neurosci. 2014 Jan; 17(1):89—96.

15. Graur D, Zheng Y, Price N, Azevedo KB, Zufall RA, Elhaik E. On the immortality of television sets: «function» in the human genome according to the evolution-free gospel of ENCODE. Genome Biol Evol. 2013;5(3):578-90.

Глава 15

1. http://womenshistory.about.eom/od/mythsofwomenshistory/a/ Did-Anne-Boleyn-Really-Have-Six-Fingers-On-One-Hand.htm.

2. Lettice LA, Heaney SJ, Purdie LA, Li L, de Beer P, Oostra BA, Goode D, Elgar G, Hill RE, de Graaff E. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Hum Mol Genet. 2003 Jul 15;12(14): 1725-35.

3. www.hemingwayhome.com/cats.

4. Lettice LA, Hill AE, Devenney PS, Hill RE. Point mutations in a distant sonic hedgehog cis-regulator generate a variable regulatory output responsible for preaxial polydactyly. Hum Mol Genet. 2008 Apr 1;17(7):978-85.

5. Подробнее см. в: http://www.genome.gov/12512735.

6. Jeong Y, Leskow PC, El-Jaick K, Roessler E, Muenke M, Yocum A, Du bourg C, Li X, Geng X, Oliver G, Epstein DJ. Regulation of a remote Shh forebrain enhancer by the Six3 homeoprotein. Nat Genet. 2008 Nov; 40(ll):1348-53.

7. Подробнее см. в: http://rarediseases.info.nih.gov/gard/10874/pancreatic-agenesis/resources/1.

8. Lan go Allen H, Flanagan SE, Shaw-Smith C, De Franco E, Akerman I, Caswell R; International Pancreatic Agenesis Consortium, Ferrer J, Hattersley AT, Ellard S. GATA6 haploinsufficiency causes pancreatic agenesis in humans. Nat Genet. 2011 Dec 11;44(1):20-2.

9. SellickGS, BarkerKT,Stolte-DijkstraI,FleischmannC,Coleman RJ, Garrett C, Gloyn AL, Edghill EL, Hattersley AT, Wellauer PK, Goodwin G, Houlston RS. Mutations in PTF1A cause pancreatic and cerebellar agenesis. Nat Genet. 2004 Dec; 36(12):1301-5.

10. Weedon MN, Cebola I, Patch AM, Flanagan SE, De Franco E, Caswell R, Rodriguez-Segui SA, Shaw-Smith C, Cho CH, Lango Allen H, Houghton JA, Roth CL, Chen R, Hussain K, Marsh P, Vallier L, Murray A; International Pancreatic Agenesis Consortium, Ellard S, Ferrer J, Hattersley AT. Recessive mutations in a distal PTF1A enhancer cause isolated pancreatic agenesis. Nat Genet. 2014 Jan; 46(1):61 —4.

11. Обзор на эту тему: Sturm RA. Molecular genetics of human pigmentation diversity. Hum Mol Genet. 2009 Apr 15;18(R1):R9-17.

12. Durham-Pierre D, Gardner JM, Nakatsu Y, King RA, Francke U, Ching A, Aquaron R, del Marmol V, Brilliant MH. African origin of an intragenic deletion of the human P gene in tyrosinase positive oculoeutane^-ous albinism. Nat Genet. 1994 Jun; 7(2): 176—9.

13. Visser M, Kayser M, Palstra RJ. HERC2 rsl2913832 modulates human pigmentation by attenuating chromatin-loop formation between a long-range enhancer and the OCA2 promoter. Genome Res. 2012 Mar; 22(3):446 455.

14. Наиболее современный каталог см. в: www.genome.gov/gwas-tudies.

15. Hindorff LA, Sethupathy P, Junkins HA, Ramos EM, Mehta JP, Collins FS, Manolio TA. Potential étiologie and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Set USA. 2009 Jun 9;106(23):9362-7.

16. Gorkin DU, Ren B. Genetics: Closing the distance on obesity culprits. Nature. 2014 Mar 20;507(7492):309-10.

17. Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, Zeggini E, Freathy RM, Lindgren CM, Perry JR, Elliott KS, Lango H, Rayner NW, Shields B, Harries LW, Barrett JC, Ellard S, Groves CJ, Knight B, Patch AM, NessAR, Ebrahim S, Lawlor DA, Ring SM, Ben-Shlomo Y, Jarvelin MR, Sovio U, Bennett AJ, Melzer D, Ferrucci L, Loos RJ, Barroso I, Wareham NJ, Karpe F, Owen KR, Cardon LR, Walker M, Hitman GA, Palmer CN, Doney AS, Morris AD, Smith GD, Hattersley AT, McCarthy MI. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity. Science. 2007 May 11;316(5826):889-94.

18. Scuteri A, Sanna S, Chen WM, Uda M, Albai G, Strait J, Najjar S, Nagaraja R, Orrü M, UsalaG, Dei M, LaiS, Maschio A, BusoneroF, Mulas A, Ehret GB, Fink AA, Weder AB, Cooper RS, Galan P, Chakravarti A, Schlessinger D, Cao A, Lakatta E, Abecasis GR. Genome-wide association scan shows genetic variants in the FTO gene are associated with obesity-related traits. PLoSGenet. 2007 Jul; 3(7):e115.

19. Church C, Moir L, McMurray F, Girard C, Banks GT, Teboul L, Wells S, Brüning JC, Nolan PM, Ashcroft FM, Cox RD. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nat Genet. 2010 Dec; 42(12):1086 92.

20. Fischer J, Koch L, Emmerling C, Vierkotten J, Peters T, Brüning JC, Rüther U. Inactivation of the Fto gene protects from obesity. Nature. 2009 Apr 16;458 (7240):894-8.

21. Smemo S, Tena JJ, Kim KH, Gamazon ER, Sakabe NJ, Gômez-Marin C, Aneas I, Credidio FL, Sobreira DR, Wasserman NF, Lee JH, Puviindran V, Tam D, Shen M, Son JE, Vakili NA, Sung HK, Naranjo S, Acemel RD, Manzanares M, Nagy A, Cox NJ, Hui CC, Gomez-Skarmeta JL, Nôbrega MA. Obesity-associated variants within FTO form long-range functional connections with IRX3. Nature. 2014 Mar 20;507( 7492):371-5.

22. Недавний обзор работ в этой сфере: Trent RJ, Cheong PL, Chua EW, Kennedy MA. Progressing the utilisation of pharmacogenetics and pharma-cogenomics into clinical care. Pathology. 2013 Jun; 45(4):357-70.

23. http://www.nhs.uk/Conditions/Herceptin/Pages/Introduction.aspx.

24. http://www.nature.com/scitable/topicpage/gleevec-the-break-through-in-cancer-treatment-565.

25. http://www.cancer.gov/cancertopics/druginfo/fda-crizotinib.

