Киселев Сергей Львович

Человек редактированный, или Биомедицина будущего

От автора

Более или менее документированная история человечества не так уж велика и ограничивается парой сотен лет. Но за этот период мир претерпел несколько эпохальных преобразований. Девятнадцатый век называют веком инженерии: появились железные дороги, автомобили с двигателями внутреннего сгорания и фотография, была построена Эйфелева башня. Вхождение в XX век сопровождалось, возможно, самым значительным открытием человечества после колеса — открытием рентгеновского излучения, которое позволило разглядеть не только каждую косточку человеческой пятерни, но и заглянуть внутрь любого вещества, узнать его структуру и атомарное строение, что привело к перевороту в химии и физике, позволило создать новые материалы и полупроводники. Рентгеновское излучение позволило человечеству открыть информационное пространство жизни, разгадать код ДНК, создать технологии генной инженерии. Текущий XXI век предлагает нам принципиально новые возможности использования информации о живой материи для создания новых технологий по принципу живого.

Когда я, еще школьником, размышлял о том, чем бы хотел заняться, я и представить себе не мог, что науки о жизни, и в частности биология, будут играть столь важную роль. Конечно, биология меня привлекала, но было совершенно неинтересно считать тычинки растений или лапки насекомых, но интересно узнать, как это устроено изнутри и почему «работает». Поэтому я выбрал физико-математическое образование, а после окончания института сразу окунулся в мир генной инженерии и молекулярной биологии. Многие истории, описанные в книге, происходили на моих глазах или даже с моим участием, хотя разговор пойдет, возможно, о самой сложной и противоречивой на сегодня технологии геномного редактирования.

Я приглашаю читателей к совместному исследованию и надеюсь, что прочитав эту книгу и пройдя путь от первых открытий ДНК до возможного редактирования генома, вы сможете сделать свой самостоятельный вывод о перспективах развития биомедицины будущего и ее инструментах, а также о возможных открытиях XXI века — века наук о жизни.

Сергей Львович Киселёв, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эпигенетики Института общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН

Введение

Пока гром не грянет...

Нас окружают явления и системы, кажущиеся нам очевидными, воспринимаемые нами как нечто само собой разумеющееся. Например, наша собственная жизнь. Конечно, мы реагируем на события, которые нас каким-то образом затрагивают, мы совершаем тысячи движений, работаем, учимся, любим, производим на свет детей и растим их, испытываем радость и страх, наслаждение и боль, строим планы на будущее и печалимся о прошедшем. Но под покровом повседневных действий, чувств и ощущений тихо и незаметно внутри нас протекает та самая биологическая жизнь — жизнь клеток и генов, тканей и органов, которая объединяет человека со всей живой природой. Таинственная жизнь, знания о которой ученым приходится добывать по крупицам...

Ну, идет и идет... Зачем о ней думать? Ведь наш организм сам знает, что ему делать, а если что-то пошло не так, всегда можно обратиться к врачу. Большинство из нас, окончив школу, благополучно забывают даже основы жизни, элементарный курс школьной биологии, и потому многих пугает, например, аббревиатура «ГМО», за которой прячется пара десятков Нобелевских премий, лекарственное и пищевое изобилие современного развитого мира. Примерно такую же реакцию вызывает слово «клонирование», которое обрело свою уже третью жизнь после рождения первого в мире клонированного млекопитающего — овечки Долли.

И только когда биология внезапно врывается в нашу жизнь, нарушая ее спокойное течение какой-нибудь смертельной опасностью или уникальным достижением, человечество вдруг понимает, что хотя его сегодняшние знания о таинственных основах жизни еще весьма скромны, именно сейчас открываются огромные перспективы дальнейшего развития биологических наук. Именно сейчас.

Эта книга пишется в тот самый год[1], когда человечество (или, как минимум, треть его) включила в свой повседневный лексикон такие слова и их сочетания, как «вирус», «пандемия», «карантин», «пневмония», «цитокиновый шторм», «искусственная вентиляция легких» (или ИВЛ), «полимеразная цепная реакция» (или ПЦР), «антитела»... Еще недавно подавляющее большинство из нас не слышали об этом даже при посещении врача, а теперь в любом переходе метро стоят санитайзеры для рук, возле касс магазинов нам предлагают маски, в транспорте призывают соблюдать социальную дистанцию, мы регулярно сдаем тесты на ПЦР или на антитела. До недавнего времени основная часть общества была далека от любых биологических и медицинских терминов, но теперь лицом к лицу столкнулась с новым вирусом человека, а по большому счету — с новым проявлением живой природы.

Конечно, вирусы, какими бы они ни были, приходят не в первый и не в последний раз. За минувшую сотню лет мы неплохо изучили ранее появившиеся вирусы, научились с ними работать, манипулировать ими, переставлять различные их части (в этой книге мы будем много говорить о вирусах). Однако к приходу и массовому вторжению в организмы людей такого объекта, как новый коронавирус (названный Всемирной организацией здравоохранения SARS-CoV-2 — от англ. Severe Acute Respiratory Syndrome-related Coronavirus 2, то есть связанный с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2), вызывающий болезнь под названием COVID-19, которая по своим тяжелым последствиям хотя и значительно уступает печально знаменитой «испанке», человечество оказалось совершенно не готовым. Состояние, в которое погрузился мир под ударом пандемии COVID-19, иначе как потрясением не назовешь.

Возмутитель спокойствия

Но как мы уже сказали, уникальные достижения в биологии порой влияют на человечество не меньше, чем катастрофические пандемии. Несколько лет назад произошло событие, вызвавшее в научном мире настоящую панику. О его важности можно судить хотя бы по тому, что оно освещалось едва ли не всеми мировыми средствами массовой информации, теме этого события были посвящены многочисленные заседания Организации Объединенных Наций и Всемирной организации здравоохранения, а научные сообщества всех развитых стран еще долго после этого пребывали в состоянии шока. Но самое поразительное в том, что неописуемое волнение, в которое пришел весь мир, было вызвано всего лишь докладом одного человека на небольшом научном симпозиуме!

Я думаю, дело здесь не только в уникальности открытия, о котором мы сейчас расскажем. Общество просто не ожидало, что «фантастическое будущее», над которым работало большое количество специалистов в лабораториях, внезапно оказалось «настоящим», поставив перед людьми массу сложнейших проблем, в том числе этических. А генетика, давно уже поражавшая человечество своими достижениями, теперь стала признанным лидером биологической науки и главной надеждой медицины будущего.

Возмутителем спокойствия оказался китайский ученый Хэ Цзянькуй. Двадцать пятого ноября 2018 года, накануне 2-го Международного саммита по редактированию генома человека, проходившего в Гонконгском университете, ученый заявил, что он генетически модифицировал с помощью технологий редактирования генома двух недавно рожденных девочек-близняшек, Лулу и Нана (их настоящие имена тщательно скрываются). Предполагалось, что в результате этого вмешательства девочки должны стать невосприимчивыми к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), который был у их родителей. Но главное, что эту генетическую модификацию они смогут передать по наследству своим детям, те — своим, и так будет продолжаться до тех пор, пока в каком-то поколении наследственная передача модифицированного гена не прекратится.

Конечно, эксперименты с генетической модификацией человека проводились и раньше, но мировое сообщество было потрясено тем, что впервые генетическому редактированию подверглись так называемые клетки зародышевого (полового) пути человека — поколение клеток, которое предшествует гаметам, или половым клеткам (яйцеклетки и сперматозоиды). При слиянии половых клеток образуется эмбрион, а из него уже развивается новый организм. Ранее никаких сознательных вмешательств в эти клетки не осуществлялось, потому что генетические модификации этих клеток передаются по наследству. Это значит, что любая ошибка экспериментатора скажется не только на том человеке, который разовьется из «отредактированного» эмбриона, но и на его потомках! А если мы не знаем, какие цели преследует экспериментатор? В общем, реакцию мирового научного сообщества можно было предугадать и заранее, тем более что автором уникального эксперимента оказался не американский, а китайский биолог.

Надо сказать, что Китай тоже официально не поддержал своего ученого, и с этим связана почти детективная история. По договоренности между организаторами — академиями наук США, Китая и Королевским научным обществом Великобритании — 2-й Международный саммит по редактированию генома человека должен был проходить в Китае, и активная подготовка к мероприятию была уже в самом разгаре. Однако в последний момент Китай по неясным причинам (официально из-за отсутствия финансирования) отказался от проведения этой встречи на своей территории. Но поскольку регион был определен заранее и многие участники даже приобрели билеты, организаторам показалось разумным перенести саммит в Гонконг. Будучи формально частью Китая, Гонконг еще обладал значительной автономией — был как бы «не совсем Китаем». Наверное, власти Китая предполагали, что Хэ Цзянькуй может рассказать о своем эксперименте, и реакция мировой общественности будет предсказуемо негативной, поэтому сделали все возможное, чтобы и об открытии сообщить, и возможные обвинения в соучастии с себя снять.

Сегодня мы знаем, что после выступления на саммите судьба китайского ученого сложилась достаточно печально (хотя, возможно, ему еще повезло, ведь в прессе появлялись сообщения о том, что ученому грозит смертная казнь). Пострадал и проект: Хэ Цзянькуй не получил признания и результаты его работы не были опубликованы в научных изданиях. Многие детали эксперимента китайского ученого остаются не очень ясными. Однако не вызывает сомнений, что девочки-двойняшки с отредактированным геномом, который будет передаваться по наследству, действительно были рождены, — ученый представил этому достаточные доказательства.

О чем пойдет разговор

Как бы мы ни относились к экспериментам по редактированию генома человека, в том числе и на уровне клеток зародышевого пути, остановить развитие технологий не удастся. Своим достижением Хэ Цзянькуй задал высокую планку, и теперь исследователям все равно придется решать возникшие научные и технические проблемы, а обществу — этические, связанные с откровенным вмешательством в человеческую природу. До какой степени это оправданно?

В этой книге мы попытаемся разобраться и понять, что такое редактирование генома, каким образом оно осуществляется, чем отличается от существующих генно-инженерных манипуляций, как может использоваться и уже используется сегодня на практике, в том числе для целей биомедицины.

Однако прежде чем говорить о геномном редактировании, мы рассмотрим основополагающие понятия генетики и научные факты, которые лежат в основе современных представлений об устройстве и работе генома, обсудим наиболее впечатляющие этапы развития методов вмешательства в геном, вплоть до создания геномных редакторов.

Мы постараемся убедиться в том, что все живое существует в едином генетическом пространстве (измерении), иначе не было бы того, что мы обозначаем скупыми буквами ЖИЗНЬ. Потому что с точки зрения биологии именно генетическое измерение дает живым существам возможность передать информацию по наследству!

И конечно же, мы подробно обсудим историю китайского ученого Хэ Цзянькуя и его уникальный эксперимент. Мы порассуждаем о перспективах биомедицины, о том, какие преимущества дает она в поисках новых средств борьбы с тяжелыми и опасными заболеваниями, и с какими проблемами (не только технологическими, хотя их немало) сталкивается человечество, желая генетическими методами усовершенствовать самое себя.

Как устроено генетическое пространство

Вспомним школу

Все мы когда-то «проходили» биологию в школе, однако с тех пор многое изменилось: во-первых, кое-что забылось за давностью лет, а во-вторых, биологическая наука в целом и генетика в частности (раздел биологии, который изучает наследственность организмов и устройство материальных носителей наследственности, так называемых генов) переживают стремительный взлет. Сегодня уже невозможно говорить о современной биологии, не понимая, что значит наследование, зародышевый путь, генетическая мутация, генетические изменения, геномное редактирование. Как мы увидим далее, здесь не просто каждое слово, а каждая буква имеет свой смысл, — и начать нам придется «с азов», то есть вернуться назад, к школьной программе, чтобы освежить свои знания. Только проделаем мы это немножко на другом уровне — соответствующем тому, что уже открыла и освоила современная наука в плане передачи наследственной информации, возможности ее контроля и изменения.

Два метра генетической информации

Мы помним, что тело (или, по-научному, сома — от др.-греч. soma) состоит из клеток. Клетка — это единица жизни, и именно она содержит информацию, которая передается по наследству. В клетке есть изолированное ядро, где находятся хромосомы. Те из нас, кто немного помнит школьный курс биологии, вероятно, представляют себе хромосомы в виде маленьких «червячков», которые находятся внутри «шарика». Конечно, это очень упрощенный образ, хотя в некоторый момент времени они действительно имеют такой вид. На самом деле хромосома состоит из двух компонентов: дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и белков.

Если мы извлечем ДНК (это полимерная молекула) из всех хромосом, содержащихся в одной человеческой клетке, — их там сорок шесть штук, или двадцать три пары, — и приставим все эти «кусочки» один к другому, чтобы они вытянулись в одну нить, то суммарная длина всех молекул ДНК в одной клетке человека составит примерно два метра при толщине всего в два нанометра! Но как же они помещаются в ядре, размеры которого обычно измеряются микронами? Природа решила сложную задачу по компактизации молекулы ДНК.

Рис. 1. В ходе компактизации ДНК ее объем уменьшается в семь тысяч раз

Как сделать компактной нитку? Ее можно намотать на катушку. Основой для этого являются белки. Но если мы намотаем длинную молекулу ДНК на одну катушку, то добраться до того участка, который идет первым слоем, нам не удастся — будет доступен только наружный слой, и это усложнит считывание наследственной информации. Поэтому на самом деле ДНК наматывается на большое количество белков-основ, которые называются нуклеосомами и распределены по всей длине молекулы. А потом эта структура, которая уже напоминает бусы, претерпевает еще несколько стадий компактизации, укладываясь в петли. Получается примерно так: сначала мы намотали молекулу ДНК на много белков-катушек, а затем свернули все это во что-то напоминающее моток альпинистской веревки. В результате получаются хромосомы, каждая из которых состоит из двух скрученных молекул ДНК (хроматид), соединенных центромерой. Именно в таком виде наследственная информация хранится в ядре клетки.

Жизнь в четырех буквах

Давайте разберемся, что же такое генетическая информация, как и на чем она записывается.

Мы уже сказали, что генетическую информацию во всех живых клетках содержит молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты — ДНК.

А записана эта информация, как выяснилось еще в середине прошлого века, всего лишь четырьмя «буквами» А, Т, Г, Ц (А, Т, G, С) — нуклеотидами. Каждому нуклеотиду присвоено название, соответствующее названию входящего в его состав уникального основания: аденин, тимин, гуанин, цитозин.

Нуклеотиды взаимодействуют между собой, образуя пары. Причем аденин взаимодействует исключительно с тимином, а гуанин — с цитозином.

В результате этого взаимодействия молекула ДНК представляет собой витую спираль, состоящую из двух нитей (или цепочек), на каждой из которых расположены различные комбинации четырех нуклеотидов. Причем их последовательности на обеих нитях являются, как говорят в биологии, комплементарными, то есть взаимодополняющими (не путать с комплиментом). Это значит, что если у нас по одной нити ДНК в каком-то месте идет последовательность букв-нуклеотидов, скажем, А, Т, Г, Ц, то на второй нити их комбинация в этом же участке будет Т, А, Ц, Г, в соответствии с правилом взаимодействия. И напротив аденина в одной цепочке обязательно окажется тимин во второй цепочке.

Эти комплементарные пары оснований образуют между собой водородные связи — особый тип химических связей, которые удерживают обе витые ниточки ДНК соединенными вместе.

Прочность водородных связей невысока, и даже при сравнительно небольшом повышении температуры раствора, в котором находятся молекулы ДНК, эти связи могут нарушиться. Если мы, например, нагреем молекулу ДНК всего лишь до шестидесяти пяти градусов Цельсия — температуры, которую может выдержать даже наш палец, если его опустить в горячую воду, — то ДНК начинает «плавиться»: две ее нити расходятся...

Только не надо этого пугаться, ведь ДНК — молекула поистине замечательная! Когда мы начнем опускать температуру ниже той, при которой «расплавили» ДНК, и возвращать ее к нормальной для жизни температуре (у человека это около тридцати семи градусов, у собаки примерно сорок, у птиц существенно выше сорока градусов), произойдет нечто уникальное. Обе нити опять соединятся, комплементарные основания найдут друг друга, и ДНК снова станет такой же прочной структурой из двух цепочек, при этом полностью сохранив всю свою информационную ценность как генетический текст. Это очень важный момент, и именно он является основой всем известной сегодня полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой проводятся многочисленные диагностики.

Еще важнее для нашей темы, что две цепочки в молекуле ДНК могут разъединяться прямо в живой клетке под действием определенных ферментов[2], а потом опять соединяться, абсолютно точно находя друг друга. Вместо температуры реакцию «плавления» ДНК катализируют ферменты.

Спрашивается: зачем природе все эти сложности? Чтобы ответить на этот вопрос, надо понять, что вообще-то все мы, то есть живые существа, построены не из ДНК! Молекула ДНК является только носителем генетической информации, содержащейся в живой клетке, — подобно флешке, которая снаружи может выглядеть как угодно, а то, на чем реально записана информация, находится внутри нее. На самом деле во флеш-карте это всего лишь кусочек кремния — песчинка. Хотя любой генетический текст записывается всего четырьмя буквами — А, Т, Г, Ц, общее количество их сочетаний, присутствующих в каждой клетке человека, составляет гигантское число — 3х10^9, или три гигабайта. А поскольку в клетке человека имеются два набора хромосом (двадцать три хромосомы от мамы и двадцать три от папы), то каждая клетка содержит 6х10^9 букв генетического текста — шесть миллиардов!

Таким образом, общий объем памяти молекул ДНК в каждой клетке — шесть гигабайт, а объем уникальной информации, которая содержится в каждой молекуле ДНК, — три гигабайта. Мы пока изучили только их малую часть, которую назвали генами... ну и еще чуть-чуть (об этом разговор впереди). Гены составляют немногим более одного процента всей информации, записанной в ДНК; они кодируют белки — строительный материал, из которого построена каждая клетка и, соответственно, тела всех живых существ.

Транскрипция, трансляция, белок

Но как происходит кодирование? Каким образом ген, то есть чисто информационный фрагмент, находящийся в составе ДНК, может организовать производство белка?

Этот удивительный процесс описала так называемая центральная догма молекулярной биологии, сформулированная в 60-х годах XX века. Согласно ей, генетическая информация передается от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении. А поскольку записана она в огромной молекуле ДНК, находящейся в ядре, которая сама производить белок не может, то посредником для передачи информации служит еще одна нуклеиновая кислота — РНК, или рибонуклеиновая кислота. Она работает как интерфейс между информацией, находящейся в ядре клетки, то есть в ДНК, и цитоплазмой клетки, где и осуществляются все процессы жизнедеятельности. Можно провести аналогию с современной флеш-картой, в которой USB — это интерфейс для связи с компьютером. Химически РНК от ДНК отличается немного, примерно как глюкоза от сахарозы (два вида сахаров), — она гораздо меньше по размеру и представляет собой одну цепочку нуклеотидов. Рибонуклеиновая кислота копирует часть информации, записанной на ДНК, и, будучи комплементарной копией одной цепи ДНК, точно копирует фрагмент генетического текста. Специальный фермент распознает двухцепочечную ДНК, находит место, где начинается ген (этот район получил название промотор), другой фермент слегка расплетает две нити ДНК, и третий фермент синтезирует одноцепочечную копию гена. Такой процесс называется транскрипцией. С одного гена, то есть определенного генетического текста, транскрибируется много одинаковых молекул так называемой матричной РНК, которая затем выходит из ядра в цитоплазму клетки. И там, по этой молекуле РНК как по образцу, происходит синтез белка, состоящего из отдельных аминокислот. Биологи называют такой процесс трансляцией (переводом), но в его подробности мы углубляться не будем. Итак, в клетке присутствует ДНК от мамы и от папы, и на каждой из ее молекул имеется одна копия гена от мамы и одна копия гена от папы. С каждой молекулы ДНК синтезируется много копий РНК этих генов, а потом с них считывается информация и синтезируется еще больше молекул белка, из которого все строится.

Пожалуй, самой большой неожиданностью для ученых оказалось то, что ДНК с ее линейной структурой (простая последовательность букв генетического текста) оказалась способной порождать немыслимое разнообразие белков не только по аминокислотному составу, но и по форме молекулы. Поначалу в процессе синтеза белка аминокислоты выстраиваются в линейной последовательности, как нуклеотиды в ДНК. Но ниточка готового белка вовсе не намерена всегда оставаться линейной (первичная структура).

Более того, выяснилось, что даже один и тот же линейный белок («кирпичик» любой формы жизни) в немного различающихся условиях внутри клетки приобретает в конце концов совершенно разные формы, сперва закручиваясь в спираль или складываясь в гармошку с образованием вторичной структуры, затем скручиваясь еще больше, — возникает третичная структура. Иногда в одну молекулу соединяются несколько ниточек — полипептидных цепочек, формируя четвертичную структуру.

Почему так происходит? Потому что в клетке существуют отделы, в одном из которых реакция среды может быть кислой, в другом — щелочной, да еще с повышенным или пониженным содержанием различных солей. В разных средах один и тот же белок будет совершенно по-разному сворачиваться в клубочки или компактные шарики (глобулярные структуры, глобулы). И каждый раз эта структура может выполнять иную функцию. Кстати, с повышением температуры у белков тоже будут постепенно возникать нарушения глобулярной структуры. Они будут изменять, как говорят по-научному, конформацию, то есть внешний вид. А это неизбежно скажется на их функциях.

КАК КЛЮЧ В ЗАМОК

Какое значение может иметь конформация молекулы белка? Давайте схематично представим взаимодействие двух молекул как взаимодействие ключа с замочной скважиной. Если у нас два правильных белка, то есть один — ключ, а второй — замочная скважина, то они находятся в правильном функциональном состоянии. Ключик хорошо вставляется в замочную скважину и выполняет свою функцию открывания замка.

Но если у нас вдруг изменился хоть один белок, то ключ просто не подходит к замочной скважине, и молекула не выполнит ту функцию, для которой она предназначена. Поэтому в природе такая тонкая настройка всегда совершается при изменении температурных или химических условий как в случае ДНК, так и по отношению к любому белку.

Универсальный код

Чем, с точки зрения генетики, отличается человек от бактерии? Мы уже знаем, что генетический текст состоит всего из четырех букв, но в различных комбинациях (это могут быть АТГЦ..., ААТТТ..., ГЦЦЦ... и любые другие, которые можно придумать и написать). Все эти комбинации на первый взгляд выглядят полной абракадаброй, как и весь генетический текст, который из них состоит, но ученые уже смогли расшифровать большую его часть. Прорыв произошел в середине XX века, когда британские ученые Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик на основании рентгеноструктурного анализа Розалинды Франклин объяснили структуру молекулы ДНК. Они выяснили, что она состоит из двух определенным образом сплетенных друг с другом цепочек комплементарных оснований (нуклеотидов), соединенных водородными связями. Позднее была раскрыта суть генетического кода: каждый его элемент — это триплет, то есть сочетание трех последовательно расположенных нуклеотидов, посредством которых закодирована одна аминокислота.

РАСТЕНИЯ СЛОЖНЕЕ ЖИВОТНЫХ?

Количество букв генетического текста в ДНК не определяет напрямую сложность организма. Так, если у человека геном включает три миллиарда букв (или в условных единицах — три гигабайта), то геном растений может содержать 10^12 букв (три тысячи гигабайта) и даже больше. Но это вовсе не означает, что растения сложнее животных. Просто в геноме растений многократно повторяется одно и то же, а дополнительной информации там нет. Таким образом, мы имеем дело не с увеличением генетической информации, а с увеличением количества ее копий. Не возрастает с количеством букв и надежность передачи наследственной информации. Клетки делятся, и при их делении происходит копирование информации. Это напоминает переписывание длинного текста. Чем длиннее текст, который мы переписываем, тем больше мы допускаем ошибок — это естественный процесс. Поэтому наличие многих копий генома, как у растений, с надежностью никак напрямую не связано.

Несколько таких триплетов полностью определяют, какой белок получится, поскольку белки состоят из отдельных аминокислот, число которых невелико — чуть больше двадцати. Но при этом все белки разные, каждый уникален, потому что комбинации из двадцати аминокислот в первичной последовательности белка тоже могут быть совершенно разными. Это общий принцип кодирования информации о живых организмах в природе.

Генетический код, то есть триплеты нуклеотидов, которые соответствуют той или иной аминокислоте, универсален для всех живых организмов Земли.

Поэтому клетка человека по принципу кодирования генетической информации, ее наследованию и реализации при построении ничем не отличается от бактерии.

Генетический код у человека и бактерии одинаков, но есть и различие — оно заключается в количестве информации. В ДНК бактерии имеется несколько миллионов букв генетического текста, у человека — примерно три миллиарда.

Вся генетическая информация, которая присутствует в ядре клетки, точнее — в ее ДНК, получила название геном.

Как воспринимать генетический текст

Беспорядочная запись букв алфавита никакой информации не несет. Казалось бы, то же самое можно сказать и о бессмысленном перечислении букв в той записи, которую мы сегодня называем генетическим текстом. Но если читать внимательно, то окажется, что среди этих трех миллиардов букв (три гигабайта) есть значимые единицы, которые называются генами. Что же мы имеем в виду, когда говорим, что это ген?

Ген имеет двоякий смысл. С одной стороны, это физическое понятие — конкретный участок генома, то есть генетический текст, состоящий из определенных букв-нуклеотидов. С другой стороны, ген — это носитель информации, которая потом получает внешнее проявление. Ведь с гена сначала копируется информация в виде РНК, затем с ее помощью синтезируется белок. Представьте себе, что вы вставили в компьютер флешку в три гигабайта, полную информации, открыли один файл в три мегабайта и распечатали его на принтере. Примерно то же самое происходит в клетке при синтезе белка. Белки выполняют различные функции, например, отвечают за окраску.

ЦВЕТ - ПРИЗНАК РАБОТЫ ГЕНА

Существование пигментных белков является одним из доказательств работы гена в живом организме. Скажем, какой-то ген кодирует красный пигмент, который обеспечит окрашивание, только если ген работает (включен). В свое время основоположник генетики Грегор Мендель наблюдал работу генов на горохе по окрашиванию цветков гороха (они могут быть красные или белые), по цвету горошин (зеленые или желтые).

В том, что у гороха всегда присутствуют все гены (хотя он так их не называл), Грегор Мендель не сомневался, но далеко не все они включены. Если ген работает, то проявляется некий признак (красный цвет цветков гороха или морщинистость горошин, как в эксперименте Грегора Менделя), а если выключен, то цветки будут белыми, а поверхность горошин гладкой.

Сегодня нам известно, что помимо генов, кодирующих белки, существуют фрагменты генетического текста, которые определяют работу гена в то или иное время (процентов десять из трех гигабайт наследственной информации). Ведь любой организм меняется со временем, проходит разные стадии развития, и ему вовсе не нужно, чтобы все гены работали одновременно и все время. Например, на раннем этапе развития человека нужна работа генов роста, потом они должны выключиться, — ведь не можем же мы расти бесконечно! Итак, экспрессия гена изменяется во времени, и информация об этом тоже содержится в генетическом тексте — геноме.

Участки генома, регулирующие работу генов, выполняют еще одну важную функцию. Как мы уже говорили, в многоклеточном организме каждая клетка независима и содержит всю генетическую информацию. Например, в клетке кожи имеется та же самая генетическая информация, что и в клетке крови. Но для чего нужно, чтобы клетка кожи работала так же, как клетка крови? Кожа осуществляет барьерную функцию, кровь — транспортную функцию внутри организма. Значит, любая клетка должна сделать так, чтобы только те гены, которые нужны ей для выполнения определенной функции, работали в данное время и в данном месте. Эта информация тоже находится внутри нашего генетического текста. Таким образом, сегодня наука расшифровала примерно десять процентов всего генома, функции остальных девяноста процентов нам пока неизвестны, иногда его называют «мусорным».

Учимся читать геном

Сама технология чтения генетического текста остается в основном побуквенной, то есть мы читаем как первоклассники, а это имеет свои недостатки. Относительно недавно появилась технология, в принципе позволяющая непрерывно читать тысячи и даже миллионы букв генетического текста. Но расшифрованный геном человека пока собирается по кусочкам размером от тридцати до пятисот букв. Представляете, сколько таких фрагментов надо соединить, чтобы осилить три миллиарда букв? Более того, встречаются повторяющиеся элементы текста, но мы пока просто не знаем, куда их поместить, поэтому некоторые участки остаются еще не до конца собранными в правильном порядке. Да и остальной текст прочитали с относительно высокой точностью всего лишь несколько лет назад. Это очень небольшой срок, чтобы понять значение каждой буквы.

ПАМЯТЬ О ПРЕДКАХ

В геноме человека сохраняются участки, доставшиеся нам от «предков», в том числе простейших и бактерий. И это неудивительно, поскольку генетический текст живых организмов, от бактерии до человека, универсален. Однако многие гены, как и соответствующие им белки, претерпели изменения — одни чуть больше, другие чуть меньше. Все зависит от того, в каких процессах они участвуют. В основные процессы жизнедеятельности (такие как энергетический обмен) будут вовлечены высококонсервативные гены, которые почти одинаковы у бактерий и млекопитающих и кодируют белки со сходными функциями; такие гены называют ортологичными.

И только с усложнением строения организмов (именно строения, то есть появления новых тканей и органов) формируются новые гены.

«Ген разума» и грустные мыши

Я намеренно подчеркиваю, что новые гены появляются при появлении новых тканей, а не при появлении у тканей новых функций. С этим связан важнейший для самосознания человека вопрос о разуме. Так вот, генетики ответственно заявляют, что до сегодняшнего дня генов разума у человека не обнаружено. Соответственно, в этом плане мы ничем не отличаемся от остальных млекопитающих!

С точки зрения генетики человек не является так называемым разумным существом.

Есть ли какие-то гены, имеющие хотя бы косвенное отношение к мыслительному процессу? Да, кое-что найти удалось.

Например, одной из особенностей, присущих человеку, считают наличие членораздельной речи. Развитие речевого аппарата действительно произошло из-за того, что у человека есть некий ген, который отвечает за эту функцию (на самом деле связочно-двигательную). Понятно, что произнесение звуков — это не осознанный процесс, а физическое явление, для которого требуются голосовые связки определенной толщины и расположения и определенное строение челюстно-лицевой области. Отвечающий за это ген FOXP2 был обнаружен в конце XX века в Англии благодаря одной семье, члены которой не обладали способностью говорить[3]. Это было вызвано мутацией в нем. Ортологичные гены есть у шимпанзе, мышей, птиц и других животных. Однако ген мыши только на три аминокислоты (менее девяти букв генетического текста) отличается от гена человека, а между геном мыши и геном шимпанзе различие еще меньше — всего в две аминокислоты. Когда ученые создали «гуманизированных» по этому гену мышей, то есть заменили ген мыши точной копией гена человека, тембр мышиного писка изменился...

К сожалению, животные так и не заговорили, зато стали грустными (вот она, плата за очеловечивание!), так как кроме влияния на тембр «голоса» ген оказал влияние на уровень многих нейромедиаторов и гормонов. А может быть, печаль грызунов была связана с тем, что сородичи перестали их понимать...

Последние исследования этого гена говорят о том, что он, скорее всего, не отвечает непосредственно за речь, а принимает участие в способности человека членораздельно говорить.

В природе все случайно?

Итак, мы уже знаем, что каждая клетка нашего организма имеет диплоидный набор хромосом — двадцать три пары, то есть сорок шесть штук.

Откуда же они берутся? Понятно, что от родителей. Из каждой пары одну хромосому мы наследуем от папы, другую от мамы. В принципе, все гены, находящиеся на этих хромосомах, одинаковы; правда, различие есть, но где-то в одну сотую процента. Почему? Ну, прежде всего потому, что папа и мама — это Два разных человека.

Давайте теперь посмотрим, велика ли эта разница. Значит, двадцать три хромосомы пришли от мамы, двадцать три — от папы. В каждой паре содержится один и тот же набор генов, расположенных на хромосоме линейно в одной и той же последовательности. Линейные хромосомы, папины и мамины, гомологичны, то есть они содержат текст, в котором в одном и том же порядке расположены районы (локусы), содержащие тот или иной ген, и другие участки, которые регулируют работу этих генов, и какие-то еще последовательности генетического текста с неизвестными нам пока функциями. В конце концов, все мы люди, и папа от мамы отличается только полом — по хромосомам, определяющим пол.

Но папина и мамина хромосомы будут различаться на уровне отдельных букв!

Это отличие составляет примерно два миллиона (2х10^6) букв. Конечно, можно сказать, что два миллиона букв — это лишь небольшая часть от трех миллиардов (менее одной сотой процента), среди которых они запрятаны. Но все-таки разница есть, и она имеет огромное значение, потому что дает генетическое разнообразие потомства. Мы не получаемся идеально похожими ни на маму, ни на папу, так как каждый геном вносит что-то свое, и ребенок генетически близок, но не идентичен каждому из родителей.

Но этим различия не исчерпываются. Выяснилось, что еще до своего рождения мы приобретаем около ста новых замен букв, которые отличают генетическую информацию родившегося ребенка и от папы, и от мамы.

