Анализы: полный медицинский справочник: ключевые лабораторные исследования в одной книге

© ИП Макеев А. В., текст, 2022

© Оформление. ООО «Издательство «Эксмо», 2022

Глава 1

Исследование крови

Взятие крови

Подготовка к сдаче анализа крови включает ряд особенностей:

1) оптимальное время сдачи анализа – утро;

2) забор крови производится натощак (через 8–12 ч после приема пищи);

3) рекомендуется исключить из рациона алкоголь за 1–2 дня до исследования;

4) необходимо не менее чем за 1 ч до сдачи крови исключить курение;

5) не рекомендуется перед сдачей крови проведение различных медицинских обследований, прием лекарственных препаратов;

6) не рекомендуется перед сдачей крови проведение диагностических (эндоскопическое и лучевое исследование, глубокая пальпация, общий массаж, биопсия, пункция), функциональных (зондирование, введение контрастных веществ) и лечебных процедур;

7) необходимо избегать физической нагрузки;

8) желательно сдавать кровь в одной лаборатории.

В лабораторной практике исследуют капиллярную кровь, которую получают путем укола в мякоть IV пальца левой руки или мочки уха, или венозную кровь из локтевой вены (при работе на автоанализаторах).

Для забора капиллярной крови используют иглы-скарификаторы, которые после употребления моют и кипятят в стерилизаторе или помещают на 2 ч в сушильный шкаф при температуре 180 °C. Кожу на месте укола протирают ватным тампоном, смоченным сначала спиртом, затем эфиром. Укол лучше производить сбоку, где более густая капиллярная сеть, на глубину 2–3 мм. Также могут быть использованы автоматические скарификаторы, способствующие снижению травматичности и соблюдению требуемой глубины прокола, в зависимости от типа скарификатора.

Кровь из ранки должна вытекать свободно, так как при сильном надавливании на палец возможно перемешивание тканевой жидкости.

Венозная кровь считается оптимальным материалом для клинического исследования крови. Забор крови осуществляется из кубитальной вены. Наложение жгута допустимо не более чем на 1 мин, кулак следует разжать при попадании в пробирку первых капель крови. При более длительном наложении жгута могут быть получены завышенные результаты общего белка, альбуминов и пр. При длительном сжатии кулака может быть повышен уровень калия в плазме на 15–25 %.

Применяемые в настоящее время гематологические анализаторы в большинстве случаев сертифицированы и стандартизированы для работы с венозной кровью. Калибровочные и контрольные материалы для калибровки гематологических анализов предназначены для венозной крови. Забор крови посредством вакуумных систем характеризуется некоторыми преимуществами, в частности, данный метод обеспечивает высокое качество пробы и способствует предотвращению контакта с кровью. Вакуумные системы представляют собой сочетание трех элементов: стерильной одноразовой пробирки с крышкой и дозированным содержанием вакуума, стерильной иглы-бабочки или одноразовой двусторонней иглы, закрытой защитными колпачками с обеих сторон, и иглодержателя. Кровь втягивается непосредственно в пробирку из вены через иглу под действием вакуума.

Из пальца забор крови производится:

1) при ожогах, имеющих большую площадь;

2) при наличии мелких или малодоступных вен;

3) при выраженном ожирении;

4) при склонности к венозному тромбозу;

5) у новорожденных.

Общий анализ крови

Таблица 1

Основные показатели общего анализа крови в состоянии нормы

Гемоглобин

Строение гемоглобина

Гемоглобин – основной компонент эритроцитов, благодаря которому осуществляется перенос кислорода. Он относится к хромопротеинам и имеет в своем составе белок (глобин) и железосодержащую группу (гем).

Гем – комплексное соединение железа и протопорфирина IХ, состоящего из четырех пиррольных колец, соединенных СН-мостиками. Железо, находящееся в центре протопорфирина, соединено с четырьмя атомами азота пиррольных колец двумя главными и двумя дополнительными связями. Одна из двух оставшихся связей (координационное число железа равно 6) используется для соединения с глобином, другая – с кислородом. Гем одинаков для всех видов гемоглобина животных.

Глобин – тетраметр, состоящий из двух пар полипептидных цепей, различие аминокислотного состава которых определяет гетерогенность молекулы гемоглобина человека. В целом молекула гемоглобина содержит 574 аминокислоты. Каждая полипептидная цепь глобина соединена с гемом (на 1 глобин приходится 4 гема).

Гемоглобин взрослого человека имеет 2α- и 2β-полипептидные цепи (табл. 2). Фетальный гемоглобин, содержащийся в крови новорожденного (HBF), имеет в своем составе 2α- и 2γ-полипептидные цепи.

Гематокрит представляет собой совокупность всех фракций клеток крови, в которых содержится гемоглобин. Показатель гипоксии – кислородного голодания – снижение гематокрита ниже нормы. Повышение гематокрита может указывать на наличие онкологических заболеваний крови.

Таблица 2

Содержание гемоглобина взрослого и фетального типа в различные возрастные периоды (в процентах от общего гемоглобина)

Гемоглобин может находиться в эритроцитах в виде:

1) оксигемоглобина: при присоединении железа к гему;

2) карбаминоксигемоглобина: при присоединении углекислого газа к свободным аминным группам глобина;

3) метгемоглобина: при окислении железа гема.

Повышение содержания карбоксигемоглобина регистрируется при гемолитических анемиях, повышении в атмосферном воздухе оксида углерода, у курильщиков.

Метгемоглобин повышается при врожденном и приобретенном снижении активности метглобинредуктаз, повышении содержания в пище нитратов, кишечных интоксикациях, наличии аномального гемоглобина М. Определение содержания гликированных гемоглобинов имеет диагностическое значение, особенно при сахарном диабете. Содержание гликозилированного гемоглобина находится у здоровых в пределах 3–6 % от общего гемоглобина.

Определение концентрации гемоглобина

Важнейшие из методов определения концентрации гемоглобина – колориметрические, инвазивные. Они широко применяются на практике ввиду их простоты и доступности.

Гематитовый метод (метод Сали). Основан на превращении гемоглобина при прибавлении к крови хлористо-водородной кислоты в хлоргемин (хлорид гематита) коричневого цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина. Полученный раствор хлорида гематита разводят водой до цвета стандарта, соответствующего известной концентрации гемоглобина. Данный метод в настоящее время сравнительно редко задействуется в лабораторной практике, поскольку существуют точные автоматические методы.

Определение проводят в упрощенном колориметре – геометре Сали. Этот прибор состоит из пластмассового штатива с 3 вертикальными гнездами. В боковых гнездах находятся 2 запаянные пробирки со стандартной жидкостью. В среднее гнездо геометра вставляют открытую сверху градуированную стеклянную пробирку того же диаметра, что и цветные стандарты. Градуированная пробирка имеет шкалу с делениями, показывающую количество гемоглобина в граммах на 100 мл крови, т. е. грамм-процентах (г%). При геометре имеются специальная пипетка для воды и стеклянная палочка для перемешивания.

В градуированную пробирку наливают до деления, помеченного цифрой «2 г%» (нижняя круговая метка) 0,1 г% раствора хлористо-водородной кислоты. Затем набирают кровь в капиллярную пипетку до метки «0,02 мл», всасывая ее ртом через резиновую трубку (необходимо, чтобы столбик крови кончался точно на уровне метки и не разрывался пузырьками воздуха). Обтерев кончик пипетки снаружи ватой, опускают ее в пробирку с 0,1 г% раствором хлористо-водородной кислоты и осторожно выдувают кровь. Повторными всасываниями и выдуваниями верхнего слоя жидкости пипетку ополаскивают. Пробирку несколько раз встряхивают и, заметив время, ставят в штатив. Для полного превращения гемоглобина в хлорид гематита требуется не менее 5 мин. Через 5 мин геометр поднимают до уровня глаз и сравнивают цвет испытуемой жидкости с цветом стандартов. Обычно (за исключением случаев крайне тяжелой анемии) он темнее, чем в стандартных пробирках. С помощью неградуированной пипетки к испытуемому раствору добавляют по каплям дистиллированную воду, перемешивают стеклянной палочкой и сравнивают со стандартами. Как только цвет исследуемой жидкости станет одинаков с цветом стандартов, отмечают, какому делению шкалы соответствует уровень жидкости (по нижнему мениску) в пробирке.

Промышленность выпускает геометры, содержащие грамм-процентную шкалу. За идеальную норму принимают концентрацию гемоглобина в крови, равную 16,67 г%, или 166,7 г/л.

При соблюдении всех правил работы с геометром у одного и того же больного при определении гемоглобина в разных порциях крови получают расхождение результатов в пределах ±0,3 г% (3 г/л).

Цианметгемоглобиновый метод наиболее точен, принят в большинстве стран как стандартный.

Он основан на превращении гемоглобина в цианметгемоглобин при добавлении к крови реактива. Концентрацию цианметгемоглобина измеряют фотометрически. В качестве реактива употребляют раствор Драбкина (NaHCO3 – 1 г, KCN – 0,05 г, K3[Fe(CN)6] – 0,2 г, дистиллированной воды – до объема 1 л) или какой-нибудь другой с подобным действием.

Под влиянием железисто-синеродистого калия гемоглобин окисляется до метгемоглобина (гемоглобина), который затем превращается при помощи цианина калия в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид). Наиболее употребительное разведение крови в реактиве Драбкина – 1: 250 (0,02 мл крови и 5 мл реактива). Через 20 мин, необходимых для полного превращения гемоглобина в гемоглобинцианид, измеряют экстинкцию при длине волны 540 нм и толщине слоя в 1 см против воды на спектрофотометре СФ-4 или на ФЭК-М и ему подобном фотоэлектроколориметре.

В настоящее время созданы прочные цианометгемоглобиновые стандарты в ампулах, соответствующие точно определенной концентрации гемоглобина. Полученные растворы исследуют на фотоэлектроколориметре и вычерчивают калибровочную кривую, откладывая показатели оптической плотности со шкалы прибора (красные цифры барабана) на оси ординат, а концентрацию гемоглобина в граммах на литр – на оси абсцисс. На основании калибровочной кривой создают рабочую таблицу, указывающую, какая концентрация гемоглобина соответствует данному показанию ФЭК.

Существуют колориметры, специально разработанные для определения гемоглобина, – гемоглобинометры. В большинстве из них используется цианметгемоглобиновый метод. Гемоглобинометры могут работать независимо или в комплексе со счетчиками частиц. Так, гемоглобинометр «Культер» (Франция), который можно применять самостоятельно, дает прямые показания гемоглобина в граммах на 100 мл. Прибор имеет высокую точность и воспроизводимость ±0,1 г% (1 г/л).

Цветовой показатель

Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците производят делением концентрации гемоглобина (Hb) на число эритроцитов в одинаковом объеме крови (1 мкл). Практически среднее содержание гемоглобина в одном эритроците представляет частное от деления Hb (г/л) на число эритроцитов в миллионах.

Величину 33 пг (пикограмм – 1 × 10–12), составляющую норму содержания гемоглобина в одном эритроците, условно принимают за 1 и обозначают как цветовой показатель. Вычисление цветового показателя производят путем деления тройного значения Hb (г/л) на 3 первые цифры числа эритроцитов в миллионах. В норме цветовой показатель колеблется от 0,86 до 1,1. В практической работе для подсчета цветового показателя используют пересчетные таблицы, а также номограммы.

Определение гемоглобина в крови методом спектрального анализа представляет собой один из наиболее информативных методов определения гемоглобина и его составляющих. Для проведения анализа данным способом применяются спектрофотомеры. Основа анализа – изучение оптической плотности пробы крови. В организме гемоглобин вступает в химическую реакцию с газами, такими как кислород, окись углерода, образуя производные. Каждое из производных гемоглобина характеризуется особыми оптическими свойствами.

Пробирка с пробой крови, разведенной дистиллированной водой в пропорции 1: 100, размещается перед спектроскопом. Проходя через призму спектрофотометра, луч белого света разлагается на спектральную гамму. При прохождении светового луча через исследуемый материал на спектральной линии проявляются полосы поглощения. Спектрофотометры, осуществляя спектральную оценку, выделяют свет одной волны. Результаты фиксируются с помощью фотоэлемента. В частности, для оксигемоглобина характерны 2 полосы поглощения в желтой и зеленой частях спектра. Аналогичны результаты для карбоксигемоглобина, но он не восстанавливается под действием химических веществ-восстановителей. Метгемоглобин проявляется в 4 полосах поглощения, наиболее четкая из которых расположена в красной части спектра. Восстановленный гемоглобин проявляется одной широкой полосой в центральной части спектра.

Co-оксиметрия представляет собой анализ газового состава крови и относится к спектроскопическому методу. Данный анализ дает возможность количественного измерения параметров крови, таких как оксигенированный, деоксигенированный гемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин, в процентах от общей концентрации гемоглобина в крови. Данные параметры крови измеряются спектрометром на пропускание/поглощение 380–780 нм.

Современные приборы для измерения гемоглобина

Фотоэлектрические гемоглобинометры измеряют концентрацию гемоглобина, сразу выдавая на дисплее показания в г/100 или 1000 мл. В зависимости от задействованного метода, приборы калибруются растворами гемиглобинцианида или гемихрома.

Фотометры со светофильтрами применяются для измерения оптической плотности пробы крови. В них используются светофильтры, поглощающие свет в пределах 540 нм. Концентрация гемоглобина рассчитывается по калибраторам или калибровочному графику на основе гемихромных или гемиглобинцианидных калибровочных растворов. На аналогичном принципе работают спектрофотомеры.

Изменения гемоглобина при патологии

Существуют физиологические и патологические виды гемоглобина. У здорового человека существуют три основных типа гемоглобина: примитивный – Р, фетальный – F, взрослый – А.

Гемоглобинопатии (гемоглобинозы) обусловлены наследственной аномалией белковой части гемоглобина, они связаны с нарушением синтеза гемоглобина.

В настоящее время установлено более 600 аномальных гемоглобинов.

Серповидно-клеточная анемия является проявлением одной из наиболее важных в клиническом отношении гемоглобинопатий. На молекулярном уровне вследствие мутаций структурных генов, контролирующих синтез цепей глобина, происходит замещение аминокислоты глутамина на аминокислоту валин. При этой патологии специфическим свойством крови является приобретение эритроцитами серповидной формы при снижении парциального давления кислорода в окружающей среде. На этом основана и специальная диагностическая проба. Для обнаружения подобного явления создают венозный застой с гипоксией путем перетяжки пальца на 5 мин. При добавлении к капле крови после этой процедуры восстановителя – метабисульфита натрия – также образуются серповидно-клеточные эритроциты. При электрофорезе гемоглобина выявляется дополнительная полоса.