Глава 16

1. Примеры таких случаев можно найти в: http://medicalmisdiagnosisresearch.wordpress.com/category/osteogeiiesis-imperfecta-misdiag-nosed-as-child-abuse.

2. Хорошее описание симптомов и генетики этого заболевания см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/osteogenesis-imperfecta.

3. Cho TJ, Lee KE, Lee SK, Song SJ, Kim KJ, Jeon D, Lee G, Kim HN, Lee HR, Eom HH, Lee ZH, Kim OH, Park WY, Park SS, Ikegawa S, Yoo WJ, Choi IH, Kim JW. A single recurrent mutation in the 5'-UTR of 1FITM5 causes osteogenesis imperfecta type V. Am J Hum Genet. 2012 Aug 10;91(2):343-8.

4. Semler O, Garbes L, Keupp K, Swan D, Zimmermann K, Becker J, Iden S, Wirth B, Eysel P, Koerber F, Schoenau E, BohlanderSK, Wollnik B, Netzer C. A mutation in the 5'-UTR of IFITM5 creates an in-frame start codon and causes autosomal-dominant osteogenesis imperfecta type V with hyperplastic callus. Am J Hum Genet. 2012 Aug 10;91(2):349-57.

5. Moffatt P, Gaumond MH, Salois P, Sellin К, Bessette MC, Godin E, de Oliveira PT, Atkins GJ, Nanci A, Thomas G. Bril: a novel bone-specific modulator of mineralization.«/ Bone Miner Res. 2008 Sep: 23(9): 1497-508.

6. Liu L, Dilworth D, Gao L, Monzon J, Summers A, Lassam N, Hogg D. Mutation of the CDKN2A 5' UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet. 1999 Jan; 21(1):128-32.

7. Tietze JK, Pfob M, Eggert M, von Preußen A, Mehraein Y, Ruzicka T, Herzinger T. A non-coding mutation in the 5' untranslated region of patched homologue 1 predisposes to basal cell carcinoma. Exp Dermatol. 2013 Dec; 22(12):834-5.

8. Полное описание см. в: http://omim.org/entry/309550.

9. Ashley CT Jr, Wilkinson KD, Reines D, Warren ST. FMR1 protein: conserved RNP family domains and selective RNA binding. Science. 1993 Oct 22;262(5133):563-6.

10. Qin M, Kang J, Burlin TV, Jiang C, Smith CB. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. J Neurosci. 2005 May 18;25(20):5087-95.

11. Azevedo FA, Carvalho LR, Grinberg LT, Farfel JM, Ferretti RE, Leite RE, Jacob Filho W, Lent R, Herculano-Houzel S. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J Comp Neurol. 2009 Apr 10;513(5):532-41.

12. Drachman DA. Do we have brain to spare? Neurology. 2005 Jun 28;64(12):2004-5.

13. Darnell JC, Van DriescheSJ, ZhangC, Hung KY, Mele A, FraserCE, Stone EF, Chen C, Fak JJ, Chi SW, Licatalosi DD, Richter JD, Darnell RB. FMRP stalls ribosomal translocation on messenger RNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 2011 Jul 22;146 (2):247-61.

14. Udagawa T, Farny NG, Jakovcevski M, Kaphzan H, Alarcon JM, Anilkumar S, Ivshina M, Hurt JA, Nagaoka K, Nalavadi VC, Lorenz LJ, Bassell GJ, Akbarian S, Chattarji S, Klann E, Richter JD. Genetic and acute CPEB1 depletion ameliorate fragile X pathophysiology. Nat Med. 2013 Nov; 19(11):1473-7.

15. Кратко изложено в: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165.

16. Jiang H, Mankodi A, Swanson MS, Moxley RT, Thornton CA. Myotonic dystrophy type 1 is associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins and deregulated alternative splicing in neurons. Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3079-88.

17. Savkur RS, Philips AV, Cooper ТА. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 2001 Sep; 29(1):40-7.

18. HoTH, Charlet-BN, Poulos MG, Singh G, Swanson MS, Cooper ТА. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 2004 Aug 4;23(15):3103-12.

19. Kino Y, Washizu C, Oma Y, Onishi H, Nezu Y, Sasagawa N, Nukina N, Ishiura S. MBNL and CELF proteins regulate alternative splicing of the skeletal muscle chloride channel CLCN1. Nucleic Acids Res. 2009 Oct; 37(19):6477-90.

20. Hanson EL, Jakobs PM, Keegan H,Coates K, BousmanS, Dienel NH, Litt M, Hershberger RE. Cardiac troponin T lysine 210 deletion in a family with dilated cardiomyopathy. J Card Fail. 2002 Feb; 8(1):28-32.

21. Цит. no: Michalova E, Vojtesek B, Hrstka R. Impaired pre-messenger RNA processing and altered architecture of 3' untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int J Mol Sci. 2013 Jul 26; 14(8): 15681-94.

22. Полное описание синдрома см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/ condition / immune-dysregulation-polyendocrinopathy-enteropa-thy-x-linked-syndrome.

23. Bennett CL, Brunkow ME, Ramsdell F, O’Briant КС, Zhu Q, Fuleihan RL, Shigeoka AO, Ochs HD, Chance PF. A rare polyadenylation signal mutation of the FOXP3 gene (AAUAAA-»AAUGAA) leads to the IPEX syndrome. Immunogenetics. 2001 Aug; 53(6):435-9.

24. Подробнее см. в: http://www.alsa.org.

25. Базу данных генов, которые, как полагают, играют какую-то роль в развитии БАС, можно найти здесь: http://alsod.iop.kcl.ac.uk.

26. Kwiatkowski TJ Jr, Bosco DA, Leclerc AL, Tamrazian E, Vanderburg CR, Russ C, Davis A, Gilchrist J, Kasarskis EJ, Munsat T, Valdmanis P, Rouleau GA, Hosier BA, Cortelli P, de Jong PJ, Yoshinaga Y, Haines JL, Pericak-Vance MA, Yan J, Ticozzi N, Siddique T, McKenna-Yasek D, Sapp PC, Horvitz HR, Landers JE, Brown RH Jr. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophie lateral sclerosis. Science. 2009 Feb 27;323(5918):1205-8.

27. Vance C, Rogelj B, Hortobâgyi T, De Vos KJ, Nishimura AL, Sreedharan J, Hu X, Smith B, Ruddy D, Wright P, Ganesalingam J, Williams KL, Tripathi V, Al-Saraj S, Al-Chalabi A, Leigh PN, Blair IP, Nicholson G, de Belleroche J, Gallo JM, Miller CC, Shaw CE. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophie lateral sclerosis type 6. Science. 2009 Feb27;323 (5918):1208-11.

28. Lai SL, Abramzon Y, Schymick JC, Stephan DA, Dunckley T, Dillman A, Cookson M, Calvo A, Battistini S, Giannini F, Caponnetto C, Mancardi GL, Spataro R, Monsurro MR, Tedeschi G, Marinou K, Sabatelli M, Conte A, Mandrioli J, Sola P, Salvi F, Bartolomei I, Lombardo F; ITALSGEN Consortium, Mora G, Restagno G, Chiô A, Traynor BJ. FUS mutations in sporadic amyotrophie lateral sclerosis. Neurobiol Aging. 2011 Mar; 32(3):550.el-4.