Это означает, что генетическая информация не является чем-то навсегда установленным: в ней происходят постоянные изменения, все время привносится что-то новое. Это случайные события, в природе все случайно.

Копирование без ошибок невозможно

Все многоклеточные организмы (включая человека, каким бы особенным он сам себе ни казался) какое-то время являются одноклеточными, поскольку жизнь начинается всего лишь с одной клетки.

И снова напомним: каждая яйцеклетка человека несет двадцать три хромосомы (половину маминого генома), каждый сперматозоид тоже несет двадцать три хромосомы (половину папиного генома), поэтому при слиянии яйцеклетки и сперматозоида будущий организм получает диплоидный набор хромосом, то есть сорок шесть хромосом, которые имеются потом в каждой клетке его тела. Но сначала появляется единственная клетка — зигота, имеющая двойной набор хромосом. Сходные процессы происходят и у других многоклеточных организмов, размножающихся половым путем, только число хромосом у них отличается в большую или меньшую сторону.

Зигота делится на две клетки, и для того, чтобы генетическая информация попала в каждую из дочерних клеток, должно произойти копирование (репликация) генетического текста. Вы представляете себе, что такое переписать, скопировать два раза по 3х10^9 букв?

Копирование происходит за счет определенных клеточных ферментов, которые носят название полимеразы, и идет оно достаточно точно, хотя и случаются ошибки. В принципе, ошибки в копировании возникают примерно в одной букве на десять тысяч. Но они исправляются другими ферментами, которые движутся следом за полимеразой. Выглядит этот процесс примерно так. Комплекс с ферментом полимеразой присоединяется к молекуле ДНК, начинает расплетать две ее нити и создавать копию каждой из них. В комплексе также находится фермент репарации (починки). Он наблюдает, насколько точно произведено копирование, и при необходимости исправляет ошибки, которые допускает полимераза.

Но все-таки система несовершенна, а значит, возникают ошибки, и если они произошли при первых делениях зиготы, то далее сохраняются и попадают в клетки тканей, из которых формируется организм. Поэтому на ранних стадиях развития организма мы получим примерно сто ошибок генетического текста — сто мутаций, которые будут принадлежать исключительно нам.

Казалось бы, ну и что? Не торопитесь с выводами. Дальше происходит деление дочерних клеток. На уровне примерно ста клеток наступает первая специализация развивающегося эмбриона (то есть нас), и в дальнейшем эта специализация нарастает — у эмбриона начинают закладываться различные специализированные ткани. В частности, на стадии примерно пятисот клеток У нас закладываются клетки зародышевого пути. Это те самые клетки, которые впоследствии сформируют мужские или женские гаметы, в зависимости от того какое сочетание половых хромосом оказалось в эмбрионе, XX или XY. То есть 100 мутаций, которые возникли на первых стадиях деления зиготы, могут попасть в половые клетки и впоследствии будут переданы по наследству. Это можно сравнить с персональной генетической подписью. А все те мутации, которые при последующем развитии эмбриона или уже рожденного организма могут произойти в клетках сомы, уже никогда не передадутся по наследству.

Жизнь — в разнообразии

Само слово «мутация» не несет никакого негативного смысла. Такие изменения могут происходить в генах, но бывают и вне генов. Это случайные, никак не контролируемые процессы изменения генетического текста.

Самое главное — что именно меняется в наследственной информации. Бывают «условно вредные» мутации, когда затрагивается работа гена, и это приводит к развитию патологии. Подчеркиваю: условно вредные, так как именно мы, люди, придали данной мутации негативный смысл; для природы это просто случайное изменение, которое, возможно, когда-нибудь (не сегодня) даже обеспечит преимущество этой особи. Например, мутация, которая приводит к серповидно-клеточной анемии, обеспечивает защиту от малярии, которая была необходима при переходе человека к земледелию в теплом и влажном климате. Риск развития диабета первого типа определяется генотипом, но существует предположение, что повышенный уровень сахаров в клетках организма был необходим человеку для выживания в условиях холода, обеспечивая дополнительную энергию и защиту от обморожений.

Чаще случаются мутации нейтральные, которые не вызывают никаких последствий. Опять-таки — сегодня. Допустим, одна буква генетического текста изменилась, но если это не повлияло на изменение аминокислотного состава или на функцию данного гена, то наличие или отсутствие этой мутации в данных конкретных условиях никак не проявляется.

Конечно, если она будет передаваться дальше по наследству, а потом случайным образом в этом же гене возникнет другая мутация, то сочетание двух случайных мутаций может оказаться вредным, а может — и очень выигрышным. Это некая рулетка: мы не способны предсказать заранее, где произойдет изменение и что оно затронет.

Меня часто спрашивают, бывают ли полезные мутации. На этот вопрос можно ответить так: полезны ли какие-то мутации для человека, мы не знаем — об этом узнают наши потомки. Мы не можем предсказать будущее. Мы судим об изменениях, которые произошли вчера, по тому, что происходит сегодня. Вчера произошла мутация, и поэтому сегодня человек заболел. Но представьте, что она произошла в гене, отвечающем за температуру тела, а сегодня после падения небольшого метеорита произошли такие изменения климата, что нужно иметь повышенную температуру. Тогда это будет уже не болезнь, а преимущество перед другими, потомки этой особи выживут в новом мире. Поэтому объективно нет ни полезных, ни вредных изменений — есть только наше субъективное мнение о них.

Если же говорить не о человеке, а о растениях или животных, то полезность определяем мы, люди. Для растения мутация может быть и вредной. Например, существование культурных сортов растений — это, скорее всего, вредная мутация с точки зрения выживания растений. Если за ними перестать ухаживать, они с большой вероятностью выродятся, то есть вернутся к дикому типу, или погибнут. Но с точки зрения человечества это полезная мутация, а в природе нет ничего вредного или полезного. Мутация для нее — это исключительно важное биологическое событие. Для нее самой, для развития жизни чем больше разнообразия, изменений, тем лучше, потому что таким образом создается больше возможностей для последующего выживания данной особи, вида или для образования нового вида. Вот простой пример: вымерли мамонты — то ли потому, что сильно похолодало, то ли их уничтожила какая-то инфекция, но в любом случае у них не оказалось нужных для выживания в новых условиях наследуемых фрагментов ДНК. Но ведь от этого жизнь на Земле не исчезла! Именно мутационное разнообразие дает живым организмам возможность существовать. Кому-то не повезло, а у кого-то произошло наследуемое изменение, и его потомки живут дальше. Вот почему так важно, чтобы изменения были наследуемыми.

И напротив, чем консервативнее какой-то биологический вид или условия, в которых он живет, тем хуже (вы сами знаете про последствия близкородственных браков). Результатом консерватизма является вырождение, деградация.

Поэтому мутации — это хорошо. И сама жизнь — в разнообразии.

Рождение генной инженерии

Революционный переворот в биологии

Сегодня трудно поверить, что могучая современная наука, связанная с изучением молекулы ДНК как физического объекта и как носителя наследственной информации, возникла лишь в середине прошлого столетия — по историческим меркам совсем недавно.

Все наиболее значительные достижения науки о ДНК, все главные открытия и эксперименты в этой области были совершены в середине и во второй половине XX века. Поистине революционный переворот в биологии случился благодаря развитию техники и использованию рентгеновского излучения — человек сумел заглянуть не только внутрь любого неживого объекта, но и глубоко внутрь живой клетки и добраться до каждой химической молекулы, из которых построена как неживая, так и живая материя.

Особенно важную роль сыграл и продолжает играть метод рентгеноструктурного анализа, с помощью которого была открыта сложная структура молекулы ДНК. Благодаря этому методу и по сей день происходит изучение пространственного строения белковых молекул. Рентгеноструктурным анализом определяется, как правильно должны выглядеть два функционально взаимодействующих белка, то есть «ключ» и «замочная скважина».

Таким образом, физические подходы и новые методы исследования оказались совершенно необходимыми и продолжают активно использоваться вплоть до сегодняшнего дня. Весь комплекс инженерных наук и технологий в области биологии, получивший интенсивное развитие с середины прошлого века, позволил исследователям заглядывать все глубже и глубже в микромир биологических объектов. И те открытия, которые были сделаны за несколько последних десятилетий, очень сильно изменили представления ученых о нем.

Однако наряду с физическими развивались и биологические подходы. В значительной степени благодаря им человечество сумело не только исследовать, но и использовать такие биологические объекты, как вирусы.

О вирусах люди узнали еще в конце XIX века. В XX веке их научились выращивать в лабораториях с применением клеточных культур и даже создавать вакцины от некоторых вирусных заболеваний, еще не предполагая, какую генетическую информацию несет вирусная частица, полная структура которой была определена лишь в 1955 году. Сегодня известно, что это некая информационная молекула на основе ДНК или РНК, запакованная в белковую оболочку и способная проникать в живую клетку.

Например, коронавирус, с которым сегодня столкнулось человечество, как раз и представляет собой молекулу РНК в белковой оболочке. Мы уже знаем, что РНК — это одноцепочечная рибонуклеиновая кислота (см. главу 1: «Транскрипция, трансляция, белок»). Содержащая ее вирусная частица, в данном случае коронавирус, размножается в цитоплазме клеток человека, используя их как фабрику для производства белковой оболочки и копирования РНК, поэтому генетическая информация коронавируса не оставляет следа в геноме клетки. А вот, скажем, вирус герпеса — это уже молекула ДНК в белковой оболочке, и в этом случае вирусная ДНК может встроиться в геном инфицированной клетки и даже остаться там надолго, до поры до времени никак себя не проявляя.

Для нас особый интерес представляют вирусы бактерий. Их назвали бактериофагами, или пожирателями бактерий[4] («фаг» в переводе с греческого означает «пожиратель»), Первоначально это название, не сулящее бактериям ничего хорошего, было дано загадочным сущностям, которых не удавалось рассмотреть даже в микроскоп. Бактериофаги были обнаружены в начале XX века, когда микробиологи заметили, что колонии бактерий на экспериментальных чашках Петри в какой-то момент исчезли. Полностью! Ученые предположили, что всему виной какое-то заболевание, возбудитель которого слишком мал, чтобы его можно было увидеть. Но вскоре на смену обычным оптическим микроскопам пришли электронные, с помощью которых ученые разглядели причину гибели бактерий — заражение ранее неизвестными вирусами.

Генетическая рекомбинация, или Поделись своим геномом

Бактериофаги, как и другие вирусы, имеют белковую капсулу, внутри которой содержится молекула ДНК или, реже, РНК. У них нет собственного обмена веществ, поэтому вне живой клетки они размножаться не могут.

Фаг проникает в бактерию, а дальше происходит нечто поразительное: его ДНК встраивается в геном бактерии. Для чего? Для того, чтобы генетический материал фага мог передаваться в ряду клеточных делений бактериальной клетки, пока не придет время его активации, которое определяется внешними факторами. В случае активации (это может произойти сразу после попадания вируса в клетку бактерии) генетическая информация с ДНК фага считывается бактериальными ферментами, то есть происходит транскрипция его собственной ДНК и синтезируются белки для сборки капсида (оболочки) вируса.

Далее наступает процесс сборки новых бактериофагов, после которого бактерия может погибнуть — лизироваться. Бактериальная стенка разрушается, и ее содержимое вытекает наружу, но теперь оно состоит из уже собранных фаговых частичек — размножение произошло. Кстати, именно свойство бактериофагов лизировать (растворять) определенные виды бактерий стоит запомнить — это пригодится, когда мы подойдем к теме редактирования генома.

Рис. 2. Генетическая рекомбинация. Вирусные частицы могут переносить генетический материал между различными клетками и организмами случайным образом

Ученые в своих экспериментах по перенесению бактериофагов с одних бактерий на другие, обладающие иными свойствами, обнаружили, что новые, вновь собранные частицы бактериофагов несут не только свой геном: они также могут захватывать какие-то фрагменты генетического текста бактерии — своего временного хозяина — и переносить этот генетический текст в другую бактерию, а могут и позабыть кусочек своей ДНК в геноме бактерии. Получается, что с помощью бактериофагов происходит обмен генетическим материалом, и это придает бактерии новые свойства.

Эксперимент, в котором был продемонстрирован такой обмен, поставил американский генетик и биохимик Джошуа Ледерберг в 1947 году. За открытие данного процесса, получившего название генетическая рекомбинация, то есть обмен генетическим материалом, в 1958 году ему была присуждена Нобелевская премия.

Процесс генетической рекомбинации между вирусами (неважно, бактериофагами или вирусами животных и человека) и клетками любых живых организмов универсален — принцип его остается неизменным.

Сегодня известно, что вирусы могут встраиваться в хромосому человека, состоящую из молекулы ДНК, потом вырезаться оттуда и встраиваться опять, но уже в другой район хромосомы. При этом вырезание и встраивание порой происходят неточно, в результате чего вирус может захватывать с собой и переносить отдельные участки генома, фрагменты генетической информации из одного места в другое.

Мы прекрасно знаем, что вирусы способны инфицировать людей, переходя от человека к человеку. Один чихнул — и вирус перелетел на другого. Это значит, что люди могут обмениваться фрагментами генетического текста просто в ходе обыденной жизни — за счет вирусов. Страшно, да?

На самом деле бояться особенно нечего по двум причинам. Во-первых, мы уже говорили в главе 1, что человек за жизнь накапливает миллионы мутаций. Передача чужого гена с вирусом — лишь один из примеров того, как эти изменения могут происходить. Однако возникает вопрос: не опасны ли они? Да, наверное, мутации, переданные вирусом, могут представлять опасность, но только в смысле возникновения вирусного заболевания, поскольку клетки взрослого организма имеют ограниченный срок жизни — они способны лишь к определенному количеству делений. Во-вторых, и это самое главное, — наш вирус, даже если он опасный, не попадет в клетки зародышевого пути, а значит, и изменения, которые он вызовет, не передадутся по наследству.

И все же полностью исключить такую возможность нельзя. Если вирус каким-то образом проникнет в оплодотворенную яйцеклетку и встроится в геном, то вызванные им изменения будут передаваться по наследству.

Пусть так, но существуют ли доказательства того, что эта гипотетическая возможность когда-либо реализуется?

За доказательствами далеко ходить не надо. Анализ генома млекопитающих показывает, что вирусы хорошо похозяйничали в клетках, в том числе клетках зародышевого пути, и многие изменения в них возникли как Раз из-за посещения их вирусами в процессе эволюции, геноме человека обнаружено исключительно большое количество древних вирусов; считается, что около трети генома человека представлено вирусной ДНК. Сегодня вирусам приписывают очень большую роль в эволюционном развитии жизни на Земле: именно они, по мнению многих биологов, стали одним из механизмов эволюции. Ее главным двигателем считается уже не только случайная мутация, которая происходит при репликации ДНК, но и активный перенос генетического материала с помощью вирусов посредством процесса генетической рекомбинации.

Но не только эволюцией мы обязаны вирусам. Вполне возможно, что от них в огромной степени зависит формирование и функционирование нервной системы человека. Ученые предполагают, что наша память, особенно длительная, может быть связана с «прыжками» элементов вирусных геномов в некоторые другие позиции нашего генетического текста, записанного в ДНК нейронов. Тем самым в геноме фиксируется произошедшее биологическое изменение: соседние гены могут начать работать по-другому, и это воспринимается нами как память о событии. Поскольку время жизни нейрона сравнимо со временем жизни всего организма (в данном случае человека), то это один из предполагаемых и возможных механизмов сохранения информации.

Таким образом, даже вопросы долговременной памяти связаны с генетикой, потому что ДНК — это главный долгожитель среди всех существующих в организме молекул. Время жизни РНК исчисляется несколькими часами: все время требуются новые молекулы, чтобы делать новые белки. Сами белки после выполнения своей работы тоже перерабатываются на новые белко-молекулы; среднее время их жизни — около суток. А руководит этим бесперебойным производством ДНК, именно эта молекула вместе со всей содержащейся ней информацией сохраняется на протяжении жизни организма.

Тут необходимо упомянуть затронувшую многих пандемию СОVID-19 и наличие антител после болезни или вакцинации. Память о столкновении организма с вирусом в результате инфицирования или прививки выражается в форме наличия в крови антител, доступных для тестирования. Но даже антитела, хотя это долгоживущие белковые молекулы, имеют период полураспада от двух до двадцати дней. Спрашивается, где же может сохраняться информация об антителе — специфическом белке против вируса, чтобы иммунитет к этому вирусу оставался у человека через месяцы и даже годы? Правильно, только в молекуле ДНК. Поэтому самым важным для защиты от инфекции является наличие клеточной памяти, то есть присутствие в организме лимфоцитов, в ДНК которых закодирована последовательность, позволяющая синтезировать соответствующие антитела в виде белка. О том, как это работает, мы поговорим чуть позже.

Бомба замедленного действия

Фрагменты генетического текста вирусов распределены по всему геному. Если вирусный фрагмент встроился в какой-то ген, работа последнего может принципиальным образом измениться. Выживет при этом данная особь или нет, зависит от того, насколько сильно нарушилась работа гена. Конечно, вероятность попадания вируса в полтора процента генома, то есть в те участки генетического текста, которые кодируют белки, во много раз меньше, чем в остальной генетический текст, но именно это событие может придать негативное значение слову «мутация». Соответствующий ген, скорее всего, не будет кодировать нужный белок — ведь его структура нарушена.

Но вирусные кусочки текста могут оказаться и в тех десяти процентах генома, которые сами не являются генами (то есть не кодируют никаких белков), а управляют их работой — осуществляют тонкую настройку, определяя, в какой момент синтез какого белкового «кирпичика» необходим для строительства клетки. Попадание вируса в эту часть генома может привести к совершенно разным последствиям — как положительным, так и отрицательным или, до поры до времени, ни к каким. Тогда вирусный фрагмент может оказаться некой бомбой замедленного действия, которая сработает в определенных условиях.

Что это за условия? Самые разные. Например, существуют патологии, которые проявляются с возрастом. В молодости повышенная или пониженная работа гена, вызванная случайным вирусным фрагментом в области регулирования его работы, не будет заметно сказываться, потому что происходит активный метаболизм, ненужные белки быстро утилизируются или разрушаются и выводятся из организма, а недостаток одного из белков компенсируется каким-то другим. Однако с годами клеточный мусор будет накапливаться, скорость синтеза белков падает, и это может привести к развитию определенной патологии.

Спокойно! Вы модифицированы!

Сегодня мы знаем достаточно много вирусов, которые живут во всех нас. Это и вирус герпеса, и еще целый вирусов на основе ДНК, которыми наши клетки могут быть инфицированы. Вирус герпеса известен всем чаще всего он проявляется язвочкой, которая вскакивает у больного на губах или в носу. «Ой, заразился», — думает бедняга. Но на самом деле этот человек также стал генетически модифицированным из-за вируса герпеса, который поселился в его организме теперь навсегда.

К счастью, потомству этот вирус не передается. Он имеет определенную локализацию; попал, например, в геном клеток слизистой вокруг рта и спокойно живет там в латентном состоянии, пока у человека не ослабнет иммунитет — в этом случае вирус немедленно начинает размножаться и проявляется в виде язвочки на губах.

Но что происходит с вирусом, который сначала заразил один организм, а потом попал от него к другому? Несет ли он на себе какой-то отпечаток своего пребывания в организме первого? Да, за счет неточного вырезания из генома вирус может прихватить фрагмент генома хозяина...

Можно сказать, что такой вирус приобретает нечто человечье, но и человек приобретает нечто вирусное. Отсюда с абсолютной точностью следует очевидный вывод:

Мы все немножко генетически модифицированы!

Обмен фрагментами генома происходит не только между человеком и вирусами, но и внутри человека между его клетками регулярно происходит обмен генетической информацией. Эти события происходят в результате описанной Джошуа Ледербергом генетической рекомбинации. Суть в том, что один генетический фрагмент обменивается кусками генетического текста с другим генетическим фрагментом. Это нормальный, естественный процесс, который имеет место во всех живых организмах, в том числе и у млекопитающих. Во время мейоза[5] происходит обмен генетическим материалом (фрагментами ДНК) между гомологичными (подобными) хромосомами, это явление носит название кроссинговер. Например, имеются восемнадцатая хромосома, доставшаяся от отца, и восемнадцатая хромосома, доставшаяся от матери, и они поменялись между собой какими-то частями. По сути, хромосомы остались теми же самыми, и гены в них те же и в той же самой линейной последовательности.

Но помните, мы уже говорили, что папин геном отличается от маминого на два миллиона букв, то есть вроде бы одинаковые хромосомы отличаются на сорок тысяч букв. А в результате рекомбинации, то есть обмена кусочками генетического текста, у нас уже нет ни чисто папиной, ни чисто маминой хромосомы, а возникает новое генетическое сочетание, которое обеспечивает еще большее разнообразие будущим внукам, чем различие в два миллиона букв. Стремление к наибольшему генетическому разнообразию — это закон природы.

Рис. 3. Кроссинговер происходит с частотой один миллион букв на клетку во время деления

Генно-инженерные технологии

С момента открытия Джошуа Ледербергом процесса генетической рекомбинации прошло более семидесяти лет, но и сегодня это открытие считается одним из важнейших, поворотных событий в истории человечества. В частности, на его основе были созданы генно-инженерные технологии — или, как их еще называют, технологии рекомбинантной ДНК, — без которых сегодня немыслимы многие области медицины, сельского хозяйства, пищевой, нефтяной и других видов промышленности.

Открытие генетической рекомбинации показало, что генетический текст (ДНК) можно в каком-то месте разрезать и в этот разрез вставить фрагмент любого генетического текста из того же самого или другого организма. Как вы уже знаете, это умеет делать вирус. Дело оставалось за малым: понять, как это смогут сделать генные инженеры.

Каким же образом вирус разрывает генетический текст? Должен быть какой-то инструмент, «ножницы», нарушающие целостность нити ДНК.

И такой инструмент был обнаружен. Им оказались ферменты рестрикции (рестриктазы). В данном случае ученые нашли ферменты, которые нарушали целостность молекулы ДНК в определенном месте.

Рестриктазы узнают в молекуле ДНК коротенькое слово генетического текста из четырех — восьми определенных букв и вносят в это место ДНК двухцепочечный разрыв.

Они были обнаружены в бактериях, но оказалось, что подобно генетическому коду многие биологические процессы универсальны, и ферментам рестрикции было совершенно все равно, чью ДНК и где разрезать. Они не имели видовой специфичности и прекрасно работали как в клетке, так и вне ее, в пробирке. За открытие рестриктаз в 1978 году американцы Даниел Натане и Хамилтон Смит вместе со швейцарским генетиком Вернером Арбером получили Нобелевскую премию по медицине и физиологии.

Именно эти два свойства генетического кода ДНК и ферментов — универсальность и сохранение свойств вне клетки, в пробирке — положили начало всем биотехнологическим и биомедицинским достижениям XX и XXI веков.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) бактериальной клетки ничем не отличается от ДНК клетки человека, кроме содержания генетического текста. Давайте представим себе генетический текст бактерий как текст тоненькой брошюрки, а генетический текст человека как текст многотомного издания. Но если мы оба текста разрежем на отдельные буквы, слова и даже предложения, то, перемешав, сможем составить новый текст с тем смыслом, который захотим ему придать. Помню, в детстве я слышал историю о том, как один заключенный, прочитав много детективов, из отдельных фраз и фрагментов прочитанного составил свой детектив, который пользовался большой популярностью. Так и здесь: если разрезать два генетических текста, а потом их фрагменты смешать в одной пробирке — вне клетки, вне организма, — то за счет рекомбинации два разных фрагмента могут объединиться в один. И неважно, что один фрагмент ДНК взят из бактерии, а другой из клетки человека. Рекомбинация все равно произойдет, и образуется новая, синтетическая молекула, в которой часть будет представлена бактериальным геномом, а часть — фрагментом генома человека.

Потом этот искусственно созданный геном, содержащий ген человека, мы можем ввести в бактерию. В результате в бактериальной клетке прекрасно начнет работать ген человека, который мы туда вставили с помощью технологии рекомбинантной ДНК; более того, он будет передаваться по наследству и окажется у всех многочисленных потомков этой бактерии.

Перенос генов и начало биотехнологии

Впервые осуществил и продемонстрировал перенос гена из одного организма в другой известный американский ученый Пауль Берг, лауреат Нобелевской премии 1980 года. Свой эксперимент ученый провел в 1971 году, но тогда речь шла только о генах микроорганизмов, поскольку технологии рекомбинантной ДНК по переносу генов между клеткой бактерии и клеткой человека еще не существовало. Тем не менее Пауль Берг был первым, кто показал, что ген одного микроорганизма может работать под контролем генетического текста (ДНК) другого микроорганизма.

Немного позже биохимик Герберт Бойер и генетик Стенли Коэн воспользовались открытием Пауля Берга и в середине 1970-х годов впервые перенесли ген инсулина человека в бактериальную клетку. Задача состояла в том, чтобы заставить ее синтезировать инсулин человека — белок, который можно было бы использовать для лечения больных диабетом.

С практической точки зрения главным достижением Г. Бойера и С. Коэна было открытие того, что любой ген человека можно переместить в подходящую бактериальную клетку, и бактерия будет безропотно производить белок, закодированный им, вне организма человека.

Рис. 4. Перенесение гена инсулина человека в бактериальную клетку

Наверное, может возникнуть вопрос: а зачем переносить ген именно в бактериальную клетку? Ведь все это есть и в клетке человека! Да, конечно, но... Для выращивания бактериальных клеток используются очень дешевые питательные среды — отходы пищевого производства, перегонки нефти, газ. Бактерия делится примерно один раз в двадцать — тридцать минут, а клетка человека — раз в несколько дней. Представьте себе, что вы на микробиологическую чашку Петри посадили одну-единственную клетку, в которую ввели одну-единственную копию синтетического гена. Назавтра, достав из инкубатора чашку Петри, вы увидите небольшую, но хорошо заметную глазом точку размером в один-два миллиметра, ведь там уже находится больше 10^7 клеток! Десять миллионов копий гена за одну ночь можно получить в этой бактериальной колонии, которая состоит из потомков одной-единственной клетки и получила название клон (а сам процесс стали называть клонированием). Представляете, сколько инсулина человека смогут производить десять миллионов клеток!

Клонирование — это получение точной копии в поколениях. Само слово «клон» по-гречески означает «ветвь», «отпрыск», «потомок». Более ста лет назад в США термин «клон» (ветвь) пытались ввести в растениеводстве, чтобы различать сельскохозяйственные растения, полученные вегетативным путем (из укорененных частей растений), а значит, точные копии. Ведь при опылении одного растения другим уже происходит оплодотворение — смешиваются два генома, получается новый геном.

Однако тогда термин «клон» не прижился, зато получил вторую жизнь в молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиях и биомедицине.

Таким образом, применив биотехнологические подходы, включающие клонирование и выделение инсулина человека из бактериальной биомассы, человечество полностью решило проблему инсулиновой зависимости. И сегодня все люди, страдающие инсулинозависимыми формами диабета, пользуются рекомбинантным инсулином, который производится бактериями.

Инженерия живого

Перед генетикой, дерзнувшей проникнуть в святая святых живого организма, чтобы определять возможность наследования признака (причем не на протяжении веков и тысячелетий), стали возникать проблемы, далеко выходящие за собственно генетические рамки.

Когда Пауль Берг открыл явление переноса генов, его самого это открытие повергло в шок: если любой ген одного организма может быть перенесен в другой организм, то что из этого может получиться?! Не перемешаем ли мы все живое на Земле? Основатель генной инженерии первым предположил возможные отрицательные последствия своего открытия.

В 1974 году Берг отправил в крупнейшие научные журналы письмо, в котором призвал приостановить как минимум на год любые операции с рекомбинантной ДНК и созвать всемирную конференцию для обсуждения потенциальных рисков таких технологий. Он и сам приложил большие усилия к организации этой конференции. В ней должны были участвовать ученые-биологи, медики и юристы. Последним предстояло оценить моральную сторону подобных деяний, то есть соединения генов низших организмов с генами человека. Страх того, что мир искусственных монстров может внезапно вырваться из пробирки в окружающую среду, был очень велик.

Неужели этот страх оправдан и мы должны ограничивать себя в познании? Ежедневно на планете Земля появляются сотни новых видов живых существ и сотни видов исчезают бесследно. Процесс естественного создания нового генетического текста идет постоянно — за счет переноса генов, за счет мутации от ультрафиолета, естественной радиации, да и просто от случайных событий при копировании текста ДНК. Миллионы видов, триллионы особей, квадриллионы случайных событий... А остаются существовать только те варианты генетического текста, благодаря которым их носители случайно, но наилучшим образом приспособились к окружающей среде. Сравните окружающую среду для бактерии на капустном листе и в тепличных лабораторных условиях. В лаборатории нет ни перепадов температур, ни аномальной влажности, ни наличия конкурирующих видов — все только для одного клона, обладающего ценными качествами. Но именно поэтому все бактериальные штаммы, все линии клеток, которые используются в генной инженерии, могут существовать только в лабораторных условиях — в природе они сразу погибнут.

За почти полвека, прошедшие со времени Асиломарской конференции, технологии значительно шагнули вперед. Вместо человека-ученого, который ставил уникальные эксперименты и открывал что-то новое в природе, сегодня роботизированные комплексы могут делать все операции по клонированию, анализу клеток, секвенированию генома (чтению генетического текста). Нужен лишь техник-лаборант, который умеет обращаться с реактивами и выключать свет.

КОНФЕРЕНЦИЯ В АСИЛОМАРЕ

Первая и последняя конференция по рекомбинантной ДНК и генной инженерии состоялась в 1975 году в Асиломаре, Калифорния, США.

В конференции, проходившей на ядерном полигоне, приняло участие более сотни специалистов из разных областей. Кстати, тогда вклад нашей страны в генетические исследования был оценен весьма достойно: пять ведущих биологов СССР принимали участие в этом обсуждении. О главной теме конференции можно судить по карикатурам, которые тогда появились: сидят ученые в каком-то бункере и обсуждают, что нужно сделать, чтобы созданная ими жизнь не вырвалась наружу. А в советских школах на уроках биологии шутили, что это будет как в мультфильме «Бременские музыканты», когда появилась ослиная голова и закукарекала, или перенесут какой-нибудь ген трактору, и тот замычит.

С одной стороны, это доказывает, что природа на самом деле устроена достаточно сложно (и не просто же так за открытия, которые подарили человечеству новые технологии, несколько десятилетий назад присуждались Нобелевские премии). С другой стороны, благодаря ученым-первооткрывателям сегодня эти эксперименты стали обыденной технологией, которую каждый может воспроизвести на кухне. Интернет полон информации о том, как это сделать и каких результатов добиваются люди.

Недавно даже появились люди, которые почему-то стали называть себя хакерами в биологии — биохакерами. В бытовых условиях они пытаются воспроизвести то, чем занимаются большие биотехнологические корпорации. Они выделяют ДНК, проводят простейшие опыты по молекулярному клонированию и пытаются модифицировать свой организм... Короче, «развлекаются». Они уже могли бы нанести миру большой вред в смысле получения новых и опасных микроорганизмов, однако пока, к счастью, ничего, кроме вреда, нанесенного самим себе, от них нет.

Работа с генами вне клетки

Благодаря открытию генетической рекомбинации человечество получило возможность работать с генами, которыми, как оказалось, можно манипулировать вне организма. Работа эта непростая. Например, надо получить ген, то есть вырезать из полного генетического текста всего пару предложений, а для этого сделать два разрыва в ДНК человека. В коротеньком генетическом тексте бактериальной клетки, который у кишечной палочки, любимицы молекулярных биологов и генных инженеров, в тысячу раз меньше, чем у человека, фермент рестрикции делает только один разрыв, чтобы можно было вставить туда вырезанный ген.

Сегодня рынок рекомбинантных технологий исчисляется триллионами долларов. В 2020 году объем этого рынка, приходящийся только на медицину, составил более шестисот миллиардов долларов. А начиналось все с инсулина, производство которого до сих пор составляет порядка пятидесяти процентов всей медицинской части рынка. Другие составляющие — это онкология, аутоиммунные заболевания и, конечно, вакцины, изготовленные на основе рекомбинантных технологий.

Широко применяются рекомбинантные технологии и в сельском хозяйстве, в том числе в растениеводстве. Дело в том, что у растений, как и у многих видов животных, существуют свои бактерии и вирусы — точно такой же инструментарий, как тот, что используется для разработки медицинских технологий или промышленных биотехнологий. Это значит, что с помощью вирусов растений можно делать ускоренный перенос генов между различными их видами. Рекомбинантные технологии позволяют улучшать пищевые свойства растений, повышать их сопротивляемость вредителям и урожайность.

Медицина и разработка методов интенсивного земледелия для решения проблемы голода — это два важнейших направления, основанных на рекомбинантных технологиях, которые позволили чуть больше чем за сто лет увеличить среднюю продолжительность жизни человека в развитых странах почти на пятнадцать лет — с шестидесяти пяти до восьмидесяти лет.