Эритроциты

Жизненный цикл эритроцитов

Эритроцит происходит из исходной мезенхимальной клетки, которая превращается в ретикулярную (гемогистобласт), который переходит в гемоцистобласт, превращающийся в эритробласт, характерной особенностью которого является наличие огромного ядра и отсутствие гемоглобина. В последующем эритробласт превращается в нормобласт первого, второго, третьего порядка. В этой стадии уменьшается ядро, клетка наполняется гемоглобином. Он превращается в молодой эритроцитретикулоцит. В этот период снижается его двигательная активность и ретикулоцит превращается в зрелый ретикулоцит. У здоровых взрослых число ретикулоцитов составляет 0,2–1,2 %.

Активная часть жизненного цикла эритроцитов протекает в периферической крови, куда они поступают в стадии ретикулоцитов. Превратившись через 1–3 дня в зрелые эритроциты, они циркулируют в организме около 120 дней. Созревание ретикулоцита сопровождается существенными изменениями в обмене веществ: прекращается значительная часть синтетических процессов, почти полностью утрачивается способность к дыханию. Эритроцит приспособлен к функции транспорта кислорода от легких к тканям и углекислого газа от тканей к легким. Основной путь обмена энергии в эритроцитах – гликолиз. Энергия гликолиза используется для активного транспорта катионов через клеточную мембрану и поддержания нормального соотношения между ионами калия и натрия в эритроцитах и плазме, а также для сохранения целостности мембраны и двояковогнутой формы клетки. Образующийся НАДФ предотвращает окисление гемоглобина в метгемоглобин. Кроме того, в эритроците происходит прямое окисление небольшого количества глюкозы в глюкозо-монофосфатном шунте с образованием восстановленного НАДФ, который используется для восстановления глютатиона. Восстановленный глютатион предохраняет мембрану клетки и предотвращает необратимое окисление гемоглобина.

В физиологических условиях стареющие эритроциты удаляются из циркуляции и разрушаются преимущественно в селезенке, печени и в меньшей степени в костном мозге клетками системы фагоцитирующих мононуклеаров. Часть эритроцитов распадается в сосудистом русле, гемоглобин соединяется с гаптоглобином в необратимый комплекс, который не проникает через почечный фильтр, а ферментативно расщепляется, главным образом в печени. При значительном гемолизе избыток гемоглобина попадает в почки. Здесь часть гемоглобина экскретируется с мочой, часть реабсорбируется в проксимальном отделе канальцев, часть гемоглобинового железа откладывается в эпителии канальцев в виде ферритина и гемосидерина, постепенно выделяясь с мочой.

Основным стимулом к повышению эритропоэтической активности служит гипоксия любого генеза. Стимулом эритропоэза обладают андрогены благодаря способности повышать биосинтез эритропоэтина. Эритропоэтин – фактор, участвующий в регуляции эритропоэза. Он влияет на процесс развития эритроидных клеток – ускоряет построение гемоглобина, способствует освобождению ретикулоцитов из костного мозга.

Определение количества эритроцитов

Метод подсчета в счетной камере. Кровь предварительно разводят с целью уменьшения числа клеток, подлежащих счету. В химические пробирки отмеривают пипеткой по 4 мл 3%– ного раствора хлорида натрия и осторожно выдувают в нее 0,02 мл капиллярной крови (кровь забирают пипеткой от геометра Сали). Полученное разведение можно практически принять равным 1: 200. Взвесь тщательно перемешивают и затем заполняют камеру с сетками Горяева. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15 × 15). Большие квадраты, расчерченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов, чередуются с квадратами, разделенными только вертикальными или горизонтальными линиями, и с квадратами чистыми, без линий. Глубина камеры равна 1/10 мм, сторона малого квадрата – 1/20 мм; объем малого квадрата равен 14 000 мм^3.

Перед заполнением камеру и шлифованное покровное стекло моют и сушат. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Каплю разведенной крови вносят пипеткой под притертое покровное стекло камеры. После заполнения камеру оставляют на 1–2 мин в покое для оседания форменных элементов, затем приступают к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре). Эритроциты считают в 5 больших квадратах (5 × 16 = 80 малым квадратам), расположенных по диагонали. Для этого отыскивают левый верхний большой разграфленный квадрат, подсчитывают количество находившихся в нем эритроцитов, затем по диагонали вниз и направо находят следующий такой квадрат и т. д. Для того чтобы дважды не сосчитать одни и те же клетки, лежащие на пограничных линиях, соблюдают правило: к данному квадрату принадлежат клетки, находящиеся большей своей частью внутри него, разделенные пограничной линией; считают только на верхней и левой границе квадрата.

Количество эритроцитов в 1 мл крови рассчитывают путем деления произведения из числа сосчитанных эритроцитов (а), 4000 (приведение к объему 1 мкл крови) и 200 (степень разведения) – а × 4000 × 200 × 80 (количество малых квадратов).

При взаимосокращении получается произведение – а × 10 000, т. е. число подсчитанных эритроцитов в 5 больших квадратах на 10 000. Ошибка метода в среднем равна ±2,5 %.

Электронно-автоматический метод. Наибольшее распространение нашел импульсный принцип, основанный на разнице электропроводности частиц крови и жидкости, используемой для разбавления. На нем работают счетчики «Целлоскоп» (Швеция) и «Культер» (Франция).

Кровяные тельца, взвешенные в изотоническом растворе хлорида натрия, всасываются через микроотверстие диаметром 100 мкм, с обеих сторон которого подведено по одному платиновому электроду. Скачкообразные повышения сопротивления, возникающие при прохождении частиц крови через капилляр, вызывают электрические импульсы, амплитуда которых прямо пропорциональна объему частиц. Импульсы усиливаются, подсчитываются в электронном устройстве. Производительность аппаратов этого типа велика: весь процесс от введения образца до получения результата происходит в течение 20 с при ошибке 1–2 %.

Индексы красной крови имеют значение для суждения о нормо-, гипер- и гипохромии эритроцитов. Под индексами красной крови понимают среднее содержание гемоглобина в одном эритроците и цветовой показатель.

Проблемы автоматического анализа эритроцитов

Благодаря появлению автоматических методик измерения эритроцитов появилась возможность исследовать дополнительные параметры: средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина (MCH), среднюю концентрацию гемоглобина (MCHC), анизоцитоз эритроцитов (RDW). Последний показатель представляет собой важный дополнительный критерий для диагностики пациентов с анемиями и динамического наблюдения за ходом лечения.

При автоматическом анализе эритроцитов в канал счета попадают также лейкоциты и тромбоциты, что может приводить к ошибке счета (увеличению количества эритроцитов). Увеличение количества эритроцитов возрастает пропорционально лейкоцитозу. Если количество лейкоцитов превышает 50 г/л, показатель среднего объема эритроцитов может быть искажен.

Причины проявления ложного «эритроцитоза»:

– наличие в крови гигантских тромбоцитов, объем которых превышает 30 фл;

– наличие криоглобулинов.

Причины ложного занижения количества эритроцитов:

– агглютинация эритроцитов;

– выраженный микроцитоз эритроцитов.

В пределах нормы считается значение среднего объема эритроцита 80–100 фл, микроцит – ниже 80 фл, макроцит – выше 100 фл. Гематологические анализаторы в большинстве поддерживают анализ эритроцитов объемом 30–300 фл. Измерение MCV осуществляется одновременно с подсчетом эритроцитов, возможна выдача результатов графически, в виде гистограммы распределения эритроцитов по объему.

Оценка MCV в автоматических анализаторах в ряде случаев может быть затруднительна. В частности, при микросфероцитарной гемолитической анемии диаметр микросфероцитов меньше нормы, тогда как средний объем может находиться в пределах нормы. В подобных случаях прибегают к исследованию мазка периферической крови с измерением диаметра эритроцитов.

Нормальные значения анизоцитоза эритроцитов (RDW) – 11,5–14,5 %. Данный показатель характеризует колебания объема эритроцитов. Традиционно анизоцитоз эритроцитов подсчитывается вручную, посредством кривой Прайс-Джонса. В настоящее время для тех же целей задействуются гематологические анализаторы – данный показатель представляет собой коэффициент вариации среднего объема эритроцитов.

Использование гематологических анализаторов для выявления анизоцитоза признано более эффективным, чем задействование визуальных методик. При оценке степени анизоцитоза под микроскопом возможно допущение ряда ошибок, в частности, при высыхании эритроцитов в мазке диаметр их уменьшается на 10–20 %, при использовании толстого мазка он меньше, чем в тонком. Автоматизированный подсчет осуществляется на основе кондуктометрического метода, при этом сохраняются стабильность клеток и воспроизводимость результатов.

В зависимости от применяемого прибора, значения показателя RDW может варьироваться для одной и той же пробы крови. Это объясняется различиями в конструкции датчиков прибора и особеннстях обработки кривой.

Измерение диаметра эритроцитов и графическая регистрация по величине

Измерение диаметра эритроцитов и графическую регистрацию по величине (эритроцитометрическая кривая, кривая Прайс-Джонса) можно производить с помощью прямых микроскопических и электронно-автоматических методов.

Прямой микроскопический метод. Измерение производят в мазке крови, фиксированном и окрашенном каким-либо методом, с использованием окуляр-микрометра и объектив-микрометра.

Окуляр-микрометр – круглая стеклянная пластинка с нанесенной по ее диаметру шкалой, разделенной на 50 делений, величина которых зависит от разрешающих свойств микроскопа. Объектив-микрометр представляет собой предметное стекло с нанесенной на нем шкалой длиной 2 мм, разделенной на 200 частей (одно деление равно 10 мкм). Вначале определяют цену одного деления окуляр-микрометра, для чего окуляр-микрометр и объектив-микрометр устанавливают так, чтобы их шкалы совпали. Затем отсчитывают число делений окуляр-микрометра, совпадающих с тем или иным количеством делений объектив-микрометра. Например, 20 делений окуляр-микрометра совпали с 3 делениями объектив-микрометра, следовательно, цена одного деления окуляр-микрометра равна 1,5 мкм (20 делений равно 30 мкм, а 1–1,5 мкм). Затем на столик микроскопа кладут окрашенный мазок крови и, зная цену одного деления окуляр-микрометра, измеряют диаметр 200–500 различных эритроцитов. Результаты распределяют по группам в зависимости от величины диаметра и устанавливают в процентах относительную численность каждой группы. Прямой микроскопический метод измерения диаметра эритроцитов трудоемок, отнимает много времени.

Электронно-математический метод. Подсчет частиц в зависимости от их диаметра может производиться счетчиками благодаря наличию амплитудного дискриминаторного устройства, позволяющего пропускать через капилляр и улавливать частицы определенной величины.

Эритрометрическая кривая (кривая Прайс-Джонса) в норме правильной формы с вершиной (пиком) на 7,2 мкм и довольно узким основанием в пределах 6–9 мкм. Размер эритроцитов в микрометрах откладывается по оси абсцисс, количество эритроцитов того или иного диаметра в процентах – по оси ординат.

При макро- и мегалоцитарных анемиях кривая имеет пологую форму с широким основанием (показатель наличия анизоцитоза) с двумя или несколькими вершинами и сдвинута вправо, т. е. в сторону больших диаметров.

При анемиях, протекающих с микроцитозом, микросфероцитозом, кривая также растянута, но сдвинута влево. Увеличение микроцитов регистрируется при железодефицитных анемиях, наследственном микросфероцитозе, свинцовом отравлении, талассемии.

При макроцитарной анемии увеличивается количество макроцитов, а при В_12-дефицитных и фолиеводефицитных анемиях их количество достигает более 50 %. В этих случаях эритроцитометрическая кривая имеет неправильную форму с широким основанием и сдвигом вправо.

Исследование ретикулоцитов

В норме эритроциты в окрашенных препаратах бесструктурные. Только в молодых эритроцитах (ретикулоцитах) при суправитальной окраске выявляется зернисто-нитчатая барофильная субстанция.

Метод суправитальной окраски бриллиантовым крезиловым синим. Каплю насыщенного раствора бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте наносят на вымытое, обезжиренное и подогретое стекло и делают тонкий мазок. На приготовленное таким образом стекло наносят каплю крови, делают мазок и тотчас помещают стекло во влажную камеру (чашку Петри, на края которой выкладывают смоченные валики марли), выдерживают в ней в течение 3–5 мин, высушивают на воздухе, после чего микроскопируют. Зернисто-нитчатая субстанция окрашивается в фиолетово-синий цвет на зеленовато-голубом фоне эритроцитов.

Лучшая окраска ретикулоцитов достигается способом Гель-Мейера: в пробирке Видаля смешивают несколько капель крови с равным объемом 1 %-ного раствора бриллиантового крезилового синего в изотоническом растворе хлорида натрия, закрывают пробкой и оставляют в пробирке на 1 ч, затем из смеси делают мазок на предметном стекле.

При любом способе окраски подсчет ретикулоцитов производится на 1000 эритроцитов (в норме содержание ретикулоцитов в крови в среднем составляет 0,7 %, пределы нормальных параметров – от 0,2 до 1,2 %).

Наиболее информативным является определение числа ретикулоцитов на разных стадиях развития в окрашенных препаратах. При этом кроме общего количества ретикулоцитов подсчитывается процентное содержание различных групп ретикулоцитов. Различают по степени зрелости 5 групп ретикулоцитов:

1) ретикулоциты содержат ядро, зернистость располагается в виде венчика вокруг ядра (нормоциты);

2) зернисто-сетчатая субстанция в них в виде клубка или глыбки;

3) ретикулоциты имеют зернистость в виде густой сетки;

4) зернистость представлена в виде отдельных нитей;

5) ретикулоциты содержат отдельные зернышки.

80 % ретикулоцитов здоровых людей могут содержать зернисто-сетчатую субстанцию и отдельные зернышки.

Современные гематологические анализаторы определяют до 10 разнообразных фракций ретикулоцитов. Отношение фракций с 3-й по 10-ю незрелых ретикулоцитов ко всему количеству ретикулоцитов составляет в норме 0,155–0,338 (анализаторы фирмы Бекман).

Увеличение количества ретикулоцитов отмечается при: гемолитических синдромах, остром недостатке кислорода, на 3–5-й день после кровопотери, при В_12-дефицитных анемиях на 5–9-й день после лечения.

Уменьшение количества ретикулоцитов определяется при: апластической анемии, гипопластической анемии, метастазах новообразований, приеме цитотоксических препаратов, лучевой терапии, заболеваниях почек.

Изменения эритроцитов при патологии

Морфология эритроцитов определяется при исследовании мазков крови с помощью иммерсионной системы микроскопа.

При свинцовой интоксикации, сидеробластных и мегалобластных анемиях в эритроцитах обнаруживается базофильная зернистость – агрегатированная барофильная субстанция в виде синих гранул, обнаруживающаяся в фиксированных (в отличие от ретикулоцитов) мазках крови, окрашенных по Романовскому, но лучше метиленовым синим. Мазок после фиксации в метиленовом синем заливают краской (из Расчета 5 капель 1 %-ного водного раствора метиленового синего на 20 мл водопроводной воды) на 1 ч, после чего краску сливают. Мазок высушивают и микроскопируют. Считают 10 000 эритроцитов и отмечают количество эритроцитов с гранулами фиолетово-синего цвета.