29. Sabatelli M, Moncada A, Conte A, battante S, Marangi G, Luigetti M, Lucchini M, Mirabelle M, Romano A, Del Grande A, Bisogni G, Doronzio PN, Rossini PM, Zollino M. Mutations in the 3' untranslated region of FUS causing FUS overexpression are associated with amyotrophic lateral sclerosis. Hum Moi Genet. 2013 Dec 1;22(23):4748-55.

Глава 17

1. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. Genomewide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 2003 Dec 19;302(5653):2141-4.

2. Цит. no: Keren H, Lev-Maor G, Ast G. Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function. Nat Rev Genet. 2010 May; 11(5):345-55.

3. Эти стадии очень четко описаны в ряде обзоров. Напр.: WangGS, Cooper ТА. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 2007 Oct; 8(10):749-61.

4. Подробнее о сплайсосоме см., напр., в: Padgett RA. New connections between splicing and human disease. Trends Genet. 2012 Apr; 28(4):147-54.

5. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/retinitis-pigmentosa.

6. Vithana EN, Abu-Safeh L, Allen MJ, Carey A, Papaioannou M, Chakarova C, Al-Maghtheh M, Ebenezer ND, Willis C, Moore AT, Bird AC, Hunt DM, Bhattacharya SS. A human homolog of yeast pre-mRNA splicing gene, PRP31, underlies autosomal dominant retinitis pigmentosa on chromosome 19ql3.4(RPll). Mol Cell. 2001 Aug; 8<2):375-81.

7. McKie AB, McHale JC, Keen TJ, Tarttelin EE, Goliath R, van Lith-Verhoeven JJ, Greenberg J, Ramesar RS, Hoyng CB, Cremers FP, Mackey DA, Bhattacharya SS, Bird AC, Markham AF, Inglehearn CF. Mutations in the pre-mRNA splicing factor gene PRPC8 in autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP13). Hum Mol Genet. 2001 Jul 15;10(15): 1555-62.

8. Chakarova CF, Hirns MM, Bolz H, Abu-Safeh L, Patel RJ, Papaioannou MG, Inglehearn CF, Keen TJ, WillisC, Moore AT, RosenbergT, Webster AR, Bird AC, Gal A, Hunt D, Vithana EN, Bhattacharya SS. Mutations in HPRP3, a third member of pre-mRNA splicing factor genes, implicated in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet. 2002 Jan 1;11(1):87-92.

9. Maita H, Kitaura H, Keen TJ, Inglehearn CF, Ariga H, Iguchi-Ariga SM. PAP-1, the mutated gene underlying the RP9 form of dominant retinitis pigmentosa, is a splicing factor. Exp Cell Res. 2004 Nov 1;300(2):283-96.

10. Микроцефальная остеодиспластическая примордиальная карликовость первого типа (также называется синдромом Тауби-Линдера): http://rarediseases.info.nih.gov/gard/5120/microcephalic-osteodysplastic-primordial-dwarfism-type-1 /resources/1.

11. Не H, Liyanarachchi S, Akagi K, Nagy R, Li J, Dietrich RC, U W, Sebastian N, Wen B, Xin B, Singh J, Yan P, Aider H, Haan E, Wieczorek D, Albrecht B, Puf fenberger E, Wang H, Westman JA, Padgett RA, Symer DE, de la Chapelle A. Mutations in U4atac snRNA, a component of the minor spliceosome, in the developmental disorder MOPD I. Science. 2011 Apr 8;332(6026):238-40.

12. Padgett RA. New connections between splicing and human disease. Trends Genet. 2012 Apr; 28(4):147-54.

13. Haas JT, Winter HS, Lim E, Kirby A, Blumenstiel B, DeFelice M, Gabriel S, Jalas C, Branski D, Grueter CA, Toporovski MS, Walther TC, Daly MJ, Farese RV Jr. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. J. Clin. Invest. 2012 Dec 3; 122(12):4680-4.

14. Byun M, Abhyankar A, Leiarge V, Plancoulaine S, Palanduz A, Telhan L, Boisson В, Picard C, Dewell S, Zhao C, Jouanguy E, Feske S, Abel L, Casanova JL. Whole-exome sequencing-based discovery of STIM1 deficiency in a child with fatal classic Kaposi sarcoma. J.Exp. Med. 2010 Oct 25;207(11):2307-12.

15. См.: http://www.genome.gov/11007255.

16. Eriksson M, Brown WT, Gordon LB, Glynn MW, Singer J, Scott L, Erdos MR, Robbins CM, Moses TY, Berglund P, Dutra A, Pak E, Durkin S, Csoka AB, Boehnke M, Glover TW, Collins FS. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nature. 2003 May 15;423(6937):293-8.

17. http://www.nhs.uk/conditions/spinal-muscular-atrophy/Pages/ Introduction.aspx.

18. http://www.smatnist.org/what-is-sma/what-causes-sma.

19. Monani UR, Lorson CL, Parsons DW, Prior TW, Androphy EJ, Burghes AH, McPherson JD. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mot Genet. 1999 Jul; 8(7):1177-83.

20. Cooper TA, Wan L, Dreyfuss G. RNA and disease. Cell. 2009 Feb 20; 136(4): 777-93.

21. http://quest.mda.org/news/dmd-drisapersen-outperforms-place-bo-walking-test.

22. http://www.fiercebiotech.com/story/glaxosmithklines-duc-henne-md-drug-mirrors-placebo-effect-phiii/2013-10-07.

Глава 18

1. Ameres SL, Zamore PD. Diversifying microRNA sequence and function. Nat Rev Mot Celt Biol. 2013 Aug; 14(8):475-88.

2. Более подробное описание классов малых РНК см. в: Castel SE, Martienssen RA. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 2013 Feb; 14(2): 100—12.

3. Kang SG, Liu WH, Lu P, Jin HY, Lim HW, Shepherd J, Fremgen D, Verdin E, Oldstone MB, Qi H, Teijaro JR, Xiao C. MicroRNAs of the miR-17-92 family are critical regulators of T (FH) differentiation. Nat Immunol. 2013 Aug; 14 (8):849-57.

4. Baumjohann D, Kageyama R, Clingan JM, Morar MM, Patel S, de Kouchkovsky D, Bannard 0, Bluestone JA, Matloubian M, Ansel KM, Jeker LT. The microRNA cluster miR-17-92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene. Nat Immunol. 2013 Aug; 14(8):840-8.

5. Tassano E, Di Rocco M, Signa S, Gimelli G. De novo 13q31.1-q32.1 interstitial deletion encompassing the miR-17-92 cluster in a patient with Feingold syndrome-2. Am J Med Genet A. 2013 Apr; 161A(4):894-6.

6. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/feingold-syndrome.

7. Han YC, Ventura A. Control of T (FH) differentiation by a microRNA cluster. Nat Immunol. 2013 Aug; 14(8):770-1.

8. Цит. no: Koerner MV, Pauler FM, Huang R, Barlow DP. The function of non-coding RNAs in genomic imprinting. Development. 2009 Jun; 136(11):1771-83.

9. Rogler LE, Kosmyna B, Moskowitz D, Bebawee R, Rahimzadeh J, Kutchko K, Laederach A, Notarangelo LD, Giliani S, Bouhassira E, Frenette P, Roy-Chowdhury J, Rogler CE. Small RNAs derived from In cRNA RNase MRP have gene-silencing activity relevant to human cartilage-hair hypoplasia. Hum Mol Genet. 2014 Jan 15;23(2):368-82.

10. Subramanyam D, Lamouille S, Judson RL, Liu JY, Bucay N, Derynck R, Blelloch R. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2011 May; 29(5):443-8.

11. Li Z, Yang CS, Nakashima K, Rana TM. Small RNA-mediated regulation of iPS cell generation. EMBO J. 2011 Mar 2;30(5):823-34.

12. Ameres SL, Zamore PI). Diversifying microRNA sequence and function. Nat Rev Mot Cell Biol. 2013 Aug; 14(8):475-88.

13. Huang TC, Sahasrabuddhe NA, Kim MS, Getnet D, Yang Y, Peterson JM, Ghosh B, Chaerkady R, Leach SD, Marchionni L, Wong GW, Pandey A. Regulation of lipid metabolism by Dicer revealed through SILAC mice. J Proteome Res. 2012 Apr 6;11(4):2193-205.

14. Yi R, O’Carroll D, Pasolli HA, ZhangZ, Dietrich FS, TarakhovskyA, Fuclis E. Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressed microRNAs. Nat Genet. 2006 Mar; 38(3):356-62.

15. Crist CG, Montarras D, Pallafacchina G, Rocancourt D, Cumano A, Conway SJ, Buckingham M. Muscle stem cell behavior is modified by microRNA-27 regulation of Pax3 expression. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Aug 11;106(32): 13383—7.

16. Chen JF,Tao Y,Li J, DengZ, YanZ, Xiao X, Wang DZ. MicroRNA-1 and microRNA-206 regulate skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by repressing Pax7. J. Cell Biol. 2010 Sep 6;190(5):867 79.

17. da Costa Martins PA, Bourajjaj M, Gladka M, Kortland M, van Oort RJ, Pinto YM, Molkentin JD, De Windt LJ. Conditional dicer gene deletion in the postnatal myocardium provokes spontaneous cardiac remodeling. Circulation. 2008 Oct 7; 118(15):1567-76.

18. de Chevigny A, Core N, Follert P, Gaudin M, Barbry P, Béclin C, Cremer H. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 2012 Jun 24;15(8):1120-6.

19. Konopka W, Kiryk A, Novak M, Herwerth M, Parkitna JR, Wawrzyniak M, Kowarsch A, Michaluk P, Dzwonek J, Arnsperger T, Wilczynski G, Merkenschlager M, Theis FJ, Köhr G, Kaczmarek L, Schütz G. MicroRNA loss enhances learning and memory in mice. J Neurosci. 2010 Nov 3;30 (44):14835-42.

20. Schaefer A, O’Carroll D, Tan CL, Hillman D, Sugimori M, Llinas R, Greengard P. Cerebellar neurodegeneration in the absence of microRNAs. J Exp Med. 2007 Jul 9;204(7): 1553-8.

21. Pietrzykowski AZ, Friesen RM, Martin GE, Puig SI, Nowak CL, Wynne PM, Siegelmann HT, Treistman SN. Posttranscriptional regulation of BK channel splice variant stability by miR-9 underlies neuroadaptation to alcohol. Neuron. 2008 Jul 31;59(2):274-87.

22. Hollander JA, Ini HI, Amelio AL, Kocerha J, Bali P, Lu Q, Willoughby D, Wahlestedt C, Conkright MD, Kenny PJ. Striatal microRNA controls cocaine intake through CREB signalling В]. Nature. 2010 Jul 8;466(7303): 197-202.

23. Fernandez-Hernando C, Baldàn A. MicroRNAs and Cardiovascular Disease. Curr. Genet. Med. Rep. 2013 Mar; 1(1):30-38.

24. Вот один из обзоров, посвященных данной теме: Suzuki Н, Maruyama R, Yamamoto Е, Kai М. Epigenetic alteration and microRNA dysregulation in cancer. Front Genet. 2013 Dec 3;4:258. eCollection 2013.

25. Kleinman CL, Gerges N, Papillon-Cavanagh S, Sin-Chan P, Pramatarova A, Quang DA, Adoue V, Busche S, Caron M, Djainbazian H, Bemmo A, Fontebasso AM, Spence T, Schwartzentruber J, Albrecht S, Hauser P, Garami M, Klekner A, Bognar L, Montes L, Staffa A, Montpetit A, Berube P, Zakrzewska M, Zakrzewski K, Liberski PP, Dong Z, Siegel PM, Duchaine T, Perotti C, Fleming A, Faury D, Remke M, Gallo M, Dirks P, Taylor MD, Sladek R, Pastinen T, Chan JA, Huang A, Majewski J, JabadoN. Fusion ofTTYHl with theC19MC microRNA cluster drives expression of a brain-specific DNMT3B isoform in the embryonal brain tumor ETMR. Nat Genet. 2014 Jan; 46 (1):39-44.

26. Song SJ, Poliseno L, Song MS, Ala U, Webster K, Ng C, Beringer G, Brikbak NJ, Yuan X, Cantley LC, Richardson AL, Pandolf PP. MicroRNA-antagonism regulates breast cancer sternness and metastasis via TET-family-dependent chromatin remodeling. Ceil. 2013 Jul 18;154(2):311-24.

27. Подробное изложение особенностей данного подхода см. в: Schwarzenbach H, Nishida N, Câlin GA, Pantel K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2014 Mar; 11(3): 145—56.

28. Chen W, Cai F, Zhang B, Barekati Z, Zhong XY. The level of circulating miRNA-lOb and miRNA-373 in detecting lymph node metastasis of breast cancer: potential biomarkers. Tumour Biol. 2013 Feb; 34(1):455-62.

29. Hong F, Li Y, Xu Y, Zhu L. Prognostic significance of serum mi-croRNA-221 expression in human epithelial ovarian cancer. J. Int. Med. Res. 2013 Feb; 41(1):64-71.

30. Shen J, Liu Z, Todd NW, Zhang H, Liao J, Yu L, Guarnera MA, Li R, Cai L. Zhan M, Jiang F. Diagnosis of lung cancer in individuals with solitary pulmonary nodules by plasma microRNA biomarkers. BMC Cancer. 2011 Aug 24;11:374.