Продукты генной инженерии

Давайте подробнее рассмотрим, что дала нам генная инженерия. Прежде всего, это возможность синтезировать с помощью бактерий белки человека, например инсулин, о котором мы уже говорили, или различные интерлейкины, интерфероны и другие цитокины — «гормоны» иммунной системы. Все они синтезированы в бактериальных клетках, — благодаря этому мы имеем возможность покупать в аптеках препараты, их содержащие.

Сегодня генно-инженерным путем производится множество синтетических антител, направленных на подавление роста опухоли. Первым таким лекарством был герцептин, он используется для лечения рака молочной железы. Антитела могут специфично связываться с рецепторами на поверхности опухолевых клеток человека, что тормозит рост опухоли.

Однако для того, чтобы с помощью биотехнологий делать полезные человеку белки, можно использовать не только бактериальные клетки. Например, есть такой лекарственный препарат — эритропоэтин. В спорте он печально известен как допинговый препарат, потому что стимулирует образование эритроцитов (красных кровяных телец): при его применении кровь становится более обогащенной кислородом и получается больший энергетический запас. Однако высокие результаты в спорте — вовсе не главная цель получения этого препарата. С его недостатком в организме (вследствие мутаций в гене, кодирующем его производство) связан целый ряд болезней человека. Искусственно полученный эритропоэтин используется как лекарственное средство при онкологических заболеваниях, почечной недостаточности, при трансплантации, анемиях и т. д. — спектр колоссально широк, но для его производства бактериальные клетки не подходят. Почему? Потому что функциональный эритропоэтин — это очень сложная белковая молекула, глобула.

Мы уже говорили, что белок не только обладает определенной линейной последовательностью, закодированной в нашей ДНК, но и претерпевает так называемые посттрансляционные (после того, как с молекулы PHК синтезировалась линейная аминокислотная последовательность белковой молекулы) модификации, когда отдельные аминокислоты белка под действием ферментов претерпевают изменения. Например, гликозилирование — присоединение к определенным аминокислотам белковой молекулы остатков сахаров. После этого молекула белка сворачивается в глобулу.

Так вот, оказывается, что многие посттрансляционные модификации не работают в бактериальной клетке, и глобулы имеют неправильную конформацию.

Поэтому многие рекомбинантные белки, для функционирования которых, как для эритропоэтина, важны модификации и правильная конформация, получают в культурах клеток животных, в том числе и человека.

Может возникнуть естественный вопрос: зачем встраивать ген человека в клетки человека и других млекопитающих, если аналогичный ген уже есть в этих клетках?

Дело в том, что гены, которые находятся в геноме каждой клетки, в организме работают только в определенные моменты или в определенных тканях и клетках. Так, белок эритропоэтин синтезируется клетками почек и печени, хотя кодирующий его ген присутствует во всех клетках. Активируют работу гена определенные фрагменты генетического текста, получившие название промоторы.

Эти генетические элементы есть у бактерий, у вирусов, у всех организмов. Однако бактериальные промоторы не будут работать в клетках млекопитающих просто потому, что в этих клетках нет бактериальных белков, которые узнают генетический текст промотора и запускают работу гена. А вот если вирус (например, гриппа) способен инфицировать клетки человека и размножаться в них, это значит, что его — вируса — промоторы, регуляторные элементы включения генов, универсальны для вируса и человека. С очень высокой степенью вероятности они смогут контролировать и работу генов человека, если их правильно разместить в генно-инженерной конструкции.

УПРАВЛЯЮЩИЕ РАБОТОЙ ГЕНОВ

Сформировавшись из одной клетки, наш организм становится многоклеточным, и во взрослом состоянии насчитывает около 10^14 клеток более двухсот различных типов. У нас есть кровь, глаза, волосы и т. д., причем в клетках, составляющих различные органы, — один и тот же геном, который был заложен в исходной зиготе. Но представьте себе, какой будет ужас, если в волосяном фолликуле вдруг заработают гены, предназначенные обеспечивать, скажем, генерацию эритроцитов, и волосы станут красными от эритроцитов! Или в глазах начнут работать те гены, которые контролируют рост волосяного фолликула...

Думаете, ничего подобного не может быть? Увы, это происходит, когда начинается патологический процесс. Но в норме работа генов в каждом клеточном типе контролируется исключительно строго отдельными участками ДНК. Определенный район ДНК, который лежит в непосредственной близости к гену и обеспечивает проявление этого гена, называется промотором (от англ, promote — «продвигать», «способствовать», «рекламировать»). Когда-то эти участки генома относились к так называемой мусорной ДНК, потому что ученые не знали ничего об их назначении. Теперь мы знаем, что регуляторные (промоторные) последовательности, составляющие около десяти процентов генома, есть у каждого гена или их комбинаций.

Знание генетического текста вирусных промоторов оказалось для ученых крайне важным. Нам уже известно, что вирусы не могут размножаться вне клетки, а попав в нее, вирусный геном начинает усиленно функционировать, обеспечивая размножение вируса, то есть все его промоторы должны быть очень активны. Этим и воспользовались наблюдательные генные инженеры. Они предположили, что если в генетическую конструкцию поместить вирусный промотор, а за ним смонтировать нужный ген, кодирующий, например, синтез эритропоэтина, то вирусный промотор, способный работать в любых клетках, обеспечит высокий уровень синтеза и вне организма — в выбранной культуре клеток млекопитающих. Таким образом, начав когда-то с бактерий, люди со временем точно так же научились работать с клетками млекопитающих и человека in vitro (вне организма), чтобы вводить туда с помощью генных манипуляций определенные гены и производить нужные биомедицинские белки.

Подведем небольшой итог. Ученые начали с бактерий: в бактерию можно ввести любой ген, она очень быстро размножается, передавая нужный ген по наследству, и синтезирует необходимые белки. На следующем уровне мы научились получать нужный белок не только в клетках бактерий: любой белок человека сегодня удается синтезировать в человеческих клетках, культивируемых вне организма.

Возможности генной терапии

Ген должен работать на своем месте

В предыдущей главе мы рассмотрели способы использования генов человека в бактериях или культурах клеток млекопитающих вне организма, чтобы синтезировать белки, которые могут быть использованы для разных целей. Например, есть люди, у которых нужный белок не производится самим организмом в необходимом количестве, потому что какой-то ген не работает вообще или работает недостаточно активно. Этим пациентам можно вводить соответствующий белок, синтезированный вне организма, и такая заместительная терапия позволит им вести более или менее нормальный образ жизни.

Возникает естественный вопрос: почему бы вместо заместительной терапии не исправить работу генов, которые находятся внутри организма?

В общем виде задача выглядит так: ДНК и гены — это осмысленный текст, с которым можно работать, то есть брать большой кусок какого-то гена, прикреплять к нему другой кусок генетического текста (называемый регуляторной последовательностью), и все это вместе вводить в определенные клетки организма, чтобы оно попало туда, куда нужно, а главное — стало работать. Но как это сделать?

Если посмотреть на достижения цивилизации, то синтетических открытий[6] типа теоремы Пифагора или теории относительности Эйнштейна было сделано не так уж много. Люди не столько изобретают нечто «из головы», сколько видят, как это устроено в природе, и потом немножко по-другому используют для собственных нужд. Возьмем, например, аденовирусы, с которыми каждый из нас сталкивается ежегодно, а то и по нескольку раз в году. Вдруг запершило в горле, потекло из глаз, из носа, а через два-три дня все прошло. Скорее всего, причиной была аденовирусная инфекция, так как этот вирус очень легко проникает в клетки слизистых оболочек глаз, носа и верхних дыхательных путей.

Цитомегаловирус, напротив, инфицирует преимущественно эпителиальные клетки легких, печени, кишечника, почек, мочевого пузыря, молочных и слюнных желез, половых органов.

Существуют ретровирусы, которые очень эффективно инфицируют другие специализированные клетки, в том числе клетки крови, включая также входящие в ее состав стволовые клетки. Одним из таких ретровирусов является хорошо известный вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Но теперь, когда мы узнали, какие вирусы есть, какие клетки они предпочитают, каков механизм инфицирования и вирусного размножения, давайте попробуем использовать эти знания, чтобы сделать искусственный вирус. Он должен эффективно заражать нужные нам клетки, нести гены, нужные нам, а не вирусу, и при этом не должен в этих клетках размножаться. Такие искусственные генетические конструкции на основе биологических молекул получили название вектор.

ЧТО ТАКОЕ ВЕКТОР

Вспомните математику: там вектор это направленный отрезок, а в генетике, молекулярной биологии и сегодняшней биомедицине вектор — это биологическая молекула, которая направленно может что-то доставлять в определенный тип клеток или тканей. Это тот «паровозик», который протаскивает нужный нам терапевтический материал в нужное время в нужное место и заставляет его работать. Вектором (то есть несущим) он называется потому, что обеспечивает направленность доставки терапевтического средства. Слово «вектор» очень часто используется и в фармакологии, где оно тоже означает некий носитель, позволяющий осуществить направленную доставку лекарства. В случае генной терапии вектор — это сопутствующая генетическая последовательность (чаще всего молекула ДНК), которая обеспечивает терапевтический эффект внедряемого нами лечебного гена. Векторы не обязательно должны быть вирусами, но вирусные векторы очень эффективны.

В результате работы генных инженеров появились вирусы, в которые встроен ген человека, но они не могут размножаться. Такая вирусная частица проникает в клетку человека и может либо встроиться в геном клетки и там остаться навсегда, не производя потомства, либо будет обеспечивать работу гена на протяжении некоторого времени. Например, всем сегодня известная вакцина «Спутник V» как раз состоит из вируса, который проникает в клетки, находится в них какое-то время и осуществляет там синтез S-белка коронавируса. Длительность работы вектора зависит от того, какой тип вируса использовался. Если в клетке поврежден какой-то ген и она не может синтезировать правильный белок, мы можем инфицировать эту клетку вирусом, который несет неповрежденную копию гена и может встроиться в геном клетки, например, ретровирусом, — в результате в клетке окажется работающая копия гена, которая будет синтезировать правильный белок. Мы вылечили клетку! А если мы возьмем в качестве вектора, скажем, аденовирус, то он не встраивается в геном клетки, поэтому доставленный вектором ген будет работать в ней только некоторое время, так как клетка утилизирует старый материал или погибает.

Детство генной терапии

Вся совокупность биомедицинских и генно-инженерных методов исправления (коррекции) функции генов с их использованием на уровне организма получила название генная терапия. Хотя генная терапия, несмотря на свою уже тридцатилетнюю историю, все еще пребывает в юношеском возрасте, у нее уже имеется колоссальное преимущество перед многими современными медицинскими подходами в том, что ее цель — устранить причину заболевания, а не просто симптомы болезни.

ВСЕ БОЛЕЗНИ - ОТ ГЕНОВ

Все болезни человека так или иначе связаны с генами. Посмотрите вокруг: один человек каждый год болеет гриппом, а другой не подхватывает даже насморк десятилетиями. Бывает, что человек, ведущий здоровый образ жизни, начинает принимать лекарства от болезней сердца уже в сорок лет, а иной курильщик и в шестьдесят может не знать, где оно находится. У одного аллергия на кашу, у другого на рыбу. Это все заложено в наших генах и в их проявлении.

Первый случай успешного применения генной терапии для лечения врожденного иммунодефицита у четырехлетней девочки относится к 1990 году, который считается годом рождения генной терапии. Четырехлетняя Ашанти де Сильва получила генетическое лечение от тяжелого заболевания — сложного комбинированного иммунодефицита, связанного с недостатком фермента ADA. В лимфоциты малышки была введена генетическая конструкция, содержащая нормальный ген, а потом лимфоциты были возвращены обратно в организм. Процедура привела к долговременному, но не постоянному восстановлению иммунной системы у девочки. Этот первый успех был закреплен еще несколькими аналогичными случаями. Однако были и неудачи. Самый тяжелый удар в 1999 году нанесла генной терапии смерть Джесси Гелсинджера, восемнадцатилетнего американца. Этот трагический случай, серьезно приостановивший развитие нового лечебного метода, был связан с использованием аденовирусного вектора.

Проблема в том, что вирусы, как бы мы ни пытались сделать их безопасными, все равно могут вызвать у человека какие-то негативные последствия. Именно это произошло с Джесси Гелсинджером. У него было редкое генетическое заболевание, которое приводило к накоплению аммония в крови. Более тяжелые формы этой болезни приводят к гибели на первом месяце жизни, но у Джесси была относительно легкая форма, которую у него диагностировали в двухлетнем возрасте, и он находился на специальной диете, потребляя еще и по несколько десятков различных лекарственных препаратов ежедневно. Ему ввели нормальную копию гена в составе аденовирусного вектора, но, увы, какой-то фактор оказался неучтенным. Молодой человек в короткий срок скончался от побочных явлений. Дальнейшие исследования в области генной терапии по требованию регулятора (американского Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, FDA) пришлось немедленно прекратить.

Когда стали разбираться, почему произошла эта дня, то выяснились два важных момента. Во-первых был нарушен протокол и пациенту ввели чуть ли не в сто раз больше вирусного вектора, чем было запланировано. Во-вторых, у пациента, который был тяжело болен на протяжении последних шестнадцати лет, оказалась гиперчувствительность именно к аденовирусу, который использовался в качестве вектора.

В общем-то, произошел несчастный случай, но если мы хотим применять генную терапию, то должны гораздо лучше знать особенности индивидуальных геномов, чтобы не возникали неожиданные побочные последствия.

Несмотря на все «недетские» проблемы первоначального периода, генная терапия продолжала интенсивно развиваться. В 2009 году авторитетный научный журнал Science назвал успех генной терапии одним из величайших достижений первого десятилетия XXI века.

Какие же конкретные достижения генной терапии дали основание для такого лестного вывода? Первое из них — устранение генетического заболевания под названием амавроз Лебера, главным симптомом которого является полная слепота с детства.

Врожденный амавроз Лебера

Глаз человека имеет удивительное строение. Он чем-то похож на фотоаппарат или камеру смартфона, у которых есть фотопленка или светочувствительная матрица, где формируется изображение. В фотопленке светочувствительными элементами были зерна серебра, а в современном смартфоне их аналогами являются фотодиоды — маленькие элементы из кремния или другого полупроводника. Фотодиоды преобразуют световой импульс в электрический и передают его дальше — для программной обработки изображения.

А у нас в глазу находятся светочувствительные клетки (фоторецепторы), которые вместо серебра или кремния содержат особые белковые структуры — диски, уложенные один на другой, как стопка монет. Когда на верхний диск попадает квант света, начинается химическая реакция, которая преобразуется в электрохимический импульс. Именно так элемент изображения попадает в нашу центральную нервную систему — в мозг, где происходит обработка полученных сигналов.

К сожалению, эти диски, как и зерна серебра в фотопленке, расходуются по мере использования. Для здорового организма в этом нет ничего страшного, так как на смену израсходованным дискам, подпирая их снизу, поднимаются вновь синтезированные такие же белковые структуры. Однако прежние диски необходимо утилизировать должным образом, ведь если подобный «мусор» оставлять в клетке или выбрасывать наружу, то с годами пробиться через эту преграду не сможет никакой свет. Поэтому рядом с клетками-фоторецепторами расположены клетки пигментного эпителия сетчатки — профессиональные мусорщики! Они энергично поглощают сброшенные фоторецепторами использованные диски. Если же эти белковые диски по какой-то причине не уничтожаются как мусор, фоторецепторные клетки либо не развиваются, либо деградируют.

Одна из форм редких наследственных болезней глаз получившая название амавроз. Лебера, как раз связана с тем, что имеется мутация в гене RPE65 (от слов retinal pigment epithelium — пигментный эпителий сетчатки). Именно он ответствен за развитие и функционирование профессиональных мусорщиков — клеток пигментного эпителия сетчатки. Если имеется мутация в гене RPE65, то человек не будет видеть с ранних лет, поскольку биологический мусор накапливается, и это приводит к гибели всех светочувствительных клеток глаза. Что же делать?

Именно с решением этой проблемы связан, по мнению журнала Science, первый большой успех генной терапии. В качестве вектора исследователи решили взять аденоассоциированный вирус, поскольку он легко проникает в слизистые и, в отличие от аденовируса, может встраиваться в хорошо известный участок генома клетки. Мы же хотим, чтобы исправный ген остался в клетке на всю жизнь! Для этого генетики путем генно-инженерных манипуляций встроили в вектор ген RPE65 и ввели полученный препарат, позже названный Люкстурна (Luxturna), в глаза больным амаврозом Лебера.

Первые шаги в новом направлении были сделаны еще в начале 2000-х, а в 2009 году в журнале Science были опубликованы сообщения о первых значительных успехах в рамках этого исследования. Собственно говоря, это были результаты первой фазы клинических исследований. Около десятка пациентов получили инъекцию генного терапевтического препарата, содержавшего нормальный ген RPE65, и больше чем в половине случаев это привело к появлению зрения на уровне различения предметов. Больные избавились от полной слепоты, впервые увидели мир и смогли самостоятельно передвигаться по улицам и обслуживать себя. Это было очень большим достижением генной терапии, и в 2017 году в США (чуть позже и в Великобритании) препарат Люкстурна был зарегистрирован и одобрен для лечения наследственной дистрофии сетчатки глаз.

К сожалению, лечение подходит не всем. Требуется большая и долгая индивидуальная подготовительная работа. Первое условие успеха — пациенты должны быть достаточно молодыми (лучше детьми), потому что с возрастом клетки, в которых должен работать ген RPE65, погибают, а вместе с ними и фоторецепторы. Чем дольше длится заболевание, тем меньше шансов восстановить зрение.

ПОЧЕМУ ТАК ДОРОГО?

Цена препарата Люкстурна в США — порядка восьмисот пятидесяти тысяч долларов, хотя себестоимость его производства меньше пяти тысяч долларов. За что же, спрашивается, надо платить остальные восемьсот сорок пять тысяч долларов? Это стоимость тех усилий и вложений, которые были сделаны за время исследований и разработки препарата. Начавшись в 2000-х, они продолжались пятнадцать лет и завершились в 2017 году выпуском препарата.

Эти исследования проводились сначала в лаборатории, то есть in vitro («в пробирке»). По полученным результатам публиковались статьи, на использование результатов получались патенты. Патенты на применение генов, на векторные молекулы, на способы введения, анализа... на все. Потом были выполнены исследования на животных, причем надо было создать определенные модели, чтобы доказать близость заболевания животного к проявлению аналогичного заболевания человека, и доказать, что препарат излечивает, что он безопасен, и только потом переходить к стадии клинических исследований на человеке. Все эти затраты, а также интеллектуальная собственность, используемая при разработке препарата, как раз и оценивается в такую колоссальную сумму, которая распределяется между небольшим количеством выпущенных упаковок препарата, так как заболевание довольно редкое.

В США наберется всего три—пять тысяч человек, имеющих такую патологию, а в Великобритании — меньше двух тысяч человек. Расходы на лечение редких заболеваний (они называются орфанными) берет на себя государство. Поэтому когда Великобритания предложила ежегодно закупать у компании Novartis две тысячи доз, но по двести тысяч фунтов за дозу, компания легко согласилась. Стабильный, хоть и меньший доход лучше, чем ничего.

Тяжелый комбинированный иммунодефицит

Приведу еще один пример генной терапии, очень успешный, хотя начиналось все неоднозначно. Есть такое заболевание — алимфоцитоз, или тяжелый комбинированный иммунодефицит. Это результат мутации в некоторых генах, которые, как мы помним, присутствуют в каждой клетке, но работают только в клетках иммунной системы — Т-лимфоцитах крови. Если какой-то из этих генов в лимфоцитах крови не работает, не происходит синтез необходимого белка, то наступает иммунодефицитное состояние. Дети рождаются с полным отсутствием иммунной защиты организма и подвержены любой инфекции, в результате чего умирают в первые годы жизни. Они могут жить только в стерильных условиях. К счастью, это очень редкое заболевание.

Дэвиду Веттеру удалось прожить девять лет. История его жизни легла в основу американского фильма «Bubble boy» («Парень из пузыря», 2001 год). В фильме все кончается хорошо, но в реальности, к сожалению, счастливого конца не получилось. На протяжении всей своей жизни Дэвид жил в специальных стерильных условиях в пузыре-коконе. Это пагубно сказалось на его психике. Потребность в развитии, желание быть человеком и жить полноценной жизнью, а также давление общественности привели к тому, что врачи все-таки согласились попробовать провести операцию по пересадке костного мозга, которая могла бы его спасти. Но чуда не произошло, спасти мальчика не удалось — он умер от рака крови, вызванного вирусом, попавшим в костный мозг донора. Дэвид так и не попробовал кока-колу, о которой мечтал всю жизнь.

Но с появлением генной терапии появилась надежда: а вдруг удастся лечить такой вид иммунодефицита с помощью этого нового метода? Шансы на успех были, ведь кровь — уникальная ткань человека, и работать с ней гораздо легче, чем с другими тканями организма. Неслучайно первые попытки людей совершать какие-то манипуляции с кровью восходят к началу XVI или даже середине XV века.

Но вернемся к алимфоцитозу. Ход рассуждений исследователей был примерно таким. Мы знаем, что у данного человека имеется мутация гена, вызывающая неправильную работу Т-лимфоцитов, отвечающих за иммунитет. Значит, если в лабораторных условиях ввести в стволовые клетки крови, из которых образуются лимфоциты, вирусный вектор, содержащий нормальную копию нужного гена, а потом трансплантировать обратно тому же самому пациенту, то, может быть, из них образуются «правильные» лимфоциты, способные обеспечить иммунную защиту?

Клинические исследования начались в 1999 году и проводились параллельно во Франции и Великобритании с участием двадцати мальчиков. Введение ретровирусного вектора, содержащего нормальную копию гена рецептора Т-лимфоцитов, в гемопоэтические стволовые клетки (дающие начало всем клеткам крови) восстановило развитие функциональных Т-клеток и, таким образом, запустило нормальную работу иммунной системы. Однако в 2003 году была опубликована информация, что у четырех мальчиков во Франции развилась лейкемия — онкологическое заболевание крови.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КРОВИ

Такие разные, непохожие друг на друга клетки крови имеют в организме, как ни странно, общее происхождение. Гипотезу первоначальной стволовой клетки крови выдвинул в начале XX века русский биолог Александр Максимов. Много позже, в 1960-х годах, эту теорию подтвердили экспериментально канадские ученые Эрнест Маккаллох и Джеймс Тилл. С этого времени стала активно развиваться трансплантация стволовых клеток крови или красного костного мозга (ткань, где они находятся) для восстановления кроветворения при различных заболеваниях.

Клинические исследования были приостановлены. Ученые многих лабораторий начали изучать причины возникновения болезни. Скоро стало ясно, что в двух случаях виноваты не испытатели, а судьба, так как у детей обнаружились мутации в других генах, приводящие к лейкемии. А вот у двух других мальчиков «виновной» оказалась большая доза лекарства, которое исследовалось. Когда повышалось количество вводимого ретровируса, он начинал встраиваться в определенное место генома, где активизировал работу протоонкогена, то есть гена, который может вызвать онкологию. Примерно так выглядит разница между тем, куда попадет брошенная наугад горсть песка и где окажется солидная кучка песка, брошенная лопатой. Во втором случае песок так и ляжет в какое-то одно место кучкой. То же самое так и происходит и в геноме. Ситуация была критической. С одной стороны, малыши, которые из-за основного заболевания долго не проживут в любом случае, с другой — понятные механизмы возникновения опухолевого процесса, которые можно контролировать. Чашу весов в сторону продолжения исследований склонили настойчивые родители мальчиков. Аргументируя свою позицию, они заявляли, что детская лейкемия сегодня лечится с эффективностью более восьмидесяти процентов, а от алимфоцитоза, тяжелого комбинированного иммунодефицита, излечения нет вообще. В результате исследования с использованием пониженной дозы векторного вируса были продолжены. Эти события привели к разработке высокочувствительных методов для обнаружения мест встраивания вирусов в геном и улучшения дизайна векторов.

Надо подчеркнуть, что негативная информация запоминается лучше, чем позитивная, поэтому большинство помнит случаи лейкемии, о которых трубили средства массовой информации, а вот огромный успех, достигнутый этими испытаниями, остался почти незамеченным. Десяток лет назад были опубликованы результаты долгосрочного наблюдения за девятью мальчиками из французского исследования, которым на тот момент было восемь—одиннадцать лет. Один из четырех детей, У которых в ходе этого испытания развился лейкоз, умер. Трое других успешно прошли курс химиотерапии и были среди семи детей, у которых наблюдалось долговременное восстановление иммунитета: более десяти лет они живут нормальной жизнью. Результаты лондонского исследования показывают аналогичное влияние на восстановление иммунитета, и только у одного ребенка развилась излечимая лейкемия.

Это опять свидетельствует о том, что избыточная доза вектора — не единственный фактор, воздействующий на результат генной терапии. Возможно, здесь еще играют роль некоторые индивидуальные особенности генома — все-таки мы все разные.

В 2016 году для использования на европейском рынке коммерческих медицинских препаратов было одобрено лекарство Стримвелис (Strimvelis), предназначенное для лечения комбинированного иммунодефицита. Около четверти века занял путь от первого эксперимента до клинического применения. Сегодня в мире коммерчески доступен целый ряд генно-терапевтических препаратов. Помимо упомянутых, это противоопухолевые препараты, зарегистрированные в Китае, — Гендицин (Gendicine, 2003 год) и Онкорин (Опсоппе, 2005 год), — пионеры одобренной официально генной терапии, и препарат, стимулирующий рост кровеносных сосудов, Неоваскулген (Neovasculgene, 2011 год), зарегистрированный в Российской Федерации, одним из разработчиков которого является автор этих строк.

Через несколько лет в США и Европе были зарегистрированы противоопухолевые препараты: Имлиджик (Imlygic) для лечения меланомы, Кимриа (Kymriah), Эскарта (Yescarta), Текартус (Tecartus) для лечения лимфом, а также Золгенсма (Zolgensma) для лечения спинальной мышечной атрофии.

Далеко не все генные препараты имели успех и оказались востребованными. Генный препарат Глибера (Glybera) для лечения нарушения липидного обмена был одобрен в Европе по цене около одного миллиона евро за курс лечения в 2014 году. Всего один человек сумел предоставить страховым компаниям необходимые бумаги для получения нужной суммы и препарата. Надо отметить, что в Европе потребителями этого вида лечения могут быть чуть более ста пятидесяти человек ежегодно. В 2017 году лицензию на данный препарат продлевать не стали, и он ушел с рынка. Но не только коммерция может быть причиной неуспеха. Летом 2020 года была опубликована информация о трех летальных исходах в ходе клинических исследований высокодозной генной терапии нейромиопатии — редкого заболевания, связанного с плохим развитием скелетных мышц. Негативный эффект введения вируса, послужившего вектором, сказался в данном случае на печени и желудочно-кишечном тракте. В группе низких доз негативных эффектов не было.

Давайте повторим вкратце суть метода генной терапии. Мы берем вирус — это некий генетический текст, вставляем в него ген — опять-таки целый фрагмент генетического текста, добавляем туда же регуляторную последовательность, и у нас получается терапевтический вектор, который мы направляем в клетки человека, чтобы они заработали по-другому — так, как нужно нам или как они работают в норме.

Генная терапия доказала свою эффективность, она будет развиваться и идти своим путем. В ней мы используем ДНК и гены как небольшие фрагменты текста. Сейчас исследователи могут работать с параграфами генетического текста — еще не на уровне каждой отдельной буквы-нуклеотида, но уже и не на уровне Целой книги или ее главы.

Рис. 5. Вирус-векторная терапия

Найти и обезвредить

Генная терапия — это выдающееся достижение человека, которое позволило, пусть не очень эффективно, но все же восстанавливать или изменять функцию гена за счет того, что его нормальная копия может быть внесена в организм в составе вектора. Пользуясь тем же сравнением с текстами на бумаге, мы должны «напечатать» целую страницу или параграф правильного генетического текста и «вклеить» дополнительно в книгу текст так, чтобы на этой странице (в этом параграфе) сохранилась функция гена и проявилась в виде синтезируемого белка. Благодаря созданию генной терапии, ученые научились работать с генетическим текстом, но не путем коррекции одиночных букв, а используя достаточно большие фрагменты. Поэтому приходится вставлять целиком новый, правильный фрагмент, а неправильный при этом никуда не исчезает.

Легко сказать «вставить правильный фрагмент (страницу)», но эта задача представляется абсолютно невыполнимой, если мы вспомним, что в нашем организме ни много ни мало сто триллионов клеток, и в каждой имеется генетический текст объемом в три гигабайта.

К счастью, делать это во всех клетках организма не приходится. Во-первых, можно ограничиться только теми из них, которые из-за мутации какого-то гена отвечают за нарушенную функцию определенных тканей. А во-вторых, порой достаточно внести исправления в генетический аппарат только части этих клеток, чтобы человек уже мог полноценно жить.

В этой главе мы разбирали лечение с помощью генной терапии тяжелого комбинированного иммунодефицита, когда в кроветворных стволовых клетках имеется мутация, приводящая к тому, что организм полностью лишен иммунитета. Если мы добавляем нормальную копию гена в часть стволовых кроветворных клеток, этого часто оказывается достаточно, чтобы восстановилась их функция (в данном случае иммунитет). Получается, что фактически мы не лечим поврежденный ген (он никуда не исчезает, до него ученые пока не могут добраться), а просто дополняем часть клеток организма нормальным геном.

К сожалению, есть заболевания, при которых эта тактика не подходит. Вспомним, что у нас в каждой клетке (кроме половых) имеется двойной набор хромосом, а значит, и два различающихся генома — от мамы и от папы. Предположим, что есть мутация в мамином аллеле[7] какого-то гена, но приводит она не к тому, что этот ген совсем не работает, а к тому, что он работает неправильно — синтезируется измененный белок. И даже если со второго аллеля у нас продуцируется правильный белок, наличие неправильного может привести к гибели клеток и деградации ткани, а без нее организм не может нормально функционировать.

Получается, что возможны ситуации, когда добавление еще одного здорового аллеля в клетку не приведет к излечению. А что приведет? Тут мы и приходим к пониманию, что умения работать с генетическим текстом целыми страницами или параграфами явно недостаточно. В данном случае в тех клетках, где нам нужна рабочая, функционирующая копия конкретного гена, необходимо исправить очень точно, побуквенно, генетическую мутацию, то есть именно тот нарушенный фрагмент генетического текста, который имеется в мамином аллеле. И только в этом случае мы сумеем устранить заболевание.

Но как это сделать? Как можно внутри клетки, среди трех миллиардов букв генетического текста правильно найти несколько нужных букв (обычно две-три), да еще их исправить? Воистину это задача, по сложности достойная человека, и она волновала ученых уже давно. Ведь речь идет о том, чтобы исправлять буквы генетического текста не в пробирке, как это делалось на заре генной инженерии, а в живой клетке! Даже в генной терапии, то есть на следующем, более высоком уровне, ученые пытаются работать с генами в клетке, но, увы, не могут найти одиночные буквы, а вклеивают в генетическую книгу целые листы, прочтение которых приведет к нормализации работы организма.

Новая задача генетики теперь выглядит так: суметь в каждой из 10^14 клеток организма найти и обезвредить одну из 3 х 10^9 букв.

Геномное редактирование

Исправляем букву за буквой

Итак, в начале 1990-х годов перед специалистами в области генетики и биохимии со всей остротой встала задача побуквенного редактирования генетического текста. Обычные помощники редактора — цветная ручка и программа Word — здесь бесполезны, ведь генетический текст представляет собой цепочку повторяющихся химических молекул — нуклеотидов, которые служат буквами этого текста. Требовалось создание принципиально новых инструментов, позволяющих работать с генетическим текстом с очень большой точностью, на уровне отдельных букв, то есть нуклеотидов, — что-то вырезать, что-то вставлять, и при этом очень точно и в живой клетке. Неправильная замена всего лишь одного нуклеотида может привести к остановке работы гена и гибели клетки.

Первые такие инструменты и появились в 1990-х годах (помните, в главе 2 мы начали рассказ о Джошуа Ледерберге и генетической рекомбинации). Для того, чтобы заменить букву или несколько букв генетического текста нам надо провести рекомбинацию, — только так в клетке может произойти замена. А для того, чтобы она произошла именно в нужном нам месте, необходимо внести разрыв в цепь ДНК. Для этого использовались особые ферменты — нуклеазы. Кроме того, какой-то механизм должен их направить в нужное место и точно распознать именно ту последовательность нуклеотидов (назовем ее «генетическим словом»), в которой нам нужен разрыв.

Для этого стали использовать так называемые мегануклеазы. Это крупные белковые молекулы, которые, кроме нуклеазной активности, характеризуются протяженным «генетическим словом», или, как говорят ученые, сайтом, который они распознают. Обычно это «слово» состоит из пятнадцати-сорока нуклеотидов. Такие длинные слова уникальны для геномов. Например, одна из первых мегануклеаз, I-Ssel, распознает определенную последовательность из восемнадцати нуклеотидов, и такое их сочетание случается настолько редко, что может встретиться в генетическом тексте, только если он в двадцать с лишним раз больше генома человека. Недостатками мегануклеаз являлись незначительное количество распознаваемых «генетических слов» и их размер (мега!), то есть протяженность сайта распознавания. Все это осложняло проведение экспериментальных работ с ними.