Изменение размеров эритроцитов возникает при нарушении синтеза гемоглобина.

Наличие в мазках эритроцитов с диаметром 5–6,5 мкм диагностируется при железодефицитной анемии, талассемии, сфероцитозе.

Тельца Гейнца – маленькие округлые включения в эритроцитах, образованные из денатурированного гемоглобина. Обнаруживаются при воздействии гемолитических ядов, анемиях, вызванных дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глютатионредуктазы и др. Выявляются с помощью окраски метиленовым фиолетовым (метод Дейси): в пробирке смешивают равные количества крови и 0,5 %-ного раствора метиленового фиолетового в изотоническом растворе хлорида натрия. Смесь оставляют на 10 мин, затем делают мазки. Тельца Гейнца окрашиваются в пурпурно-красный цвет.

Тельца Жолли – остатки ядра, сохранившиеся в эритроцитах из-за нарушенного обезъядривания нормобластов, имеют округлую форму, окрашиваются в тон хроматина, содержатся в клетке по одному, реже по два. Часто встречаются при мегалобластной анемии, а также при гемолитических анемиях и после спленэктомии.

Кольца Кебота – остатки ядра в виде восьмерки или овала, не содержащие хроматина, происхождение которых связывается с нарушением биосинтеза пистонов. Обнаруживаются преимущественно при мегалобластной анемии и при свинцовой интоксикации.

Железосодержащие гранулы в эритроцитах находят в норме в развивающихся нормобластах (сидеробластах), в части ретикулоцитов и в единичных зрелых эритроцитах (сидеролитах). Представляют собой связанное с митохондриями внутриклеточное железо, не включенное в гемоглобин. Используют окраску на берлинскую лазурь: фиксированные в метаноле мазки костного мозга и периферической крови опускают в смесь, состоящую из равных частей 1 %-ного феррицианида калия и 0,1 %-ного раствора хлористо-водородной кислоты. Химический стакан с указанной смесью ставят на водяную баню при температуре 50–60 °C на 15–20 мин. Затем препарат вынимают, промывают в проточной дистиллированной воде и докрашивают 0,1 %-ным водным раствором сафранина. Зернистые включения в цитоплазме окрашиваются в синий цвет.

Измененные формы эритроцитов и связанные с ними заболевания

Акантоциты. Клетки оснащены шпоровидными наростами различной величины. Картина характерна для цирроза, токсического гепатита, тяжелых фрм сфероцитоза, нарушений липидного обмена, гепаринотерапии.

Дакриоциты. Эритроциты каплевидной формы. Характерны для миелофиброза, мелоидной метаплазии, обнаруживаются при росте опухоли при гранулеме, лимфоме, фиброзе.

Дрепаноциты (серповидные эритроциты). Эритроциты похожи на серп. Мембрана клетки изменяется под действием повышенного количества гемоглобина-s. Характерно для гемоглобинопатии, серповидноклеточной анемии

Кодоциты (мишеневидные эритроциты). Эритроциты выглядят как плоские клетки, бледные по краям, с ярким гемоглобиновым пятном в центре. Площадь клетки увеличена из-за избыточного холестерина. Характерны для гемоглобинопатии, железодефицитной анемии, талассемии, болезни печени, отравления свинцом.

Микросфероциты. Шарообразная форма, размеры 4–6 мкм. Характерны для наследственного микросфероцитоза (болезни Минковского-Шоффара).

Стоматоциты. Эритроциты на 1/3 большего размера и объема, просветление по центру в виде полосы. При осаждении напоминают чаши. Картина характерна для наследственных стоматоцитоза и сфероцитоза, опухолей различной этиологии, цирроза печени, алкоголизма

Сфероциты. Эритроциты обычного размера, шаровидной формы, отсутствует светлая область в центре. Характерны для гемолитической болезни новорожденных (несовместимость крови по системе AB0), спетицимии, аутоиммунных патологий, различных видов анемий.

Элиптоциты (овалоциты), Эритроциты удлиненной или овальной формы по причине аномалий мембраны, отсутствует светлая область в центре. Характерны для талассемии, наследственного овалоцитоза, цирроза печени, ряда анемий (мегобластной, железодефицитной, серповидно-клеточной).

Эхиноциты. Клетки оснащены шипами одинакового размера, расположенными на равном расстоянии друг от друга. Данная форма эритроцитов характерна при раке желудка, уремии, наследственных патологиях, нехватке фосфатов, магния.

Лейкоциты

Жизненный цикл лейкоцитов

Лейкоциты («белая кровь») – это индикаторы состояния организма. Они являются ядросодержащими клетками крови.

Лейкоциты крови выполняют в организме различные функции. Фагоцитирующие лейкоциты – нейтральные гранулоциты вместе с мононуклеарными макрофагами – составляют неотъемлемую часть защиты организма от инфекции. Нейтральные гранулоциты характеризуются наличием в цитоплазме двух типов гранул: азурофильных и специфических, содержимое которых позволяет этим клеткам выполнять свои функции.

В азурофильных гранулах содержатся миелопероксидаза, нейтральные и кислые гидролизы, катионные белки, лизоцим. Специфические гранулы имеют в своем составе лизоцим, лактоферрин, коллагеназу, аминопептидазу. 60 % общего числа гранулоцитов находится в костном мозге, составляя костномозговой резерв, около 40 % – в других тканях и лишь 1 % – в периферической крови. Одна часть (примерно половина) гранулоцитов крови циркулирует в сосудах, другая секвестрируется в капиллярах (маргинальный гранулоцитовый пул). Длительность полупериода циркуляции нейтрофильных гранулоцитов равняется 6,5 ч, затем они мигрируют в ткани, где осуществляют свою основную функцию. Основные места тканевой локализации гранулоцитов – легкие, печень, селезенка, желудочно-кишечный тракт, мышцы, почки. Время жизни гранулоцитов зависит от многих причин и может колебаться от нескольких минут до нескольких дней (в среднем – 4–5 дней). Тканевая фаза их жизни является завершающей.

Моноциты и мононуклеарные макрофаги в норме обнаруживаются в крови, костном мозге, лимфатических узлах, селезенке, печени, других тканях. Моноциты содержат две популяции гранул: пероксидазоположительные и пероксидазоотрицательные. В гранулах моноцитов, помимо пероксидазы, определяются лизоцим, кислые гидролизы и нейтральные протеиназы. Отношение содержания этих клеток в тканях и циркулирующей крови 400: 1. Одна четверть всех моноцитов крови составляет циркулирующий пул, остальная часть относится к маргинальному пулу. Продолжительность полупериода циркуляции моноцитов – 8,4 ч. При переходе в ткани моноциты превращаются в макрофаги, в зависимости от места обитания они приобретают специфические свойства, позволяющие отличать их друг от друга. В норме обмен макрофагов в тканях происходит медленно, например купферовские клетки печени и альвеолярные макрофаги обмениваются через 50–60 дней. Для всех макрофагов, фиксированных и свободных, характерна ярко выраженная способность к фагоцитозу, пиноцитозу и распластыванию на стекле.

Способность к фагоцитозу определяет участие нейтрофилов и макрофагов в воспалении, причем нейтрофильные гранулоциты являются главными клетками острого воспаления, а макрофаги рассматривают как центральное клеточное звено хронического воспаления, в том числе иммунного: фагоцитоз возбудителя, иммунных комплексов, продуктов клеточного распада, выделение биологически активных веществ, взаимодействие с тканевыми факторами, образование активных пирогенов, выделение ингибиторов воспаления и т. д.

Эозинофилы после созревания в костном мозге менее одного дня находятся в циркуляции, а затем мигрируют в ткани, где продолжительность их жизни составляет 8–12 дней. Существует несколько хемотаксических факторов для эозинофилов, среди которых компоненты комплемента С3, С5 и С5,6,7, описанные для нейтрофилов, а также специфический хемотаксический эозинофильный фактор анафилаксии, выделение которого из тучных клеток может быть опосредовано иммуноглобулином класса Е и сходно с выделением гистамина по временным, биохимическим и регуляторным параметрам. Т-лимфоциты продуцируют фактор, активирующий эозинофилы. Гранулы эозинофилов содержат лизосомальные ферменты, фосфолипазу D, арилсульфатазу В, гистаминазу, брадикинины. Эозинофилы могут фагоцитировать комплексы антиген – антитело и определенные микроорганизмы.

Эозинофилы вовлекаются в реакции гиперчувствительности немедленного типа, выполняя при этом регуляторную и проективную функции, связанные с инактивацией гистамина, а также медленно действующего вещества анафилаксии (арилсульфатазы В) и фактора, активирующего тромбоциты (фосфолипазы D), выделяемых тучными клетками. Эозинофилы играют роль в межклеточных взаимодействиях при гиперчувствительности замедленного типа.

Базофилы – самая малочисленная часть гранулоцитов в периферической крови (0,5–1 % всех лейкоцитов). Функция этих клеток сходна с функцией тучных клеток. Продолжительность жизни базофилов – 8–12 дней, время циркуляции в периферической крови – несколько часов. Базофилы, как и тучные клетки, имеют на своей поверхности рецепторы для антител класса IgE, одна клетка может связать от 10 до 40 000 молекул IgE. Взаимодействие между антигеном и IgE на поверхности базофила вызывает дегрануляцию с освобождением медиаторов: гистамина, серотонина, фактора, активирующего тромбоциты, медленно действующего вещества анафилаксии, фактора, хемотаксического для эозинофилов. Эти процессы лежат в основе реакции гиперчувствительности немедленного типа. Базофилы играют роль и в реакции замедленного типа. Хемотаксическими факторами для них являются С3а, С5а, калликреин, лимфокины, освобождаемые активированными Т-лимфоцитами, а также антитела, вырабатываемые В-лимфоцитами.

Защитная роль подвижных клеток крови и тканей сформулирована фагоцитарной теорией иммунитета. Микрофаги и макрофаги имеют общее миелоидное происхождение от полипотентной стволовой клетки, которая является единым предшественником грануло- и моноцитопоэза. Все фагоцитирующие клетки характеризуются общностью основных функций, сходством структур и метаболических процессов. Наружная плазматическая мембрана отличается выраженной складчатостью и несет множество специфических рецепторов и антигенных маркеров. Фагоциты снабжены высокоразвитым лизосомным аппаратом. Активное участие лизосом в функциях фагоцитов обеспечивается способностью их мембран к слиянию с мембранами фасготом или с наружной мембраной. В последнем случае происходят дегрануляция клеток и сопутствующая секреция лизосомальных ферментов во внеклеточное пространство. Фагоцитам присущи 3 функции:

1) защитная – связанная с очисткой организма от инфекционных агентов, продуктов распада тканей и т. д.;

2) представляющая – заключающаяся в презентации антигенных эпитопов на мембране;

3) секреторная – связанная с секрецией лизосомальных ферментов других биологически активных веществ.

В соответствии с перечисленными функциями различают следующие стадии фагоцитоза:

1) хемотаксис – целенаправленное передвижение фагоцитов в направлении химического градиента хемоаттрактантов;

2) адгезия – опосредованная соответствующими рецепторами;

3) эндоцитоз – являющийся основной физиологической функцией фагоцитов.

Для распознавания и последующего поглощения имеет большое значение опсонизация объектов фагоцитоза. Опсонины, фиксируясь на частицах, связывают их с поверхностью фагоцитирующей клетки. Основными опсонинами являются компоненты активированного классическим или альтернативным путем комплемента (С3в и С5в) и иммуноглобулины класса G и М. Это делает клетку высокочувствительной к захвату фагоцитами и приводит к последующей внутриклеточной гибели и деградации. В результате эндоцитоза образуется фагоцитарная вакуоль – фагосома. Азурофильные и специфические гранулы нейтрофила и гранулы макрофагов мигрируют к фагосоме, сливаются с ней, выделяя в нее свое содержимое. Поглощение – активный энергозависимый процесс, сопровождающийся усилением АТФ-генерирующих механизмов – специфического гликолиза и окислительного фосфорилирования в макрофагах.

В нейтрофилах существует несколько систем микробоцидности. Кислородозависимый механизм состоит в активации гексозо-монофосфатного шунта и повышении потребления кислорода и глюкозы с одновременным выбросом биологически активных нестабильных продуктов восстановления кислорода: перекиси водорода, супероксиданионов кислорода, гидроксильных радикалов ОН. Кислородонезависимый механизм связан с активностью основных катионных белков (один из них фагоцитин) и лизосомальных ферментов, изливающихся в фагосому при дегрануляции, – лизоцима, лактоферрина и кислых гидролиз.

Определение количества лейкоцитов

Метод подсчета в камере. Взятие и разведение крови производят пробирочным методом. В пробирку (лучше видалевскую) вносят 0,4 мл разводящей жидкости и 0,02 мл капиллярной крови. Полученное разведение практически считается равным 1: 20. В качестве разводящей жидкости обычно употребляют 3–5 %-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим (уксусная кислота визирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Камеру заполняют так же, как для подсчета эритроцитов.

Лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов (1–2 на большой квадрат), поэтому для точности подсчет производят в 100 больших квадратах (неразграфленных). Расчет: в 100 больших квадратах (1600 малых) сосчитано а лейкоцитов. Помня, что объем малого квадрата равен 14 000 мм3, а кровь разведена в 20 раз, рассчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови: 4000 × 20 и делится на 1600 = = 1/2 × а. Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать два нуля. В среднем ошибка метода составляет ±7 %.

Более точным (ошибка 2–3 %) и совершенным является подсчет лейкоцитов с помощью электронных аппаратов. Подсчет лейкоцитов в счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом. В автоанализаторе «Техникон» в качестве такового применяют раствор уксусной кислоты, в аппаратах «Культер» и «Целлоскоп» – сапонин или сапоглобин, которые добавляют разведенными (1: 500, 1: 700) в изотоническом растворе хлорида натрия (6 капель на 20 мл разведения).

Подсчет лейкоцитарной формулы крови производят в окрашенных мазках периферической крови. Считать лучше ближе к концу мазка в самом тонком месте, не менее 200 клеток (исключение составляют выраженные лейкопении), а затем выводят процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов. Подсчет рекомендуется производить в одном порядке: половину клеток считать в верхней, половину – в нижней части мазка, не заходя на самый край и середину, по зигзагу (3–4 поля зрения вдоль мазка, 3–4 поля под прямым углом к середине мазка, затем 3–4 поля в сторону параллельно краю, вновь под прямым углом вверх и так далее в одну сторону).