31. Подробнее см. в: http://emedicine.medscape.com/article/233442-overview.

32. Trobaugh DW, Gardner CL, Sun C, Haddow AD, Wang E, Chapnik E, Mildner A, Weaver SC, Ryman KD, Klimstra WB. RNA viruses can hijack vertebrate microRNAs to suppress innate immunity. Nature. 2014 Feb 13;506(7487):245-8.

33. JoplingCL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science. 2005 Sep 2:309(5740): 1577-81.

Глава 19

1. Краткий перечень лекарств, активнее всего продававшихся за последние годы, см. в: http://www.fiercepharma.com/special-reports/ 15-best-selling-drugs-2012.

2. Этой сфере посвящено множество блогов. Напр.: http://biop-harmconsortium.com/rnai-therapeutics-stage-a-comeback.

3. Подробнее см. в: http://ghr.nlm.nih.gov/condition/transthyre-tin-amyloidosis.

4. http://investors.alnylam.com/releasedetail.cfm?ReleaseID-805999.

5. Все новости о данной программе можно найти здесь: http://mir-narx.com/pipeline/mirna-MRX34.html.

6. Koval ED, Shaner C, Zhang P, du Maine X, Fischer K, Tay J, Chau BN, Wu GF, Miller TM. Method for widespread microRNA-155 inhibition prolongs survival in ALS-model mice. Hum Mol Genet. 2013 Oct 15; 22(20):4127-35.

7. Ozsolak F, Kapranov P, Foissac S, Kim SW, Fishilevich E, Monaghan AP, John B, Milos PM. Comprehensive polyadenylation site maps in yeast and human reveal pervasive alternative polyadenylation. Celt. 2010 Dec 10; 143(6): 1018-29.

8. Очень хороший обзор, посвященный тому, как антисмысловая экспрессия может регулировать гены: Pelechano V, Stein me tz LM. Gene regulation by antisense transcription. Nat Rev Genet. 2013 Dec; 14(12):880-93.

9. http://www.dmgs.com/cons/fomivirsen-intraocular.html.

10. https://www.bhf.org.uk/heart-matters-online/august-septem-ber-2012/medical/familial-hypercholesterolaemia.aspx.

11. http://www.medscape.com/viewarticle/804574_5.

12. http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnounceme nts/ucm337195.htm.

13. http://www.medscape.com/viewarticle/781317.

14. http://www.nature.com/nrd/journal/vl2/n3/full/nrd3963. html.

15. Lindow M, Kauppinen S. Discovering the first microRNA-targeted drug. J Cell Biot. 2012 Oct 29;199(3):407-12.

16. http://www.fiercebiotech.com/story/merck-writes-rnai-punts-sirna-alnylam-175m/2014-01-13.

17. http://www.ficrcebiotech.com/press-releases/rana-therapeu-tics-raises-207-milUon-harness-potential-long-non-coding-rna.

18. http://www.bostonglobe.com/business / 2014/01 /30/dicer-na-shares-soar-first-day-trading-after-biotech-raises-million-initial-public-offering/mbwMnXBSPsVCUVkGQLc64I/story.html.

19. http://www.dicerna.com/pipcline. php, по состоянию на 14 апреля 2014.

20. http://www.fiercebiotech.com/story/breaking-novartis-slams-brakes-rnai-development-efforts/2014-04-14.

Глава 20

1. Последняя история в этой книге сводит воедино различные находки, сделанные множеством исследователей. Вместо ссылок на каждую публикацию лучше дать ссылку на великолепную обзорную статью: van der Maarel SM, Miller DG, Tawil R, Filippova GN, Tapscott SJ. Facioscapulohumeral muscular dystrophy: consequences of chromatin relaxation. Curr Opin Neurol. 2012 Oct; 25(5):614-20.

2. Впервые это разграничение и это терминологическое новшество ввел Сидни Бреннер (Sidney Brenner).

Приложение

ЗАБОЛЕВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА, СВЯЗЫВАЕМЫЕ С МУСОРНОЙ ДНК И УПОМИНАЕМЫЕ В ОСНОВНОМ ТЕКСТЕ КНИГИ

XO-снндром (синдром Тёрнера). Женщины с этим заболеванием имеют лишь одну X-хромосому. Болезнь вызвана неравномерным распределением X-хромосом в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

XXX-синдром. Женщины с этим заболеванием имеют три X-хромосомы. Болезнь вызвана неравномерным распределением X-хромосом в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

ХХY-снндром (синдром Клайнфельтера). Мужчины с этим заболеванием имеют две X-хромосомы. Болезнь вызвана неравномерным распределением X-хромосом в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

IPEX-синдром (синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии, связанный с X-хромосомой). Аутоиммунное заболевание, вызванное мутацией в области, не кодирующей белки и расположенной на конце гена. Мутация препятствует нормальному процессингу информационной РНК.

Апластическая анемия. Примерно 5% случаев обусловлены мутациями в некоторых из важнейших генов, поддерживающих нужную длину теломер — мусорных участков на концах хромосом.

Атаксия Фридрейха. Вызван экспансией ГАА-повтора в области, не кодирующей белки и находящейся внутри гена[80]. Повтор препятствует экспрессии гена, мешая клетке копировать его ДНК в РНК.

Базальная карцинома. Небольшая часть случаев вызвана мутациями в области, не кодирующей белки, которая располагается в начале одного из генов, что приводит к ослаблению экспрессии РНК этим геном.

Болезнь Альцгеймера. Возможно, связана со сверхэкспрессией антисмысловой РНК, которая соединяется с важнейшей информационной РНК, кодирующей фермент BACE1, и стабилизирует ее.

Вирусный гепатит С. Малая РНК, вырабатываемая клетками печени человека, связывается с вирусной РНК, стабилизируя ее и увеличивая эффективность размножения вируса.

Восточный североамериканский вирусный лошадиный энцефалит. Малая РНК, вырабатываемая иммунными клетками человека, связывается с геномом вируса, не позволяя иммунной системе узнать, что организм подвергается атаке.

Врожденная диарея. Вызвана мутацией сплайсингового сигнала в гене.

Врожденный дискератоз. Возможно, обусловлен мутациями в целом ряде различных генов, каждый из которых влияет на поддержание нужной длины теломер — мусорных участков на концах хромосом.

Гипоплазия развития хрящевой ткани и волосяного покрова человека (гипоплазия хрящей и волос). Обусловлена мутациями, которые влияют на малые РНК, входящие в состав длинных некодирующих РНК.

Голопрозэнцефалия. Показано, что некоторые случаи обусловлены мутациями в энхансере морфогена.

Злокачественная меланома. Небольшую долю случаев вызывают мутации в области, не кодирующей белки и расположенной в начале гена. Мутации приводят к встраиванию лишних аминокислот в белок.

Идиопатический пневмофиброз. Возможно, обусловлен мутациями в целом ряде различных генов, каждый из которых влияет на поддержание нужной длины теломер — мусорных участков на концах хромосом.