Первый значимый прорыв в направленном распознавании генетического текста внутри клетки произошел в начале XXJ века. Тогда придумали искусственные распознающие нуклеазы, которые получили название нуклеазы типа цинковых пальцев (zinc-finger nucleases). Наиболее интересен данный тип нуклеаз с точки зрения творческого, дизайнерского подхода человека к использованию фундаментальных знаний, поэтому далее мы уделим им немного больше внимания, а заодно узнаем об очень важных генах.

Транскрипционные факторы

Мы уже говорили в главе 1, что в изученную часть ДНК человека, помимо самих генов, кодирующих белки, входят регуляторные последовательности — фрагменты ДНК, ответственные за работу гена. С химической точки зрения это такие же участки ДНК, как и гены, поскольку тоже составлены из четырех чередующихся в определенной последовательности нуклеотидов А, Т, Г и Ц. Как же эти участки ДНК могут регулировать работу гена?

Информация обо всех процессах в клетке записана в последовательности ДНК. Чтобы считать информацию с флешки, ее надо вставить в компьютер. Другим видом накопителя информации является стример. Он записывает информацию на магнитную ленту и используется в больших дата-центрах. Именно стримерам принадлежит рекорд по плотности записи информации на единицу площади. А принципиальное устройство стримера очень простое. Может, кто-то помнит или видел катушечный магнитофон: там две катушки, с одной лента сматывается, на другую наматывается, а посередине магнитная головка, которая касается ленты и считывает информацию, превращая ее в звук. Информация с ДНК — «магнитной ленты» — считывается такой же биологической «головкой». Этот «звукосниматель», который «озвучивает» ген, то есть делает его простую копию для преобразования в белок, называется транскрипционным комплексом, а процесс «озвучки» — транскрипцией. Транскрипционный комплекс собирается из нескольких белковых молекул, очень важно, чтобы он собрался в правильном месте, то есть выбрал правильный генетический текст для озвучки. За это отвечают так называемые транскрипционные факторы — белковые молекулы, которые узнают определенные комбинации «слов» (последовательностей нуклеотидов), носящих название промоторы.

И транскрипционные факторы, и промоторы эволюционно изменились очень мало, о чем свидетельствует их поразительное сходство у совершенно различных биологических видов, от плодовой мушки дрозофилы до человека. Это доказывает, что транскрипционные факторы были очень значимы в эволюции живых существ и, как мы теперь понимаем, играют огромную роль в функционировании наших генов.

Дело в том, что работа генов в организме подчинена тем же самым законам, что и устройство любого социума. Это значит, что в нем есть «господа» — такие, как транскрипционные факторы, а есть гены-«работники», которые подчиняются транскрипционным факторам. Один такой фактор может контролировать работу сотни генов, поэтому всего полторы тысячи транскрипционных факторов контролируют работу двадцати пяти тысяч генов.

Транскрипционный комплекс из транскрипционных факторов и различных кофакторов[8] как раз и задает все особенности транскрипции гена в определенной клетке и в определенное время. Изучать работу определенного гена в определенных условиях — это большая наука, но пока оставим эту тему в стороне.

Нас в данный момент интересует, что транскрипционные факторы очень хорошо умеют распознавать генетический текст, но все по-разному. Одни распознают текст очень специфично, и тогда не требуется слишком большой сборки из транскрипционных факторов и кофакторов, а другие — менее специфично, и тогда для повышения точности транскрипции генов могут понадобиться еще какие-то белки-помощники и еще один кофактор, которые осуществили бы «тонкую настройку».

Понятие транскрипционного фактора появилось в конце 1980-х годов, а чуть позже исследователи обнаружили целое семейство транскрипционных факторов, белковая структура которых имела повторяющиеся элементы, и эти элементы получили название цинковые пальцы.

Нуклеазы типа цинковых пальцев

Свое странное название эти фрагменты белковых молекул получили за характерную трехмерную структуру и наличие в их составе ионов цинка. Цинковый палец представляет собой последовательность аминокислот, состоящую из пары близко расположенных цистеинов (аминокислотных остатков), потом следует промежуток в полтора-два десятка любых аминокислот, и опять идут два близко расположенных цистеина или гистидина. Ионы цинка стабилизируют, удерживают эту конструкцию, связываясь координационными связями с двумя близко расположенными цистеинами. Представьте себе веревку с четырьмя завязанными узелками — это будут цистеины или гистидины. А теперь пальцами притяните все узелки в одну точку. Ваши пальцы сыграли роль иона цинка. У вас получатся три петли, которые можно назвать тремя пальцами. Так вот, каждый палец достаточно точно узнает три-четыре нуклеотида ДНК, расположенные в определенном порядке, и связывается с ними. Три пальца уже распознают девять-десять нуклеотидов — определенное слово генетического текста.

Рис. 6. Нуклеазы типа цинковых пальцев

Среди трех миллиардов букв, составляющих генетический текст ДНК, группа из трех-четырех букв попадается довольно часто. А вот если мы возьмем сочетание пяти-шести цинковых пальцев, которые однозначно определят последовательность примерно пятнадцати-семнадцати нуклеотидов генетического текста, то с вероятностью девяносто девять целых и девять десятых процента это будет уникальная последовательность среди трех миллиардов букв.

Конечно, для того чтобы этого добиться, тоже потребовалась большая работа. Цинковые пальцы были исследованы вдоль и поперек, и для каждого пальца специалисты изучили специфичность распознавания ими определенных сочетаний нуклеотидов. С помощью этого знания, используя рекомбинантные технологии, исследователи смогли создать искусственные сочетания цинковых пальцев, которые бы распознавали с полной определенностью нужный фрагмент генетического текста внутри клетки.

Сейчас изучены шестьдесят четыре цинковых пальца, которые могут распознавать шестьдесят четыре различные комбинации из трех нуклеотидов, входящих в последовательность ДНК. Исследователи научились достаточно точно распознавать очень конкретные слова генетического текста, с точностью до одной буквы, до одного нуклеотида, — и все это внутри живой клетки. Теперь, опять-таки с помощью рекомбинантных технологий, нужно было к распознающей части цинковых пальцев, которые у нас есть, дополнительно синтезировать и вставить в ту же самую белковую молекулу специальный белковый фрагмент, который обладает нуклеазной активностью. Это значит, что он может нарушать ковалентные связи в молекуле ДНК, то есть разрезать нить ДНК в том месте, где цинковые пальцы распознали определенную последовательность букв генетического текста.

Если мы знаем, какой конкретно генетический текст нужно исправить из-за наличия в нем мутации, и есть определенный нуклеотид, который нуждается в замене, то следующим шагом должна быть эта самая замена с помощью гомологичной генетической рекомбинации.

Технология использования нуклеаз типа цинковых пальцев активно развивалась в первое десятилетие XXI века. Очень большой вклад в разработку нуклеаз цинковых пальцев и связанных с ними методов редактирования генома внес американский генетик российского происхождения Федор Урнов. Однако у этого метода обнаружились и некоторые недостатки. Ограниченное количество известных цинковых пальцев значительно сужает применимость подхода для распознавания любого генетического текста. К тому же эта технология оказалась очень трудозатратной и дорогостоящей, так как для каждой конкретной мишени надо было разрабатывать особую нуклеазу цинковых пальцев, и на это уходило шесть — девять месяцев.

Конструкции TALEN

В 2010 году был открыт новый, более перспективный инструмент, позволяющий распознавать и разрезать последовательности генетического текста с большим успехом, чем нуклеазы цинковых пальцев. Это были особые искусственные конструкции, полученные из бактерий растений. Они были названы TALEN (Transcription activator-like effector nucleases), что расшифровывается как эффекторные нуклеазы, схожие с активаторами транскрипции. Распознаванием букв ДНК в них занимаются особые белковые домены, каждый из которых распознает только один нуклеотид. В природе есть прототипы таких доменов: это белки некоторых бактерий-паразитов, живущих в клетках сельскохозяйственных растений. Попадая в ядро растительной клетки, эти бактериальные белки имитируют транскрипционные факторы и связываются с определенными участками ДНК, активируя гены, необходимые для выживания паразита.

МЕТОД ГОДА

Термин геномное редактирование возник в конце первого десятилетия нынешнего века, а в 2011 году редактирование генома было признано методом года. Название метода подразумевало, что внутри клетки мы можем найти короткую последовательность генетического текста, состоящую примерно из пары десятков нуклеотидов, и заменить в ней хотя бы одну букву.

Вариабельность нуклеаз TALEN гораздо больше, чем у белков типа цинковых пальцев, и направлять нуклеазы можно даже более точно. Но это опять белок который каким-то образом надо сделать рекомбинантным и проверить эффективность его связывания c нашей последовательностью ДНК, которая является мишенью. Потом к нему должен быть присоединен фермент, обладающий нуклеазной активностью, то есть разрезающий ДНК в нужном месте. Это тоже достаточно сложно и трудоемко, к тому же взаимодействие двух разных белковых доменов может быть неоднозначным, да и специфичность не всегда возрастает. Тем не менее открытие TALEN'ов повысило интерес человека к точному редактированию генома.

Но почему надо обязательно заменять? Мы можем просто разрезать ДНК и не производить никакой гомологичной рекомбинации. Тогда, естественно, работа клетки нарушится. Как ни странно, это тоже инструмент, ведь для того, чтобы изучить работу гена в живой системе, нужно этот ген удалить и посмотреть, что будет без него. Этот стандартный исследовательский прием получил название генетический нокаут, или вышибание гена. В 2010 году была присуждена Нобелевская премия за разработку генетического нокаута с использованием эмбриональных стволовых клеток на экспериментальных моделях — мышах. Там тоже все основывалось на гомологичной рекомбинации, но если в природе такая рекомбинация происходит с частотой 10-6-10-7 событий на одну клетку, то в системе редактирования генома за счет внесения разрыва ДНК в нужном месте эффективность этого процесса повышается на три-четыре порядка. Это принципиально меняет трудозатраты и подход.

Но в 2013 году ситуация в технологии редактирования генома кардинально изменилась: мир заговорил о CRISPR/Cas9 — эта загадочная аббревиатура сегодня в первую очередь ассоциируется с тем, что мы называем геномным редактированием, а за открытие, которое за ней скрывается, была вручена Нобелевская премия по медицине 2020 года.

Революционная система CRISPR/Cas9

Впервые в мире биологии, биотехнологии, наук о жизни аббревиатура CRISPR прозвучала в 2002 году, но сегодня все специалисты в этих областях знают, что за непонятными буквами CRISPR скрывается очень большое научное открытие. Может быть, со временем оно даже будет оценено как одно из великих открытий первых десятилетий XXI века.

Расшифровывается эта аббревиатура тоже не слишком понятно: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. По-русски: кластеризованные (расположенные группами) регулярно прерывающиеся короткие палиндромные повторы (напомню, что палиндромы — это слова-перевертыши, такие как слово «или», известная фраза «А роза упала на лапу Азора»).

На самом деле история этого открытия уходит в начало 1990-х годов. Конечно, начали с простейшего — микроорганизмов. И вот когда ученые стали расшифровывать генетический текст, составляющий геном микроорганизмов, как раз и была обнаружена эта странность — короткие палиндромные повторяющиеся фрагменты генетического текста в геноме бактерий, причем разных. Схематично это выглядело так: «или», «а роза азора», «или», «упала на лапу», «или»...

Было совершенно непонятно, к чему эти «или» могут относиться, и необычный феномен оставался загадкой очень долго. Понять, с чем имеют дело, ученые смогли только благодаря тому, что технологии секвенирования и анализа генетического текста совершенствовались все это время, а база знаний о геномах различных организмов постоянно пополнялась. Это может показаться удивительным, но в 2005 году сразу трем независимым группам исследователей удалось сделать шаг в понимании системы CRISPR. Именно широкомасштабное внедрение технологии секвенирования (напомним, что это специальный технологический процесс чтения генома, последовательности нуклеотидов ДНК) и компьютерного анализа генетического текста, который сегодня составляет отдельное направление исследований под названием биоинформатика, позволили сделать этот шаг.

Группа испанских ученых с помощью биоинформационных подходов анализировала геномы бактерий, которые уже были секвенированы и генетические тексты которых находились в базах данных, и обнаружила там коротенькие фрагменты бактериофагов — вирусов бактерий, разделенных «или», «упала на лапу». Как говорили раньше, произошло «открытие на кончике пера», только теперь вместо пера были принтер и компьютер. Две группы из Франции совершенно независимо секвенировали уже другие бактериальные геномы, которых еще не было в базах данных, и тоже обнаружили там маленькие кусочки генетического текста бактериофагов, разделенные повтором «или», «а роза азора» либо другими. Пазл понемногу начинал складываться. У бактерий в геноме есть фрагменты генетического текста их врагов — бактериофагов, то есть вирусов бактерий. Кусочки текста короткие, два десятка нуклеотидов. Это не то, что обнаружил Ледерберг, когда описывал интеграцию целого бактериофага в геном бактерии. Да и не одному бактериофагу принадлежат эти кусочки — они относятся к абсолютно разным бактериальным паразитам, которых у бактерий, как и у нас, великое множество. Это маленькие фрагменты чужого текста, разделенные палиндромами. Исследователи одной из французских групп заметили, что те штаммы бактерий, которые имели в своем геноме фрагмент бактериофага А, оказывались к нему устойчивы, не погибали. Те, которые имели фрагмент от Б, были устойчивы к Б. Но только вторая группа французских исследователей, обнаружив такое же явление, предположила, что в формирование этих структур вовлечена фрагментация (нарезание) ДНК продуктами генов с нуклеазной активностью, которые находились рядом с кластером CRISPR, поэтому соответствующие гены получили название CRISPR associated (ассоциированные с CRISPR), или Cas-гены. Более того, исследователи даже предположили, что это все нужно бактериальной клетке для борьбы с чужеродной ДНК. Это была их гипотеза. Доказательств еще не было, но уже предвиделась роль CRISPR/Cas.

НЕМНОГО ИСТОРИИ

Хочется немного остановиться на исследователях из второй французской группы. В нее входили два русских ученых — Александр Болотин и Алексей Сорокин, с которыми мне пришлось начинать карьеру в восьмидесятые годы, в бытность мою еще студентом Московского инженерно-физического института. Тогда мы встретились во Всесоюзном научно-исследовательском институте (ВНИИ) генетики и селекции промышленных микроорганизмов Главмикробиопрома СССР. Было такое ведомство, которое, помимо разработки штаммов микроорганизмов для медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, должно было в случае необходимости в кратчайшие сроки переориентировать биотехнологические производства на выпуск микроорганизмов для биологического оружия. Но мы во ВНИИ генетики занимались мирными исследованиями по генной инженерии микроорганизмов и растений.

В лихие годы перестройки, когда ни генетика, ни медицина, ни питание не интересовали никого, все, кто мог, были увлечены растаскиванием имеющегося имущества, меньшая часть населения решила продолжить свою профессиональную деятельность, но там, где она востребована. Тогда много талантливых ученых покинули СССР для научной работы в странах Европы и Америки. Александр и Алексей работали в одной лаборатории ВНИИ генетики, и сначала Алексей уехал во Францию, чуть позже к нему присоединился Александр и еще несколько человек. После отъезда Саши Болотина я увиделся с ним в Новосибирске на конференции «Фундаментальные науки — медицине» в 2007 году. Мы встретились, как будто вчера расстались, и отлично провели время, засиживаясь чуть ли не до утра за разговорами. Александр тогда докладывал о новых открытиях в области CRISPR, а я, к своему сожалению, в то время совершенно не оценил важность этого открытия. У меня были свои интересы и увлечения: генная терапия, стволовые клетки человека; мне казалось, что это очень далеко от бактерий и бактериофагов.

Казус компании Danone

Одной из компаний, давно применявших вирусы бактерий, является всем известная Danone, которая снабжает нас творожками и йогуртами под этим же торговым названием. Она активно использует бактериофаги в молочной продукции. Это делается для того, чтобы продукция, которую мы покупаем в магазине, была строго стандартизирована и сертифицирована. Любой творожок должен пройти правильный путь молочно-кислого брожения, и йогурты должны содержать только правильные микроорганизмы, чтобы получить определенный вкус. Во всех магазинах всех стран и городов продукция компании Danone не должна отличаться по качеству ни сегодня, ни завтра. Стандарт!

НЕТ В МИРЕ СОВЕРШЕНСТВА

Но представьте себе, что вы вылили ведро закваски в чан с пятьюдесятью тоннами молока. Перед тем как разлить продукт по баночкам и пустить на конвейерную упаковку, подходит дегустатор-биохимик и берет анализ. Проверяет — ба, это что ж такое? В свежем молочном продукте, кроме тех бактерий, которые были влиты в составе закваски, размножились еще какие-то! Продукт сброжен немножко по-другому, вкус чуть-чуть отличается от стандартного. Это плохо, ведь потребитель хочет, чтобы было так, как он привык. Мало того, могут измениться сроки хранения. А если йогурт скиснет раньше времени? А вдруг произойдет еще какая-нибудь неприятность, которую этот случайный попутный штамм бактерий может вызвать?

Увы, нет в мире совершенства. Иногда закваски чуть-чуть отклоняются от стандарта или молоко в чане может содержать небольшую долю случайно привнесенных бактерий. Это известная технологическая проблема.

Однако с проблемой попутных штаммов технологи научились бороться следующим образом. Специалисты выяснили, какие попутные, неправильные, ненужные нам бактерии появляются наиболее часто. И против них были найдены и выделены определенные бактериофаги, которые их убивали. При этом нужные микроорганизмы этими бактериофагами не инфицировались и чувствовали себя спокойно.

Вроде бы простое с технологической точки зрения производство, но какие там сложные взаимоотношения! Этот технологический процесс, который использовала компания Danone, отлично работал.

Но внезапно у Danone возникли серьезные проблемы. Работники компании обнаружили, что те бактериофаги, которые использовались в этом казалось бы стандартном технологическом процессе, перестали убивать ненужные бактерии. И творожки с йогуртами стали выходить скисшими, тухлыми, многие пошли в брак. Но почему?

Руководители Danone обратились за помощью к ученым. По случайности это исследование опять проводилось во Франции. Исследователи стали изучать бактерии Streptococcus thermophilus, которые наиболее часто используются для закваски, и устойчивость этого штамма к двум типам бактериофагов. Обнаружилось, что микроорганизм становится устойчив к фагу, если в его ДНК в район CRISPR попадает кусочек этого бактериофага и в бактерии активен ген Cas9. В 2007 году появилась работа, в которой было экспериментально показано, что наличие у бактерий кусочков вирусного генетического текста означает, что изучаемые бактерии были когда-то инфицированы этими вирусами и приобрели к ним иммунитет.

Прежде, до этого открытия, считалось, что адаптивный иммунитет присущ только высшим организмам, в том числе человеку. Благодаря его наличию, человек приспосабливается к окружающему миру в том смысле, что если он один раз встретился с некой инфекцией, то потом может стать к ней устойчивым. Многочисленные вакцины, которые, на наше счастье, снизили смертность от инфекционных заболеваний и тем самым увеличили среднюю продолжительность человеческой жизни лет на тридцать, как раз и связаны с адаптивным иммунитетом.

Как работает иммунитет

В отличие от бактерии, человек является многоклеточным организмом, в котором имеются различные ткани и есть системы органов, объединяющие различные ткани (опорно-двигательная, кровеносная и нервная системы), поэтому адаптивный иммунный ответ, функционирующий у человека, крайне сложен. Он основан на том, что распространение инфекции в сложно устроенном многоклеточном организме требует достаточно длительного времени — часов, а то и дней. Даже для вируса, который очень быстро распространяется по кровотоку, прохождение по кругу кровообращения все равно занимает пару десятков минут, а ведь ему еще надо проникнуть в клетки, которых в человеке 10^14, чтобы инфицировать их.

Природа позаботилась о том, чтобы при попадании инфекции в организм он был всегда готов к ответу, стоял на страже своего здоровья. Происходит это так. Иммунной системой постоянно продуцируются различные варианты либо антител, либо клеток с распознающими рецепторами, которые путешествуют по нашему телу. Их вариантов существует множество, ведь неизвестно, с каким патогеном произойдет встреча, и они должны быть «заготовлены» чуть ли не на любой случай.

А дальше две возможности. Если за цикл путешествия по организму антитело или клетка с распознающим рецептором не встретили партнера по взаимодействию (бактерию, вирус или еще какого-нибудь врага), то они потом уничтожаются самим организмом, погибает клетка, продуцирующая данный вариант антитела или распознающего рецептора. Но если один из этих стражей встретил свою мишень, к которой он подходит, как ключ к замку, то клетка, которая произвела данное антитело или распознающий рецептор, не погибает, а начинает пролиферировать, то есть активно размножаться, чтобы своими «ключами» уничтожать все эти «замки».

Этот процесс, в котором осуществляется сложное клеточно-белковое взаимодействие, происходит постоянно. Беспрестанно генерируются миллионы B-лимфоцитов, вырабатывающих всевозможные антитела, и T-лимфоцитов, которые продуцируют клеточные рецепторы, распознающие чужеродные молекулы. Эти миллионы наших защитников все время погибают; только единицы из них, если человек инфицирован, встречаются со своими «половинками», «мишенями», которых они распознали. Таким образом, наш многоклеточный организм позволяет себе иметь ненужные в данный момент молекулы и клетки, которые массово производятся и уничтожаются при неиспользовании. Но бактерия — это всего одна клетка, все происходит на одной крохотной площадке. Обязанность бактерии — делиться каждые двадцать минут; как, например, это делает Esherichia coli, кишечная палочка — у нее не хватит энергии на то, что запросто делает многоклеточный организм, кидающий в себя ежедневно два килограмма пищи. У бактерии должны быть более простые и быстрые варианты защиты от той или иной внешней инфекции, в частности от бактериофагов.

Дальнейшие исследования детально объяснили, каким образом функционирует адаптивный иммунитет бактерии. Оказалось, что он, как и у человека, изначально работает случайным образом. К примеру, в бактериальную клетку проникает чужеродная ДНК бактериофага или плазмиды. Единственное, чем может бактериальная клетка защититься от проникшей в нее чужеродной ДНК, пока еще нет иммунитета, — это расщепить врага, уничтожить целостность генетической информации, то есть порезать ее на маленькие кусочки. Как только клетке удалось разрезать ДНК бактериофага в каком-то месте (а лучше в двух или даже трех местах), молекула вирусной ДНК становится нефункциональной и нанести вред клетке уже не может.

Но кусочки, на которые клетка расщепила ДНК бактериофага, не пропадают просто так. Они встраиваются в определенный район генома самой бактерии, который мы как раз и назвали CRISPR.

Итак, та бактерия, которой счастливо удалось избежать гибели от бактериофага и встроить крошечные кусочки его ДНК (короткие фрагменты по десять-пятнадцать нуклеотидов) в свой геном, получает устойчивость к данному бактериофагу и при делении передает эту устойчивость по наследству.

После того как кусочки ДНК бактериофага попали в CRISPR-район ДНК бактерии, эта бактерия начинает делать почти то же самое, что и многоклеточный организм: со своего CRISPR-района с чужеродными фрагментами она все время транскрибирует последовательности в виде коротких молекул РНК, которые когда-то пришли в бактериальный геном от вируса. Но присутствуют они не просто так, а уже вместе с нуклеазой Cas9.

Рассмотрим теперь, что происходит при повторном инфицировании этой бактерии тем же самым бактериофагом, кусочки которого в ней имеются. Если в бактерию проникла ДНК бактериофага, то короткая РНК способна связаться с комплементарным участком ДНК этого бактериофага, ведь она когда-то от него и произошла. И как только она это сделала, фермент Cas9, то есть нуклеаза, связанная с молекулой РНК, тут же расщепляет ДНК бактериофага и убивает врага (см. рис.7).

Эту короткую молекулу РНК, которая распознает определенный кусок генетического текста бактериофага и направляет нуклеазу на чужеродную ДНК, называют направляющей (guided) РНК.

Рис. 7. Работа CRISPR системы

ЧТО ЖЕ СЛУЧИЛОСЬ С DANONE

Мы рассмотрели, как у бактерии функционирует иммунная система, и стало понятно, что за беда приключилось у компании Danone. Обычная технология, когда в молочную массу добавляли бактериофаги, чтобы удалить посторонние бактерии, не сработала, продукты выходили испорченными. Такой результат получился оттого, что сотрудники компании регулярно применяли свои бактериофаги на одних и тех же штаммах бактерий, которые в конце концов приобрели устойчивость к данным вирусам, стали нечувствительны к ним. А это значит, что бактерии приобрели адаптивный иммунитет, но совершенно другим способом, чем человек, — без всяких антител.

Следующим важным открытием стало то, что система CRISPR/Cas9 уже известной нам бактерии Streptococcus thermophilus может эффективно работать в кишечной палочке Escherichia coli, то есть система универсальна и не видоспецифична на уровне микроорганизмов. Сообщение об этом открытии опубликовали в 2011 году коллеги из Вильнюсского института биотехнологий, который когда-то тоже входил в состав Главмикробиопрома СССР и занимался получением и очисткой различных ферментов для промышленности и научной работы.

Будущие нобелевские лауреаты 2020 года Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна включились в изучение системы CRISPR в начале двухтысячных. Обе исследовательницы были специалистами по РНК и решили объединить свои усилия, чтобы экспериментально продемонстрировать молекулярные механизмы иммунитета бактерий на основе системы CRISPR/Cas9.

БОЛЬШАЯ РАЗНИЦА

Принципы распознавания чужеродных молекул, используемые иммунитетом многоклеточных (например, человека) и одноклеточных организмов (бактерий), совершенно различны. У людей главную роль в распознавании играют сложные белковые молекулы — антитела, а распознать они должны очень маленький, но значимый фрагмент того или иного белка — антиген. Он короткий, содержит порядка семи аминокислот и свернут в сложную трехмерную структуру. Антитело распознает не линейную последовательность и не отдельные аминокислоты, а антиген в целом, то есть и буквы, и то, в какую трехмерную структуру оказалась свернута эта линейная молекула.

А у бактерий система адаптивного иммунитета распознает не форму, а линейную структуру генетического текста. Есть последовательность вирусной ДНК, закодированная четырьмя нуклеотидами А, Г, Ц и Т, и есть направляющая РНК бактерии, которая должна просто распознать такую же последовательность в полтора десятка нуклеотидов, без всяких там форм, структур и сложного внешнего вида.

Коллеги из Вильнюса тоже продолжали работать в этом направлении и шестого апреля 2012 года отправили в авторитетнейший журнал Cell свою статью о роли CRISPR/Cas9 в иммунном ответе бактерий. Надо сказать, что процесс публикации научных данных в сегодняшней конкурентной среде очень сильно зависит от ненаучных обстоятельств. К сожалению, через шесть дней в публикации статьи было отказано даже без проведения внешней рецензии. Редактор журнала сразу написал авторам, что статья не представляет никакого научного интереса, и даже не обратился к своим коллегам-ученым с просьбой провести экспертизу представленных данных. Двадцать первого мая 2012 года авторы направили те же материалы в другой, как сейчас бы сказали, менее пафосный журнал Proceedings of the National Academy of Sciences (Труды национальной академии наук США), который опубликовал статью четвертого сентября. Увы, Шарпантье и Дудна опережают литовский коллектив на два месяца. Свою аналогичную статью они направили в журнал Science восьмого июня, а уже двадцать восьмого июня статья была не только принята, но и опубликована.

Сегодня нам известен целый ряд важнейших принципов устройства всего живого на нашей планете. Генетический код, то есть буквенный код нашего генома, одинаков — что у человека, что у бактерии. У всех живых существ ДНК состоит из одних и тех же четырех оснований. Принцип кодирования белков один и тот же. Этим универсальным генетическим кодом написаны индивидуальные (персональные, не одинаковые) тексты. Они отличаются последовательностями нуклеотидов, но основной принцип формирования у них одинаков.

И это не просто констатация неких научных фактов. На самом деле из них следует крайне важный для человечества практический вывод. Ученые предположили, что направляющая (guided) РНК, которая распознает генетический текст у бактерии и вируса, должна столь же успешно распознавать те самые полтора десятка букв генетического текста и внутри клетки человека. А если эта РНК так же, как в бактериальной клетке, связана с ферментом Cas9-нуклеазой, то как раз в том месте молекулы ДНК, где произошло распознавание, может быть сделан разрез. В целом ряде публикаций, вышедших в 2012 году, такая возможность подвергалась сомнению. Однако научные статьи, которые появились в самом начале 2013 года, экспериментально подтвердили ее для клеток млекопитающих, в том числе человека. Фермент Cas9-нуклеаза очень точно разрежет нить ДНК именно в том месте, на которое указала направляющая РНК. Это значит, что мы можем вносить разрыв в генетический текст человека, состоящий из трех миллиардов букв, внутри клетки с исключительно большой точностью, а главное — с удивительной простотой.

В начале этой главы мы говорили об инструментах для побуквенного редактирования генетического текста. Упоминали мегануклеазы, нуклеазы типа цинковых пальцев и т. д. Все это сложные белковые молекулы, которые обычно приходится подбирать в каждом случае отдельно и синтезировать искусственно. Для того чтобы создать подобную распознающую белковую молекулу и проверить ее действие, мы должны синтезировать определенную молекулу ДНК, потом синтезировать нужный белок, затем этот белок выделить, почистить, доказать его эффективность. Требования к правильности структуры распознающих белков очень велики, и их создание — достаточно трудоемкий процесс, который занимает до полугода.

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ СИНТЕЗАТОР

Уже больше тридцати лет ученые имеют возможность синтезировать короткие последовательности нуклеотидов с любым порядком букв на устройстве под названием олигонуклеотидный синтезатор. Я впервые познакомился с этим чудом в конце 1980-х годов, когда работал в лаборатории Университета Джона Хопкинса в США.

Синтезатор был размером с большую микроволновую печь. Туда подвешивались десятка полтора баночек, и надо было ввести нужную комбинацию букв генетического текста (А, Т, Г, Ц). Прибор начинал завораживающе щелкать, и через пару часов у меня уже был заказанный мною и введенный по буквам фрагмент генетического текста длиной в двадцать — двадцать пять нуклеотидов.

Совершенно иные возможности представило человеку открытие иммунной системы бактерий. Всего одна универсальная нуклеаза Cas9 и несколько букв генетического текста нужны для того, чтобы направить или, если хотите, запрограммировать эту нуклеазу на разрезание молекулы ДНК в определенном месте. Остальное делают природные механизмы. Сегодня можно просто, дешево и быстро химически синтезировать короткую последовательность нуклеотидов, необходимую в качестве направляющей РНК.

Сейчас скорость синтеза принципиально не изменилась, но в любом случае часа за два можно синтезировать нужную последовательность ДНК, которая будет кодировать направляющую РНК. Еще день-другой на несложные генно-инженерные манипуляции — и ваша направляющая РНК готова к работе: она находит на ДНК клетки определенный фрагмент генетического текста, который вы задали при ее синтезе, и в этом месте Cas9-нуклеаза производит разрыв ДНК.

В отличие от сложных белок-белковых трехмерных взаимодействий, у нас происходит простое уотсон-криковское взаимодействие двух линейных структур по принципу комплементарности, то есть взаимодополняемости (см. главу 1). Требуется всего-навсего определенная физиологическая концентрация поваренной соли — как в клетке и определенная температура — тридцать семь градусов Цельсия, поскольку именно при этой температуре живут наши клетки. Больше ничего не нужно. Поэтому длительность побуквенного редактирования генома сократилась от шести месяцев до десяти—четырнадцати дней. Просто, дешево и быстро! Благодаря этому, система CRISPR/Cas9 произвела революцию в современных технологиях генной инженерии.

Оттачиваем инструменты

После того как были открыты первые виды микроорганизмов, имеющих адаптивный иммунитет к бактериофагам, ученые стали искать и другие виды бактерий, тоже имеющих подобную систему защиты, и обнаружили их достаточно много. Отчасти эта активность была обусловлена стремлением запатентовать новые типы нуклеаз или принципы функционирования направляющей РНК для последующей возможной коммерциализации, но, как мы видели на примере йогуртов Danone, даже тот интерес, за который платят деньги, быстро приводит к новым научным открытиям и технологическим прорывам.

Системы CRISPR и ферменты, сходные с Cas9-нуклеазой, были обнаружены у очень многих видов бактерий. Оказалось, что они обладают несколько различающимися свойствами в плане распознавания коротких нуклеотидных последовательностей. Это важно, потому что, как мы помним, у человека в геноме три миллиарда букв, и если мы хотим как-то отредактировать генетический текст, резать надо очень точно и в строго определенном месте, то есть необходима специфичность разрезания. Например, если в случае использования CRISPR стрептококка для распознавания посредством направляющей РНК особенно важны только первые три нуклеотида, то в случае стафилококка уже требуется последовательность, в которой особенно важны первые шесть нуклеотидов. Среди трех миллиардов букв генома человека комбинация из трех нуклеотидов еще может найтись, но найти вторую такую же комбинацию из шести нуклеотидов направляющая РНК и фермент Cas9-нуклеаза едва ли сумеют, поэтому специфичность распознавания и точность разрезания будут намного выше.