Приготовление мазков. Тщательно вымытым и обезжиренным предметным стеклом (его краем) прикасаются к капле крови на месте укола. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом в 45° к предметному стеклу впереди капли. Подведя стекло к этой капле, ждут, пока кровь расплывется вдоль его ребра, затем быстрым легким движением проводят шлифовальное стекло вперед, не отрывая от предметного раньше, чем иссякнет вся капля.

Правильно сделанный мазок имеет желтоватый цвет (тонкий), не достигает краев стекла и заканчивается в виде следа (усов).

Окрашивание сухих мазков производят после предварительной фиксации. Лучшая фиксация достигается в абсолютном метиленовом спирте (3–5 мин) или в смеси Никифорова из равных частей абсолютного этилового спирта и эфира (30 мин).

К основным гематологическим краскам относят метиленовый синий и его производное – азур I (метиленовый азуровый) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего), к кислым – водорастворимый желтый эозин.

1. Окраска по Романовскому – Гимзе. Краска Романовского – Гимзе (заводского приготовления) имеет следующий состав: азур II – 3 г, водорастворимый желтый эозин – 0,8 г, метиловый спирт – 250 мл и глицерин – 250 мл. Рабочий раствор краски приготавливают из Расчета 1,5–2 капли готовой краски на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливают на мазок возможно более высоким слоем; длительность окраски – 30–35 мин. По истечении этого срока мазки промывают водой и высушивают на воздухе. При этом способе удается хорошо дифференцировать ядро, но гораздо хуже – нейтрофильную зернистость цитоплазмы, поэтому его широко используют для окраски мазка периферической крови.

2. Комбинированная окраска Мая – Грюнвальда – Романовского – Гимзе по Паппенгему. На фиксированный мазок наливают пипеткой готовый краситель – фиксатор Мая – Грюнвальда, представляющий собой раствор эозинметиленового синего в метиленовом спирте, на 3 мин. Через 3 мин к покрывающей раствор краске добавляют равное количество дистиллированной воды и продолжают окрашивание еще 1 мин. После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8–15 мин. Этот метод считается наилучшим, особенно для окраски мазков костномозговых пунктатов (табл. 3).

Таблица 3

Нормальная лейкограмма

Увеличение числа лейкоцитов в периферической крови выше нормального уровня называют лейкоцитозом, уменьшение – лейкопенией. Лейкоцитоз (лейкопения) редко характеризуется пропорциональным увеличением (уменьшением) числа лейкоцитов всех видов, например лейкоцитоз при сгущении крови. В большинстве случаев имеется увеличение числа (уменьшение) какого-либо одного типа клеток. Увеличение или уменьшение числа отдельных видов лейкоцитов в крови может быть относительным или абсолютным в зависимости от общего содержания лейкоцитов – нормального, повышенного или пониженного. Изменение числа, соотношения отдельных форм и морфологии лейкоцитов зависит от вида и вирулентности возбудителя, характера, течения и распространенности патологического процесса, индивидуальной реакции организма.

Изменения лейкоцитов при патологии

Количественные изменения

Нейтрофилез (нейтрофилия) – увеличение содержания нейтрофилов выше 6 × 10^9/л крови. Нейтрофильный лейкоцитоз сопровождает бактериальные инфекции, интоксикации и заболевания, протекающие с некрозом ткани. Нейтрофилез наблюдается при сепсисе, перитоните, абсцессе, остеомиелите, пневмонии и многих других воспалительных заболеваниях. Кроме этого, нейтрофилез наблюдается в результате действия гистамина, препаратов наперстянки, применения кортикостероидов, при укусах ядовитых насекомых. Иногда наблюдаются лейкемоидные реакции – изменения крови реактивного характера, напоминающие лейкозы (лейкемии) по степени увеличения числа лейкоцитов или по морфологии клеток. Лейкемоидные реакции нейтрофильного типа описаны при злокачественных опухолях, особенно с множественными метастазами в костный мозг.

Снижение содержания нейтрофилов отмечается при хронических инфекциях, облучении, вирусных заболеваниях, приеме цитостатиков, В_12-дефицитных анемиях, агранулоцитозе.

Эозинофилия – повышение уровня эозинофилов крови выше 0,4 × 10^9/л. Эозинофилия сопутствует аллергии, внедрению чужеродных белков и других продуктов белкового происхождения. При некоторых состояниях (эндокардите Леффлера, узелковом периартериите, лимфогранулематозе) могут наблюдаться гиперэозинофильные лейкемоидные реакции, как при хроническом лейкозе (50–70 % эозинофилов при количестве лейкоцитов 20–70 тыс.) с эозинофильной гиперплазией костного мозга и инфильтрацией тканей эозинофилами. Понижение числа эозинофилов может наблюдаться при воздействии кортикостероидов, адреналина, никотиновой кислоты, после приема антибиотиков, сульфаниламидных препаратов.

Базофилия – увеличение содержания базофилов в периферической крови, наиболее часто встречается при хроническом миелолейкозе и эритремии, а также при хроническом язвенном колите, некоторых кожных поражениях, при аллергических состояниях, заболеваниях системы крови, воспалительных процессах в печени, при длительном облучении малыми дозами радиации, сахарном диабете, в начале месячных у женщин.

Снижение количества базофилов отмечается при применении лучевой терапии, при острых лейкозах.

Моноцитоз – увеличение числа моноцитов выше 1,0 × 10^9/ л крови у взрослого. Моноцитоз является признаком хронического моноцитарного лейкоза. При легочном туберкулезе моноцитоз сопутствует острой фазе заболевания. Кроме этого он может наблюдаться при протозойных и вирусных инфекциях, развитии злокачественных заболеваний, инфекционном мононуклеозе.

Лимфоцитоз – увеличение содержания лимфоцитов выше 5 × 10^9/л крови. Лимфоцитоз сопровождает вирусные, некоторые хронические бактериальные инфекции, является характерной чертой хронического лимфолейкоза. Лейкемоидные реакции лимфатического типа отмечаются наиболее часто при инфекционном мононуклеозе, остром инфекционном лимфоцитозе, но возникают иногда при туберкулезе, сифилисе, бруцеллезе.

Он может возникать после тяжелого физического труда, в период затихания воспалительных процессов, во время месячных.

Лейкопения – уменьшение числа лейкоцитов в крови ниже 4,0 × 10^9/л, чаще бывает обусловлена снижением содержания нейтрофилов. Лейкопения (нейтропения) при одних инфекциях (брюшном тифе, паратифах, туляремии, некоторых вирусных инфекциях) выявляется закономерно, при других (подострый бактериальный эндокардит, инфекционный мононуклеоз, милиарный туберкулез) – в некоторых случаях. Факторы (ионизирующая радиация, бензол, цитостатические препараты), обладающие миелотоксическим действием, всегда вызывают лейкопению. Лейкопения (нейтропения) отмечается при недостаточности витамина В_12 и фолиевой кислоты.

Агранулоцитоз – резкое уменьшение числа гранулоцитов в периферической крови (менее 0,75 × 10^9/л) вплоть до полного исчезновения, ведущее к снижению сопротивляемости организма и развитию бактериальных осложнений:

1) миелотоксический агранулоцитоз. Возникает в результате действия цитостатических факторов, зависит от их дозы и экспозиции, развивается обычно постепенно. Число лейкоцитов может падать очень резко, с нейтрофилами уменьшается содержание других лейкоцитов, ретикулоцитов. Миелотоксическому агранулоцитозу свойственно сочетание лейкопении с тромбоцитопенией и анемией, т. е. панцитопения;

2) к иммунным агранулоцитозам относят гаптеновый и аутоиммунный (при системной красной волчанке и некоторых других формах иммунной патологии), а также изоиммунный агранулоцитоз (у новорожденных, иногда после гемотрансфузий). Гаптеновый агранулоцитоз развивается обычно остро, падение числа нейтрофилов в периферической крови может произойти за несколько часов и закончиться полным их исчезновением из циркуляции. Лейкопения носит чаще более умеренный характер, причем гранулоцитопения может быть изолированной при сохранении лимфоцитов, ретикулоцитов и тромбоцитов. В костном мозге наблюдается уменьшение клеточных элементов за счет гранулоцитарного ростка, трепанат нередко оказывается достаточно клеточным.

Продолжительность агранулоцитоза разная: гаптеновый в большинстве случаев заканчивается через 1–2 недели при условии соответствующей терапии. Выход из агранулоцитоза характеризуется появлением в крови плазматических клеток, молодых гранулоцитов – метамиелоцитов и миелоцитов, моноцитов.

Аутоиммунный агранулоцитоз связывают с аутоантителами, обнаруживающимися в крови больных системной красной волчанкой и некоторыми другими заболеваниями и являющимися результатом снижения активности Т-супрессоров.

Изоиммунную нейтропению связывают с отсутствием в костном мозге зрелых гранулоцитов, отмечается иногда у новорожденных, что объясняется выработкой в организме матери антител (изоагглютининов) против лейкоцитов плода, проникновением этих антител через плаценту в кровь ребенка и разрушением гранулоцитов.

Эозинопения (менее 0,05 × 10^9/л) отмечается при введении аденокортикотропного гормона, при синдроме Кушинга, стрессовых ситуациях, при начальных фазах инфекционно-токсического состояния.

Лимфоцитопения (менее 1 × 10^9/л) у подростков и детей бывает связана с гипоплазией тимуса и сочетается с врожденной α-γ-глобулинемией, у взрослых наблюдается при лимфогранулематозе, распространенном туберкулезе лимфатических узлов, нередко наряду с нейтропенией, при системной красной волчанке, остром радиационном синдроме, при стрессе.

Снижение числа моноцитов (менее 0,09 × 10^9/л) имеет значение главным образом при оценке лимфоцитарно-моноцитарного соотношения при легочном туберкулезе.

Морфологические и биохимические изменения

Токсическая грануляция в нейтрофилах – грубая, темно-красного цвета зернистость, содержится в нейтрофилах (сегменто-ядерных, палочкоядерных, метамиелоцитах) при тяжелых инфекциях или токсических состояниях. У здорового взрослого человека часть гранул нейтрофилов не окрашивается по Романовскому – Гимзе, но при изменении цитоплазматического окружения, что отмечается при патологии, они становятся окрашенными, как лизосомы.

Тельца Деле – овальные или вытянутые образования (включения) светло-голубого или серого цвета в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов, обнаруживаемые при скарлатине, пневмонии, кори, ожогах и представляющие собой участки цитоплазмы, свободные от специфических гранул и богатые РНК.

Гиперсегментация нейтрофильных лейкоцитов – наличие более пяти сегментов в ядрах нейтрофилов, может отмечаться у здоровых людей как наследственная конституционная особенность, но также характерна для макрополицитов при дефиците витамина В_12 и фолиевой кислоты.

Пельгеровская семейная аномалия лейкоцитов – доминантно наследуемое нарушение созревания, характеризующееся уменьшением сегментации ядер гранулоцитов при нормальной зрелой цитоплазме. Наиболее часто зрелые нейтрофилы содержат двухсегментное или несегментированное ядро, редко – трехсегментное. Иногда форма ядра бывает округлой или вытянутой и напоминает ядра молодых нейтрофилов (палочкоядерных, мета- и миелоцитов), однако отличается от них грубым пикнотичным темноокрашенным хроматином. Обычно отмечается гетерозиготное носительство аномалии с доброкачественным течением.

Характерной чертой синдрома Чедиака – Хигаси – редкого заболевания детей и подростков с аутосомно-рецессивным типом наследования – является наличие больших цитоплазматических включений (аномальных гранул) во всех типах клеток крови, за исключением мегакариоцитов. Эти включения в нейтрофилах и моноцитах содержат миелопероксидазу, кислую фосфатазу, а в лимфоцитах – PAS-положительный материал и представляют собой, по-видимому, гигантские лизосомы.

При хронической гранулематозной болезни детей предрасположенность к повторным гнойным инфекциям и формированию гранулем в органах обусловлена наследственным метаболическим дефектом гранулоцитов (а также моноцитов и гистиоцитов), заключающимся в неспособности клеток во время фагоцитоза к респираторному взрыву (окислению глюкозы в гексозомонофосфатном шунте) и формированию перекиси водорода из-за недостаточности НАДФ-Н-оксидазы. Это ведет к нарушению внутриклеточного поглощения бактерий (стафилококков, протеев и др.), которые сами неспособны генерировать перекись водорода. Для диагностики заболевания применяют тест восстановления нитросинего тетразолия.

LE-феномен (lupus erythematosus) наблюдается в процессе инкубации периферической крови больных системной красной волчанкой (СКВ) и некоторых других заболеваний аутоиммунной природы.

Положительный LE-тест (метод ротирования крови со стеклянными бусами в модификации Е. И. Новоселовой) включает следующие морфологические образования: LE-клетки – нейтрофильный лейкоцит, содержащий фагоцитированный гомогенный ядерный материал. Ядерное тело имеет округлую форму, окрашивается в ярко-красный цвет, занимает центральную часть клетки, оттесняя собственное ядро нейтрофила к периферии, причем клетка с включением выглядит в 1,5–2 раза крупнее обычной. Истинные LE-клетки необходимо отличать от так называемых tart-клеток, обычно моноцитов с фагоцитированным ядром; свободно лежащий ядерный материал (гематоксилиновые тела) – образование ядерной природы, округлой формы и величиной с 1–2 лейкоцита, по гомогенной структуре и ярко-красной окраске сходный с телами внутри LE-клеток; «розетки» – образования из нейтрофилов, кольцом окружающие ядерное тело.

Внеклеточные ядерные (гематоксилиновые) тела и розетки рассматривают как промежуточные этапы образования LE-клеток. Формирование LE-клеток зависит от LE-фактора, содержащегося в плазме крови и других жидкостях у больных СКВ и представляющего собой антинуклеарные антитела (главным образом к нуклеопротеину, в меньшей степени к гистону и ДНК) γ-глобулиновой природы.

Взаимодействие фактора с ядром лейкоцита ведет к деполимеризации ядерного хроматина, освобождению ядерного материала из клетки и последующему фагоцитозу его нейтрофильными лейкоцитами, причем для фагоцитоза необходимо участие комплемента.

LE-клетки находят в 80 % случаев СКВ, при ревматоидном артрите, активном гепатите, склеродермии и при лекарственных волчаночноподобных синдромах.

Лимфоциты

Жизненный цикл лимфоцитов

Лимфоциты являются главным клеточным элементом иммунной системы организма. В процессе лимфопоэза из общей клетки развиваются 2 класса лимфоидных клеток. Одна отделившаяся клетка мигрирует из костного мозга в тимус, где под влиянием гормоноподобного вещества – тирозина – дифференцируется в Т-клетки, поступающие затем в циркуляцию и в периферические лимфоидные органы (лимфоузлы, селезенку, миндалины, лимфоидную ткань кишечника); другая в костном мозге превращается в В-клетку, предшественники которой мигрируют в кровь и лимфатические органы. Дальнейшая дифференцировка Т-клеток в эффекторные Т-лимфоциты, в антителопродуцирующие плазматические клетки зависит от антигена. Т-лимфоциты и часть В-лимфоцитов находятся в постоянном движении по периферической крови и тканевым жидкостям. Уровень функциональной дифференцировки лимфоцитов не всегда можно определить морфологически в световом микроскопе, морфологические отличия свойственны лишь иммунобласту – бласттрансформированному под влиянием антигена лимфоциту.