Карликовость амишей Огайо. Вызвана мутацией в некодирующей РНК. Эта РНК требуется для нормального функционирования сплайсинговой аппаратуры клеток.

Лимфома Бёркитта. Возникает, когда ген Мус транслоцируется с хромосомы 8 на хромосому 14 и оказывается под контролем иммуноглобулинового промотора.

Миотоническая дистрофия. Вызвана экспансией ЦТГ-повтора в области, не кодирующей белки и находящейся на конце гена. Повтор копируется в РНК и связывает белки, способные соединяться с РНК, что приводит к нарушению регуляции большого числа других молекул информационной РНК.

Мышечная дистрофия Дюшенна. Некоторые случаи обусловлены мутациями, приводящими к аномальному сплайсингу молекулы РНК, кодирующей дистрофин.

Нейропатическая боль. Возможно, связана со сверхэкспрессией длинной некодирующей РНК, регулирующей экспрессию ключевого ионного канала.

Несовершенный остеогенез (болезнь хрупких костей, болезнь «стеклянного» человека). Небольшую долю случаев вызывают мутации в области, не кодирующей белки и расположенной в начале гена. Мутации приводят к встраиванию лишних аминокислот в белок.

Плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия (ПЛЛМД). Обусловлена взаимодействиями целой комбинации элементов мусорной ДНК, приводящими к аномальной экспрессии ретровирусной нуклеотидной последовательности.

Панкреатический агенез. Показано, что некоторые случаи обусловлены мутациями в энхансерных последовательностях.

Пигментный ретинит (пигментная дистрофия сетчатки). Некоторые случаи обусловлены дефектом в том белке, который требуется для обеспечения нормального сплайсинга и для удаления мусорной ДНК из молекул информационной РНК.

Подверженность инфицированию вирусом ННV-8. Возможно, вызвана мутацией сплайсингового сигнала в гене.

Полидактилия (многопалость). Причина — замена одного нуклеотидного основания в энхансере морфогена.

Прогерия Хатчинсона-Гилфорда. Обусловлена мутацией, порождающей в гене лишний сплайсинговый сигнал.

Рак. Мусорную ДНК связывают с различными уровнями онкологических процессов: например, со сверхэкспрессией определенных длинных некодирующих РНК при некоторых формах рака. В большинстве случаев пока нет убедительных доказательств, которые позволили бы определить, насколько значительную роль мусорная ДНК играет в патологии этой группы заболеваний у человека. Однако сверхэкспрессия белков, поддерживающих нужную длину теломер (мусорных участков на концах хромосом), теперь повсеместно считается одной из причин развития некоторых злокачественных опухолей. Сейчас в качестве одной из возможных причин аномального размножения раковых клеток активно исследуется и неверное таргетирование эпигенетических ферментов, направляемых на неподобающие гены вследствие аномальной экспрессии длинных некодирующих РНК.

Синдром Ангельмана. Болезнь, вызванная аномальным импринтингом. Мусорная ДНК играет важнейшую роль при контроле импринтинга. В этих процессах участвуют области, контролирующие импринтинг, промоторы, длинные некодирующие РНК. Играет роль в них и взаимодействие с эпигенетическими системами.

Синдром Беквита—Видемана. Причиной заболевания служит аномальный импринтинг. Мусорная ДНК играет важнейшую роль при контроле импринтинга. В этих процессах участвуют области, контролирующие импринтинг, промоторы, длинные некодирующие РНК. Играет роль в них и взаимодействие с эпигенетическими системами.

Синдром Дауна. Обусловлен неравномерным распределением хромосомы 21 в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

Синдром Корнелии де Ланге. Обусловлен дефектами в белке, который требуется для обеспечения ДНК-структурирования высокого порядка при посредстве мусорных последовательностей.

Синдром ломкой X-хромосомы с умственной отсталостью (синдром Мартина-Белл). Вызван экспансией ЦЦГ-повтора в области, не кодирующей белки и находящейся в начале гена. Повтор препятствует экспрессии гена, мешая клетке копировать его ДНК в РНК.

Синдром Опица-Каведжна. Вызван дефектами в белке, играющем важнейшую роль во взаимодействии с длинными некодирующими РНК в комплексе-медиаторе.

Синдром Патау. Вызван неравномерным распределением хромосомы 13 в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

Синдром Прадера—Вилли. Причиной заболевания служит аномальный импринтинг. Мусорная ДНК играет важнейшую роль при контроле импринтинга. В этих процессах участвуют области, контролирующие импринтинг, промоторы, длинные некодирующие РНК. Играет роль в них и взаимодействие с эпигенетическими системами.

Синдром Робертса. Обусловлен дефектами в белке, который требуется для обеспечения ДНК-структурирования высокого порядка при посредстве мусорных последовательностей.

Синдром Сильвера—Рассела. Причиной заболевания служит аномальный импринтинг. Мусорная ДНК играет важнейшую роль при контроле импринтинга. В этих процессах участвуют области, контролирующие импринтинг, промоторы, длинные некодирующие РНК. Играет роль в них и взаимодействие с эпигенетическими системами.

Синдром Файнгольда. Некоторые случаи обусловлены утратой определенного кластера малых РНК.

Синдром Эдвардса. Обусловлен неравномерным распределением хромосомы 18 в развивающихся гаметах. Процесс зависит от особенностей центромеры — одной из мусорных областей генома.

Спинальная мышечная атрофия. Ген SMN2 не в состоянии компенсировать мутации в почти идентичном ему гене SMN1 из-за вариации в нуклеотидном основании, препятствующей нормальному сплайсингу информационной РНК, созданной на основе гена SMN2. В итоге не удается синтезировать полноценно функционирующий белок.

Эмбриональная злокачественная опухоль мозга ETMR (embryonal tumor with multilayered rosettes, эмбриональная опухоль с истинными розетками). Обусловлена реаранжировкой и амплификацией кластера малых РНК.

Примечания

1

Что значит имя? Роза пахнет розой, / Хоть розой назови ее, хоть нет. («Ромео и Джульетта», акт II, сцена 2. Перев. Б. Пастернака.)

2

Встречаются и двунитевые РНК. Это особый класс, речь о котором пойдет в главе 18. (Прим. перев.)

3

Мы видим, что белки-слова могут образовываться путем удаления букв (участков, кодирующих аминокислоты), но не их перестановки. (Прим. перев.)

4

Руководитель компании Celera Genomics Крейг Вентер рассказал о своей жизни и своих работах по расшифровке генома человека в замечательной книге «Decoded Life» («Расшифрованная жизнь». Москва, БИНОМ, Лаборатория знаний, 2015).

5

Амиши — одно из наиболее консервативных направлений в меннонитстве, ставшее отдельной протестантской деноминацией. Как правило, амиши вступают в брак только с единоверцами. (Прим. перев.)