Помимо поиска новых CRISPR-систем и Cas9-нуклеаз в различных бактериальных штаммах, люди, овладевшие навыками генной инженерии, сами пытаются тем или иным способом изменить, усовершенствовать эти ферменты под собственные нужды. И это на самом деле возможно, потому что если мы имеем какой-то фермент — скажем, нуклеазу, — то знаем, конечно, его структуру и можем постараться внести туда те или иные модификации, чтобы получить фермент с другими свойствами.

Например, первоначально Cas9-нуклеазы обладали такой активностью, что происходило разрезание обеих цепей ДНК. Это очень ценное качество, но исследователи решили попробовать сделать по-другому, и были получены модифицированные варианты этих ферментов, которые могли разрезать только одну нить ДНК. Почему это хорошо? Опять-таки, для повышения точности! Если мы в одной цепи ДНК делаем разрыв в одном месте, а в другой цепи — со сдвигом, скажем, на десять нуклеотидов в сторону, то направленность и точность распознавания сильно повышается, и единственный на весь геном разрез будет именно в этом месте. Бывают случаи, когда это совершенно необходимо.

Возможны и другие модификации. В частности, варьируя нуклеазную активность фермента, мы можем даже просто ее «убить», чтобы этот фермент совсем не имел нуклеазной активности. Тогда в клетке будет происходить высокоспецифичное распознавание, но никакого разрезания ДНК не произойдет вообще.

Конечно, надо честно признаться, что не все в обсуждаемом нами методе так идеально. Хотя исследователи исходят из того, что направляющая РНК осуществляет строго направленное воздействие и способна распознавать конкретные буквы генетического текста, всегда остается опасение, что случайным образом молекула ДНК может быть где-то разрезана еще и будет нарушена целостность генома. Это явление называется off-target, или внемишенный эффект. Поэтому для биомедицинских целей все усилия исследователей в использовании данного метода направлены на то, чтобы максимально повысить специфичность распознавания.

Это объясняет, зачем нужны модифицированные нуклеазы, которые распознают одну цепь. Чтобы с их помощью произвести двухцепочечный разрез, надо использовать две направляющие РНК к двум фрагментам генетического текста, и это повышает точность, а значит, уменьшает внемишенный эффект. Избегать таких эффектов — очень важная составляющая работы в области биологии и медицины, потому что главное — это все-таки безопасность для человека.

С тех пор как основным инструментом геномного редактирования стала система CRISPR/Cas9, в мире наблюдается взрывной интерес к ее применению в фундаментальной науке и множестве практических приложений. Создан целый ряд компаний, занятых редактированием геномов растений и модификацией животных. Существуют компании, работающие в области биомедицины, чтобы использовать эти же технологии в здравоохранении.

Во многих отношениях применение CRISPR/Cas9 сталкивается с теми же трудностями, что и другие сконструированные нуклеазы: это не всегда высокая эффективность разрезания ДНК, недостаточная специфичность есть проблемы с доставкой фермента в нужные клетки, а также возможность иммунной реакции (поскольку все нуклеазы содержат элементы, полученные от бактерий) и сложность оценки конечного результата. Но есть и одно громадное преимущество — простота использования по сравнению со всеми предшествующими инструментами редактирования генома.

Многие ученые внесли свой вклад в замечательные открытия, о которых мы говорили в этой главе. Но высшая награда, Нобелевская премия по химии за 2020 год, была присуждена двум выдающимся женщинам-исследователям — Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье, которые сначала участвовали в открытии адаптивного иммунитета бактерий, а потом вместе с коллегами занимались разработкой технологии CRISPR/ Cas9.

Почему открытие системы CRISPR/Cas9 заслуживает Нобелевской премии?

Союз науки и бизнеса

Не секрет, что в современном мире открытия редко совершаются учеными-одиночками. Обычно над любой серьезной проблемой работают коллективы исследователей, порой одновременно в разных странах, и всякий раз Нобелевский комитет сталкивается с весьма сложной задачей — как выбрать наиболее достойных. Здесь действует принцип, четко обозначенный в завещании самого Альфреда Нобеля. Суть его в том, что Нобелевская премия дается не за научное открытие как таковое, а присуждается тем ученым, кто «в течение предыдущего года сделал научные открытия, которые принесут наибольшую пользу человечеству».

Лауреаты Нобелевской премии 2020 года по химии Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье как раз и оказались теми учеными, которые за минувший год внесли наибольший вклад не только в открытие иммунной системы бактерий, но и в применение этого открытия, на основе которого была разработана технология для улучшения жизни и здоровья человека. К тому же новая технология, получившая название «система CRISPR/Cas9», позволяет сделать точное побуквенное геномное редактирование за считаные дни и недели, а не за месяцы и годы, как это было в ранее созданных системах геномного редактирования, что существенно экономит время и деньги для новых исследований.

Однако никакие открытия ученых сами по себе не могут принести заметную пользу человечеству — на их основе надо создать технологии, которые будут востребованы. Если научные исследования обычно финансируются государством, то технологиями чаще всего владеет бизнес, который может быть заинтересован в их внедрении. И он же получает от этого внедрения основной доход. Каждое небольшое научное достижение, даже каждый, грубо говоря, «научный чих» можно каким-то образом попытаться превратить в товар. А система CRISPR/Cas9 бактерий — это действительно выдающееся научное открытие, на основе которого можно теперь создать технологию и получить конечные продукты. Но для того чтобы не было конкурентов, необходимо получить исключительные права на использование системы CRISPR/Cas9 для разработок, прежде всего путем патентования тех возможных областей, где ее можно использовать. Какие это области — уже понятно, поскольку новый инструмент генной инженерии позволяет работать с генами не в пробирке, как это было с середины 1970-х годов, а непосредственно в живой клетке.

Сразу скажу, что почти всеми патентами на применение системы CRISPR/Cas9 владеют нобелевские лауреаты Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье, кто-то из их ближайших коллег и те компании, в которые они входят. А владение всеми патентами на использование системы означает, что за любое коммерческое применение геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9 необходимо платить владельцам патентов или их компаниям. К счастью для мировой науки, патент закрывает только возможность коммерческого использования научного достижения, но никак не ограничивает его дальнейшее применение в научных изысканиях.

Научные исследования могут проводиться без всяких ограничений.

Важнейшие области коммерческого применения системы CRISPR/Cas9 владельцы патентов видят в сельском хозяйстве (растениеводстве и животноводстве) и в индустриальной биологии, направленной на получение более высокоэффективных источников биотоплива и создание новых типов микроорганизмов, способных уничтожать те или иные отходы. Это исключительно важное направление, потому что запасы органических веществ, используемых нами сегодня (и прежде всего нефти и газа), имеют очень длительный цикл восстановления, измеряемый миллионами лет. Человечеству нужно органическое топливо, которое бы очень быстро восстанавливалось. При этом население Земли производит сегодня немыслимое количество различных отходов, которые могут даже без каких-либо аварий, просто в результате скученности, в которой живут миллиарды людей, привести к экологической катастрофе. Поэтому получение каких-то микроорганизмов, которые могут исключительно быстро, а главное, безопасно уничтожать те или иные продукты жизнедеятельности человека, тоже представляет для нас огромную важность.

Однако существует гораздо более обширная сфера применения системы CRISPR/Cas9, которая сегодня составляет семьдесят—восемьдесят процентов рынка как по своей направленности, так и по финансовым вложениям. Это медицина.

Возможное биомедицинское применение быстрой и эффективной технологии геномного редактирования изменило отношение к части редких, но смертельных заболеваний. Люди и не предполагали, что от некоторых недугов в принципе можно избавиться.

Есть неизлечимые болезни, с летальным исходом, вызванные врожденной заменой всего лишь одной буквы генетического текста в определенном гене. К ним относятся бета-гемо-талассемия — очень тяжелое заболевание крови, мелкоклеточная анемия, муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна и т. д.

Теперь появилась возможность обратить внимание на редкие генетические заболевания и попытаться лечить те из них, которые до появления революционной системы CRISPR/Cas9 были неизлечимы. Это реальный переворот в медицине, однако права на использование системы принадлежат всего лишь нескольким компаниям. Основные финансовые рынки потребления биомедицинских продуктов находятся в США и объединенной Европе, поэтому, скорее всего, коммерческое использование CRISPR/Cas9 в странах третьего мира не будет преследоваться правообладателями из-за невысоких прибылей. Но для быстро развивающихся стран с практически неограниченным рынком потребления, таких как Китай, эти ограничения могут представлять реальную угрозу, что заставляет страны действовать на опережение.

Однако, как я уже сказал, помимо коммерческого применения CRISPR/Cas9, возможно и другое использование системы геномного редактирования — в научных целях. За него не надо платить правообладателям, но оно тоже открывает совершенно фантастические перспективы.

Заглянем в «кухню»

Чтобы понять, как работает система CRISPR/Cas9 и каким образом ее можно использовать в научных целях, давайте вспомним, что мы уже знаем о ней. Это система распознавания, в которой одноцепочечная направляющая РНК, попадая внутрь клеточного ядра, очень точно распознает короткий фрагмент ДНК (примерно полтора десятка букв генетического текста) по принципу комплементарности. Эта направляющая РНК ассоциирована с белковым комплексом, который называется Cas9 и обладает нуклеазной активностью (нуклеаза — это белок, который может вносить разрывы в цепи ДНК). Направляющая РНК подводит этот белок к совершенно определенной, уникальной последовательности длиной около полутора десятков нуклеотидов, и белок Cas9 вносит в этом месте двухцепочечный разрыв, разделяя таким образом ДНК на два фрагмента.

А если мы попытаемся изменить свойства комплекса? Ученые предложили еще один вариант: хорошо, пусть распознавание происходит с помощью распознающей РНК и комплекса Cas9, но мы внесем в этот белок-нуклеазу определенные мутации, которые полностью устранят нуклеазную активность. Значит, распознавание будет, а разрезания не будет! Зато получится очень точная система позиционирования — не хуже, чем современный смартфон, который, находясь в любой точке мира, определяет свое положение с точностью до двух-трех метров.

Зачем все это нужно? Давайте опять вспомним «наши» биотехнологические достижения и генно-инженерные конструкции. Мы уже синтезировали эту направляющую РНК и умеем делать так, чтобы к ней был прикреплен вот этот мутантный белок Cas9, лишенный нуклеазной активности. А теперь, лиха беда начало, прикрепим к белку Cas9 генно-инженерными методами (один лишний день работы!) известный белок, который либо подавляет работу генов, либо активирует.

Я уже писал, что в геноме есть гены, которые кодируют определенные белки — «кирпичики» для построения клеток, и регуляторная часть — участок, который контролирует работу гена. Но имеются также особые белковые молекулы, например транскрипционные факторы, которые могут активировать работу гена, связываясь с определенными последовательностями генетического текста. Есть и другой тип ДНК-взаимодействующих белков, которые могут совершать обратное действие — снижать уровень экспрессии (проявления работы) гена, репрессировать его. Такие молекулы получили общее название активаторные, или репрессорные, белки. И если мы к нашей сложной конструкции, состоящей из направляющей РНК и мутантного фермента Cas9 без нуклеазной активности, «пришьем» с помощью генной инженерии некий активатор транскрипции гена, то вся конструкция, проникнув в клетку, исключительно точно распознает определенный район именно того гена, который необходимо активировать. А если вместо активаторного белка мы вставим репрессорный, то конструкция подавит работу данного гена. Это исключительно точное направленное воздействие, дающее эффект, с которым сегодня не сравнятся никакие химические молекулы, обладающие сходным действием. К тому же любая синтезированная химическая молекула из-за значительных побочных эффектов будет дополнительно изменять работу многих генов. Правда, надо признать, что у малых химических молекул есть преимущество: они легче проникают в клетку, чем CRISPR/Cas9.

Для чего можно использовать активационную или репрессорную конструкции? Вот реальный пример. В опухолевых клетках активирован целый ряд генов, которые в норме работать в них не должны. Но мы можем постараться подавить их работу за счет того, что доставим в опухолевые клетки конструкцию, которая будет состоять из системы распознавания — направляющей РНК — и инактивированного мутантного фермента Cas9, а также репрессора (подавителя) транскрипции данного конкретного гена. Это один из вариантов инактивации (выключения) ненужных генов, который дает шансы вылечить заболевание, вызванное слишком высоким уровнем экспрессии генов (как это обычно бывает в опухолевых клетках).

Часто случаются и противоположные ситуации, когда в организме отсутствует или недостаточна экспрессия какого-то гена, и это приводит к патологии. В таком случае для регуляции конкретного гена можно подобрать направляющую РНК, которая распознает последовательность именно этого гена, добавить белок Cas9 без нуклеазной активности, генно-инженерным путем присоединить активаторный белок, и тогда мы сможем очень точно и целенаправленно активировать нужный ген.

Серьезно говорить об использовании этих подходов для лечения людей пока еще преждевременно, но вне организма, in vitro, на модельных системах такая возможность сейчас активно изучается.

Наверняка каждый читающий эту книгу слышал о стволовых клетках, но не все знают, что они бывают разными. Они есть и во взрослом организме, и нужны для естественных процессов восстановления тканей, поэтому их называют тканеспецифичными, из них получаются (или, по-научному, дифференцируются) только специализированные клетки определенной ткани, например костной. А поскольку каждый человек развивается из одной-единственной клетки, то стволовые клетки, которые появились в зародыше в самом начале его развития, порождают все многообразие клеток взрослого организма, в том числе и тканеспецифичные стволовые клетки.

Эти ранние зародышевые стволовые клетки называют эмбриональными — по месту их нахождения или плюрипотентными — по их функциональным возможностям. Плюрипотентность (от лат. pluri — много) означает способность дифференцироваться в большое количество разнообразных клеточных типов. Эти клетки уникальны своим потенциалом: из них можно получить клетки и крови, и мозга, и кишечника, и печени, и... еще пару сотен других. Но откуда их взять для взрослого человека, организм которого уже прошел этап эмбрионального развития?

А что, если попробовать использовать для этого обычную соматическую клетку? Ведь в конце концов, геном и у одноклеточного эмбриона, и у стоклеточного зародыша, и у взрослого организма одинаков. Просто для развития и жизнедеятельности организма не нужна работа всех генов во всех клетках одновременно. На ранних стадиях развития сначала работают одни комбинации генов, через пару дней некоторые гены выключаются и включаются другие, еще через неделю возникает новая комбинация и т. д. Если же мы возьмем взрослый организм, то в каждой определенной его клетке на протяжении всей жизни должна работать стабильная комбинация некоторых генов, причем в разных специализированных клетках потребуется активность разных генов, а остальные будут выключены (репрессированы).

Тонким балансом между активностью одних и репрессией других генов как раз и достигается клеточное совершенство — гомеостаз, то есть саморегуляция, направленная на поддержание стабильного состояния. Но что произойдет, если в специализированной клетке взрослого организма активировать те гены, которые нужны на стадии стоклеточного эмбриона, то есть репрограммировать ее — заставить выполнять программу эмбриональной клетки? Для этого можно провести генную терапию. Мы используем вирус, в котором находится нужный ген, по каким-то причинам не работающий в клетке, затем вводим нашу конструкцию в ДНК клетки, и вот — извольте! — в ней начинает работать ген, привнесенный вирусом.

Именно так поступили японские исследователи под руководством Синъя Яманака с клетками мыши, а чуть позже и человека. В 2006 году были опубликованы результаты этого исследования. Ученые применили к клеткам, полученным из взрослого организма, генную терапию четырьмя транскрипционными факторами, которые активно работают на стадии эмбрионального развития. И — о чудо! — эти клетки репрограммировались в эмбриональное состояние плюрипотентности, а эту четверку транскрипционных факторов назвали «магическая четверка» (magic four).

Это значит, что любую клетку нашего организма в лабораторных условиях можно перевести в плюрипотентную стволовую! Представьте, ведь потом из них можно получить любую клетку организма — и это действительно может оказаться прорывом в регенеративной медицине. Я не буду вдаваться в подробности технологии и ее научные основы, скажу лишь, что всего через шесть лет после появления первой статьи Синъя Яманака получил за эту технологию Нобелевскую премию. Такой короткий срок повторяет рекорд Вильгельма Рентгена — первого в мире лауреата Нобелевской премии по физике, который в 1895 году впервые применил свои лучи и получил изображение металлического кольца на ладони, а в 1901 году ему была вручена Нобелевская премия. Только эти два открытия, две технологии, два человека — Вильгельм Рентген и Синъя Яманака — не попали под действие известного правила номинантов: чтобы получить премию, надо жить долго.

Итак, применяя генную терапию для клетки, мы можем изменять ее судьбу, но, к сожалению, не всегда бесследно. Введенные вирусы, гены, дополнительные последовательности ДНК представляют потенциальную, хотя и не очевидную опасность. Однако если точечно активировать «магическую четверку» генов с помощью направленного действия активаторной CRISPR/Cas9-системы, клетка репрограммируется до состояния плюрипотентной стволовой без всякого генетического следа от проведенного воздействия.

При использовании CRISPR/Cas9 исследователи вводят свою генно-инженерную конструкцию прицельно, направляя ее на каждый конкретный ген. Конечно, выбрать его весьма непросто — необходимы большая работа и хорошее понимание процесса. Но зато если мы поймем, какой ген в каждом патологическом процессе является ключевым, и сможем с помощью этой системы на него воздействовать, то подобный подход позволит решить многие медицинские и биологические проблемы. В частности, CRISPR/Cas9 позволяет углубить наши знания об устройстве живой клетки и о тех сложнейших процессах реализации (проявления) генетической информации, которые в ней происходят.

Многие помнят изображение хромосом в школьных учебниках в виде буквы X. Оно очень распространено, хотя надо понимать, что такой вид хромосомы имеют только в момент, когда клетка начинает переходить к процессу деления — митоза. Именно своим перекрестьем они прикрепляются к определенным структурам во время метафазы (стадия митоза) и расходятся по разным клеткам. Они так и называются — метафазные хромосомы. В этот момент они сильно конденсированы, то есть генетический материал в них очень плотно упакован, ведь хромосомы содержат нить ДНК длиной несколько десятков сантиметров, генетическую информацию которой надо поделить между двумя дочерними клетками без потерь.

Сам процесс деления клетки продолжается недолго. Большую часть времени клетка пребывает в интерфазе — состоянии между делениями, когда занимается своей «профессиональной» деятельностью. Длительность интерфазы у клеток разной специализации сильно различается. Например, нейроны находятся в стадии интерфазы практически на протяжении всей жизни организма; можно считать, что они не делятся. А вот активированные лимфоциты будут делиться примерно один раз за промежуток времени от двух до двадцати четырех часов, в зависимости от степени их активации. Им же надо бороться с инфекцией! Именно после встречи с инфекцией они становятся активированными и начинают делиться. В любом случае клетка уделяет значительное время выполнению своих специальных функций, то есть определенная часть генетической информации должна быть постоянно доступна для считывания.

Как вы понимаете, с ДНК, плотно упакованной в крошечных «червячках» метафазных хромосом, сложно считывать информацию. Поэтому хромосомы деконденсируются — молекула ДНК раскручивается и заполняет собой все ядро. Если окрасить каждую хромосому в свой цвет, ядро в этот момент по раскраске будет напоминать трехмерный пазл или очень сложную головоломку — 3D-шар. Различные фрагменты одной хромосомы соседствуют с фрагментами другой, переплетаясь, а некоторые очень отдалены. И это не хаос а стабильно сохраняющееся состояние генетического материала в интерфазе — фазе «профессиональной» деятельности клетки.

На этом этапе клеточного цикла хромосомы занимают хромосомные территории в пространстве ядра. Расположение соседних территорий и определяет закрытость или открытость генетических файлов, то есть комбинаций тех генов, которые должны работать в специализированной клетке, ведь они раскиданы по разным хромосомам (и это правильно: «не клади все яйца в одну корзину»), но работать должны скоординированно. Для этого считывающие транскрипционные комплексы (помните наши ленточные магнитофоны XX века и современные стримеры?) собираются в определенных местах ядра, и необходимые гены располагаются там же, даже если они на разных хромосомах и работают под воздействием одного транскрипционного комплекса, так как находятся в одном определенном месте. Для понимания работы всего генетического аппарата обнаружение активных генов с разных хромосом, находящихся физически в одном месте, имеет огромное значение. Это уже не изучение одного-единственного гена в пробирке, а исследование синхронизированной работы генов в клетке.

Технологии секвенирования нового поколения и современные информационные технологии позволили предсказать такие возможные генетические комплексы. Но, увы, только теоретически. С определенной вероятностью, довольно высокой — девяносто пять, девяносто, восемьдесят пять, восемьдесят процентов, — можно сказать, что эти два, три, четыре, пять... генов действительно находятся рядом и используют одну и ту же транскрипционную машину. Но как это подтвердить на сто процентов? Вот если бы можно было увидеть своими глазами! Оказалось, что можно, и в решении этой проблемы ученым помогли... медузы.

МЕДУЗЫ И ГЕНЕТИКА

Как ни странно, в глубинах океана, куда вообще не проникает свет, тоже есть жизнь — богатая и разнообразная. Обитающие там организмы, никогда не видевшие света, обладают множеством диковинных свойств, предназначение которых зачастую бывает для нас непонятным. Одно из них обнаружили еще в 1960-х годах. Вытащенные на поверхность глубоководные организмы, потерявшие при солнечном освещении всю свою красоту, случайно были освещены ультрафиолетовым светом определенной длины волны. И вдруг полупрозрачные, почти бесцветные медузы и другие подводные жители «загорелись» зеленым, синим, красным, оранжевым цветами!

Оказывается, ультрафиолетовый свет этой длины волны, невидимый для наших глаз, приводит к возбуждению электронов в молекулах определенных белков, и клетки, содержащие эти белки, начинают светиться. Это качество, для глубоководных существ абсолютно ненужное и бессмысленное, так как вода прекрасно поглощает ультрафиолет, для нас оказалось чрезвычайно полезным. На данный момент открыто много различных флуоресцентных белков, одна часть которых выделена напрямую из тех или иных видов медуз, кораллов и других подводных жителей, а другая часть получена генно-инженерными способами. Сегодня флуоресцентные цветные белки активно применяются в научных исследованиях.

Именно флуоресцентные белки стали использоваться для создания так называемой репортерной системы на основе мутантной системы CRISPR/Cas9. Репортерная система — это, конечно, научный жаргон экспериментальных исследователей. Сегодня у нас слово «репортер» ассоциируется только со средствами массовой информации. В привычном понимании это кто-то, передающий информацию с места событий. Такое же значение это слово приобрело и в современной экспериментальной биологии. Биологическая репортерная система связана со светящимися белками, благодаря которым появляется возможность своими глазами видеть микроскопические события, происходящие внутри клетки. За использование свойств зеленого флуоресцентного белка — GFP (green fluorescent protein), выделенного из медуз, в 2008 году была вручена

Нобелевская премия. Надо отметить, что в справке Нобелевского комитета ни разу не прозвучало сочетание «репортерная система», зато неоднократно использовались такие слова, как «освещает» (illuminate) и «маяк», «бакен», «сигнальный огонь» (beacon). Действительно, если с помощью генной инженерии сделать синтетическую конструкцию, в которой какой-то клеточный белок, например инсулин, составляет единое целое с GFP, то введя ее в клетки или даже в целый организм, мы сможем визуально проследить, как инсулин секретируется клетками и путешествует по организму.

При создании репортерной системы на основе CRISPR/Cas9 используется следующий подход. Берется направляющая РНК, с помощью генной инженерии соединенная с мутантным белком Cas9, который лишен нуклеазной активности (способности разрезать ДНК), к нему «пришивается», как говорят генные инженеры, репортерный флуоресцентный белок. Посветив ультрафиолетом на клетку, в которую введена такая репортерная конструкция, мы увидим ее свет именно там, где направляющая РНК нашла определенный фрагмент ДНК, с которым она связалась. Теперь надо ввести в клетку генетические конструкции с направляющими РНК к тем генам, которые предположительно находятся все вместе в одном районе ядра (колокализуются), причем каждая из генетических конструкций содержит мутантный Cas9 своего цвета. И тогда мы получим возможность своими глазами увидеть в живой клетке, не разрушая ее, в каком именно месте находятся наши гены, использующие один и тот же транскрипционный комплекс. И это не просто игрушка ученых, а важный технологический шаг, потому что очень многие болезни характеризуются как раз нарушением работы генов, но далеко не всегда ясно, какие механизмы при этом задействованы и, соответственно, какие требуются методы для лечения.

Репортерные конструкции предоставляют ученым еще одну необыкновенную возможность: увидеть живую клетку в процессе ее жизнедеятельности. Сегодня получило удивительное развитие такое направление, как прижизненное клеточное кино. Существующая микроскопическая техника позволяет наблюдать живую клетку на протяжении дней и даже недель, но если при этом в нее ввести наши репортерные конструкции, то с их помощью ученые смогут четко определять, каким образом те или иные фрагменты ДНК становятся активными, связываясь с транскрипционными факторами. Система на основе CRISPR и модифицированного Cas позволяет делать это очень эффективно, расширяя наши познания о том, как живет клетка.

В принципе, легко себе представить, что все описанные выше возможности — подавление гена, активация гена, репортерная система, позволяющая определить, как этот ген заработал, и другие — могут быть применены совместно в одной клетке, в одной пробирке, и можно будет наблюдать в режиме реального времени, что при этом происходит, добиваясь нужных результатов. А это значит, что система распознавания на основе направляющей РНК CRISPR и мутантного фермента Cas9 дает огромные дополнительные возможности в науке, причем без значительных временных затрат.

Генетическое модифицирование в сельском хозяйстве

Многие сотни тысяч лет наши древние предки в поисках пищи и более благоприятных климатических условий кочевали по всем континентам Земли, промышляя главным образом собирательством того, что находится на уровне глаз и под ногами. Это части и плоды растений, насекомые и их личинки, прибрежная морская или речная живность, остатки пищи от крупных хищников. Некоторые ученые считают, что древние люди в силу своих ограниченных возможностей были дневными падальщиками, поскольку более сильные хищники охотились ночью, а днем спали. Только палка и камень, взятые в руки, немного уравняли возможности вида Homo erectus и других близких видов с возможностями крупных хищников.

Собирательство было не самым надежным источником пищи, оно требовало постоянных перемещений для освоения новых территорий. Несомненным преимуществом в природе обладают те виды животных, у которых детеныши могут сразу самостоятельно перемещаться вслед за матерью, что обеспечивает и безопасность, и питание. Однако большинству животных необходимы месяцы, пока их детеныши смогут следовать за группой. Это время они проводят в укромном уголке, чтобы матери имели возможность покидать потомство. Наиболее близкие человеку виды приматов минимизировали свой контакт с землей, которая представляет для них опасность, и переселились на ветки деревьев, что обеспечило их пищей и дало возможность относительно спокойно передвигаться с детенышами, вцепившимися в матерей. Увы, относительно слабые предки человека были не способны жить на деревьях и не могли выкапывать безопасные норы с длинными ходами. Такое низкое положение в иерархической лестнице природы заставило их проявлять чудеса наблюдательности, анализа и творчества.

В частности, наши далекие предки обратили внимание на то, что остатки плодов и семена, случайно оставшиеся возле их стоянок, давали всходы. Человек начал их специально высаживать, отбирать самые плодовитые и вкусные. И вскоре люди заметили, что целенаправленное выращивание съедобных растений дает гораздо больший эффект, чем собирательство. Появилась возможность вести оседлый образ жизни, поскольку растительная пища эффективно обновлялась, а животные фактически приходили к этим местам сами. Многовековое наблюдение за растениями позволило человеку из дикорастущих видов выбрать оптимальные по вкусовым качествам, калорийности, урожайности, удобству уборки урожая и возможности хранения виды. Появились сорта растений, которые со временем стали называться культурными.

Такие растения отличались от дикорастущих прежде всего своей плодовитостью, позволяющей с единицы площади получить больше съедобной продукции. Сегодня мы понимаем, что наблюдательные люди по чисто внешним признакам отбирали те растения, в которых произошли какие-то случайные мутации. Они не знали, что мутации бывают разными, что их может происходить несколько, и отбирали не мутацию, а тот колосок, в котором образовалось больше зерен. Вид Homo sapiens sapiens освоил земледелие примерно десять тысяч лет назад; плотность населения была низкая, и окультуренные виды растений могли прокормить человечество. Климатические изменения зачастую приводили к появлению случайных мутаций, которые изменяли свойства растений, а человек продолжал отбирать лучшие. Это было время искусственного отбора и простейшей селекции с помощью скрещивания.

Однако численность населения росла со все возрастающей скоростью: порядка четырехсот миллионов — в X веке, к началу XIX века — уже миллиард, на начало XX века — около двух миллиардов, и на рубеже XIX и XX веков реально возникла проблема недостатка пищи. Земледелие должно было стать более интенсивным, чтобы обеспечить потребности растущего населения Земли. Но уже не было столетий на проведение селекции новых, еще более урожайных сортов — эту роскошь человек не мог себе позволить.

В этот трудный исторический момент сыграла свою роль техническая революция. Научные открытия и последовавшие за ними технологические решения в области физики и химии (в том числе открытие новых химических соединений, химический синтез, открытие радиоактивности, возможность заглянуть внутрь любых молекул) помогли людям научиться влиять на некоторые естественные процессы — по крайней мере, в биологических объектах. Первым вкладом науки в новую технологию земледелия стал в начале XX века радиационный и химический мутагенез. Люди научились искусственно вызывать у растений те же изменения, которые в природе происходили в результате случайных событий биологического характера, а также внешних факторов. Среди них, например, извержение вулкана несколько тысяч лет назад, вызвавшее изменение состава почв, образование и исчезновение озоновых дыр, влияющие на поток ультрафиолета, космическая радиация и т. п.

Благодаря радиационному и химическому мутагенезу можно было не ждать тысячелетиями случайных природных событий, а «вызвать» их при облучении или обработке семян химикатами (комбинаторное воздействие). Это позволяло достаточно быстро получить колоссальный набор вариантов данного растения и выбрать среди них нужный, чтобы сделать его селекционным сортом. Но что происходит при этом на генетическом уровне, никто по-прежнему не знал, а ведь нужны были именно генетические изменения — только они наследуются и сохраняются в ряде поколений. Отбор подходящих мутантных сортов производился по признакам, которые представлялись селекционерам наиболее важными: по внешнему виду, химическому составу, продуктивности, устойчивости — безотносительно к тому, что в действительности происходило внутри растения.

Подобный подход не одно десятилетие служил людям, но их становилось все больше. К середине XX века численность населения планеты составляла уже три миллиарда. И опять перестало хватать еды!

Во второй половине XX века человечество уже знало, что радиация и химическая обработка влияют на гены, от мутаций которых изменяются свойства растений. Многое стало известно о том, какие гены работают в живых организмах и какие функции они выполняют. В 1970 году была вручена Нобелевская премия за доказательство возможности переноса генов между видами, и всего через несколько лет появился рекомбинантный инсулин человека: его производят бактерии кишечной палочки E.coli, в которые введен ген инсулина человека.

А почему бы не сделать то же самое с растением и не перенести на него полезные свойства других организмов? Например, это может быть свойство устойчивости к инфекциям. Из биологии мы знаем, что существуют гены резистентности. Почему одни растения устойчивы к какой-то инфекции, а другие нет? Потому что в них нет генов резистентности. Но можно ввести ген резистентности другого растения в культурное растение, чтобы защитить его.

Технологии генетической модификации растений работают исключительно направленно и тщательно просчитаны. Уже не надо ждать десятилетия, как ждали наши предки, или произвольно и бездумно менять геном, как делали еще полвека назад. С 1980-х годов воздействие на гены растений производится только целевым образом, чтобы получить необходимые признаки. Создавая генетически модифицированные растения, генные инженеры заранее знают, какой нужен результат, поэтому воздействие осуществляется на конкретные, вполне определенные гены. Это принципиально отличает современные технологии от слепого поиска, свойственного прошлым тысячелетиям. По своей технологии генетическая модификация растений не отличается от создания рекомбинантных микроорганизмов или генной терапии человека. Здесь тоже имеется клетка и есть генетическая конструкция, которая должна проникнуть в эту клетку и встроиться в ее геном. Для этого используют, как и в случае с генной терапией человека, вирусы растений или другие способы доставки. А после того как генетическая конструкция попала внутрь клетки, происходит то, с чего мы начали нашу историю, — генетическая рекомбинация. И в дальнейшем из этой растительной клетки выращивается целое живое растение, семена которого используются для посевов.