Т-лимфоциты ответственны за распространение чужих антигенов, отторжение чужеродных и собственных клеток, модифицированных антигенами. Они делятся на несколько субклассов – киллеры, хелперы, эффекторы гиперчувствительности замедленного типа, супрессоры.

Система В-лимфоцитов также подразделяется на множество мелких функциональных подсистем, способных реагировать с разными антигенами. Подобная специализация (клональная селекция) обеспечивает продукцию около миллиона различных антител. На часть антигенов (тимуснезависимые) В-лимфоциты отвечают самостоятельно, на большинство других (тимусзависимые АГ) гуморальный ответ возможен при условии кооперирования В-клеток с Т-клетками (и макрофагами) и получения от Т-лимфоцитов (Т-В-хелперов) дополнительного сигнала.

При первичной встрече с антигеном антителопродуцирующие потомки В-клеток синтезируют сначала (2–4 дня после иммунизации) антитела, относящиеся к IgM, затем (4–7 день), если доза антигена большая, происходит синтез антител класса IgG и в конечной стадии – IgF. Кроме того, при первичном ответе образуется клон В-лимфоцитов, обладающий памятью. При вторичной иммунной стимуляции на большинство антигенов вырабатываются антитела класса IgG. Функциональная разнородность лимфоцитов при морфологическом сходстве затрудняет изучение их кинетики. Тем не менее радиоизотопными методами установлено существование двух популяций лимфоцитов – коротко- и долгоживущих. Продолжительность жизни первых около 4 дней, вторых – в среднем около 170 дней. Короткоживущие формы составляют около 30 % всех лимфоцитов периферической крови. Большинство В-клеток принадлежат к короткоживущим, а Т-клетки (кроме Т-супрессоров) – к долгоживущим лимфоцитам.

Методы идентификации разных классов и субклассов лимфоцитов основаны на выявлении клеточных рецепторов – поверхностных мембранных структур, обладающих способностью спонтанно связывать некоторые индикаторные клетки или молекулы.

Распределение Т- и В-лимфоцитов в периферической крови человека следующее: 25–30 % составляют В-клетки и 60 % – Т- клетки. Лимфоциты, на которых не выявляются ни Т-рецепторы, ни В-рецепторы, названы нулевыми, содержание которых в периферической крови около 10 %. Предполагают, что к нулевым клеткам принадлежат предшественники Т- и В- лимфоцитов.

Тромбоциты

Жизненный цикл тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой фрагменты клеток мегакариоцитов, основная их функция – участие в процессе свертывания крови. Нормальное количество тромбоцитов: 180–320 × 10^9/л – у детей старше 10 дней, 99–421 × 10^9/л – у взрослых.

Одна треть вышедших из костного мозга тромбоцитов депонируется в селезенке, остальная часть циркулирует в крови.

Тромбоциты живут максимум 10–12 дней, средняя продолжительность жизни тромбоцита составляет 7 суток. Родоначальной клеткой мегакариоцитарного ряда является мегакариобласт – клетка крупного размера (20 мкм) с ядром грубой структуры, содержащим нуклеолы. Цитоплазма барофильная.

Промегакариоцит имеет тенденцию к полиморфизму ядра, цитоплазма базофильная, беззернистая.

Мегакариоцит – гигантская клетка костного мозга диаметром от 60 до 120 мкм. Ядро грубое, принимает различные, иногда причудливые, формы.

Цитоплазма отличается очень большими размерами, содержит зернистость розово-фиолетового цвета. От цитоплазмы мегакариоцита отшнуровываются тромбоциты.

Тромбоциты содержатся в периферической крови у здоровых лиц в основном в виде нормальных зрелых пластинок (90–98 %) размером от 1 до 3 мкм, имеющих четкие границы, сиреневый гиаломер и центрально расположенный грануломер, состоящий из 5–20 азурофильных зерен.

Другие виды пластинок: юные (с голубоватым гиаломером и скудной зернистостью), старые (с неровными очертаниями и плотным грануломером, иногда занимающим весь тромбоцит) формы раздражения (мелкие или в виде гигантских тромбоцитов); в норме составляют лишь небольшой процент и появляются в большем количестве при патологии.

Тромбоциты – кровяные пластинки – имеют 3 структурные зоны:

1) периферическую (трехслойная мембрана, содержащая рецепторы для коллагена, АДФ, серотонина, эпинефрина, тромбина, фактора Виллебранда; на внешней стороне мембраны расположен аморфный слой из кислых мукополисахаридов и адсорбированных факторов свертывания плазмы крови);

2) зоны «золь-гель» (микротубулы-каналы, часть которых имеет выход на наружной мембране; микрофиламенты, содержащие контрактильный протеин тромбостеин, участвующий в поддержании дискообразной формы пластинок; от его свойств зависит ретракция кровяного сгустка);

3) зону органелл (гликогеновые гранулы, митохондрии, α-гранулы, плотные тела, аппарат Гольджи).

Гранулы высокой плотности содержат серотонин, адреналин (адсорбируются из плазмы через каналикулярную систему), кальций, неметаболические АДФ и АТФ, 4 фактора тромбоцитов, гранулярную часть, 3 фактора тромбоцитов; α-гранулы содержат гидролитические ферменты (кислую фосфатазу, β-глюкуронидазу, катепсины), фибриноген тромбоцитов. Тромбоциты используют энергию АТФ, образуемую в процессе гликолиза, а также в процессе фосфорилирования.

Определение количества тромбоцитов

Метод подсчета в мазке крови. В мазке крови подсчитывают количество тромбоцитов по отношению к 1 тыс. эритроцитов. Зная абсолютное число эритроцитов в 1 мкл крови, вычисляют количество кровяных пластинок в 1 мкл. Для предотвращения агглютинации кровяных пластинок на место укола наносят каплю 14 %-ного раствора сульфата магния. Выделившуюся каплю крови смешивают с магнезией и из смеси готовят мазки на предметных стеклах, которые окрашивают по Романовскому – Гимзе в течение 2–3 ч. Подсчет кровяных пластинок производят под иммерсионной системой микроскопа с использованием сетчатого окуляра или вкладного окошка.

Существует метод подсчета тромбоцитов в камере, при котором кровь разводят для предотвращения свертывания и агглютинации тромбоцитов в консервирующей жидкости, например в 5–7 %-ном растворе трилона Б, заполняют камеру и подсчитывают тромбоциты и эритроциты одновременно. Сосчитав 1 тыс. эритроцитов, суммируют общее количество встретившихся тромбоцитов. Зная количество эритроцитов в единице объема крови, высчитывают количество тромбоцитов для единицы объема крови.

Метод подсчета тромбоцитов на счетчике частиц. Тромбоциты можно подсчитывать на любом счетчике частиц типа «Культер» и «Целлоскоп». Венозную кровь, смешанную с антикоагулянтом (цитратом натрия), оставляют на несколько часов для оседания эритроцитов и лейкоцитов. Тромбоциты практически не оседают и остаются равномерно распределенными в плазме крови.

Плазму разводят изотоническим раствором хлорида натрия и пропускают через счетчик. Используется измерительная трубка с капиллярным отверстием для подсчета тромбоцитов (50 мкм). Затем производят второй подсчет, пользуясь измерительной трубкой с большим капиллярным отверстием для подсчета оставшихся в плазме и не осевших эритроцитов (60 мкм). Разность между результатами первого и второго подсчета показывает истинное количество тромбоцитов.

В настоящее время подсчет числа тромбоцитов производится на гематологическом анализаторе. Это повышает точность и скорость подсчета тромбоцитов. Принцип подсчета основан на кондуктометрическом методе. Обычно ход исследования излагается в инструкции к прибору.

Число тромбоцитов у здорового человека в среднем составляет 180–320 × 10^9/л.

Исследование адгезии тромбоцитов

Из способов изучения адгезии тромбоцитов наиболее информативными являются закрытые методы, при которых кровь прямо из вены пропускается через колонку со стеклянными бусами (диаметр 0,5 мм) с соблюдением времени контакта. По разнице количества тромбоцитов в крови до и после прохождения через колонку судят о количестве тромбоцитов, подвергшихся адгезии к стеклу.

Исследование агрегации тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов исследуют в обогащенной тромбоцитами плазме крови с помощью ФЭК или специальных фотометров (агрегометров) либо микроскопически – путем подсчета тромбоцитарных агрегатов и свободно лежащих тромбоцитов.

Агрегационную функцию тромбоцитов определяют при воздействии различных физиологических агрегирующих агентов: оптимальных и малых доз АДФ, коллагена (в эмульсии), адреналина, малых доз тромбина.

Кроме этих методов, применяют электронно-микроскопические (изучение ультраструктуры тромбоцитов), радиоизотопные (определение продолжительности жизни тромбоцитов), гистологические (исследование мегакариоцитов в срезах костного мозга), иммунологические (определение антитромбоцитарных антител) методы исследования.

Оптическая агрегатометрия. Прибор регистрирует изменения светопропускания плазмы, обогащенной тромбоцитами. До анализа данным методом необходимо центрифугировать образец крови для получения средней концентрации тромбоцитов 200–250 г × 10^9/л. Отрицательное последствие центрифугирования – возможность контактной активации тромбоцитов, а также потери части рецепторов с их поверхности. Положительная сторона – наличие одинаковой концентрации тромбоцитов, что позволяет сравнить результаты анализов у одного пациента, проведенных в разное время.

Импедансная агрегатометрия. Для анализа берут цельную кровь. Данный метод не нуждается в предварительной подготовке, получении обогащенной плазмы. В нем измеряется изменение сопротивления между двумя электродами, погруженными в цельную кровь. Данный анализ демонстрирует физиологическое состояние в крови пациента в конкретный момент забора крови. Посредством этого метода возможно выполнение значительного количества исследований за меньшее время.

Как гипоагрегация (снижение агрегационной способности тромбоцитов), так и гиперагрегация (склонность к тромбообразованию) могут быть выявлены любым из приведенных выше методов. Считается, что гипоагрегацию лучше распознает оптическая агрегатометрия, а гиперагрегацию – импедансная.

Гематологические анализаторы рисуют тромбоцитометрические кривые-гистограммы. При наличии молодых форм происходит сдвиг гистограммы вправо, старые формы располагаются слева, так как по мере старения их объем уменьшается.

Изменения тромбоцитов при патологии

Тромбоцитоз – увеличение числа тромбоцитов выше чем 400 × 10^9/л – бывает первичным (результат первичной пролиферации мегакариоцитов) и вторичным (на фоне какого-либо заболевания). Вторичный тромбоцитоз (реактивный) обычно не столь выражен, как первичный, реже осложняется тромбозом или кровотечением и исчезает при устранении причины. Он встречается при ревматической лихорадке, ревматоидном артрите, туберкулезе, циррозе печени, остеомиелите, острой кровопотере, карциноме, состоянии после спленэктомии, после операций, остром гемолизе и других заболеваниях.

Тромбоцитоз как часть миелопролиферативного синдрома (эритремии, хронического миелолейкоза, миелофиброза) может быть очень выражен (до 4–5 млн в 1 мкл крови), обычно стоек и сочетается с лейкоцитозом, а при эритремии – с эритроцитозом.

Тромбоцитопения – уменьшение числа тромбоцитов в крови – может быть значительной или умеренной, однако клинические проявления геморрагического синдрома возникают при количестве тромбоцитов 180 × 10^9/л.

Гематологические анализаторы

В настоящее время в лабораторной диагностике широко используются гематологические анализаторы, позволяющие измерить ряд параметров крови. С полным стандартом оснащения клинико-диагностических лабораторий различных уровней можно ознакомиться в Приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 18 мая 2021 года № 464н «Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований».

Благодаря появлению новых технологий, в том числе компьютерной и телевизионной техники при микроскопическом анализе, появились новые возможности исследования изменения формы, структуры объектов, а также спектральных свойств и количества вещества. Это приводит к повышению объективности исследований клеток и тканей. В медицинской практике особенно важна диагностическая морфометрия, способствующая дифференциальной диагностики патологических процессов, характеризующихся близкими морфологическими проявлениями.

Автоматические лабораторные анализаторы в большинстве своем представляют собой компьютерные анализаторы изображений. Современные лабораторные комплексы позволяют сохранять изображения объектов, проводить измерения, сравнивать полученные данные как с результатами предыдущий измерений, так и со стандартной базой данных.

Виды компьютерных анализаторов изображений:

1. Универсальные. Используются в различных областях медицины. Широко распространены в лабораторной медицине. Включают в себя расширенных набор измеряемых параметров, а также готовые методики:

– архивирование изображения и улучшение его качества;

– измерение объектов как в ручном, так и в автоматическом режиме;

– подсчет количества объектов различных классов, а также процентного соотношения между ними;

– подсчет количества объектов определенного класса;

– анализ соотношения ядер и цитоплазмы;

– иммуногистомия для ядер и пр.

2. Специализированные. Применяются для автоматизации конкретных методов исследования (хромосомный анализ, автоматический анализ формулы крови и пр.).

Автоматические гематологические анализаторы далеко не универсальны. Точность анализов зависит прежде всего от квалификации специалиста. В частности, анализатор не может оценить патологические включения в эритроциты, а это необходимо при диагностике анемии. Анализатор не способен распознать атипичные клетки, такие как типичные мононуклеары, а это помешает диагностировать инфекционный мононуклеоз. Не распознаются анализатором молодые клетки, характерные для лейкозов. Ошибка возможна и при подсчете тромбоцитов, поскольку они могут быть распознаны как фрагменты эритроцитов или лейкоцитов, микросгустки. В итоге результаты анализов получаются завышенными или, в случае склеивания тромбоцитов, заниженными. Для исключения подобных ошибок необходим контроль специалиста. В частности, при подсчете тромбоцитов следует осуществлять подсчет или контроль тромбоцитов в мазке крови под микроскопом.

В лабораторной практике могут быть использованы различные виды гематологических анализаторов.

Анализаторы гематокрита ИВД, автоматические и полуавтоматические. Предназначены для определения гематокрита эритроцитов (объема массы эритроцитов) в образце цельной крови. Принцип действия анализаторов данного типа может быть основан на центрифугировании, фотометрии, электрометрии.