6

Вот эти классы: SINEs (short interspersed repetitive repeats, short interspersed elements (короткие рассеянные повторяющиеся последовательности, короткие рассеянные элементы»; LINEs (long interspersed elements (длинные рассеянные элементы)); LTRs (elements with long terminal repeats (элементы с длинной концевой зоной повторов)); ДНК-транспозоны.

7

Этот ген называется Мус.

8

Ген называется Gcn5. Он кодирует белок, обладающий целым рядом функций. Одной из них является добавление ацетильной группы к лизину — аминокислоте, содержащейся в некоторых белках.

9

Научный термин для клеточного самоубийства — программируемая гибель клеток, или апоптоз.

10

Основной фермент при этом кодируется геном TERT, а РНК матрица кодируется геном TR, который также именуется TERC.

11

Такие клетки называются гемопоэтическими стволовыми клетками (ГПСК), или гемоцитобластами.

12

Этот ген называется Dyskeratosis Congenita 1 (DKC1), или дискерин. (Дискерином называется также белок, связывающий РНК-теломеразу. — Прим. перев.)

13

В данном случае имеются в виду почкующиеся дрожжи — например, Saccharomyces cerevisiae.

14

Caenorhabditis elegans.

15

Эта элементарная повторяющаяся единица длиной в 171 нуклеотидную пару называется альфа-сателлитным повтором.

16

Гистона H3.

17

Этот ген называется SRY.

18

От «X-inactive (Xi)-specific transcript» (букв. «X-неактивный специфический транскрипт инактивированной X-хромосомы»).

19

Обратите внимание: оснований, а не пар оснований. РНК — однонитевая молекула, в отличие от ДНК.

20

Этот ген называется MeCP2. Его функция состоит в том, чтобы связываться с эпигенетически модифицированной (в данном случае — метилированной) ДНК, где он взаимодействуете другими белками, подавляя экспрессию генов на тех участках, к которым прикрепляется.

21

Это знаменитый мысленный эксперимент. При создании данного анекдота реальные лягушки не пострадали.

22

Это так называемые длинные интергенные некодирующие РНК (line RNAs, long intergenic non-coding RNAs).

23

Исключение — клетки иммунной системы, борющиеся со специфическими инфекциями. В ходе необычных процессов эти клетки проводят реаранжировку некоторых своих генов, создавая различные комбинации антител и рецепторов, способные реагировать на широчайший спектр чужеродных белков.

24

Этот главный репрессор называется EZH2. Данный фермент отвечает за добавление трех метильных групп к аминокислоте лизину, содержащейся в гистоне H3 в так называемом 27-м положении. Вкратце такая модификация именуется H3K27me3. Эго один из наиболее изученных признаков эпигенетической репрессии, если не считать метилирования ДНК.

25

Этот комплекс называется поликомб-комплексом 2 (Polycomb Response Complex 2, PRC2). Деятельность PRC2 плотно координируется с деятельностью другого репрессивного комплекса — PRC1. Комплекс PRC2 обычно создает первые репрессивные модификации на том или ином участке генома. Затем PRC1 вносит дополнительные модификации, которые стабилизируют репрессивное состояние.

26

Ключевую роль здесь играют белки DNMT3A и DNMT3L — заново синтезируемые ДНК-метилтрансферазы.

27

Этот белок называется DNMT1, или поддерживающей ДНК-метилтрансферазой.

28

Так называемая мутация de novo, т.е. не наследуемая, а возникающая заново, «с нуля».

29

Так называемая однородительская дисомия, в данном случае — материнская однородительская дисомия.

30

Этот ген называется UBE3A. Он пристраивает определенную молекулу (убиквитин) к другим белкам, что приводит к их деградации.

31

Привожу здесь чисто условные цифры — просто чтобы проиллюстрировать мысль.

32

РНК, вовлеченные в данный процесс, принадлежат к особому классу малых ядрышковых РНК, получившему название C/D box.

33

Метилтрансфераза, необходимая для данного процесса, называется фибрилларином. Фермент действует в комплексе с тремя другими белками и с малой ядрышковой РНК.

34

Митохондрии используют в своих биохимических процессах множество других белков, но большинство белков они получают из цитоплазмы клетки. Все белки, кодируемые лишь в митохондриях, задействованы в так называемой цепи переноса электронов митохондрий. Соответствующий процесс проходит в самих митохондриях и играет важнейшую роль для всего живого. Именно благодаря ему мы вырабатываем и накапливаем энергию, питающую наши клетки.

35

Ген, кодирующий этот белок, называется Myc (как всегда, буквы латинские) и играет роль также в развитии целого ряда других разновидностей рака.

36

Если хотите знать, речь идет о пристраивании фосфатной группы (одного атома фосфора и четырех атомов кислорода) к определенной позиции гистона НЗ. Такую модификацию обычно связывают с активными генами.

37

Данный компонент медиатора называется MED12.

38

Это так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК).

39

Этот белковый комплекс называется когезином.

40

Есть одно-два исключения, когда гены собраны в кластеры, отражающие картину их экспрессии. Главным образом это Hox-гены, контролирующие строение тела, и Ig-гены, кодирующие антитела.

41

Официальное его название — CTCF.

42

Этот белок называется SHOX (short stature homeobox, гомеобокс невысокости).

43

Обычно в качестве таких свойств рассматривалась доступность по отношению к ферментам, которые способны к «разрезанию» молекул ДНК: это признак того, что мы имеем дело с открытой структурой, которая, возможно, обладает способностью копироваться в РНК.

44

Ген этот называется Ёжик Соник [Sonic Hedgehog], сокращенно — Shh. Ученые прошли период, когда генам нередко давали такие вот явно комические прозвища. Теперь это не поощряется. Представьте, как врач, дающий консультации по генетическим проблемам, вынужден сообщать это развеселое названьице родителям ребенка, страдающего опасным генетическим заболеванием.

45

Эта область-энхансер называется ZRS. Он находится на длинном плече хромосомы 7.

46

Этот транскрипционный фактор называется Six3.

47

Этот транскрипционный фактор называется GATA6.

48

Этот транскрипционный фактор называется PFT1A.

49

Эта вариантная пара нуклеотидных оснований носит броское имя rs12913932.

50

Этот ген называется ОСА2.

51

Этот подход, предполагающий поиск генов и их вариаций, связанных с заболеванием или с характеристикой (чертой), называется полногеномными ассоциативными исследованиями (genome-wide association studies, GWAS).

52

Этот ген называется FTO, или «ассоциируемым с жировой массой и ожирением» [«fat mass and obesity associated»].

53

Этот ген называется IRX3, или Iroquois homeobox 3 (ген из семейства ирокез-гомеобокс, кодирующий одноименный белок — ирокез-гомеобокс 3).

54

Речь идет о несовершенном остеогенезе V типа.

55

В литературе их часто обозначают как UTR (untranslated regions). Нетранслируемый участок в начале информационной РНК называется 5'-UTR, а тот, что находится в конце информационной РНК, именуется З'-UTR.