И все-таки можно ли считать, что генетическая модификация растений, которая началась в 1980-х годах и в значительной степени используется до сих пор, решает все проблемы? К сожалению, нет. Во-первых, как здесь уже говорилось, воздействие на организм, при котором берется один ген и переносится в геном другого вида, — это технология манипулирования страницами или целыми параграфами генетического текста. Во-вторых, при традиционной генетической модификации множественные генетические изменения требуют последовательных действий: нужно ввести в клетки один ген, вырастить растение, потом из него получить новые клетки, ввести другой ген, и так далее, собирая урожай на каждой стадии.

Но ведь теперь о растениях известно гораздо больше! Мы знаем, какой ген за что отвечает, какие у них есть регуляторные последовательности и многое другое, поэтому сегодняшняя технология побуквенного редактирования генетического текста CRISPR/Cas9 очень важна для земледелия. Она позволяет за короткое время (всего за одну генерацию растения) проделать, в общем, то же самое, что и при генетической модификации, но одновременно с добрым десятком генов, причем изменяя в желаемом направлении каждую букву генетического текста. Теперь это можно делать сразу, не тратя лишние годы.

В качестве примера можно привести одну из работ, выполненных в Китае, публикация о которой появилась в 2018 году. Менее чем за год китайские ученые создали новый сорт риса с продуктивностью, повышенной на тридцать процентов. При этом генетические манипуляции с одиночными буквами генетического текста (а их количество даже больше, чем у человека) не требовали внесения генов других организмов, всего лишь изменение своего. Это кажется чудом, но на самом деле реализована еще недавно казавшаяся фантастической возможность — получить за короткий срок, всего за год, растение с новыми заданными свойствами. Китайцы ориентировались на продуктивность, но можно менять в нужную сторону и другие свойства растения (того же риса: количество крахмала, содержание тех или иных белков и пр.), причем вносить изменения одновременно во многих генах. Только система CRISPR/Cas9 предоставляет сегодня такую возможность.

Животноводство в плане использования современных методов старается не отставать от земледелия. Если раньше сельскохозяйственные животные подвергались отбору и селекции, то почему бы теперь не повысить эффективность получения новых видов с помощью генетических технологий? Конечно, было ясно, что выведение генетически модифицированных животных окажется более трудоемким, чем растений, потому что жизненный цикл коров, коз и т. д. составляет годы. Да и количество оплодотворенных яйцеклеток исчисляется штуками, тогда как семян риса можно взять мешок. В животноводстве нужен индивидуальный подход.

Тем не менее успехи в создании генетически модифицированных сельскохозяйственных животных и птицы несомненны:

• с использованием технологии геномного редактирования выведены гипоаллергенные куры-несушки с удаленными генами овальбумина (альбумина куриного яйца) — белка, который вызывает у многих людей аллергию на яйца, снижая коммерческий спрос на них;

• несколькими группами исследователей получены козы, в том числе кашмирской породы, с улучшенными качествами шерсти;

• благодаря использованию технологии геномного редактирования выведена порода безрогих коров.

Наверное, история с выведением безрогих (комолых) коров наиболее интересна. Казалось бы, зачем они нужны? Но на самом деле это весьма актуально. Во-первых, несколько десятков тысяч человек в год страдают от повреждений и травм, которые наносят им коровы своими рогами. Для этого животное даже не надо дразнить, просто случайно тряхнет головой, заденет рогом — и травма. Во-вторых, коров транспортируют с ферм до места их забоя автомобильным или железнодорожным транспортом. Чтобы животные случайно не нанесли себе повреждения во время транспортировки, их не загружают очень плотно. И последнее: рога не позволяют эффективно использовать пространство при кормежке животных. Совокупно наличие рогов выливается в кругленькую сумму, и поэтому некоторые фермеры удаляют их у своих коров в раннем возрасте или проводят генетическое тестирование стада на появление безрогих животных. А такое возможно, так как в природе иногда рождаются комолые особи из-за мутации — потери примерно двухсот нуклеотидов в гене безрогости (Polled).

Много лет селекционеры, работающие в области животноводства, пытались совместить признак безрогости с обилием мяса или молока, но из этого скрещивания ничего хорошего не получалось: или признак был нестабильным, или уменьшал полезные качества животного.

Но зато, используя такой метод, как редактирование генома с помощью технологии TALEN (см. главу 4: «Конструкции TALEN»), это удалось сделать очень быстро в 2016 году. В течение короткого времени генные инженеры сумели получить двух безрогих быков-производителей, удалив у них те самые двести букв генетического текста в гене Polled. От одного быка было получено потомство из шести быков-производителей, два из которых стали основой для получения стада безрогих коров.

Казалось бы, все идет хорошо, но производство и потребление качественных продуктов питания контролируется государством. Например, за безопасность пищевых продуктов и лекарств, продаваемых на территории США, отвечает FDA (Food and Drug Administration) — Администрация по продуктам питания и лекарственным средствам. Так вот, эта самая Администрация заявила, что безрогую корову (то есть, конечно, не саму корову, а ее мясо или молоко) на пищевой рынок не пропустит, потому что над ней были совершены определенные действия, были внесены определенные генетические модификации, и ее мясо или молоко должны пройти всяческие тестирования, чтобы убедиться в их безвредности.

Парадокс заключается в том, что если продуктами животноводства занимается FDA, то продуктами растительного происхождения ведает USDA (United States Department of Agriculture) — Департамент сельского хозяйства США, который заявил, что не регулирует и не собирается в ближайшем будущем регулировать использование растительных продуктов, полученных с помощью методов редактирования генома. По их мнению, это даже не генетически модифицированные организмы. С 2019 года в США используется растительное масло Calyno из соевых бобов, полученных с помощью геномного редактирования. Оно обладает большими преимуществами: содержит восемьдесят процентов мононенасыщенных жирных кислот и на двадцать процентов меньше насыщенных жирных кислот и вообще не содержит трансжиров. Специалисты компании-производителя считают, что оно в три раза более устойчиво при жарке и хранении, чем любые существующие виды растительных масел сегодня. «На подходе» генно-модифицированный листовой салат, полученный методом редактирования генома, который не гниет.

Сегодня в мире отношение к генетически модифицированным продуктам остается достаточно противоречивым. Можно ли считать исправление одной буквы в геноме чем-то необычным, требующим строгого подхода и разнообразных испытаний или же ничего особенного не произошло?

В Японии в 2018 году регуляторные ведомства решили, что генетически модифицированные продукты, сделанные по традиционной технологии генетической модификации, и такие же продукты, но полученные с помощью побуквенного редактирования генома, — это одно и то же. Они не регулируются никак, но на продукте должна быть отметка, что он произведен с использованием технологии генетической модификации. При этом неважно, растительный это продукт или животный.

Именно в Японии была выведена порода кур, которые несут гипоаллергенные яйца. Сейчас там яйца этих кур продаются без всяких ограничений наряду с обычными яйцами, только на упаковке сделана отметка, что продукт содержит ГМО. Таким образом, Япония избрала легализацию генетически модифицированных продуктов как растительного, так и животного происхождения, то есть пошла по разрешительному пути.

Европейские страны пошли по пути жесткого ограничения генетически модифицированной сельскохозяйственной продукции. В 2019 году Европейская комиссия подтвердила, что продукция с отредактированным геномом — это то же самое, что ГМО, и точно так же регулируется, то есть в основном находится под запретом. Выращивание генетически модифицированных организмов в странах Евросоюза не разрешается, а к применению допущены всего несколько видов (четыре сорта ГМО-кукурузы и по одному — сои, хлопка и рапса), да и то только после проверки на соответствие нормативам Евросоюза.

Но эти запреты введены не потому, что ГМО — это вредная пища, а потому, что Европа ставит защитные барьеры для своих собственных производителей. Европейские страны (и в первую очередь Нидерланды, где наиболее плотно сосредоточены основные европейские сельскохозяйственные мощности) традиционно являются экспортерами высококачественной сельскохозяйственной продукции, в том числе мяса и молока, а главное в сфере сельского хозяйства работает значительная доля населения этих стран. Внедрение ГМО, имеющих значительные преимущества по многим параметрам перед обычными сельскохозяйственными культурами, приведет к сокращению занятости и безработице, и Евросоюз активно этому сопротивляется, выставляя различные запреты генетически модифицированным видам культурных растений и домашних животных.

В России нет законов, которые бы определяли, является ли геномное редактирование одним из видов генетической модификации и относить ли растения и животных с отредактированным геномом к ГМО. Определенным позитивным сдвигом в этой области я считаю указ Президента и постановление Правительства РФ о развитии в России генетических технологий, в том числе геномного редактирования[9]. Первые шаги в этом направлении уже сделаны.

Как мы видим, отношение к вопросам регулирования технологий и применения результатов генетических методов в сельском хозяйстве в разных странах сильно отличается. Не пришли к единому мнению даже специалисты в этой области, и тем более население. Одни люди выступают против геномного редактирования утверждая, что это те же самые генетически модифицированные организмы, ГМО, влияние которых на человека еще нужно долго изучать. Другие считают, что поскольку при геномном редактировании все делается побуквенно, с точностью до одного нуклеотида, то никакая это не генетическая модификация. Лично я считаю, что геномное редактирование — это, конечно же, вмешательство в геном. Да, это не вклейка новых страниц текста или переписывание целых страниц генома, это проведенные с ювелирной точностью замены нескольких нуклеотидов без затрагивания других фрагментов текста. Но если мы все-таки искусственным путем, с помощью наших умов и рук меняем геном, пусть даже на одну букву, то создаем генетически модифицированный организм, хотя он и может полностью повторять то, что встречается в природе, как, например, безрогая корова.

Но давайте все-таки посмотрим, почему на протяжении многих лет люди не могли достичь того же самого результата посредством селекции, скрещивания. Видимо, в природе подобный процесс заблокирован. Мы еще не знаем, не понимаем, почему возник этот блок и насколько он важен для коровы и для нас. Ясно лишь, что природа усложнила выведение таких коров человеком с помощью естественного процесса. Возможно, он как-то противоречит природе, или эволюции, или существованию этих коров в принципе. Но если объективно подходить к тому, что было сделано с коровами, то мы должны признать: да, это генетически модифицированные организмы, ГМО. А дальше нужно, как совершенно правильно сделали японцы, просто отметить на табличке, что данная продукция содержит генетически модифицированный организм. И всё.

Завершая разговор о применении геномного редактирования в сельском хозяйстве, надо отметить, что благодаря генным технологиям производство продуктов питания очень сильно возросло. Наряду с вакцинами и устранением страшных эпидемических заболеваний начала XX века изобилие продуктов позволило увеличить продолжительность жизни человека лет на тридцать. Раньше из-за голода умирало не меньше людей, чем от инфекционных заболеваний. Голод в пределах стран и континентов наступал по разным причинам: из-за засух, природных и социальных катаклизмов и т. д. До сих пор на Африканском континенте, куда техническая революция еще не пришла, очень часто бывает голод в связи с засухой. Эта беда веками преследовала и Россию, и Европу. Но сегодня, благодаря интенсивному сельскому хозяйству и ГМО, уже половина населения Земли (которое в целом насчитывает порядка семи с половиной миллиардов человек) имеет пищевое изобилие.

Редактирование генома

«Генетическое лекарство»

Достижения генетики и генной инженерии в области обеспечения человечества пищей несомненны и общепризнаны, как бы ни относились к генетически модифицированным организмам отдельные люди, незнакомые с существом дела. Однако не меньшую важность для здоровья человека, чем предотвращение голода, представляет решение чисто медицинских проблем. Использование редактирования генома в сфере медицины не просто перспективно — от него ожидают совершенно потрясающих вещей. Некоторые экспериментальные и даже клинические исследования уже активно обсуждаются, тестируются и начинают шаг за шагом входить в нашу жизнь.

Давайте посмотрим, как развивались методы редактирования генома в области биомедицины и как разрабатывались те или иные стратегии и подходы к лечению заболеваний человека.

Одной из первых прорывных публикаций в этой области была замечательная статья, опубликованная в журнале Nature Biotechnology в 2014 году. Исследование, выполненное авторами статьи, заключалось в следующем. Ранее с использованием мутагенеза была создана модельная мышь, у которой в определенный ген была введена точечная мутация, приводившая к проявлению такого заболевания человека, как наследственная тирозинемия первого типа. При этой патологии происходит накопление токсических метаболитов, в первую очередь в гепатоцитах — специализированных клетках печени, ответственных за общую дезинтоксикацию организма, что приводит к их гибели и вызывает общее отравление организма. Накопление токсичных продуктов обмена и гибель гепатоцитов могут быть приостановлены лекарственным препаратом, при условии, что пациенты всю жизнь будут следовать очень строгой диете. То же самое было необходимо и модельной мыши с этим заболеванием: отмена лечения приводила к гибели животного.

Ученые задумались, можно ли вылечить эту мышь с помощью метода геномного редактирования, для чего сделали соответствующие генетические конструкции. Они подобрали и синтезировали определенную направляющую РНК, которая должна была связываться с последовательностью ДНК именно в месте мутации, а затем с помощью генной инженерии создали векторную генетическую структуру, которая включала эту направляющую РНК и белок Cas9. Была также синтезирована последовательность длиной в двести нуклеотидов, полностью идентичная последовательности гена «дикого» типа, то есть нормальной копии гена, без мутации. Ученые ввели в хвостовую вену мыши эти «лечебные» генетические последовательности, вместо того чтобы сделать укол лекарством, который она ежедневно получала. По сути, исследователи ввели мышке «генетическое лекарство».

Нужно отметить, что эта работа удачно сочетала в себе грамотный подход к методике проведения эксперимента с правильным выбором модельного организма. Инъекция в хвостовую вену мыши — обычная процедура, так как она хорошо заметна на голом мышином хвосте и ведет напрямую к воротной вене печени, то есть если мы вводим в хвостовую вену какое-то вещество, то оно очень быстро попадает в печень. Таким образом, «генетическое лекарство» — конструкции с направляющей РНК/Cas9 и фрагмент ДНК, необходимый для замещения мутантной последовательности, — попадало прямо в гепатоциты, которым необходимо лечение. Направляющая РНК находила среди миллиарда букв генетического текста мыши необходимое место и комплементарно связывалась с ним, а фермент Cas9 вносил разрыв в структуру ДНК.

Рис. 8. Благодаря системе CRISPR/Cas ученые могут точечно заменять какие-либо участки ДНК, как будто орудуют мини-ножницами

При появлении разрыва клетка тут же пытается заделать эту брешь, а если рядом находится фрагмент с гомологичным текстом (по сути, «кирпичик», по форме идеально сходный с брешью), то он и замещает оригинальный фрагмент ДНК за счет гомологичной рекомбинации. Теперь вместо фрагмента текста с ошибкой вставлен правильный (см. рис. 8).

РЕДАКТИРУЮЩАЯ МЕДИЦИНА

Этот потрясающий эксперимент с геномным редактированием печени мышек недолго оставался чисто научным достижением. Вскоре на основе этого исследования была создана американская коммерческая компания Editas Medicine, то есть редактирующая медицина, или медицина редактирования, которая тут же привлекла более сорока миллионов долларов для развития, когда разместила свои акции на рынке ценных бумаг. Вот так одна публикация, вроде бы простая, но хорошо продуманная, дает мощный толчок и развитию технологии, и быстрой коммерциализации. Надо отметить, что тут еще не идет речи о лечении человека, а только получено доказательство его возможности. Но коммерческие компании, имеющие или купившие право на использование данного открытия, сразу же стараются привлечь средства для движения вперед, так как вполне очевидно, что в будущем этот небольшой научный эксперимент может быть использован и для терапии человека.

Мышкам, которым ввели это «генетическое лекарство», теперь не нужно было принимать специальные препараты и сидеть на диете — они выздоровели! Конечно, не все оказалось просто. Для своих экспериментов исследователи решили использовать три разных направляющих РНК. Все три распознавали генетический текст вблизи мутации, но были сдвинуты относительно друг друга на один-три нуклеотида. Только одна направляющая РНК позволила подопытным животным отказаться от медикаментозного лечения, остальные оказались не настолько эффективны. Для этого варианта направляющей РНК мутация была исправлена в одной из каждых трехсот клеток. Но даже столь небольшой доли исправлений оказалось достаточно, чтобы полностью отменить прием лекарственного препарата. И это на всю жизнь!

Но при всех блестящих успехах генетических технологий, как и при использовании любых других вмешательств в человеческий организм, всегда остается проблема побочных эффектов. А не могут ли они возникнуть и от «генетических лекарств»? Это не исключено. Мы говорили, что направляющая РНК узнает порядка двадцати букв генетического текста, но с особой точностью распознает лишь первые три-пять букв, а чем дальше, тем более снижается точность узнавания. Поскольку у человека три миллиарда букв генетического текста, то какие-то повторения, безусловно, возможны. Например, слово из пяти букв мы найдем в генетическом тексте не один, а очень много раз, поэтому существует вероятность, что выбранная нами направляющая РНК некорректно узнает нужный или ошибочно распознает еще и ненужный текст. Мы сами, когда что-то переписываем, можем нечаянно пропустить букву или написать не ту, в результате чего исказится смысл слова, фразы, всего текста. Так и ошибка направляющей РНК, в принципе, может вызвать нежелательные последствия: где-то в другом месте генома тоже произойдет распознавание, разрезание и какое-то замещение. Это и есть побочные эффекты, которых боятся при использовании технологии геномного редактирования.

Стоит ли нам опасаться чего-нибудь подобного в описанном эксперименте? Предположим, направляющая РНК распознает в клетках печени взрослой мышки (а больше никуда при таком методе терапии она не попадает) некий фрагмент генома и изменит его. В каких-то клетках исправит нужное, а в других распознает нечто иное. Есть такая вероятность, хотя гены занимают в геноме чуть больше процента от трех миллиардов букв, и возможность того, что введенная в организм генетическая конструкция сломает какой-то важный ген, очень невысока. Да и произойдет это в клетках, которые и так «больны». К тому же нет и не может быть лекарств, вообще не имеющих побочных эффектов. С точки зрения сохранения генома человека как вида не следует бояться этих изменений, ведь то, что мы лечим, касается только клеток взрослого организма — соматических. Эти изменения уже не передаются по наследству. Даже если нечаянно внести ошибку и затронуть еще какой-то генетический текст, он в любом случае не будет унаследован нашими потомками, потому что изменения проводятся не в клетках зародышевого пути.

Мы поговорили только об одном варианте «генетического лекарства», в котором используется система геномного редактирования. С тех пор на мышиных моделях было проведено много экспериментов и по использованию геномного редактирования для лечения инфекционных заболеваний (таких, например, как СПИД, вирусный гепатит В, поражения вирусом папилломы человека), заболеваний опорно-двигательного аппарата (миодистрофия Дюшенна), зрения и многих других.

Генетическое редактирование иммунной системы

Работа по геномному редактированию у мышей, о которой мы говорили, была опубликована в 2014 году, но прошло всего года два, и эта технология была впервые испытана на человеке. Но это, опять-таки, касалось только изменения генетического текста в некоторых соматических клетках взрослого организма. Авторы работы, китайские ученые, на этот раз выбрали заболевание из области онкологии. С помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 они решили изменить определенный ген в клетках крови больных раком легких таким образом, чтобы лимфоциты могли уничтожать опухолевые клетки. Но для того, чтобы этот небольшой технологический эксперимент состоялся, множество ученых во всем мире работали не один десяток лет, стараясь понять, почему иммунная система человека позволяет появляться опухоли. В итоге оказалось, что опухолевые клетки сами блокируют иммунный ответ. За открытие данного явления и способа преодоления такой блокировки американскому исследователю Джеймсу Эллисону и его японскому коллеге Тасуку Хондзё была вручена Нобелевская премия по медицине в 2018 году. Чем же так примечательно это открытие?

Мы уже обсуждали в главе 4 принцип работы иммунной системы человека. Как вы помните, встреча с ослабленным патогеном или его частью — антигеном — приводит к иммунному ответу и формированию иммунологической памяти. Если патоген проникнет в организм в следующий раз, то эти клетки иммунной системы быстро организуют эффективный отпор, помня ранее встреченный антиген. Так происходит с теми лимфоцитами, которые нашли свою мишень, то есть соответствующий антиген. Однако миллионы других рецепторов — «ключей», не нашедших свою «замочную скважину», — погибают вместе со своими носителями-лимфоцитами, так как в данный момент они оказались ненужными. Однако им на смену генерируется новый пул разнообразных В- или Т-клеток. Каждый Т-лимфоцит, чей рецептор случайно распознал какой-то патоген, получает право на жизнь, активируется и дает клоны.

Считается, что одну из главных ролей в противоопухолевом ответе играют Т-лимфоциты, которые, непосредственно распознавая опухолевую клетку и связываясь с ней, должны ее уничтожить. Почему же так происходит не всегда и опухолевые клетки избегают надзора со стороны иммунной системы? Увы, антигены есть у всех клеток, они имеются не только на патогенах, но и на любой клетке нашего собственного организма. И конечно же, сгенерированный иммунной системой случайный набор вариантов Т-лимфоцитов с их, как говорят, «репертуаром» клеточных рецепторов будет распознавать и собственные клетки. А вот это как раз нам совсем не нужно! Ведь если лимфоцит распознает собственные клетки, это приведет к возникновению аутоиммунитета — явления, охватывающего большой класс тяжелых болезней, называемых аутоиммунными заболеваниями, когда иммунная система организма уничтожает его собственные здоровые клетки и ткани.

И природой мудро придумано, как избежать возникновения аутоиммунного ответа. Для этого на поверхности Т-клетки имеется «нобелевский лауреат» — особый рецептор под названием PD1 (programmed [cell] death, или программируемая [клеточная] смерть). В названии заложена его функция. Если Т-лимфоцит может случайно распознать клетку нашей собственной ткани, то ничего страшного не произойдет, для блокирования этого имеется ответная часть для «нобелевского лауреата» PD1 — так называемый PD1-лиганд. Если при взаимодействии PD1-лиганд связывается с PD1-рецептором, то Т-лимфоцит получает сигнал на программируемую смерть. Таким образом осуществляется обратная связь с иммунной системой, которая случайным образом сгенерировала вариант распознавания своей ткани, своего антигена.

Так и должно происходить в норме, но мы знаем, что порой аутоиммунитет все-таки развивается. Далеко не все системы совершенны, и возможен сбой: например, если Т-лимфоцит по каким-то причинам не распознает на поверхности клетки PD1-лиганд, возникает аутоиммунное заболевание.

К сожалению, бывают случаи, когда нормальная клетка организма ошибается и становится трансформированной клеткой. В результате у нее появляются шансы сформировать опухоль.

Считается, что для того, чтобы клетка стала трансформированной, в ней должны произойти от трех до семи генетических изменений, приводящих к тому, чтобы она стала активно делиться, перестала реагировать на внешние сигналы, стала эгоистичной и бессмертной. Таким образом, опухолевая клетка претерпевает долгую эволюцию, прежде чем сформировать опухолевую ткань.

Но ведь когда-то она была нормальной клеткой организма, и многие черты нормальной клетки у нее остались. В частности, на поверхности большинства опухолевых клеток остался PD1-лиганд. И вот представьте себе: к трансформированной клетке подходит Т-лимфоцит и распознает опухолевый антиген. Как бы хорошо было, чтобы наш лимфоцит немедленно активировался, начал делиться и убивать все опухолевые клетки, в которых этот антиген сидит. Увы, этого не происходит, ведь на каждой из опухолевых клеток находится PD1-лиганд. Он связывается с PD1-рецептором на поверхности Т-клетки и говорит этому лимфоциту: «Не тронь, погибни!»

И вот тут мы подошли к ответу на вопрос, за что была дана Нобелевская премия: за открытие иммунологических «тормозов» в виде молекул PD1 и CTLA4 и возможность использования этого явления для терапии рака. Оказалось, что можно сделать генно-инженерным путем рекомбинантное антитело, которое будет связываться с PD1-рецептором и предотвращать его взаимодействие с PD1-лиганд ом клетки. Это примерно то же самое, как если бы мы на Т-лимфоцит надели чехол — мы его изолировали. Теперь Т-клетка связывается с опухолевым антигеном, но не получает сигнала погибнуть, поскольку PD1-рецепторы изолированы, а получает сигнал на размножение и начинает убивать опухолевые клетки в организме. Эти противоопухолевые средства, направленные на так называемые контрольные точки иммунитета, появились в последние шесть-семь лет и оказались эффективными в лечении ряда онкологических заболеваний, существенно изменив качество жизни многих пациентов.

На этом примере видно, с одной стороны, как непросто устроено все в природе, а с другой — какие возможности дает человеку детальное знание функционирования очень специализированных клеток организма — Т-лимфоцитов крови. Мы уже говорили, что кровь — весьма удобная ткань, с которой медицина уже давно и успешно работает. Можно даже выделить из крови персональные Т-лимфоциты, чем и решили воспользоваться китайские ученые.

Они взяли у пациентов, страдающих раком легких, Т-клетки — это довольно простая процедура под названием лимфоцитоферез, когда кровь просто прокачивается через специальный аппарат, в котором клетки крови разделяются, и можно безопасно выделить тот или иной тип лимфоцитов. Затем с помощью технологии геномного редактирования CR1SPR/Cas9 инактивировали у них PD1-рецепторы и ввели лимфоциты обратно. Теперь уже не требовалось вводить какие-то антитела пациентам, потому что у них часть Т-лимфоцитов фактически не имела PD1-рецепторов. Такой генетически отредактированный Т-лимфоцит распознавать опухолевый антиген сможет, а сигнала на самоуничтожение через PD1-рецептор не получит, и эти Т-клетки будут атаковать опухоль.

Это очень хороший пример, когда подвергается редактированию, а в данной работе — инактивируется определенный ген взрослого организма, находящийся в нужных клетках, в нашем случае в Т-лимфоцитах. Это необходимо потому, что экспрессия (то есть нормальное проявление гена) в данной ситуации мешает борьбе организма с опухолью. Однако надо понимать, что только часть Т-клеток станет обладать противоопухолевым действием, остальные по-прежнему будут нести на себе этот рецептор.

К сожалению, эффективность этой терапии пока оказалась не очень высокой. Всего в клинических испытаниях принимало участие около тридцати пациентов, и по результатам, опубликованным в 2018 году, положительный ответ на лечение наблюдался только у тридцати процентов. Но ведь мы еще только в начале пути! Ответ на противоопухолевую терапию даже у тридцати процентов больных — это уже хорошо. Конечно, процедуру надо усовершенствовать, повысить эффективность и сохранить безопасность. Возможно, имеет смысл выбрать другое заболевание, где эффект от блокирования «иммунологических контрольных точек» более значителен. При оценке успеха надо еще учитывать, что клинические испытания разрешено применять только на больных третьей и более поздних стадий прогрессирования рака: считается, что на более ранних стадиях риск может превышать ожидаемую пользу. Пациенты, на которых проводилось обсуждаемое нами исследование, были в очень тяжелом состоянии, и ожидать какого-то чуда и большей эффективности, чем эти полученные тридцать процентов, наверное, не стоило.

Перспективные мишени генной терапии

Несмотря на то что мы очень точно нацеливаемся на тот или иной ген, то есть на очень короткую и определенную последовательность генетического текста, все наши манипуляции с генами подпадают под термин генная терапия, потому что мы в лечебных целях либо инактивируем, либо восстанавливаем гены. Примером генной терапии является описанная выше технология, когда китайские ученые ввели в Т-лимфоциты определенную генетическую конструкцию, чтобы инактивировать ген PD1 и повысить эффективность противоопухолевой борьбы.

Генная терапия может осуществляться двумя разными способами. Один из них — ex vivo (вне организма), когда клетки извлекают из организма, проводят манипуляцию с их генами и снова возвращают в организм, как в указанной работе китайских ученых. Другой подход — in vivo (в организме) — мы рассматривали, обсуждая эксперимент с мышкой, которой в хвостовую вену вводили «генетическое лекарство» — специальную генетическую конструкцию, приводившую к излечению.

Сегодня для проведения генной терапии имеется очень большое количество перспективных мишеней. Например, в портфеле швейцарской биотехнологической компании CRISPR Therapeutics, одним из учредителей которой является Эмманюэль Шарпантье, лауреат Нобелевской премии за создание системы CRISPR/Cas9, предусмотрено использование технологий геномного редактирования для лечения десятка заболеваний.

В первую очередь в планах CRISPR Therapeutics — болезни крови и иммунные заболевания, к которым относятся бета-талассемия, мелкоклеточная анемия и тяжелый комбинированный иммунодефицит. Поскольку речь идет о клетках иммунной системы — лимфоцитах, это уже хорошо отработанная процедура, как мы разобрали на примере работы китайских ученых, и она может быть применена очень эффективно.

В США уже идут клинические испытания первой и второй фазы генной терапии бета-талассемии и мелкоклеточной анемии, и я думаю, что скоро мы узнаем о том, насколько успешными они оказались.

Другая мишень компании — терапия онкогематологических заболеваний, то есть онкология, связанная с кровью. Сегодня для лечения B-клеточных лимфом все шире используется генно-терапевтический подход, который называется CAR-Т, или химерный антигенный Т-клеточный рецептор (Chimeric Antigen Receptor 7). Мы уже немного говорили о Т-клетках и о том, что по разным причинам опухоль ускользает от поражения Т-лимфоцитами. Но знания в области молекулярных механизмов иммунного ответа становятся все глубже, и теперь с помощью генной инженерии можно собрать химерный Т-клеточный рецептор. Почему он химерный? Потому что мы уже имеем возможность генно-инженерным путем собрать конструкцию, которая будет содержать фрагмент антитела, распознающего опухолевый антиген В-клеточной лимфомы, добавить к фрагменту этого антитела фрагмент Т-клеточного рецептора, проходящего через клеточную мембрану, а к внутриклеточной части Т-клеточного рецептора добавить еще целый ряд фрагментов от других рецепторов, необходимых для эффективного устранения опухолевой клетки. Собранную таким образом генетическую конструкцию вводят в Т-клетки, а потом уже эти клетки вводятся пациенту. И возникает противоопухолевый ответ. Это, конечно, не очень простая и достаточно дорогая технология, поскольку манипуляция с клетками пациента выполняется вне его организма. Но альтернативной терапии для этих людей нет, поэтому приходится прибегать и к такому подходу.

Я еще раз хочу напомнить, что во всех случаях генетического редактирования, о которых мы до сих пор говорили, генные исправления делались в соматических клетках, и все эти исправления не будут наследоваться.

Вирусы на службе генетиков

В главе 3 мы уже говорили об использовании вирусов в качестве векторов для переноса в клетку «правильного» гена, как, например, в случае генной терапии одного из видов наследственной дистрофии сетчатки глаз — амавроза Лебера. Эта технология использует аденоассоциированный вирус для доставки прямо в глаз здоровой копии мутировавшего гена RPE65, и на ее основе в 2018 году появился препарат Люкстурна, позволяющий частично вернуть таким больным зрение.

К сожалению, тяжелые болезни зрения бывают вызваны мутациями в достаточно широком спектре генов. В результате люди либо рождаются незрячими, либо постепенно теряют зрение — в пятнадцать, двадцать, тридцать лет, и это еще более трагическая ситуация, влекущая за собой тяжелую психологическую травму. Не было никаких способов хотя бы остановить прогрессирование этой патологии, и только генная терапия дает какие-то шансы впоследствии изменить ситуацию.

Сегодня ученые уже научились создавать вирусные векторы для генной терапии, используя в них и аденовирусы, и аденоассоциированные вирусы, и даже вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), что звучит достаточно страшно — а вдруг он действительно приведет к развитию иммунодефицита! Но нет, на самом деле уже с 1970-х годов ученые умеют работать с генами в пробирке.

В чем заключается работа с вирусами? Главное, в чем состоит для нас ценность вируса, — это его свойство копировать свою генетическую информацию внутри клетки за счет ее ферментов репликации. Если мы уберем из состава генома вируса те фрагменты генетического текста, которые отвечают, скажем, за его размножение, то вирус сохранится, но размножаться не сможет. А можно изъять из генома вируса те фрагменты генетического текста, которые у него отвечают за синтез белков капсида (оболочки вируса), генно-инженерным путем встроить их в клетку, и клетка будет сама производить эти белки, в то время как вирусная молекула эту способность потеряет. Таким образом удается существенно уменьшить генетическую информацию самого вируса, поскольку часть его функций теперь передана клетке вне организма. А с уменьшением содержания генетической информации вирус становится более безопасным, неинфекционным.

Благодаря этой генно-инженерной манипуляции можно сделать все вирусы достаточно безопасными, а кроме того, за счет передачи некоторых функций вируса специализированным клеткам освободить в его геноме место для полезной генетической информации. И получается тот самый вектор, в который дальше можно с помощью методов генной инженерии и гомологичной рекомбинации вставить нужный ген, в специализированных клетках собрать уже новые вирусные частицы — нашу синтетическую химерную нуклеиновую последовательность, запаковать ее в вирусные белки и уже этим вирусом инфицировать человека. Напомню, что он лишен возможности реплицироваться и собираться, так как у него нет генов для синтеза этих белков — они остались в тех специализированных клетках, с которыми производились манипуляции в лаборатории для производства нашего векторного вируса. Он может совершить инфицирование только один раз — перенести нужный нам генетический материал в клетку и на этом закончить свое существование.