Анализаторы гематологические, автоматические и полуавтоматические. Осуществляют подстчет популяций клеток крови. Принцип действия основан на технологии лизиса, электропроводности, электрического сопротивления, светорассеяния. Используются для измерения и подсчета параметров эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

Анализатор ретикулоцитов. Применяется для качественного и количественного определения незрелых эритроцитов (ретикулоцитов). Принцип работы основан на применении специфического источника света (в частности, лазера) для определения количества, а также степени созревания эритроцитов. Действие прибора основано на выявлении рибонуклеиновой кислоты (РНК), окрашенной для обнаружения или связанной посредством флуоресцентного маркера.

Анализатор объема циркулирующей крови. Применяется для количественного определения циркулирующей крови, плазмы или объема эритроцитов пациента. Принцип действия: пациенту вводится радиоактивная метка (в частности, изотоп йода 131), после чего через определенные временные интервалы берутся образцы крови. Степень разбавления раствора с радиоактивной метокй применяется для определения объема крови: пробы сравниваются с идеальным объемом крови, рассчитанным в зависимости от роста, массы тела, половой принадлежности пациента и пр. Часть этапов процедуры автоматизирована.

Агрегометры тромбоцитов, автоматические и полуавтоматические. Применяются для качественного и количественного определения функции тромбоцитов. Принцип действия: индуктирование агрегации тромбоцитов путем добавления тромбоцитных агрегационных агентов. Прибор может работать на основе ряда технологий, в том числе фотометрии, электрического импеданса, турбидиметрии, люминесценции совместно с обработкой и визуальным воспроизведением данных.

Система микроскопического анализа клеток. Применяется для количественного микроскопического анализа крови, а также прочих клинических образцов. Путем использования прибора осуществляется изучение, подсчет, запись, оценка морфологических характеристик клеток и прочих биологических компонентов. Обычно в состав системы входят микроскоп, камера, монитор, пакет программного обеспечения. Возможно наличие дополнительного оборудования, в частности, для электрического воздействия на клетки.

Анализаторы гемоглобина лабораторные, автоматические и полуавтоматические. Применяются для определения концентрации гемоглобина. Работа основана на технологии колориметрии, электрометрии или фотометрии.

Анализаторы скорости оседания эритроцитов, автоматические и полуавтоматические. Применяются для определения СОЭ в антикоагулированном образце цельной крови.

Современные гематологические анализаторы позволяют расшифровать от 5 до 24 показателей крови.

Таблица 4

Обозначение основных показателей крови в современных гематологических анализаторах

Комплекс «Видео-Тест-Гем»

В качестве примера приводится один из видов автоматических анализаторов, подходящих для применения в клинической лабораторной диагностике, – это автоматизированный комплекс «Видео-Тест-Гем» российского производства. Данный комплекс дает возможность автоматизировать методы анализа крови. Применение автоматических анализаторов способствует повышению объективности данных и производительности. Забор крови может осуществляться как вручную, так и путем применения механических и автоматических устройств.

Возможности анализатора:

1. Автоматический просмотр мазка крови с возможностью выборки лейкоцитов, подсчета лейкоцитарной формулы, анализа эритроцитов, тромбоцитов, количественной оценки анизоцитоза и пойкилоцитоза.

2. Построение кривой Прайс-Джонса, определение характеристик эритроцитов: толщина, индекс сферичности, оптическая плотность, график распределения по форме, индекс овалоцитоза.

3. Подсчет тромбоцитов по Фонио, определение характеристик тромбоцитов: относительная концентрация, гистограмма распределения по площади.

4. Получение изображений клеток и возможность корректировки результатов специалистом.

5. Ввод изображений клеток костного мозга, подсчет миелограммы.

6. Сохранение результатов в базе данных, возможность дальнейшего вывода на печать.

Итак, компьютерный анализатор изображений позволяет оценить форму эритроцитов как количественно, так и качественно, способствует объективной оценке объектов, не зависящей от опыта и классификации врача, что упрощает диагностику отдельных патологических состояний.

Изменения картины крови при патологии

Различают 5 типов изменений в клеточном составе «белой крови» при различных заболеваниях.

1. Нейтрофильно-эозинопенический. Для него характерны увеличение содержания лейкоцитов, нейтрофилов; снижение моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов. Эти изменения регистрируются при онкологических заболеваниях, септических состояниях, пневмонии, перитоните.

2. Нейтрофильно-эозинофильный. Характеризуется лейкоцитозом, нейтрофильным сдвигом влево, эозинофилией, снижением количества лимфоцитов, моноцитов. Встречается при туберкулезе, лимфогранулематозе, скарлатине.

3. Нейтропенический. При этом выявляется увеличение количества лимфоцитов, уменьшение содержания нейтрофилов, «дегенеративный» сдвиг влево. Выявляется при многих инфекционных заболеваниях.

4. Реакции моноцитарные и лимфатические. Встречаются при инфекционных заболеваниях, сопровождаются лейкоцитозом, моноцитозм, лимфоцитозом.

5. Протозойный. Характеризуется лейкопенией, лимфопенией. Встречается при лейшманиозе, малярии.

Малярия. Малярийный плазмодий паразитирует в организме человека как в промежуточном хозяине, так как здесь протекает бесполая фаза его жизненного цикла. Она называется шизогонией. Вначале спорозоиты инвазируют гепатоциты. После разрушения гепатоцитов спорозоиты, которые преобразовались в мерозоиты, внедряются в эритроциты. Это так называемая эритроцитарная шизогония. После разрушения эритроцита мерозоиты выходят в русло крови, при этом часть паразитов, не подвергшихся фагоцитозу, заражает новые эритроциты, и цикл шизогонии повторяется.

Лабораторная диагностика проводится путем микроскопического исследования мазков крови больного, окрашенных по Романовскому – Гимзе, а также препаратов, приготовленных методом «толстой капли» и «тонкого мазка». При этом дифференциация видов плазмодиев основана на морфологических особенностях паразитов, а также пораженных эритроцитов. В ряде случаев используется серодиагностика (реакция иммунофлюоресценции, пассивной гемагглютинации, иммуноферментный анализ).

Крупозная пневмония. Наблюдаются лейкоцитоз с нейтрофилезом, сдвиг лейкоцитарной формулы влево до метамиелоцитов. Иногда могут встретиться миелоциты. В нейтрофилах появляется токсигенная зернистость, которая исчезает после кризиса. Относительная лимфоцитопения, эозинопения; скорость оседания эритроцитов увеличена.

Сепсис. Гнойные заболевания (флегмона, остеомиелит, абсцессы). Характерен высокий лейкоцитоз, нейтрофилез со сдвигом влево до метамиелоцитов и миелоцитов. Индекс сдвига достигает 0,3–0,4. Резко выражены токсигенная зернистость нейтрофилов, эозинофилия. В крайне тяжелых случаях лейкоцитоз сменяется лейкопенией с нейтрофилезным ядерным сдвигом влево. Возникает тромбоцитопения. В красной крови снижается количество эритроцитов и гемоглобина; наблюдается значительное увеличение скорости оседания эритроцитов.

Брюшной тиф. Характерна нейтропения, наступающая на 2-й неделе болезни. Одновременно нарастает относительное число лимфоцитов. Лимфоцитоз и нейтропения со сдвигом влево держатся до конца болезни. Анэозинофилия. Появление эозинофилов рассматривается как благоприятный признак. Снижается количество тромбоцитов. С течением болезни нарастает скорость оседания эритроцитов.

Скарлатина. Наблюдаются нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево и токсикогенная зернистость в нейтрофилах, моноцитоз и лимфоцитопения. Заболевание протекает с эозинофилией, достигающей иногда больших цифр. С исчезновением сыпи прекращается и эозинофилия.

Коклюш. Появляется высокий лейкоцитоз с абсолютным лимфоцитозом и моноцитозом. У маленьких детей может наступить лейкемоидная реакция с количеством лейкоцитов до 50 млн в 1 мкл крови и высоким содержанием лимфоцитов.

Грипп. Заболевание протекает с нормальным количеством лейкоцитов или лейкопенией. При этом наблюдается нейтропения с умеренным сдвигом влево. Индекс сдвига до 0,1–0,2. Умеренный относительный лимфоцитоз, снижение количества эозинофилов.

Злокачественные новообразования. Типичные изменения в крови наступают на поздних стадиях заболевания и отчасти зависят от локализации опухоли. Характерны наличие умеренного лейкоцитоза с нейтрофилезом без левого сдвига, моноцитоз, тромбоцитоз. Наблюдается снижение количества эритроцитов и гемоглобина. Скорость оседания эритроцитов резко увеличена.

Острая лучевая болезнь. В первые часы после облучения появляется нейтрофильный лейкоцитоз, в тяжелых случаях быстро сменяющийся лейкопенией с нейтрофилезом. Скорость оседания эритроцитов обычно несколько замедлена. В период разгара болезни наступает резкое угнетение функции костного мозга, что проявляется в подавлении всех источников кроветворения. В периферической крови отмечается лейкопения с нейтропенией и токсикогенной зернистостью нейтрофилов. Катастрофически падает количество эритроцитов и гемоглобина. Количество тромбоцитов снижается до единичных в препарате.

Хроническая лучевая болезнь. В раннем периоде изменения количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов непостоянны. Часто наблюдаются нейтрофильный лейкоцитоз, умеренная эозинофилия, моноцитоз. В разгар заболевания наступает стойкая лейкопения с относительным лимфоцитозом. При этом в единице объема крови количество лимфоцитов и нейтрофилов снижено. Развивается эозинопения. Падает число эритроцитов и тромбоцитов. Развивается панцитопения.

К заболеваниям кроветворного аппарата относятся апластические анемии. Апластическая анемия – это синдром, характеризующийся снижением количества кроветворных элементов в костном мозге и резкой панцитопенией в периферической крови, что является следствием угнетения кроветворения в костном мозге. Заболевание начинается с анемии, затем присоединяются тромбоцитопения и агранулоцитоз.

Апластические анемии могут возникнуть после приема некоторых лекарств, являющихся аллергенами (амидопирина, некоторых антибиотиков), а также длительного воздействия ряда химических веществ (бензола), оказывающих токсическое воздействие на костный мозг. Развитию апластической анемии способствуют хронические заболевания (туберкулез, сифилис) и длительное применение при них лекарственных препаратов, а также вирусная инфекция (инфекционный гепатит). Ионизирующая радиация также является фактором, вызывающим аплазию костного мозга. Апластические анемии, причины возникновения которых не выяснены, называют идиопатическими. Считается, что одной из причин апластической анемии является уменьшение количества стволовых клеток. Апластические состояния бывают и конституциональными, передающимися по наследству.

Гематологическими признаками аплазии костного мозга являются выраженная анемия (концентрация гемоглобина падает до 20–30 г/л), лейкопения (нейтропения с относительным лимфоцитозом) и тромбоцитопения, иногда до полного исчезновения тромбоцитов. Анемия чаще нормохромная и макроцитарная, число ретикулоцитов снижено. Во многих случаях наблюдается повышение уровня фетального гемоглобина (НbF составляет до 15 % общего гемоглобина), и обычным является повышение уровня эритропоэтина. Основной признак – рефрактерная к лечению анемия. Пункционная биопсия костного мозга показывает малое количество ядросодержащих клеток.

Гемобластозы – опухолевые заболевания кроветворной ткани – разделяются на 2 группы: формы с диффузным поражением костного мозга и формы, характеризующиеся первоначальным внекостномозговым опухолевым ростом. Первые обозначают как лейкозы, вторые – лимфомы (лимфосаркомы).

Лейкозы делят на острые и хронические. Морфологический субстрат острого лейкоза составляют молодые клетки (бластные формы 2–3-го класса предшественников или клетки 4-го класса), основная масса опухоли при хроническом лейкозе представлена зрелыми и созревающими клетками. Названия разным формам острого лейкоза даны соответственно нормальным гомологичным костномозговым предшественникам (лимфобластам, миелобластам и т. д.). Хронические лейкозы обозначают по названию тех зрелых и созревающих клеток, которые характеризуют опухолевую пролиферацию. Морфологические классификации внекостномозговых опухолей разделяют на 2 группы: лимфогранулематоз (болезнь Ходжкина) и неходжкинские лимфомы.

Лейкозные клетки отличаются от нормальных гомологичных клеток рядом морфологических, химических, цитогенетических особенностей.

Бластные клетки могут быть значительно увеличены в размере (в 2–3 раза) или уменьшены до размера лимфоцита; характерен анизоцитоз. Контуры ядра нередко деформированы, количество хроматина увеличено и распределено неравномерно. Отмечаются вакуолизация ядра, его сегментация, многоядерность. В костном мозге увеличено количество клеток в стадии митоза. Число нуклеол часто увеличено (до 8 и более), размер их может достигать 1/3–1/2 диаметра ядра. Отмечаются повышенная базофилия цитоплазмы, ее вакуолизация. Нередко обнаруживаются выраженная азурофильная зернистость и тельца Ауэра.

Цитохимические показатели, используемые для дифференцировки различных форм лейкозов:

1) активность миелопероксидазы определяют при дифференцировке острых миелобластных лейкозов. Миелопероксидаза выявляется в гранулоцитах, у части моноцитов. Клетки миелоидного ряда проявляют пероксидазную активность, начиная с некоторых миелобластов; лимфоциты дают строго отрицательную реакцию;

2) для лейкемических лимфобластов характерна отрицательная реакция на липиды, для миелобластов – положительная;

3) гликоген содержится во всех клетках в большем или меньшем количестве. Он обнаруживается преимущественно в зрелых гранулоцитах. В миелобластах гликоген или вовсе не содержится, или представлен в виде гомогенной массы розового цвета при окраске фуксином, входящим в состав реактива Шиффа. В лимфоцитах гликоген выявляется в виде гранул красного цвета. Его содержание повышается при хроническом лимфатическом или остром лимфобластном лейкозах;

4) активность неспецифической эстеразы в разной степени выявляется во всех лейкоцитах, максимально – в незрелых гранулоцитах и моноцитах. Моноциты и их предшественники дают самую интенсивную реакцию на α-нафтилэстеразу. Это позволяет отличать моноциты и служит критерием диагностики острого монобластного лейкоза. Хлорацетат-эстераза выявляется во всех клетках миелоидного ряда, но особенно в промиелоцитах, что позволяет дифференцировать промиелоцитарный вариант острого миелобластного лейкоза;

5) активность кислой фосфатазы повышается при остром монобластном, остром миелобластном и промиелоцитарном лейкозах;

6) высокое содержание лизоцима в крови и моче характерно для хронического моноцитарного и острого монобластного лейкозов;

7) при хроническом миелолейкозе активность щелочной фосфатазы снижается, тогда как при эритремии, лейкемоидных, миелоидных реакциях и нагноениях количество обладающих активностью фермента гранулоцитов и уровень ее в каждом из них повышаются. Увеличение активности щелочной фосфатазы в гранулоцитах при остром лейкозе является благоприятным признаком.