56

Этот ген называется IFITM5.

57

I wandered lonely as a cloud (Как облако, бродил я, одинок). Первая строка знаменитого (по крайней мере, среди англоязычных читателей) стихотворения Вордсворта «Нарциссы». Русскоязычный читатель с такой же легкостью расшифрует, например, такую цепочку букв: Выхожуодинянадорогу. (Прим. перев.)

58

Тимин отличается от урацила лишь наличием одной метильной группы в определенном положении. (Прим. перев.)

59

Напомним, ДНК — двунитевая молекула, и при обсуждении ее структурных единиц речь идет, как правило, о парах оснований, каждая из которых состоит из двух комплементарных оснований (соединяющихся с основаниями соседней нити по правилам, описанным в главе 2: основание А всегда соединяется лишь с Т, а Г — лишь с Ц). Здесь, как и во всех подобных случаях, названы лишь основания, находящиеся на одной из нитей ДНК. Этого вполне достаточно: правила комплементарности всегда позволяют при необходимости узнать, какие основания находятся в соседней цепочке. (Прим. перев.)

60

Этот белок называется Muscleblind-like protein 1, или MBNL1 (белок 1, напоминающий белки из семейства muscleblind).

61

Это называется нематричным изменением РНК, поскольку в геноме нет такой исходной ДНК-матрицы, которая задавала бы данную последовательность оснований А в данном месте.

62

IPEX - Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-Linked Syndrome (синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии, связанный с X-хромосомой).

63

Этот белок — транскрипционный фактор FOXP3.

64

Регуляторных Т-лимфоцитов.

65

Этот ген называется FUS — Fused in Sarcoma / Translocated in Sarcoma (подвергающийся слиянию или транслокации при саркоме).

66

Легендарные кавалерийские подразделения, воевавшие под началом британцев в Индии и прилегающих регионах в конце XVIII - начале XX вв. (Прим. перев.)

67

«Лего. Фильм». Если не видели, обязательно посмотрите. Великолепная вещь.

68

Напомню, мусорные участки между зонами, кодирующими аминокислоты, называются интронами. А сами области гена, кодирующие аминокислоты, именуются экзонами.

69

Полезно выделить два типа малых РНК. Малые РНК, запускающие разрушение информационных РНК. называются микроРНК. Малые РНК, затрудняющие трансляцию, называются малыми интерферирующими РНК. Чтобы избежать лишнего нагромождения терминов, будем называть и те и другие просто малыми РНК.

70

Похоже, в отечественной научной литературе пока нет устоявшегося перевода для данного термина. Обычно он дается в исходном виде. Изредка используются и такие варианты, как «затравочная последовательность», «порождающая последовательность», но все они не совсем передают суть происходящих процессов. (Прим. перев.)

71

Эти клетки называются сателлитными.

72

Этот белок называется BK (латинские буквы, обозначающие один из клеточных калийных каналов).

73

Такие новообразования называются супратенториальными нейроэктодермальными опухолями.

74

Этот белок называется транстиретином.

75

Изречение встречается, например, у Шекспира: «И, неизбежность обративши в доблесть...» («Два веронца», акт IV, сцена 1, перев. М. Кузмина). Вариант В. Левина: «Хотите ль сделать проигрыш доходным...».

76

Речь идет о цитомегаловирусе (ЦМВ).

77

Таргетируемый белок именуется аполипопротеином B100.

78

Название этого лекарства — мипомерсен (Mipomersen). У него есть и другое название — кинамро (Kynamro).

79

В данном случае — DUX4.

80

«Внутри гена» в данном случае означает «не в начале и не в конце гена». (Прим. перев.)

Content

Несса Кэри
Мусорная ДНК. Путешествие в темную материю генома

Nessa Carey Junk DNA. A Journey Through the Dark Matter of the Genome

* * *

Благодарности

О терминах

Введение в темную материю генома

Глава 1. Темная материя, или Отличная материя для размышлений

Вязание с помощью ДНК

Невозможный недуг

Глава 2. Когда темная материя становится совсем темной

Отсекая бессмыслицу

И как только вы обзавелись красивой теорией...

Глава 3. Куда ушли все гены?

Дорогой, я куда-то задевала гены

Ядовитая рыба и генетические изоляторы

Глава 4. Засидевшиеся гости

Опасное повторение

Путь от вины до невиновности лежит через мусорную ДНК

Глава 5. Мы стареем, и у нас все съеживается

Шнурки ДНК

Забота о шнурках

Теломеры и болезни

Тик-так, говорит теломера

Глава 6. Два — лучшее число на свете

Вопрос места

Из ничего не выйдет ничего

Количество имеет значение

Глава 7. Рисование мусором

У женщин есть выключатель

Очень большой кусок мусора

Слева направо, справа налево

Момент, длящийся вечно

Не следует недооценивать везение (и невезение)

Полосы и пятна везения

Глава 8. Длинная игра

Бревна или щепки?

Хорошее начало жизни — половина дела

Длинные РНК и рак

Длинные РНК и мозг

Глава 9. Раскрашивая темную материю

Отыскать местечко в геноме

Если вы неактивны, вы остаетесь неактивны

Как заставить древних чужаков хранить молчание

Эпигенетика и экспансия

Глава 10. Почему родителям так нравится мусор

Откуда берется ДНК

Отключение посредством включения

Как провести импринтинг заново

Когда импринтинг идет не так

Влияние катастрофического события

Глава 11. Особое задание для мусора

Мы зависим от тех, кто нас захватил

В начале была РНК (по-видимому)

Глава 12. Включить и усилить

Управляя плавно меняющимся откликом

Эпигенетика и энхансеры: интенсивное общение

Преодолевая расстояния

От кустарного промысла до фабричного конвейера

Глава 13. Ничейная земля

Останавливая распространение

Почему XX отличается от XXX

Глава 14. Проект ENCODE, или Как большая наука взялась за мусорную ДНК

Множественные параметры

Потенциальное против реального

Эволюционное поле битвы

Глава 15. Обезглавленные королевы, странные коты, жирные мыши

Перчатки и котятки

Морфогены и развитие лица

Морфогены и поджелудочная железа

Вариации на тему

Виновные в соучастии

Глава 16. Потеряно без перевода

Начало и конец

В начале была мутация

А теперь зайдем с другого конца

Скажите «ААААААААА»

Глава 17. Почему «Лего» лучше, чем «Эйрфикс»

Сплайсинг как образ жизни

Сплайсинг и болезни

Манипулирование сплайсингом в лечебных целях

Глава 18. Маленькие, но могучие

Малые РНК: польза и вред

Малые РНК и стволовые клетки

Малые РНК и мозг

Малые РНК и рак

Мертвые лошади и умолкшие гены

Глава 19. Иногда лекарства все-таки действуют

Может ли нас спасти мусорная ДНК?

Иногда все кончается хорошо

Глава 20. Луч света во тьме

Примечания

Приложение

Примечания