Когда без редактора не обойтись

Но, увы, использование рассмотренного выше метода для генной терапии ограничено размерами вируса. Мы не можем вместить в него больше генетической информации, чем позволяет его природный максимальный размер, называемый емкостью вируса. Но даже существенное замещение вирусного генома на необходимый для переноса генетический текст не всегда удовлетворяет потребностям исследователей. Сегодня мы можем вставить внутрь вирусных векторов, в зависимости от используемого вируса, где-то от трех до семи тысяч букв генетического текста. А, например, при генной терапии макулодистрофии сетчатки, которая возникает из-за мутации в гене СЕР290, размер гена раза в три больше, чем может себе позволить, скажем, аденоассоциированный вирус. Поэтому для пациентов с таким диагнозом стандартный подход генной терапии с помощью вирусов неприменим.

Кажется, положение безвыходное. Но почему бы не попытаться исправить дефектный ген прямо в клетках глаза, не прибегая к доставке нового гена, а с помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9?

Ученые умеют доставлять в клетку целую страницу генетического текста, а вот уже пять—десять страниц не могут, и приходится переходить на новый уровень редакторской работы: не просто заменять параграф, зная, что там что-то произошло, а внимательно читать десятки страниц и менять отдельные буквы. Это как раз и позволяет делать система геномного редактирования CRISPR/Cas9. И вот уже компания Editas Medicine, которой принадлежит одно из первых достижений ге-номного редактирования — восстановление функции печени у мышей, в 2019 году получила разрешение FDA на проведение клинических исследований по исправлению гена СЕР290 с помощью CRISPR/Cas9 прямо в глазу у пациента. Понятно, что исправление гена в соматических клетках человеческого глаза никак не затрагивает клетки зародышевого пути, и эта мутация продолжит передаваться по наследству. Но благодаря даже еще не конечному, а лишь начальному, но положительному решению регулятора (FDA) по поводу планов компании, она сразу получила от инвесторов двадцать пять миллионов долларов. То есть становится возможным появление перспективного лекарственного препарата.

Не унаследовать бы изменения!

Главной целью генной терапии, естественно, является благо человека, его избавление от тяжелых заболеваний, которые другим путем не лечатся. Однако в этой книге я уже неоднократно подчеркивал, что все исследования, о которых мы говорили, были направлены на клетки взрослого организма, которые не принадлежат к клеткам зародышевого пути, а значит, все внесенные в процессе терапии генетические изменения не будут наследоваться. Почему же люди проявляют такую боязливость в отношении вмешательства в стандартный биологический процесс? Разве человечество не вмешивается постоянно в биологические процессы окружающей среды, выводя новые виды растений и животных за счет скрещиваний и модификаций?

Тем не менее факт остается фактом: человек о себе заботится больше, чем об окружающей природе. Например, когда в 1978 году родилась Лиза Браун — первый в мире ребенок, зачатый «в пробирке», это почему-то вызвало бурю негодования, и не только среди людей религиозных, но и в научном сообществе. Как посмели вмешаться? А вдруг что-то у этого человека пойдет не так? И еще неизвестно, что его ждет в будущем!

Действительно, опасность существует, когда мы повторяем некоторые естественные процессы в искусственных условиях. Наверное, также негативно воспринималось когда-то появление ребенка с помощью кесарева сечения, — это тоже вмешательство в нормальную биологию, но оно спасало жизни. А новая технология экстракорпорального оплодотворения дарила жизни, причем никаких отклонений ни у мамы Лизы Браун, ни у нее самой, ни у других десяти миллионов детей, «зачатых в пробирке», пока не наблюдается.

Почему я уделяю особое внимание технологии экстракорпорального оплодотворения? Потому что именно она дает возможность вмешательства в клетки зародышевого пути человека. Ведь на первом этапе своего развития человек представляет собой одну клетку! Потом эта клетка делится — их становится две, затем четыре и т. д. На ранних этапах все они одинаковы, неотличимы друг от друга, и только на стадии примерно ста клеток в эмбрионе начинается первая специализация, то есть появляются клетки, которые потом создадут нервную, кровеносную, пищеварительную, эндокринную, сердечно-сосудистую системы, а часть клеток станет гоноцитами и из них смогут образовываться сперматозоиды или яйцеклетки.

Если изменить генетическую информацию на самых ранних стадиях развития эмбриона, генетические изменения попадут и в клетки зародышевого пути. По достижении половой зрелости организма эти клетки полового пути естественным путем передадут введенные в них генетические изменения потомству.

Казалось бы, это так здорово! Давайте всех заранее откорректируем, чтобы никто не болел, и пусть болезни вообще устранятся из рода человеческого. Что тут скажешь? Несомненно, когда речь идет об известных моногенных неизлечимых заболеваниях, такой подход имеет право на существование. Но у людей, как правило, появляются и другие, порой опасные желания по изменению генотипа человека. В любом случае они мешают появлению естественного биоразнообразия, а значит, препятствуют развитию. Конечно, геномное редактирование, в том числе с помощью системы CR1SPR/Cas9, позволяет при необходимости заменить единственную букву генетического текста. Но даже эта, самая совершенная на сегодняшний день система все равно, увы, несовершенна. Она тоже может ошибаться. Как часто? Вроде бы нечасто, с вероятностью 10-6. Но если у нас 10^9 букв генетического текста в одной клетке, то даже при точности редактирования 10-6 все равно около одной тысячи букв могут быть повреждены. Эти внемишенные (off-target) изменения можно как-то предсказать и потом просмотреть соответствующие фрагменты генетического текста, чтобы выяснить, действительно ли там происходит повреждение (скажу по собственному опыту: в основном нет, не происходит). И все-таки вероятность внесения каких-то нежелательных изменений, пусть низкая, но существует. Поэтому возникает естествен-ный вопрос: допустимы ли подобные вмешательства в принципе?

В 2013 году появились первые публикации о применении системы СRISPR/Cas9 для геномного редактирования, а уже в 2014 году китайскими учеными была опубликована совершенно фантастическая работа, выполненная на приматах — мартышках. Приматы гораздо ближе к человеку, чем мыши: человек ведь тоже из отряда приматов. Китайские ученые решили на уровне одноклеточного эмбриона мартышки, то есть на только что оплодотворенной яйцеклетке, провести множественное редактирование генома — исправить генетический текст не в одном месте, а в пяти различных местах, чтобы добиться определенных признаков у потомства.

Зачем это делалось? У исследователей была благая цель. Мартышки хоть и близки к человеку, но в плане иммунной системы отличаются, и использовать обезьян, чтобы проверять на них те или иные биомедицинские технологии, связанные с иммунной системой человека, не удается. Китайские исследователи решили с помощью геномного редактирования сделать так, чтобы эти мартышки могли впоследствии быть использованы в качестве реципиентов тканей и органов человека для трансплантации.

Это очень важно, потому что сегодня ученые уже умеют выращивать «зачатки» искусственных органов (органоиды) человека для всевозможных исследований. Но прежде чем пересаживать искусственно выращенные органы, надо проверить, как они будут встраиваться в организм, взаимодействовать с другими его тканями, как туда проникнут кровеносные сосуды, как эти ткани будут иннервироваться[10]. Мы не сможем поместить в мышь выращенный печеночный органоид человека, пусть и маленький, величиной с наперсток, из-за физической и физиологической несовместимости.

Для всех таких экспериментов требуются соответствующие модельные системы, и задачей китайских исследователей в данном случае было выведение такой линии животных, которые впоследствии могли быть использованы для изучения особенностей организма человека. А для этого надо, чтобы они были иммунологически совместимы с человеком. Причем вносить изменения надо было на уровне одной клетки, чтобы они попали в зародышевый путь, и уже после этого животное-основатель (founder), в котором обнаружатся необходимые свойства, естественным путем могло передать их своим потомкам, которых впоследствии можно было бы использовать в научных целях.

Для своего эксперимента исследователи использовали сто девяносто восемь яйцеклеток (ооцитов), извлеченных из мартышек. Для этого потребовалось около сорока самок. После искусственного оплодотворения было получено сто восемьдесят шесть зигот, из которых восемьдесят три ученые подсадили тридцати суррогатным самкам. Всего развилось девять беременностей и родилось девятнадцать мутантов-мартышек. Процедура получилась длительная и очень дорогая. Но зато дальнейшие расходы сводятся к минимуму, потому что один мутантный самец с заданными свойствами менее чем за год способен естественным образом обеспечить появление двух-трех десятков потомков с необходимым генотипом. Таким образом, китайским ученым с помощью технологии геномного редактирования CRISPR/ Cas9 удалось получить линию мартышек с заданными генетическими свойствами — совместимостью с клетками и тканями человека.

Девятнадцать мутантных отпрысков были тщательно исследованы учеными. У мартышек были обнаружены только те генетические изменения, которых они добивались, а в других местах никаких изменений не оказалось, что указывает на высокую точность редактирования.

Это генетическое редактирование, проведенное на уровне яйцеклетки, было первой работой, которая показала, что если данный процесс вообще можно проводить на приматах, то технология полностью готова для проведения генетического редактирования генома человека, причем такого, при котором внесенные изменения станут наследуемыми.

Следующего шага долго ждать не пришлось. Уже в 2015 году вышла новая работа китайских ученых, в которой они сообщили о результатах проведенного генетического редактирования на эмбрионах человека. В опубликованной статье было сказано, что большинство эмбрионов после их геномного редактирования оказались нежизнеспособными, а с остальными эксперимент был прерван на стадии четырнадцатого дня развития эмбриона, причем большинство из них погибло даже раньше. Тем не менее этот эксперимент вызвал бурный взрыв эмоций со стороны научных сообществ, в первую очередь американского. Ученые из США возмущались громче всех, доказывая, что это неэтично, что человечество к таким экспериментам еще не готово, надо проверить получше, изучить более тщательно, провести дополнительные исследования.

Наверное, это отчасти правильно. Чем больше мы проведем исследований, прежде чем применить что-то непосредственно на человеке, тем лучше, все-таки человек — не обезьяна. Но все равно когда-то придется переходить на человека и применять разработанные на животных технологии. А неудовольствие американских ученых этим первым экспериментом, скорее всего, было вызвано тем, что «кто-то» опередил США.

В декабре 2015 года в США состоялся 1-й Международный саммит по редактированию генома человека. Организаторами являлись США, Великобритания и Китай, присутствовали ученые из разных стран. В отличие от Асиломарской конференции 1975 года, российских представителей там не было. На саммите 2015 года участники конференции договорились, что на настоящий момент клиническое использование отредактированных эмбрионов человека является безответственным.

Такое решение не было первым. Еще в конце 2014 года Организация Объединенных Наций выпустила декларацию, к которой присоединился ряд стран, в том числе и Россия, о том, что нельзя использовать геномное редактирование для клеток человека, которые могут попасть в зародышевый путь. Но в китайской работе 2015 года по редактированию эмбрионов человека генетическая информация уже могла бы сохраниться, если бы эмбрионы не погибли или их развитие не было специально остановлено. Саммит 2015 года был созван, чтобы, так сказать, сверить часы. По его результатам было принято решение, что эмбрионы человека редактировать не стоит...

Однако в 2017 году вышла работа американских ученых именно по генетическому редактированию эмбриона человека, выполненная под руководством одного из ведущих ученых-эмбриологов мира Шухрата Миталипова, в свое время получившего образование в СССР.

За этим ученым признано несколько больших технологических прорывов. В частности, он был первым в мире человеком, который совершил терапевтическое клонирование приматов. Он же впервые в мире в 2012 году клонировал эмбрион человека. Это было не репродуктивное клонирование с целью рождения нового человека, а терапевтическое клонирование для получения эмбриональных стволовых клеток, полностью идентичных донору генетического материала.

Целью исследования 2017 года было внесение исправлений в некую патогенную мутацию. Сначала коллектив Миталипова пытался идти по пути своих китайских коллег и производить геномное редактирование на уровне зиготы, когда яйцеклетка уже оплодотворена сперматозоидом и там присутствуют два генома — отцовский и материнский. Но оказалось, что при последующих делениях получается целый набор различных вариантов клеток, отличающихся своим геномом. Бывает, например, так, что все клетки в многоклеточном эмбрионе оказываются несущими нужные исправления. Возможен и совершенно другой вариант: получаются эмбрионы, в которых вообще нет никаких генетических исправлений. Но самое плохое — когда образуется смешанный вариант (он называется мозаик), в котором присутствуют различные геномы; это значит, что в получившемся многоклеточном эмбрионе часть клеток несет генетические исправления, а другая часть — не несет.

Последний вариант хуже всех, потому что впоследствии эти клетки продолжают деление и с определенного момента начинают специализироваться: какие-то идут в клетки зародышевого пути, другие начинают формировать сердце, образуют закладки мозга, крови, пищеварительного тракта и других органов тела. А вот в какую ткань попадет клетка с каким геномом — совершенно непредсказуемо. И получится, что уже во взрослом организме клетки с исходной мутацией будут, скажем, наблюдаться в коже, но отсутствовать в крови. Или, к примеру, в сердце они могут и присутствовать, и отсутствовать. Это значит, что совершенно четкой картины мы не получим и не сможем сказать, каков вклад мутации, исправили мы ее или нет. Группа Шухрата Миталипова поставила перед собой задачу преодолеть эту проблему — сделать так, чтобы все эмбрионы на стадии сотни клеток были однородными, не мозаичными. Для этого генетический редактор вводился в ооцит на разных стадиях оплодотворения. Оказалось, чтобы получить единообразный эмбрион, лучше делать генетическое редактирование еще на стадии яйцеклетки — до того, как произошло оплодотворение отцовским геномом. Вероятно, здесь работают какие-то определенные механизмы, приводящие к более эффективному геномному редактированию.

В своих работах на приматах китайские исследователи проблем мозаичности не наблюдали. Почему такая разница в результатах китайских и американских ученых? В первую очередь надо понимать, что каждый исследователь использует свои условия, которые хоть немного, но отличаются (как минимум, это собственные глаза и руки). Немножко различаются и используемые реактивы, поскольку они выпускаются разными фирмами, изготовлены в разные годы, по-разному хранились (это «немножко» может на самом деле оказывать большое влияние). Исследования некоторых групп, проведенные позже, не совсем подтвердили точку зрения Миталипова и его коллег относительно того, что лучше редактировать геном яйцеклетки до оплодотворения. Ничего драматичного нет в том, что по каким-то неустранимым причинам результаты оказываются не полностью воспроизводимыми. К тому же надо иметь в виду, что работа очень сложна, поскольку ведется на живых системах, которые исключительно гибки, и действие многих внешних факторов нам трудно заранее предсказать.

Итак, можно сказать, что, несмотря на принятые самими учеными ограничения, работы с эмбрионами человека активно продолжались и усложнялись, хотя и были исключительно экспериментами в пробирке, in vitro. В США, Англии и еще нескольких странах Европы действовал категорический запрет на геномное редактирование эмбрионов человека с их последующей имплантацией.

Наиболее грамотную политику в плане всех новых технологий, в том числе геномного редактирования, проводил Китай: эти работы не были полностью запрещены, но для них были установлены некие внутренние правила. И хотя они подлежали определенным согласованиям и разрешениям, запреты были минимальны, поэтому исследования развивались стремительно. Глядя на успехи применения технологии геномного редактирования в Китае, американские регуляторы в 2017 году несколько снизили строгость своего запрета на редактирование эмбриона человека. Они уже допускали, что с большой вероятностью исследования по редактированию наследственных заболеваний на уровне эмбриона человека могут быть совершены в будущем при серьезной патологии у людей.

Причина этого послабления простая: наука не стоит на месте, и этот вопрос все равно придется решать. Делать пока ничего нельзя, но запрещать себе даже думать о генетическом редактировании на уровне эмбриона для лечения наследственных заболеваний уже непростительно. Таким образом, американский регулятор FDA сделал первый шаг, позволив ученым «думать». А в середине 2018 года уже британский регулятор выпустил очередную брошюру, в которой отмечалось, что редактирование эмбриона при наследственном заболевании может быть приемлемо при некоторых обстоятельствах. Это была гораздо более приближенная к жизни формулировка, чем в США, поскольку не содержала расплывчатых указаний на вероятные действия в неопределенном будущем. Великобритания допускала, что в обозримые сроки этот вопрос каким-то образом точно будет решен.

В сентябре 2018 года Министерство здравоохранения Японии выпустило правила, допускающие выдачу разрешений на генетическое редактирование эмбриона человека для клиники.

Таким образом, запрет на эти действия постепенно начал ослабевать.

Наследуемое редактирование генома человека: фантастика или факт?

Наследственность из пробирки

С самого начала книги, подготавливая читателя, мы рассказывали о манипуляциях с геномом человека, которые чаще всего проводились in vitro. Такой подход давно уже никого не удивляет; сегодня существуют и применяются многие продукты, сделанные в лабораторных условиях на основе ДНК человека, то есть его генов. Мы можем производить лекарственные белки — инсулин, интерлейкины, интерфероны. Сегодня широко распространены антитела, с помощью которых лечат онкологические, аутоиммунные, даже вирусные заболевания. И все это делается благодаря генам человека, с которыми ученые работают вне его тела, — в пробирке или в других организмах.

Следующим этапом в развитии биомедицины стала работа с генами человека непосредственно в клетках, находящихся внутри организма. Появилось такое медицинское направление, как генная терапия, позволяющая (если человек родился с каким-то генетическим заболеванием) вводить в соматические клетки нормальную, функционирующую копию поврежденного гена и тем самым восстанавливать его утраченную функцию. Мы рассматривали эту возможность на примере заболеваний сетчатки глаза и болезней, связанных с иммунной системой.

Особенность нынешнего этапа развития геномного редактирования, которому посвящена эта глава, состоит в том, что описанные в ней модификации производятся уже не с соматическими клетками, а с клетками зародышевого пути — по сути, бессмертными! Сейчас объясню, почему это так.

Когда появляется новый организм, то на самых ранних этапах его эмбрионального развития большинство клеток начинает формировать наше тело — сому. Однако небольшая часть клеток отделяется, и из них закладываются клетки зародышевого пути. У мужских особей эти клетки продуцируют сперматозоиды, у женских — яйцеклетки. Но их главное отличие от соматических состоит в том, что заключенная в них генетическая информация обо всем организме, несмотря на предстоящую неизбежную гибель нашего, увы, смертного тела, бессмертна, потому что она наследуется, то есть передается нашему потомству. И сами клетки зародышевого пути — гаметы — в определенном смысле оказываются бессмертными.

Целью генетической модификации, на которую впервые в мире решился китайский ученый Хэ Цзянькуй, было проведение геномного редактирования — именно в гаметах, чтобы потом эти изменения естественным образом наследовались в ряду поколений человека.

В предыдущей главе мы тоже обращались к наследованию, но там все-таки речь шла об обезьянках. А Хэ Цзянькуй сделал свой большой шаг в технологии геномного редактирования, чтобы изменить наследуемую генетическую информацию человека.

Научные открытия или заблуждения?

Считается, что наука — это поиск истины. Тем не менее научные события часто развиваются по детективному сценарию, и многое происходит под покровом тайны. И дело не только в трудностях исследований, но и в природе самого человека, занятого научным поиском. Ученые хотят быть первыми и во многих случаях не спешат раскрывать подробности своей работы.

Поэтому время от времени возникают проблемы и даже скандалы с исследованиями ученых. В частности, одним из наиболее известных стал так называемый хвангейт — скандал, связанный с терапевтическим клонированием человека. Случился он в 2005—2006 годах, когда южнокорейский ученый Хван У Сок, который заявлял, что клонировал человека, был обвинен в фальсификации результатов, и это подтвердилось.

Другой известный скандал в области клеточных генетических технологий, произошедший в 2014 году, связан с именем японской исследовательницы Харуко Обоката. Она опубликовала в авторитетных научных журналах статьи о том, что разработала удивительно простые методы репрограммирования соматических клеток человека. Однако через полгода ей пришлось отозвать статьи, опубликованные в журнале Nature, потому что данные оказались подделанными. Скандал завершился трагедией: известный японский ученый Йошики Сасаи, директор Центра биологии развития RIKEN и соавтор статей Харуко Обоката, после признания их фальсификацией покончил жизнь самоубийством.

Зачем эти люди фальсифицировали результаты? Вопрос сложный. Даже Шухрат Миталипов, официально признанный первым человеком в мире, кто совершил терапевтическое клонирование человека, допустил промах. В его статье, опубликованной в высокорейтинговом международном журнале Cell, были обнаружены материалы, которые оказались ошибочными. И он тогда признал свою неправоту. Из его объяснений следовало, что фотографический материал, который приводился в этой статье в качестве доказательств, к сожалению, попал туда случайно, по ошибке — вместо другого, правильного. Теперь уже ученый предоставил журналу «правильные» фотографии и с надлежащими извинениями уверил научную общественность, что, несмотря на допущенную ошибку в публикации промежуточных результатов, конечный результат, тем не менее, остается верным.

ЧЕГО НЕ СДЕЛАЕШЬ РАДИ РЕЗУЛЬТАТА

Когда южнокорейский ученый Хван У Сок в 2004 году опубликовал в журнале Science свою первую статью о клонировании человека, он был признан национальным героем Южной Кореи. На него посыпались почести, ему выделялись сотни миллионов долларов на продолжение исследований. В 2005 году вышла его вторая работа; в ней Хван У Сок говорил о том, что для неких пациентов, страдающих тяжелыми заболеваниями, ему удалось получить персонифицированные линии клонированных клеток, и теперь специально для них можно вырастить новые клетки, чтобы вылечить этих пациентов. Понятно, что речь шла об открытии, имеющем колоссальный потенциал! Однако в декабре 2005 года бывший коллега южнокорейского ученого опубликовал в интернете небольшой пост о том, что на самом деле фотографии уникальных стволовых клеток, которые иллюстрировали его работу, — снимки одной и той же клетки, но сделанные в разных ракурсах, чтобы подтвердить желаемый результат. Было проведено и журналистское, и научное расследования. В январе 2006 года независимая экспертная группа Сеульского университета сообщила окончательные результаты проверки работ лаборатории Хван У Сока. Оказалось, что все результаты, связанные с клонированием человеческих клеток, подделаны. Фальшивкой признано и создание первой в мире линии человеческих стволовых клеток от клонированного эмбриона, и получение персонифицированных культур стволовых клеток. Вопреки южнокорейским законам, Хван У Сок закупил более тысячи донорских яйцеклеток на черном рынке. Но самым серьезным обвинением, предъявленным ученому, было то, что он, пользуясь служебным положением, склонял к донорству яйцеклеток и своих сотрудниц.

Здесь надо пояснить, что эффективность клонирования очень невысока, особенно для крупных животных. Шухрат Миталипов в 2007 году, проводя клонирование обезьянок, использовал порядка полутора сотен яйцеклеток, чтобы получить две-три клонированные линии клеток. То есть для получения одной клонированной линии требуется не менее сотни яйцеклеток. Но у женщин в норме выходит ежемесячно одна яйцеклетка. И лишь при искусственной овуляции, производимой по технологии экстракорпорального оплодотворения, может выйти около десятка яйцеклеток. Но это достигается только путем применения гормона по медицинским показаниям и под наблюдением врача, потому что действие этого гормона не так уж безобидно, может иметь побочные последствия и должно быть обосновано.

Как ни странно, в результате разоблачения Хван У Сок почти не пострадал. Он был уволен из Сеульского национального университета и основал крупнейшую фирму по клонированию животных, в частности собак. Именно он со своей группой в 2005 году впервые в мире клонировал собаку, а позже — корову, свинью и кошку. Его фирма работает также над межвидовым клонированием (в 2011 году они клонировали койота на основе собаки) и клонированием исчезающих видов животных, например красного волка. А в 2012 году Хван У Сок заключил соглашение с Северо-Восточным федеральным университетом Республики Саха (Якутия) о намерении клонировать сибирского мамонта — это его давняя мечта. Теоретически такое клонирование возможно, хотя имеющиеся сегодня технологии не позволяют этого сделать. Поэтому пока вместо мамонта корейский ученый привез в Якутию трех клонированных полицейских собак. Так что главная работа еще впереди!

Полна подделок история разработки современных средств из области регенеративной медицины. Так, в конце 2018 года было окончательно завершено расследование двух очень интересных дел о фальсификации, заведенных на известных ученых.

Итальянский ученый Паоло Маккиарини, талантливейший торакальный (от слова торакс — грудная клетка) хирург, прославился среди прочего тем, что получил мегагрант Правительства РФ. О том, как трудно было Паоло Маккиарини получить этот мегагрант, предназначенный для поддержки важнейших научных исследований в России, рассказано в книжке Елены Кокуриной «Мегагрант». Целью работы, которая выполнялась в Краснодаре, была пересадка человеку искусственной трахеи.

Маккиарини приезжал в Россию несколько раз еще до получения мегагранта и сумел заинтересовать своей работой научные круги нашей страны. В то время он занимал одну из лидирующих позиций в Каролинском институте в Швеции, публиковал свои статьи в международном высокорейтинговом медицинском журнале The Lancet и в ряде других изданий. В этих статьях говорилось о том, что автор выращивает вне организма трахею, а потом пересаживает эту искусственно выращенную трахею пациентам, которые в этом нуждаются.

Закончилась эта история грандиозным скандалом. За рубежом было проведено журналистское расследование, и оказалось, что на самом деле все пациенты Маккиарини умерли. Он действительно проводил эти операции, но после них никто из пациентов с пересаженной трахеей долго не жил.

Статьи Маккиарини были отозваны. Каролинский институт в Швеции, где ученый работал последние годы перед разоблачением, отказался от его услуг. Мало этого, пострадали также декан факультета, где работал Маккиарини, и еще несколько ученых этого института — за то, что приняли на работу человека, занимавшегося подобными делами, и длительное время одобряли его деятельность. Все они входили в Нобелевский комитет — участвовали в присуждении премий по физиологии и медицине, а также по химии. Двое или трое из этих ученых были вынуждены не только покинуть Каролинский институт, но и выйти из Нобелевского комитета. В результате даже возникла проблема присуждения Нобелевской премии за 2017 год, поскольку пришлось срочно искать новых членов Нобелевского комитета.

Другая скандальная история связана с именем американского ученого Пьеро Анверса. Он приобрел известность в начале 2000-х годов, когда начал публиковать свои работы об открытии им популяции стволовых клеток сердца. В одной из его статей сказано, что благодаря этим клеткам сердечная мышца у взрослых людей обновляется примерно на семь процентов в год. Понятно, что стволовые клетки сердца стали бы «золотой жилой» для медицины, поскольку сердечно-сосудистые заболевания, и особенно инфаркт сердца, при котором разрушается сердечная мышца, — это наиболее массовая патология и одна из главных причин смертности. Если бы действительно удалось найти стволовую клетку, из которой получается кардиомиоцит (клетка мышцы сердца), то это открытие осчастливило бы не менее тридцати процентов человечества. А Пьеро Анверса обнаружил эту клетку еще в начале 2000-х и на протяжении добрых пятнадцати лет публиковал результаты, даже провел несколько клинических исследований с использованием стволовых клеток на пациентах с заболеваниями сердца.

Результаты, полученные Пьеро Анверса, неоднократно пытались воспроизвести в других лабораториях, но чаще всего безуспешно. В 2014 году началось расследование; в ряде работ ученого были обнаружены нестыковки, неточности в иллюстрациях, а в заявках на финансирование — сфальсифицированные данные. В результате расследования Гарвардский университет, в котором Пьеро Анверса занимал профессорскую должность, был оштрафован на десять миллионов долларов Национальными институтами здоровья США. От него просто потребовали вернуть полученные гранты.

Расследование окончательно завершилось в 2018 году. Открытие стволовых клеток сердца многие критики ученого признали фальсификацией, не заслуживающей траты времени и средств на продолжение этой работы. Более тридцати публикаций Пьеро Анверса с коллегами, сделанных за эти годы в научных журналах, были отозваны.

ВСПОМНИМ ОВЕЧКУ ДОЛЛИ

Захватывающие истории, которыми полна наука, нередко заканчиваются трагически; сегодня это отчасти связано и с тем, что наука стала большим бизнесом, который подразумевает большие деньги, большой рынок и, конечно, рекламу. А интрига обычно создается журналистами — прежде всего научными журналистами в содружестве с крупными научными изданиями. Происходит это так. Авторитетные международные научные издания — Science, Nature, Cell, The Lancet и т. п. — постоянно собирают, точнее, получают сведения о наиболее интересных научных исследованиях, результаты которых готовятся к публикации. Вспомним хотя бы первое клонированное животное — овечку Долли. Она была рождена в середине 1996 года, и вскоре в журнал Nature пришло сообщение о том, что авторы планируют в феврале 1997 года прислать об этой работе подробную статью. Действительно, 21 февраля 1997 года редакция журнала Nature получила материалы об овечке Долли и стала готовить публикацию в следующий номер журнала, который должен был выйти 27 февраля. Тогда же, 21 февраля, журнал Nature на условиях полной секретности разослал короткие пресс-релизы про овечку Долли крупным газетам, имеющим хорошие научные колонки.

Редакция рассчитывала, что 27 февраля, в день выхода научной статьи в журнале Nature, другие издания поддержат тему своими комментариями. Такова стандартная практика научных журналов: когда у них появляется горящая новость, они заранее рассылают информацию о ней во многие СМИ, чтобы журналисты подготовили свои колонки. Смысл этой практики двоякий: с одной стороны, информировать публику — дело благородное, с другой — получается мощнейшая рекламная кампания, а все научные журналы являются также и коммерческими предприятиями.

Однако уже 23 февраля, за четыре дня до выхода основной статьи, несколько газет опубликовали материал о клонировании.

Рекламный демон, «подогревающий» интерес широкой публики, был выпущен наружу гораздо раньше самого события. Сегодня благодаря интернету и навыкам хакеров время, за которое секретная научная информация может просочиться наружу и стать достоянием общества, еще более сократилось. Для этого может быть достаточно одних суток. Так произошло в 2018 году в истории, героем которой стал китайский ученый Хэ Цзянькуй — первый в мире человек, отредактировавший человеческий геном так, что внесенные изменения должны наследоваться.

Я уже писал, что в связи с появлением системы CRISPR/Cas9, когда показалось, что с ее помощью можно просто и быстро, всего за несколько дней провести генетическое редактирование даже соматических клеток человека, в декабре 2015 года был созван в Вашингтоне Международный саммит по редактированию генома. Его организаторами были национальные академии наук США, Великобритании и Китая.

А в ноябре 2018 года уже в Китае должен был состояться 2-й Международный саммит по редактированию генома, организованный теми же тремя академиями наук. Но тут-то и начинается настоящая детективная история.

Внезапно в сентябре-октябре 2018 года, когда до встречи уже почти не оставалось времени, Академия наук Китая заявила, что не получила никакого финансирования на запланированное мероприятие и саммит не может быть проведен на китайской территории. Для остальных двух организаторов это стало шоком. Но переносить его в другую страну уже было сложно — серьезными учеными такие мероприятия планируются заранее, поэтому организаторы решили принципиально ничего не менять, а просто провести саммит в Гонконге.

Дело в том, что Гонконг, хотя и является особым административным районом Китая, по своему статусу сохранил большую степень независимости. Организаторами саммита стали Национальная академия наук США, Королевское научное общество Великобритании и Академия наук Гонконга. Участие Хэ Цзянькуя в этой встрече было запланировано. И вдруг за сутки до официального начала саммита приходит информация, что Хэ Цзянькуй будет делать свой доклад вовсе не на ту тему, которая была заявлена, а расскажет о двух недавно рожденных девочках, которым он произвел геномное редактирование, причем так, что в последующем эти изменения будут наследоваться.

Это известие в немалой степени подогрело обстановку, но то, что рассказал китайский ученый, буквально всех потрясло.

ВИЧ как мишень

Причины того, почему Хэ Цзянькуй взялся именно за эту тему, достоверно не ясны. Пока известно только, что молодой ученый решил поработать с людьми, которые являются носителями вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Как мы все знаем, этот вирус может приводить к тяжелым последствиям и способен передаваться по наследству. Но известно также, что к ВИЧ люди имеют различную чувствительность.

Например, чернокожие жители тропических стран обладают высокой чувствительностью к ВИЧ и с большой вероятностью могут быть ВИЧ-инфицированными, причем вирус встраивается в их геном и в дальнейшем присутствует в иммунной системе. Весьма вероятны и проявления самого заболевания — СПИДа.

У жителей Южной Европы — итальянцев, французов — вероятность ВИЧ-инфицирования более низкая. Еще ниже она в Северной Европе (Скандинавия, Россия). Когда стали изучать на молекулярно-генетическом уровне, в чем причина такой разницы, то оказалось, что вообще вирус иммунодефицита человека обладает весьма высокой специфичностью: он заражает особый тип лимфоцитов — Т-клетки-помощники (Т-хелперы). А на поверхности этих Т-клеток-помощников находится среди прочего рецептор CCR5, или хемокиновый рецептор.