Для всех форм лейкозов характерно резкое изменение кроветворения, т. е. полное или почти полное замещение нормальной ткани патологической тканью опухоли. Бластные клетки теряют способность к созреванию. В периферической крови появляются бластные формы: миелобласты, лимфобласты, эритробласты и др. Морфологически бластные клетки мало отличаются друг от друга, поэтому для их дифференцировки применяются цитохимические методы. В мазке периферической крови и костного мозга преобладают бласты (до 99 %), но встречаются и единичные зрелые клетки (1–5 %). Созревающих клеток, промежуточных между ними, нет. Это явление называется лейкемическим зиянием и характерно только для острых лейкозов. Острый лейкоз часто протекает с лейкоцитозом (до 100–300 тыс. в 1 мкл). Однако это заболевание может сопровождаться лейкопенией (до 200–300 в 1 мкл). Вследствие разрастания опухолевой ткани угнетаются эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения.

Хронические лейкозы характеризуются меньшей степенью анаплазии, чем острые. Субстрат опухоли представлен созревающими и зрелыми клетками. В отличие от острого лейкоза бластных форм в периферической крови мало. Они появляются главным образом при обострении заболевания. Общим признаком хронических лейкозов служит лейкоцитоз.

Исследование физико-химических свойств крови

Определение вязкости крови. Определение вязкости крови основано на сравнении скорости продвижения крови и дистиллированной воды в одинаковых капиллярах в вакууме при комнатной температуре. Определение проводится в приборе вискозиметре.

В правую капиллярную пипетку вискозиметра набирают дистиллированную воду до отметки «0». В левый капилляр насасывают кровь из пальца также до нулевой отметки. Проворачивают трехходовой кран таким образом, чтобы соединить обе капиллярные пипетки с резиновой трубкой, через которую втягивают воздух из обеих пипеток для образования вакуума. При этом столбики воды и крови продвигаются вперед с разной скоростью, которая зависит от вязкости. Как только столбик крови дойдет до отметки «1», втягивание воздуха прекращают. За это время вода, обладающая меньшей вязкостью, продвигается значительно дальше, чем кровь. Вязкость крови определяют по длине пути, пройденного водой, который отсчитывается по шкале градуированной пипетки. Вязкость крови в норме для мужчин равна 4,3–5,4, а для женщин – 3,9–4,9 делений шкалы.

Наблюдается зависимость вязкости крови от количества и объема эритроцитов, общего содержания белка и соотношения его фракций в плазме, а также от содержания в крови углекислоты. Повышение вязкости отмечается при сгущении крови и некоторых видах лейкозов (эритремии, миелофиброзах), понижение – при анемиях.

Определение скорости оседания эритроцитов осуществляется микрометодом в модификации Панченкова. Определение производят в специальных градуированных капиллярах, имеющих просвет 1 мм и длину 100 мм. Пипетку предварительно промывают 3,7 %-ным раствором цитрата натрия, затем набирают этот раствор в пипетку до отметки «70» (30 мкл) и выливают на дно пробирки Видаля. Кровь из пальца насасывают тем же капилляром – сначала целый капилляр, затем еще до отметки «80» (120 мкл). Количество цитрата и крови может быть разное – 25 мкл цитрата и 100 мкл крови, 50 мкл цитрата и 200 мкл крови, но соотношение их должно быть обязательно 1: 4. Кровь помещают в пробирку с цитратом и после тщательного перемешивания вновь набирают в капиллярную пипетку до метки «0». Капилляр с цитратной кровью ставят в штатив вертикально между двумя резиновыми прокладками и оставляют на 1 ч. Затем определяют величину оседания по столбику плазмы над осевшими эритроцитами. Деление капиллярной пипетки, соответствующее границе плазмы и эритроцитов, записывают как величину скорости оседания эритроцитов в миллиметрах в час (мм/ч).

В последние годы применяется международный метод определения СОЭ – метод Вестергрена с использованием капилляров длиной 200 мм. Также все более широкое применение находят автоматические и полуавтоматические анализаторы параметров крови.

Скорость оседания эритроцитов в норме меняется в зависимости от возраста и пола. У новорожденных скорость оседания эритроцитов редко выше 2 мм/ч; дети имеют более низкую скорость оседания (1–8 мм/ч), чем взрослые, а лица среднего возраста – меньше, чем старики. У мужчин скорость оседания эритроцитов более низкая (в среднем 5 мм/ч, колебания от 1 до 10 мм/ч), чем у женщин (в среднем 9 мм/ч, колебания от 2 до 15 мм/ч).

При определении по Вестенгрену СОЭ – до 20 мм/ч.

Поскольку скорость оседания эритроцитов зависит в основном от белковых сдвигов (увеличения содержания фибриногена, α_2-глобулинов, γ-глобулинов), то увеличение скорости оседания эритроцитов наблюдается при всех состояниях, сопровождающихся воспалением, деструкцией соединительной ткани, тканевым некрозом, иммунными нарушениями.

Определение гематокрита. Гематокрит (Ht) – это соотношение между объемом форменных элементов крови и объемом плазмы. Метод основан на разделении плазмы и эритроцитов с помощью центрифугирования. Определение производят в гематокрической трубке, представляющей собой стеклянную пипетку, разделенную на 100 равных частей. Перед взятием крови гематокрическую трубку промывают раствором гепарина или щавелевокислых солей (0,82 г оксалата калия, 1,2 г оксалата аммония и 100 мл дистиллированной воды). Затем набирают в трубку капиллярную кровь до отметки «100», закрывают резиновым колпачком и центрифугируют в течение 1–1,5 ч при 1,5 тыс. об./мин. После этого отмечают, какую часть в градуированной трубке составляют эритроциты.

Гематокритную величину определяют с помощью отсчетной шкалы, прилагаемой к центрифуге. В норме объем массы эритроцитов меньше объема плазмы. Гематокритная величина у женщин составляет 36–42 %, у мужчин – 40–48 %. Увеличение гематокрита наблюдается при эритремии и обезвоживании организма, уменьшение – при анемиях. Величиной гематокрита пользуются для Расчета массы эритроцитов, циркулирующих в крови, и некоторых других показателей крови, например средней процентной концентрации гемоглобина в одном эритроците и среднего объема одного эритроцита. Практически средний объем одного эритроцита определяют по формулам:

1) величину гематокрита в объемных процентах умножают на 10, затем делят на число миллионов эритроцитов в 1 мкл крови;

2) величину гематокрита, умноженную на 100, затем также делят на число миллионов эритроцитов в 1 мкл крови.

В современных гематологических счетчиках Ht является вторичным параметром, выводимым из количества эритроцитов и их объема. Гематокрит равен содержанию эритроцитов в крови, умноженному на средний объем эритроцитов.

Определение резистентности эритроцитов. Резистентность – свойство эритроцитов противостоять разрушительным воздействиям: осмотическим, механическим, тепловым и др. В клинике наибольшее значение приобрело определение осмотической резистентности. Эритроциты в гипертонических солевых растворах сморщиваются, а в гипотонических – набухают. При значительном набухании наступает гемолиз. Готовят в пробирках растворы хлорида натрия различной концентрации (от 0,7 до 0,22 %), затем вносят в них один и тот же объем крови (0,02 мл) и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Через 1 ч пробирки центрифугируют и определяют начало гемолиза по легкому порозовению раствора и полный гемолиз – по интенсивной красно-лаковой окраске раствора. В норме минимальная резистентность у взрослых людей колеблется между 0,48–0,46 % NaCl, максимальная – между 0,34–0,32 % NaCl.

Осмотическая резистентность лейкоцитов. Определение осмотической стойкости лейкоцитов (по Сторти и Кучере). После контакта с гипотоническим раствором хлористого натрия лейкоциты окрашивают и затем подсчитывают неразрушенные формы. Для этого используют 0,2 %-ный раствор NaCl, метилрозанилин (1 %-ный водный раствор) – 1,5 мл или метилвиолет той же концентрации и объема, уксусную кислоту ледяную – 1,0 мл, дистиллированную воду – 20 мл. 0,1 мл крови из пальца смешивают в пробирке с 0,9 мл хлористого натрия. Перед подсчетом в камере Горяева 0,1 мл полученной взвеси смешивают с 0,1 мл метилрозанилина или метилвиолета. После повторного взбалтывания заполняют камеру. Подсчет неразрушенных клеток производится через 30, 60, 120 и 180 мин.

У здоровых людей ненарушенными спустя 30, 60, 120 и 180 мин остаются в среднем 94, 82, 43 и 26 % полинуклеаров и соответственно 86, 68, 42 и 25 % мононуклеаров. При сепсисе, пневмонии стрептококковой этиологии наблюдается понижение осмотической стойкости полинуклеаров с последующей нормализацией в период ремиссии. Повышение осмотической стойкости полинуклеаров отмечено при гриппозной пневмонии и в отдельных случаях при злокачественных новообразованиях.

Исследование коагуляции

Плазменные факторы свертывания крови

Фактор I – фибриноген – белок, находящийся в плазме в растворенном состоянии. В процессе свертывания крови он становится нерастворимым, образуя фибрин.

Фактор II – протромбин – белок плазмы, неактивный предшественник тромбина. Тромбин (IIа) способствует превращению фибриногена в фибрин, активирует тромбоциты, из которых под его влиянием освобождаются клеточные факторы свертывания.

Фактор III – тканевой тромбопластин (тканевой фактор) – липопротеид, который освобождается при повреждении тканей. Поступая в плазму крови, он воздействует на протромбин, превращая его в тромбин. Аналогичным действием обладает тромбокиназа плазмы.

Фактор IV – ионизированный кальций.

Фактор V – проакцелерин, Ас-глобулин, лабильный фактор, акцелератор превращения протромбина.

Фактор VI – акцелерин – белок глобулиновой природы, ускоряющий превращение протромбина в тромбин.

Фактор VII – проконвертин, стабильный фактор, неактивная форма фермента конвертина.

Фактор VIII – антигемофильный глобулин, участвующий в образовании тромбокиназы.

Фактор IX – фактор Кристмаса, антигемофильный глобулин-В, катализирует образование тромбокиназы.

Фактор Х – фактор Стюарта – Прауэра, участвует в образовании тромбокиназы и непосредственно в превращении протромбина в тромбин.

Фактор ХI – фактор Розенталя, ускоряет образование тромбокиназы.

Фактор XII – фактор Хагемана, контактный фактор.

Фактор ХIII – фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, участвует в переходе растворимого фибрина в нерастворимую форму.

Кроме плазменных, в свертывании участвует ряд клеточных факторов, выделяемых форменными элементами крови. Первостепенную роль играют тромбоцитарные факторы. Обозначаются они как Р1, 2, 3, 4, РII. При агрегации тромбоцитов из них выделяются вещества, которые ускоряют процесс свертывания крови. Наибольшее значение для свертывания имеет тромбоцитарный фактор 3 (фосфолипид).

Большинство из вышеперечисленных ферментов синтезируется в печени. Для синтеза факторов II, VII, IX и Х необходим витамин К.

Свертывание крови условно протекает в 3 фазы.

Фаза 1 – формирование активной протромбокиназы.

Имеются 2 механизма активации свертывания крови – внешний (при поступлении в кровь тканевого тромбопластина) и внутренний (без тканевого тромбопластина).

При внешнем механизме активации фактор III (из поврежденных тканей или разрушенных форменных элементов) вступает во взаимодействие с фактором VII и в присутствии ионов кальция быстро образует активатор фактора Х. Активированный фактор Х (Ха) в комплексе с фактором V, фактором 3 тромбоцитов и ионами кальция трансформирует протромбин.

Во внутреннем механизме участвуют факторы ХII, ХI, IХ, VIII наряду с факторами Х, V, тромбоцитарным фосфолипидом и ионами кальция, которые являются общими для обоих механизмов. Каскад свертывания состоит в следующем: контакт крови с чужеродной поверхностью (например, стекло пробирки при запуске механизма in vitro) активирует фактор XII, который активирует фактор ХI, тот, в свою очередь, фактор IХ. Активированный фактор IХ (IХа) в присутствии фосфолипида, ионов кальция и фактора VIII активирует фактор Х. Активированный фактор Х (Ха) в сочетании с фосфолипидом, фактором V и кальцием (протромбокиназа) участвует в превращении протромбина.

Фаза 2 – тромбинообразование – состоит в превращении протромбина в тромбин под влиянием активного комплекса протромбокиназы. В основе превращения протромбина лежит расщепление его молекулы на фракции, одна из которых с молекулярной массой 37 тыс. переводится фактором Ха в тромбин. Реакция требует наличия ионов кальция и ускоряется в присутствии фактора V и фосфолипида.

Фаза 3 – фибринообразование – состоит в превращении фибриногена в фибрин при участии тромбина. Тромбин отщепляет от фибриногена по два пептида А и В, что ведет к полимеризации оставшихся фибрин-мономеров с образованием фибрин-полимера, растворимого в мочевине. Стабилизация молекулы фибрина происходит под влиянием активированного тромбином фактора ХIIIа и состоит в формировании поперечных глютамин-лизиновых связей между единицами фибрина, в результате чего образуется прочная (не растворимая в мочевине, монохлоруксусной кислоте и других растворителях) фибриновая сетка.

Наиболее общее представление о коагуляции дает время свертывания цельной крови. Простым и удобным является метод Моравица: на часовое стекло наносят каплю крови, взятой из пальца или мочки уха, диаметром 4–6 мм. Тонким запаянным стеклянным капилляром проводят каждые 30 с по поверхности капли. Время свертывания определяют в момент появления первых фибриновых нитей, тянущихся за капилляром.

В методе Ли – Уайта используют венозную кровь. Пробирку с 1 мл венозной крови устанавливают на водяной бане при 37 °C и включают секундомер. Через каждые 30 с пробирку наклоняют под углом 45°. Время от момента взятия крови до появления сгустка является временем свертывания крови. У здоровых людей время свертывания цельной крови составляет 5–8 мин.

Общую оценку конечного этапа свертывания крови дает тромбиновое время, т. е. время свертывания цитратной плазмы крови под влиянием стандартной дозы тромбина.

Метод Сирман в модификации Рутберга. В пластиковую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой крови, добавляют 0,1 мл подогретого до 37 °C изотонического раствора хлорида натрия и инкубируют смесь в течение 60 с при 37 °C. Затем вносят 0,1 мл стандартизированного раствора тромбина (раствор тромбина такой активности, который в смеси с равным объемом донорской плазмы вызывает свертывание последней за 15 с), включают секундомер и отмечают время свертывания плазмы крови. В норме тромбиновое время равно 14–16 с.

Метод определения фибриногена по Рутбергу. К 1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл 5%-ного раствора хлорида кальция и 0,1 мл раствора тромбина (активность – 15 с). Образовавшийся сгусток переносят на обеззоленный бумажный фильтр и просушивают другим фильтром до сухого состояния. Взвешивают сухой фибрин на торсионных весах. В норме масса сухого фибрина – 9–12 мг. Для Расчета концентрации фибриногена в плазме крови массу сгустка умножают на экспериментально установленный коэффициент 22,2. В норме концентрация фибриногена в крови равна 0,2–0,4 г в 100 мл.