Хемокины — это особые биологические молекулы, которые привлекают клетки примерно так, как запах колбасы собаку: они заставляют клетки, в частности лимфоциты, двигаться в направлении источника «запаха» путем воздействия на их хемокиновые рецепторы. И тот же самый рецептор хемокина CCR5 используется вирусом для проникновения внутрь лимфоцита. Известно также, что чувствительность различных людей к ВИЧ-инфекции опосредуется через генетические варианты хемокинового рецептора.

Уже говорилось, что мутации — это просто изменения. Для человека различные мутации хемокинового рецептора считаются популяционной нормой и называются полиморфизмом. Мы помним, что каждый ген имеет в клетке две копии: одна пришла от мамы, другая от папы. И если, к примеру, одна копия гена хемокинового рецептора полностью «нормальная», то есть наиболее часто встречающаяся, то вторая может содержать вполне определенную мутацию: в ней отсутствуют тридцать два нуклеотида, и такой мутированный ген называется CCR5-дельта-32. Так вот оказалось, что при наличии одной копии такой мутации (гетерозигота) риск заболеть СПИДом будет значительно ниже, чем если у человека имеются две нормальные (на биологическом сленге — «дикие») копии этого гена. А если и от папы, и от мамы достались мутантные варианты дельта-32, то человек оказывается устойчив к вирусу.

География здесь играет пока непонятную, но важную роль. Чем дальше на север, тем чаще встречаются люди, у которых имеются в той или иной форме мутации CCR5-дельта 32. Так, на территориях к югу от Средиземного, Черного и Каспийского морей всего три—пять процентов населения имеют полиморфный вариант гена CCR5-дельта-32, а на территориях, лежащих к северу, — от восьми до шестнадцати процентов. К таким удивительным последствиям приводит природный, абсолютно естественный полиморфизм.

Китай в этом смысле — достаточно южная страна, в которой встречается только «дикий» тип рецептора CCR5. Молодой амбициозный ученый Хэ Цзянькуй решил помочь тем родителям, которые заражены вирусом СПИДа, и ввести в их будущих детей мутацию хемокинового рецептора CCR5-дельта-32, чтобы снизить вероятность заболевания СПИДом. Причем не просто ввести мутацию в соматические клетки рожденных детишек, а сделать так, чтобы эта новая для них мутация появилась в китайской популяции и могла бы передаваться по наследству, то есть и дети этих детей оказались бы защищенными от ВИЧ.

Конечно, есть возможность (кстати, используемая одной из коммерческих компаний для разработки технологии лечения), когда просто берут кровь у больных СПИДом, вводят в клетки крови эту же мутацию и помещают клетки обратно в организм. Но в популяции такие вылеченные гены не останутся — они не наследуются. А Хэ Цзянькуй хотел, чтобы они именно передались по наследству.

Надо сказать, что китайский ученый не собирался проводить свое исследование нелегально. На самом деле в определенный момент (правда, уже после того как он начал свой эксперимент) Хэ Цзянькуй направил в китайский Регистр клинических исследований запрос, чтобы ему разрешили это сделать. Однако китайский регулятор ответил, что разрешения ему не даст. Скорее всего, и информация о том, чем занимается ученый, утекла в средства массовой информации из китайского Регистра клинических исследований.

Но здесь опять-таки важно, что хотя намеченная конференция была весьма престижной, Китай в последний момент отказался от ее проведения и она состоялась пусть и рядом с Китаем, но в автономном регионе. По-видимому, отказом принять на своей территории эту конференцию Китай показал, что знает о сути эксперимента, выполненного китайским ученым, и хочет от него дистанцироваться, но не будет мешать тому, чтобы о случившемся узнал весь мир.

Самый смелый из «тысячи талантов»

История первого в мире наследуемого редактирования генома человека на долгое время оказалась в центре внимания биологии и регенеративной медицины. И это понятно, потому что очень велики надежды на биомедицину — на то, что человечество сможет более эффективно управлять такой сложной биологической системой, как человек, внося необходимые поправки на генном или клеточном уровне.

Хэ Цзянькуй родился в 1984 году в Китае, после окончания университета уехал в США учиться в аспирантуре, в 2010 году защитил диссертацию на соискание ученой степени (PhD, соответствует кандидату наук) по биофизике, а в 2012 году вернулся в Китай по программе «Тысяча талантов». Это специальная программа, принятая китайским правительством, по возвращению на родину талантливых соотечественников, чтобы они занимались научными исследованиями не за границей, а у себя в Китае.

Программа «Тысяча талантов» сначала была действительно рассчитана на тысячу человек, но потом расширена и продолжает осуществляться. Хэ Цзянькуй получил лабораторию в университете города Шэньчжэнь. Среди тех людей, которых правительство Китая привлекло для работы на родине, он считался одним из самых талантливых. Его называли китайским Эйнштейном, восходящей звездой и т. д. И хотя Хэ Цзянькуй защищал диссертацию по биофизике, после возвращения в Китай он очень плотно занялся редактированием генома. Мы уже знаем, что именно в этот период, с 2012 до 2013 год, стало очень активно развиваться редактирование генома, особенно с помощью системы CR1SPR/Cas9, позволявшей сократить время редактирования до нескольких недель.

Работая по гранту «Тысяча талантов», Хэ Цзянькуй как молодой ученый в 2018 году получил еще дополнительный грант от китайского правительства. Ему предоставили все условия для работы. Помимо научных изысканий, он, как сейчас принято во всем мире, основал семь различных коммерческих компаний как раз в области геномного редактирования, общая стоимость которых оценивается примерно в полмиллиарда долларов. Однако поначалу об эмбрионах человека речи не шло.

По словам ученого, его увлечение редактированием генома человека началось только в последние годы, но никаких публикаций у него на эту тему не было. В основном Хэ Цзянькуй пытался проводить геномное редактирование на мышах, но ни на обезьянах, ни на эмбрионах человека он не работал — по крайней мере, никто не знал его как исследователя в этой области.

Тем более поразительной для всех была новость, появившаяся за сутки до открытия международного симпозиума, о том, что Хэ Цзянькуй не только провел геномное редактирование эмбрионов человека, но и трансплантировал их и что уже родились два ребенка с отредактированным геномом. Новость облетела весь мир: сначала она была опубликована одним журналистом в твиттере, потом перепечатана в журнале Массачусетского института технологии (MIT). Этот еженедельный внутренний журнал публикует обзорные статьи по последним достижениям науки, поэтому новость об уникальном эксперименте стала очень быстро тиражироваться другими СМИ.

Однако пока это был лишь ничем не подтвержденный слух. И вот за день до начала симпозиума, в неофициальной обстановке Хэ Цзянькуя встретила Дженнифер Дудна (одна из первооткрывателей технологии CRISPR/Cas9) и как бы невзначай спросила, будет ли он рассказывать на конференции о своих экспериментах с геномом человека. Он сказал, что сообщать об этом не планировал и собирается делать доклад, посвященный каким-то другим своим работам. Дудна была поражена: как можно эксперимент, о котором уже говорит весь мир, не обсудить на этой конференции? В тот же вечер члены оргкомитета пригласили Хэ Цзянькуя в ресторан поужинать и пообщаться. Все они выразили некоторое удивление тем, что ученый решился на подобный эксперимент, хотя он объяснил, что эта работа была одобрена китайским госпиталем, где проводится экстракорпоральное оплодотворение, однако институт, где работает Хэ Цзянькуй, его эксперимент не одобрил, поэтому рассказывать об этой работе он не собирается. Тем не менее члены оргкомитета выудили из него некоторые подробности и, несмотря на свое осуждение эксперимента в принципе, дружно стали уговаривать китайского ученого сделать о нем доклад на конференции.

И на второй день конференции Хэ Цзянькуй сделал доклад о том, как его усилиями две девочки, которых он называл Нана и Лулу, появились на свет в октябре 2018 года — более чем за месяц до конференции, на которой прозвучал его доклад. Родились они с помощью кесарева сечения, но по медицинским показаниям — без всякой связи с исследованиями ученого.

Подробности уникального эксперимента Хэ Цзянькуя

В своем докладе Хэ Цзянькуй рассказал о некоторых подробностях того, что и как делал. Ученый отобрал в клинике экстракорпорального оплодотворения несколько супружеских пар, которые были инфицированы ВИЧ. Геномное редактирование, то есть введение системы CRISPR/Cas9 в клетки будущего эмбриона, происходило как раз в этой клинике. Были взяты единственная женская яйцеклетка и один сперматозоид, потому что нужно было хорошо отмыть сперматозоид от возможного присутствия вируса иммунодефицита человека в сперме при ее массовом отборе — это было необходимо из клинических соображений. Затем единственным сперматозоидом оплодотворяли яйцеклетку и к этим двум слившимся клеткам сразу же добавляли систему CRISPR/Cas9 на основе рибонуклеиновой кислоты для проведения редактирования генома.

Дальше оплодотворенную яйцеклетку (зиготу) с СRISPR/Cas9помещали на несколько дней в лабораторный инкубатор, чтобы по существующей технологии, разработанной задолго до Хэ Цзянькуя, провести генетический анализ. Обычно он проводится, когда у людей есть подозрение на какое-то генетическое заболевание плода, например болезнь Дауна или еще что-то. По этой технологии на третий-четвертый-пятый день развития зиготы можно от эмбриона отщепить одну клетку, при этом эмбрион не пострадает — он и дальше будет нормально развиваться. Но на единственной взятой из него клетке можно провести генетический анализ (он называется предимплантационной генетической диагностикой) и посмотреть, хорош ли этот эмбрион с генетической точки зрения или плох. Если, предположим, обнаруживается трисомия по двадцать первой хромосоме (синдром Дауна), то данный эмбрион уже подсаживать не будут; вместо этого проверят другой эмбрион, и если он не несет трисомию, его можно будет подсадить. Предимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — это стандартная процедура, используемая уже не один десяток лет.

Хэ Цзянькуй для проведения ПГД взял как раз одну клетку, но целью его диагностики в данном случае была необходимость узнать, прошло ли редактирование и насколько хорошо. Ведь и яйцеклетка, и сперматозоид до слияния несли свои геномы — по двадцать три хромосомы от каждого из родителей. Текст, на который нацеливался китайский ученый (ген CCR5), находился на третьей хромосоме генома мамы (в яйцеклетке), а другая его копия — на третьей хромосоме генома папы (в сперматозоиде). После их слияния образуется диплоидный набор хромосом: двадцать три от мамы и двадцать три от папы, всего сорок шесть. На этом этапе в зиготу был добавлен генетический редактор, нацеленный на ген CCR5. Такой ген есть и на маминой, и на папиной хромосоме, а значит, в дальнейшем могут получиться такие варианты: генетический редактор не сработает (оба аллеля гена CCR5 сохранятся неизменными); будет отредактирован только один аллель, а второй останется нетронутым; будут отредактированы оба аллеля.

При проведении ПГД на этапе, когда эмбриону от трех до пяти дней, Хэ Цзянькуй ставил своей целью посмотреть, в каких из нескольких развивающихся эмбрионов произошло редактирование целевого гена, чтобы выбрать впоследствии самую лучшую бластоцисту (раннюю стадию развития эмбриона) для трансплантации в матку женщины. Всего ученый использовал двадцать две оплодотворенные яйцеклетки от нескольких супружеских пар, и оказалось, что только в шестнадцати из них произошло редактирование — либо наполовину, либо полностью. Одиннадцать из этих шестнадцати эмбрионов были использованы для имплантаций. Сегодня не рекомендуется имплантировать женщине более двух бластоцист, так как техника экстракорпорального оплодотворения развита достаточно хорошо, и в семидесяти процентах случаев обе бластоцисты нормально развиваются до самых родов, так что рождается двойня.

Поскольку было имплантировано одиннадцать эмбрионов, и не более двух — одной женщине, то, очевидно, трансплантация была проведена пяти или шести женщинам. Однако, судя по всему, развилась только одна беременность, и родились двойняшки (не однояйцевые близнецы) — никакой информации о других беременностях не появлялось.

Так родились Нана и Лулу. У одной из них, как выяснилось, была внесена мутация только в один аллель, то есть получилась гетерозигота по гену CCR5. Это значит, что один аллель оказался измененным и несет природную мутацию дельта-32. А второй аллель остался исходным, без полиморфного варианта гена. Другая девочка имела изменения в обоих аллелях гена CCR5, то есть они несли мутацию дельта-32. Считается, что такие люди устойчивы к вирусу иммунодефицита человека.

К сожалению, с тех пор как Хэ Цзянькуй выступил со своим докладом на конференции в Гонконге в ноябре 2018 года, никакой новой информации об этом уникальном эксперименте не появлялось. Каких-либо определенных научных публикаций в рецензируемых журналах до сих пор нет; ни один из них не решился напечатать материалы, отправленные китайским ученым. И та история, о которой я здесь рассказываю, стала известна скорее из публикаций в СМИ и научно-популярных изданиях, чем из какой-то научной аналитической статьи.

В природе такого не бывает

О явлении, названном мозаицизм, мы уже говорили, когда обсуждали эксперименты на обезьянах и работы Шухрата Миталипова по редактированию эмбриона человека без имплантации. Мозаицизм возникает, когда у одного и того же организма разные клетки могут нести немного отличающиеся гены. Читатель уже, наверное, понял, что это явление могло развиться при геномном редактировании на уровне эмбриона, которое провел Хэ Цзянькуй. Ученый ввел необходимый генный редактор в зиготу (уже оплодотворенную яйцеклетку с диплоидным геномом), однако дальше эта клетка делится, образуя две, четыре, восемь, шестнадцать клеток и т. д., — и на каком этапе генный редактор сработает, неизвестно. Как вы помните, Шухрат Миталипов утверждал, что вводить генный редактор надо не тогда, когда гаметы уже слились, а на более раннем этапе, еще до оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом. Хэ Цзянькуй пошел более стандартным путем, и генный редактор действительно сработал гораздо позже — уже на этапе нескольких клеток, причем сработал, скорее всего, далеко не во всех из них. В каких-то клетках ген был изменен, а в других остался в своем нормальном состоянии.

В естественной популяции такого не бывает. Существуют природные варианты гена CCR5 — те, которые наследуются. Например, от мамы будущий ребенок получает ген CCR5-дельта-32, а от папы более широко распространенный вариант гена без этого изменения, и все клетки этого человека с момента его рождения и до самой смерти будут гетерозиготны по гену CCR5. А вот с ситуацией, когда возникает мозаицизм, то есть часть клеток в одном и том же организме гомозиготна по гену CCR5, а другая гетерозиготна, человечество никогда раньше не сталкивалось. Как будет развиваться такой организм? Скорее всего, нормально, ведь и с тем и с другим геном люди живут и чувствуют себя прекрасно. Но если мозаиками окажутся кроветворные стволовые клетки, то когда дело дойдет до иммунного ответа, предсказать его правильность пока не представляется возможным.

Проблема в том, что на самом деле ген CCR5 играет важную роль для клеток иммунной системы. В частности, некоторые из них, а именно Т-лимфоциты, как раз из-за наличия гена CCR5 становятся мишенями ВИЧ. Очень показательна история Тимоти Рэя Брауна, американца, у которого в 1995 году во время учебы в Берлине диагностировали ВИЧ. На фоне иммунодефицита у Тимоти развился острый миелоидный лейкоз — разновидность лейкемии (рака крови). Самым эффективным способом лечения лейкемии является химическое устранение всех клеток крови, включая стволовые, поскольку они-то как раз и становятся раковыми. А взамен нужно было трансплантировать пациенту кроветворные клетки костного мозга от подходящего донора, и если они приживутся, пациент будет жить долго и счастливо.

Трансплантация состоялась в 2007 году. Несколько лет после этого события имя пациента скрывалось из соображений конфиденциальности. Из шестидесяти доноров был выбран человек, имевший мутацию гена CCR5 в обоих аллелях, доставшихся ему и от папы, и от мамы. Люди с этой мутацией встречаются достаточно редко — примерно в одном проценте случаев. Именно такие клетки костного мозга получил ВИЧ-инфицированный пациент для лечения своей лейкемии. То, что произошло дальше, назвали берлинским чудом: пациент оказался полностью излеченным от ВИЧ, потому что тот вид вируса, которым он был инфицирован, проникал в здоровые клетки именно через рецептор CCR5. Мутация дельта-32 приводит к тому, что вирус не связывается с рецептором на Т-лимфоцитах и не проникает в них, инактивируя в дальнейшем всю иммунную систему. Этот человек вылечился и прожил еще тринадцать лет. К сожалению, в 2020 году Тимоти Браун умер в результате рецидива лейкемии. Ему было пятьдесят четыре года.

Известен всего один случай успешного повторения этой лечебной процедуры у другого человека, известного как лондонский пациент. Случай аналогичный: у больного нашли лимфому, и при этом он был ВИЧ-инфицированным. Он тоже получил костный мозг от донора, который, по счастливому совпадению, имел ген CCR5 с мутацией дельта-32 в обоих аллелях. Лондонский пациент выздоровел и в 2019 году сообщил свое имя — Адам Кастильехо.

В этих двух случаях использовалась весьма дорогостоящая и сопряженная с повышенным риском медицинская процедура, ориентированная в первую очередь на онкологических больных. Но сегодня для целого ряда компаний, работающих по редактированию генома, мишенью является именно ген CCR5. Его редактируют, но не на уровне эмбриона, чтобы последствия этого редактирования не передавались по наследству, а берут у пациента кроветворные стволовые клетки костного мозга, вне организма редактируют их, а потом помещают обратно. Таким образом, зародышевый путь не затрагивается, наследования не происходит, но зато часть стволовых клеток крови получает мутацию дельта-32, и они становятся устойчивыми к инфицированию вирусом иммунодефицита человека.

Китайский эксперимент: за и против

Сегодня человечество находится еще в самом начале клинических исследований в области методов лечения ВИЧ с помощью технологии геномного редактирования. Задача, которую поставил себе Хэ Цзянькуй, была более сложной, чем у других исследователей, потому что в китайских популяциях мутация дельта-32 гена CCR5 не встречается. Ученый надеялся, что та мутация, которую он внес Нане и Лулу, в случае образования как гомозиготы, так и гетерозиготы повлияет не только на них, но — за многие годы — и на всю китайскую популяцию в плане защиты от ВИЧ. В самом деле, если клетки с подобной мутацией попадут в женскую репродуктивную систему и сформируют яичник, то либо половина яйцеклеток (у той девочки, у которой гетерозигота), либо все яйцеклетки (у второй девочки, у которой гомозигота) будут нести мутацию дельта-32 и передадут ее потомкам.

В этом Хэ Цзянькуй видел главный положительный момент, когда обосновывал свой эксперимент по редактированию эмбриона. Но тут надо оговориться, что есть несколько подтипов ВИЧ, использующих для проникновения в организм разные рецепторы, и CCR5, который выбрал в качестве мишени китайский ученый, — только один из них. Поэтому если мы изменили ген CCR5, то это не означает, что человек будет полностью защищен от инфицирования вирусом иммунодефицита человека.

Насколько важно наличие или отсутствие участка гена CCR5, лежащего в области дельта-32? Люди, естественным образом имеющие гомозиготную мутацию по этому рецептору, живут без него и каких-то особых проблем из-за этого не замечают — даже на Фарерских островах, где частота мутации дельта-32 максимальна и достигает трех процентов общей численности населения. По-видимому, ген CCR5 — не тот ген, вариации которого представляют опасность для здоровья в настоящее время.

Эксперимент китайского исследователя неожиданно возродил интерес и к полиморфизму гена CCR5. Так, в июне 2019 года в журнале Nature Medicine (это один из наиболее авторитетных научных журналов) была опубликована статья, что от варианта гена дельта-32 бывают и негативные последствия. Проанализировав результаты генотипирования и данные о смерти четырехсот тысяч британцев, исследователи из Университета Беркли пришли к выводу, что мутация CCR5-дельта-32 в гомозиготном состоянии увеличивает для ее обладателей риск смерти от любых причин! И это в довесок к тому, что она вроде бы приводит и к повышенной восприимчивости к вирусу гриппа. Шокирующая информация была опровергнута через полгода, когда три независимых анализа той же самой базы данных о смертности и генотипе дельта-32 опровергли данные статьи, поскольку обнаружили техническую ошибку в расчетах. В октябре 2019 года исходная статья о риске смерти была отозвана авторами из журнала. Ситуация как в старом анекдоте: ложки-то мы нашли, но осадочек остался... Тем не менее многие функции этого гена остаются неизвестными. Например, мы не знаем, для чего ген CCR5 экспрессируется в мозге, в опухолях и т. д. Насущная потребность в изучении таких вопросов отсутствует, а значит, и средства на их решение не выделяются.

Так каких же негативных эффектов можно ожидать от того, что в этих двух девочках, Нана и Лулу, Хэ Цзянькуй полностью или наполовину изменил рецептор CCR5? Прежде всего надо упомянуть, что они — возможные генетические мозаики, а в природе таких организмов не существует, и нам трудно оценить их дальнейшее развитие. В этом большой риск, потому что рецептор CCR5 экспрессируется не только на Т-лимфоцитах, но и на других клетках, и каким теперь будет взаимоотношение клеток с разными вариантами гена в одном организме — остается пока загадкой.

Одного из факторов риска — по крайней мере, со слов Хэ Цзянькуя — ему удалось избежать. Он сказал, что не обнаружил у этих девочек никаких внемишенных изменений в геноме. Да, система CRISPR/Cas9 действительно обладает высокой точностью распознавания генетического текста, но ведь «и на старуху бывает проруха»! Если система должна из шести миллиардов букв (по три миллиарда от папиного и маминого генома) генетического текста найти двадцать уникальных буквенных сочетаний, понятно, что она может и ошибаться. По утверждению китайского ученого, в случаях с этими девочками система нигде не ошиблась и совершенно четко произвела мутацию дельта-32, которую он и хотел получить.

Какой еще может быть риск от ее введения? Есть небольшое количество публикаций, в которых говорится, что при природной мутации дельта-32 в гене CCR5 у людей повышается риск заболеть лихорадкой Западного Нила. Но болеют ею люди нечасто. Возможно, более серьезная опасность, согласно единственной публикации, состоит в том, что эта мутация повышает чувствительность к гриппу. Но опять-таки надо учитывать некий баланс. От гриппа ежегодно умирает в мире, по разным оценкам, от трехсот до шестисот тысяч человек (а болеют шестьсот миллионов или больше), а от СПИДа каждый год погибает около миллиона, — при том, что болеют им гораздо реже, чем гриппом.

Возможно, удастся изучить, будут ли эти китайские девочки более чувствительными — пусть не к лихорадке Западного Нила, которая случается все-таки очень редко, а к гриппу.

Подводя общий итог целесообразности выбора китайским исследователем мутации CCR5-дельта-32, можно сказать, что это направление остается перспективным для исследований во всем мире. Но исследований не на уровне эмбриона, а на уровне соматических клеток — ученые ищут наиболее эффективные методы внесения нужной мутации в стволовые клетки крови, чтобы обеспечить защиту пациентам, инфицированным ВИЧ.

Заключение

Кто-то должен быть первым

Работа по наследуемому редактированию человеческого генома, которую выполнил Хэ Цзянькуй, — это смелый эксперимент, поставленный на человеке. Всего два дня — и информация об этой прорывной работе облетела интернет, была перепечатана, состоялись неофициальная встреча китайского ученого с оргкомитетом международной конференции по использованию геномного редактирования CRISPR/Cas9 и его собственный доклад на этой конференции, — за эти два дня мир реально изменился.

Реакция части научного сообщества была негативной. В прессе появилось письмо ста китайских ученых, в котором они осудили своего коллегу за его действия. Но я хочу особо подчеркнуть, что подписали письмо всего сто человек, даже не тысяча, что для Китая с его огромным количеством научных учреждений очень мало. Напомню также, что Китай отказался проводить эту конференцию на своей территории, хотя китайское правительство финансировало работы Хэ Цзянькуя, и поговаривают, что эта работа не была исключением. Однако, ожидая негативной реакции мирового ученого сообщества, власти Китая, на мой взгляд, просто решили «валять дурочку».

Они не могли не понимать, что обладание такой технологией дает фантастические возможности, и кто-то должен быть первым.

Хэ Цзянькуй — чрезвычайно отважный человек, даже если он не соблюдал каких-то законодательных формальностей в своей стране. Нельзя шагнуть в неизвестное, не нарушив каких-то правил. Поступок китайского ученого можно сравнить со смелостью первого человека, который, сев на простое бревно, оттолкнулся от берега Африки и поплыл через океан. Едва ли его соплеменники могли оценить этот поступок, но не будь таких людей, человечество никогда не заселило бы Землю, люди не знали бы колеса и не летали в космос. В разговорах о вмешательстве в эмбрион человека неизменно присутствуют указания на неэтичность таких работ. Но кто оценивал этичность запуска человека в космос? Кто с этой точки зрения обсуждал Юрия Гагарина и тех людей, которые сделали возможным его полет, в конце концов (ну что тут играть словами!), приказали лететь? А полетел он с радостью и удовольствием. Первый! Установка тогда была предельно четкая: люди могут в этом полете погибнуть (и погибали в других). Те, кто летел первыми, прекрасно это себе представляли, но все равно хотели быть первыми.

Да, в ряде стран существуют запреты и ограничения на действия с человеческим геномом. Но реальных наказаний за них не предусмотрено. И нет никаких доказательств, что это неэтично. В современном мире понимание этики оказывает весьма неоднозначное влияние на то, чем занимается человек. В моем понимании этика — это переживание об уже содеянном, и используя этот опыт для будущего, большинство формирует ограничения для всех.

В целом реакция научного мира на китайский эксперимент оказалась сдержанно негативной. Заинтересованные люди были недовольны тем, что Китай позволил или не помешал своему ученому выйти за установленные рамки. Лишь некоторые ученые сказали, что он молодец, поскольку нашел в себе смелость сделать шаг вперед и вступить на совершенно новую территорию.

К сожалению, отсутствие реальной поддержки со стороны научной общественности привело к тому, что эта новая территория, куда вступил Хэ Цзянькуй, стала подобной обратной стороне Луны. Мы не знаем доподлинно, что произошло с самим ученым. Из последнего по времени сообщения следует, что в декабре 2019 года Хэ Цзянькуй был приговорен к трем годам лишения свободы и штрафу в три миллиона юаней за нарушение законодательства в области экспериментов с людьми и проведение медицинских процедур без лицензии. Тем более ничего не известно о дальнейшей судьбе двух китайских девочек с отредактированным геномом, которым идет уже третий год.

Для эксперимента это большой срок, и науке было бы очень важно иметь информацию о том, что происходит с их развитием, иммунной системой, как отразился на их здоровье вирус иммунодефицита человека, которым инфицированы их родители. На мой взгляд, отсутствие такой информации приводит к тому, что у Хэ Цзянькуя появляются последователи, которые тоже желают провести редактирование эмбриона. Не так давно, примерно год назад журнал Science опубликовал статью Дениса Ребрикова, руководителя лаборатории Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова. В статье было сказано, что лаборатория полностью готова к имплантации бластоцист с отредактированным геномом и ждет только разрешения, чтобы это сделать.

Кстати, здесь уместно вспомнить Роберта Эдвардса, лауреата Нобелевской премии за экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), ведь китайский ученый как раз использовал его технологию. Эдвардс в 1967 году попросил разрешения на использование технологии ЭКО. Нетрудно догадаться, какой он получил ответ... Тогда он попросил денег и разрешение на то, чтобы получить первого в мире ребенка в пробирке. Ему ответили, что это, во-первых, невозможно, а во-вторых, неправильно, так как зачатие — дело Божье.

Десять лет спустя Роберт Эдвардс нашел себе компаньона и финансирование и осуществил первое экстракорпоральное оплодотворение. Это тоже был риск, и последовали гонения. Тогда это был первый ребенок «из пробирки» (сейчас это мать двоих детей, зачатых естественным путем). На данный момент по миру ходят еще около десятка миллионов детей, зачатых в пробирке. Эта смелость — сделать шаг в неизвестность — всегда сопровождается риском и гонениями.

Есть еще один очень важный вопрос: а нужно ли, чтобы редактирование эмбриона передавалось по наследству? И нужно ли оно вообще? На самом деле трудно представить себе такие ситуации, где наследуемое редактирование генома было бы необходимо с медицинской точки зрения.

Денис Ребриков предлагает лечение генетической глухоты. Понятно, что глухота — вещь неприятная, но испокон веков люди с глухотой жили, даже сформировали свое сильнейшее сообщество — «Всероссийское общество глухих», и это не угрожающая жизни ситуация. То есть реально найти медицинскую мишень, для которой необходимо использовать технологию геномного редактирования с тем, чтобы результаты генетических манипуляций передавались по наследству, мне кажется, очень сложно.

Хэ Цзянькуй, на мой взгляд, сделал исключительно важный шаг. Правда, в данный момент мы еще не знаем его последствий. Скорее всего, подобное наследуемое генетическое редактирование не имеет большого медицинского значения, потому что не исправляет ситуации, однозначно угрожающие жизни. Но запрещать такие исследования нельзя. Мы должны уметь пользоваться технологией геномного редактирования, в том числе так, чтобы оно безопасно могло наследоваться.

Но мы ведь не знаем, что ждет человечество в будущем! А вдруг мы обнаружим, что определенная мутация в каком-то гене позволит человеку легко переносить космическое излучение или продлит срок его активной жизни? В любом случае можно говорить о том, что геномное редактирование прочно войдет в нашу жизнь и, возможно, станет основой биомедицины будущего.

Примечания

1

Книга написана в 2021 году, в момент пандемии COVID-19. — Прим. ред.

2

Ферменты — это особые белки, ускоряющие определенные реакции в живых системах. — Прим. ред.

3

Название генов принято сокращать, образуя символ гена. В качестве первой берется первая буква названия, а последующие могут быть выбраны из следующих слов. Разное расположение или состояние одинаковых генов обозначают буквами или цифрами. В случае гена FOXP2 он расшифровывается как Forkhead box protein Р2. — Прим. ред.

4

Подробнее о бактериофагах можно прочитать в книге Мухаммада Хамида Замана «Биография сопротивления. Эпическая битва между людьми и патогенами» (изд-во «Портал», 2021 г.) — Прим. ред.

5

Деление ядра половой клетки, приводящее к уменьшению количества хромосом в два раза; в результате образуются гаметы, несущие гаплоидный набор хромосом. — Прим. ред.

6

Синтетические открытия — это принципиально новое понимание того, что ранее считалось общеизвестным. — Прим. ред.

7

Аллель — это одна из форм определенного гена. Аллели (аллельные гены) — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках гомологичных хромосом, определяющие проявление признака. — Прим. ред.

8

Кофактор — небелковое соединение, чаще всего ион металла, которое присоединяется к функциональному участку белка и способствует его биологической деятельности. — Прим. ред.

9

Указ Президента РФ от 28 ноября 2018 г. № 680 (ред. от 2 марта 2020 г.) «О развитии генетических технологий в Российской Федерации», Постановление Правительства № 479 от 22.04.2019 — Прим. ред.

10

Иннервация — снабжение органов и тканей нервами, обеспечивающее связь с центральной нервной системой. — Прим. ред.

Content

Киселев Сергей Львович Человек редактированный, или Биомедицина будущего

От автора

Введение

Пока гром не грянет...

Возмутитель спокойствия

О чем пойдет разговор

Как устроено генетическое пространство

Вспомним школу

Два метра генетической информации

Жизнь в четырех буквах

Транскрипция, трансляция, белок

Универсальный код

Как воспринимать генетический текст

Учимся читать геном

«Ген разума» и грустные мыши

В природе все случайно?

Копирование без ошибок невозможно

Жизнь — в разнообразии

Рождение генной инженерии

Революционный переворот в биологии

Генетическая рекомбинация, или Поделись своим геномом

Бомба замедленного действия

Спокойно! Вы модифицированы!

Генно-инженерные технологии

Перенос генов и начало биотехнологии

Инженерия живого

Работа с генами вне клетки

Продукты генной инженерии

Возможности генной терапии

Ген должен работать на своем месте

Детство генной терапии

Врожденный амавроз Лебера

Тяжелый комбинированный иммунодефицит

Найти и обезвредить

Геномное редактирование

Исправляем букву за буквой

Транскрипционные факторы

Нуклеазы типа цинковых пальцев

Конструкции TALEN

Революционная система CRISPR/Cas9

Казус компании Danone

Как работает иммунитет

Оттачиваем инструменты

Почему открытие системы CRISPR/Cas9 заслуживает Нобелевской премии?

Союз науки и бизнеса

Заглянем в «кухню»

Генетическое модифицирование в сельском хозяйстве

Редактирование генома

«Генетическое лекарство»

Генетическое редактирование иммунной системы

Перспективные мишени генной терапии

Вирусы на службе генетиков

Когда без редактора не обойтись

Не унаследовать бы изменения!

Наследуемое редактирование генома человека: фантастика или факт?

Наследственность из пробирки

Научные открытия или заблуждения?

ВИЧ как мишень

Самый смелый из «тысячи талантов»

Подробности уникального эксперимента Хэ Цзянькуя

В природе такого не бывает

Китайский эксперимент: за и против

Заключение Кто-то должен быть первым

Примечания