Для выявления заблокированных продуктов деградации фибриногена (ПДФ) и фибрин-мономеров, что характерно для диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС- синдром), применяют так называемые паракоагуляционные пробы (этаноловую, протамин-сульфатную, β-нафтоловую) и тесты с протеазами из некоторых змеиных ядов.

Тест на толерантность плазмы к протамин-сульфату. В 1-й пробирке проводят определение времени свертывания цитратной плазмы крови под влиянием тромбина (тромбиновое время), во 2-й – то же определение, но после добавления равного объема (0,1 мл) 0,01 %-ного раствора протамин-сульфата. Разница во времени свертывания плазмы крови в 1-й и 2-й пробирках в норме составляет 7–10 с. Увеличение этой разницы (более 7–10 с) свидетельствует об увеличении в крови гепарина (протамин-сульфат обладает способностью связывать свободный гепарин) и других антитромбинов.

Если конечный этап свертывания не нарушен (тромбиновое время нормально), то раздельно оценивают внешний и внутренний механизмы активации свертывания (формирование протромбиназы, трансформирующей протромбин в тромбин). Внешний механизм суммарно оценивают с помощью теста протромбинового времени по Квику (времени свертывания рекальцинированной цитратной плазмы при добавлении к ней тканевого тромбопластина стандартизированной активности).

Метод Квика. В пробирку вносят 0,1 мл испытуемой плазмы крови, 0,1 мл суспензии тромбопластина (активность тромбопластина тестируется на нормальной донорской плазме), ставят в водяную баню при 37 °C на 60 с. Затем приливают 0,1 мл 0,025 г хлорида кальция и включают секундомер. Отмечают время свертывания крови. Опыт повторяют 2–3 раза и определяют средний показатель.

Протромбиновое время при стандартизированном тромбопластине в норме составляет 12–15 с. Поскольку могут быть отклонения в активности отдельных серий тромбопластина, то прибегают к вычислению протромбинового индекса по формуле:

А / В × 100,

где А – протромбиновое время плазмы крови донора;

В – протромбиновое время исследуемого лица.

В норме этот показатель равен 80–100 %.

При нормальном тромбиновом времени нарушения внешнего механизма могут быть обусловлены дефицитом факторов VII, Х, V или II, поскольку все они определяются протромбиновым временем. При нормальном тромбиновом и протромбиновом времени нарушения внутреннего механизма свертывания зависят только от факторов ХII, ХI, IХ и VII. Для оценки внутреннего пути активации свертывания крови используют общие коагуляционные тесты: время свертывания цельной крови, парциальное (частичное) тромбопластическое время (или каолин-кефалиновое время), аутокоагуляционный тест.

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы крови в стандартных условиях, создаваемых внесением каолина – активатора ХII фактора и кефалина – аналога 3-тромбоцитарного фактора, для исключения влияния тромбоцитов на результат исследования (метод Proctor с соавторами). В пластиковую пробирку вносят 0,1 мл бедной тромбоцитами цитратной плазмы, 0,1 мл каолин-кефалиновой суспензии, смешивают и инкубируют при 37 °C в течение 3 мин. Добавляют 0,025 г хлорида кальция равного объема (0,1 мл), подогретого до 37 °C, и включают секундомер. Отмечают время образования сгустка. В норме активированное частичное тромбопластиновое время составляет 30–40 с.

Аутокоагуляционный тест (АКТ) (по Беркарду с соавторами). Стандартизация фосфолипидной и контактной активации начальной фазы процесса свертывания осуществляется добавлением к рекальцинированной плазме крови гемолизата эритроцитов исследуемого больного (аутотест).

По данным, полученным через 2–6–8–10–20–30–40–50–60 мин после добавления гемолизат-кальциевой смеси, строят график, восходящая часть которого отражает динамику нарастания активности тромбопластина и тромбина, нисходящая часть – скорость инактивации тромбина за счет антитромбинов и продуктов фибринолиза.

Коагулограмма: основные показания

Коагулограмма, или гемостазиограмма, представляет собой лабораторный анализ на свертываемость крови. Виды:

– простая (базовая, скрининговая, стандартная). Способствует выявлению/исключения нарушений в функционировании системы коагуляции. Включает в себя протромбин по Квику или ПТИ (протромбиновый индекс), МНО (международное нормализованное отношение), фибриноген, АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время), ТВ (тромбиновое время);

– развернутая (расширенная). Позволяет отследить не только наличие качественных изменений, но и количественные показатели параметров коагуляции. Помимо показаний базового исследования, включает антитромбин III, D-димер, ряд стандартных коагулограмм.

Таблица 5

Основные показатели коагулограммы в состоянии нормы

Исследование фибринолиза

Противосвертывающие механизмы представлены двумя группами антикоагулянтов: физиологическими, которые образуются независимо от свертывания крови и фибринолиза, и антикоагулянтами, образующимися в процессе свертывания крови и фибринолиза. К первым относятся антитромбокиназы (антитромбопластины), антитромбины, гепарин и др. Все они оказывают ингибирующее влияние на различные фазы процесса свертывания крови. Антитромбокиназы тормозят начальную фазу свертывания крови и угнетают активность образовавшейся тромбокиназы. Антитромбины замедляют переход протромбина в тромбин и препятствуют воздействию тромбина на фибриноген. Гепарин нарушает образование тромбокиназ, инактивирует тромбин, связывает фибриноген, т. е. тормозит все фазы процесса свертывания. Ко второй группе антикоагулянтов относятся вещества, которые образуются в результате свертывания крови и фибринолиза и обладают аникоагулянтным действием. Ингибиторные механизмы существуют на каждой фазе свертывания крови. Известную роль в предотвращении вступления тромбоцитов и контактных факторов свертывания в процесс коагуляции играет нормальный эндотелий сосудов.

Для приготовления дефибринированной крови наиболее часто используют трикалевую (дикалевую) соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), тринатрий-цитрат и гепарин. Первые два вещества ингибируют коагуляцию путем удаления кальция из крови.

Из известных антикоагулянтов 1-й фазы свертывания наибольшее физиологическое значение имеют ингибитор активированного фактора ХI (ХIа), относящийся к α-2-глобулинам, и антитромбопластины (ингибиторы комплекса фактор III – фактор VIIа). К ингибиторам 2-й фазы коагуляции относится антитромбин II – α-2-глобулин крови; ингибирует не только тромбин, но и другие активированные факторы свертывания – Ха, IХа, ХIа, ХIIа, калликреин. На антитромбин III приходится большая часть спонтанной антикоагулянтной активности, что определяет его ведущую роль в поддержании жидкого состояния крови и предупреждении тромбозов. Доля других естественных антитромбинов – α-2-макроглобулина и α-1-антитрипсина – составляет лишь около 25 % антикоагулянтной активности дефибринированной плазмы крови.

Фибринолиз осуществляется протеолитической ферментной системой крови – плазмогеплазмином. Превращение плазминогена в активную форму происходит с помощью активаторов, которые находятся в плазме крови, моче, различных тканях, образуясь в эндотелии сосудов. Обнаруживаемый в моче активатор (урокиназа) продуцируется почкой. Способностью активировать плазминоген обладают и некоторые продукты бактериального происхождения, в частности стрептокиназа.

Под влиянием активаторов происходит ферментативное расщепление молекулы плазминогена, и образуется плазмин, обладающий выраженным протеолитическим свойством в отношении фибрин-фибриногена (кроме того, факторов VII, V, комплемента, некоторых гормонов). Лизис фибриногена происходит в несколько этапов. Вначале после отделения мелких фрагментов А, В, С формируется высокомолекулярная Х-фракция. Затем она расщепляется на D- и Y-фракции. В дальнейшем Y-фракция расщепляется на вторую D- и дополнительную Е-фракцию. D- и Е-фракции – это конечные продукты деградации фибриногена. Деградация плазмином растворимого фибрина сходна с таковой фибриногена, за исключением того, что на первом этапе отсутствуют мелкие фрагменты. Деградация стабилизированного фибрина отличается образованием вместо D-фракции двойного по размеру фрагмента-D-димера.

Ферментативный фибринолиз поддерживают комплексные соединения гепарина с фибриногеном, адреналином, мочевиной, плазмогеном, обладающие способностью лизировать нестабилизированные сгустки фибрина (неферментативный фибринолиз). Фибрин может лизироваться протеазами, выделяемыми лейкоцитами, которые участвуют в фибринолизе также благодаря освобождению лейкоцитарных активаторов плазминогена и фагоцитозу продуктов расщепления фибрина.

Терапевтическую стимуляцию фибринолиза проводят с помощью ферментов бактериального происхождения (стрептокиназы и др.) или урокиназы.

Представление о фибринолитической активности крови дает ее определение эуглобулиновым методом. Метод Ковальского – осаждение в кислой среде и при низкой температуре эуглобулиновой фракции, содержащей факторы свертывания крови и фибринолиза, главным образом плазминоген. 0,1 мл оксалатной плазмы (1: 9) помещают в центрифужную пробирку, добавляют 1,8 мл кислой воды (рН 5,2), пробирку ставят в холодильник при 4 °C (при этом из плазмы выпадает эуглобулиновая фракция). Через 30 мин пробирку вынимают и центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость отсасывают, к осадку приливают 0,1 мл бората натрия и ставят в термостат при 37 °C на несколько минут до полного растворения осадка. Добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция (содержащийся в эуглобиновой фракции фибриноген превращается в фибрин). Засекают время образования сгустка и ставят пробирку в термостат до полного лизиса сгустка. Время от момента образования сгустка до его растворения выражает фибринолитическую активность крови, которая в норме равна 3–4 ч.

Применяют методы исследования фибринолиза, основанные на дополнительной стандартизированной активации его стрептокиназой, а также методы выявления в плазме крови продуктов фибринолиза – ПДФ (иммунологические и химические) и их соединений с фибрин-мономерами и фибриногеном (паракоагуляционные пробы), методы исследования неферментативного фибринолиза по Б. А. Кудряшову.

Анализаторы свертывания крови

В лабораторной практике широко применяются коагулологические анализаторы, действующие в автоматическом и полуавтоматическом режиме.

Коагулометры лабораторные, автоматические и полуавтоматические. Применяются для качественного и количественного определения одного или нескольких факторов коагуляции, задействованных в гемостазе. В частности, может быть определено тромбиновое, частичное тромбопластиновое время. Принцип работы может быть основан на нескольких методах: спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, электрометрии, механическом средстве контроля образования сгустка.

Приборы данного типа отличаются высокой производительностью и точностью полученных результатов. Для их работы требуется минимальное количество биологического материала. При работе с полуавтоматическими и автоматическими приборами исключается человеческий фактор (вероятность ошибки).

Иммунологические реакции

Иммунологические реакции используются для выявления специфических антител, идентификации возбудителей и других антигенов, определения групп крови и подбора адекватного донора при пересадках органов и тканей. Серологические реакции – реакции между антигенами и антителами in vitro – применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена соответственно. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые – преципитации. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Антигены, по которым отдельные индивидуумы или группы особей одного вида различаются между собой, являются изоантигенами. Изоантигены, генетически связанные, объединены в группы, получившие следующие названия: система АВО, резус и др. В плазме человека всегда содержатся естественные, полные, холодовые изоантитела к агглютиногенам А и В. Агглютинин анти-А – α-агглютинин, а агглютинин анти-В – β- агглютинин (табл. 6).

Таблица 6

Групповая принадлежность людей по системе АВО

Определение группы крови (определение агглютиногенов). Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток определяют групповые агглютиногены в эритроцитах. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива, имеющих по 3 гнезда, или в 1 штатив с двумя рядами гнезд. Слева направо ставят сыворотки групп 0 α-β (I), А β(II), В α(III). Отдельно ставят сыворотку АВ0(IV). Определение производят на белых пластинах или тарелках. На левой стороне делают надписи 0 α-β, в середине – А β, справа – В α. Под соответствующей надписью наносят по 0,1 мл каждой стандартной сыворотки отдельной для каждой сыворотки пипеткой. Кровь для исследования берут из пальца, 0,01 мл крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Перемешивают капли стандартной сыворотки с исследуемой кровью. После этого пластину покачивают, затем на 1–2 мин оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее 5 мин, несмотря на то что агглютинация начинается в течение первых 10–30 с, так как возможна поздняя агглютинация, например эритроцитами группы А2 (II). По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки в течение 5 мин, после чего оценивают результат. При положительной реакции в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки (агглютинанты), состоящие из склеенных эритроцитов. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается. В случае отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения (5 мин) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживаются агглютинанты. Результаты реакции в каплях с сыворотками одной группы обеих серий должны быть одинаковыми. Возможны различные комбинации реакций:

1) сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию – испытуемая кровь принадлежит к группе 0(I);

2) сыворотки групп 0 α-β(I) и В α(III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А β(II) – отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе А(II);

3) сыворотки группы 0 α-β(I) и А β(II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В α(III) – отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе В(III);

4) сыворотки всех групп дали положительную реакцию. В этом случае для исключения неспецифической агглютинации проводят дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0(IV).

Отсутствие агглютинации в капле этой сыворотки при наличии ее во всех остальных позволяет отнести кровь к группе АВ0(IV). Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0(IV) говорит о неспецифической агглютинации. В этих случаях нужно исследование повторить с отмытыми эритроцитами.

Определение полной групповой формулы крови (агглютиногенов и агглютининов). Одновременное определение групповых антигенов эритроцитов и агглютиногенов сыворотки позволяет установить полную групповую формулу исследуемой крови. Для этого берут 2 различные серии стандартных сывороток групп крови 0 α-β(I), А β(II), В α(III), АВ0(IV); 0,85 %– ный раствор хлорида натрия; стандартные эритроциты групп 0(I), А(II), В(III). В центрифужную пробирку, содержащую 0,25–0,5 мл 3,8 %-ного раствора цитрата натрия, добавляют 2–4 мл крови специально отобранных доноров, затем пробирку на 3/4 заполняют изотоническим раствором хлорида натрия. Перемешивают, центрифугируют и оставляют стоять до оседания эритроцитов. Отмытые стандартные эритроциты хранят в холодильнике. Срок годности – 2–3 дня. Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива. Отдельно ставят сыворотку группы АВ0(IV). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в отдельный штатив с тремя гнездами в следующем порядке: группа 0(I), А(II) и В(III). На пластинке делают надписи слева направо: 0 α-β, А β и В α для стандартных сывороток и 0, А и В – для стандартных эритроцитов. Под соответствующими обозначениями наносят по 1 большой капле всех стандартных сывороток и по 1 маленькой капле стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь для отделения сыворотки центрифугируют или оставляют стоять 20–30 мин. Исследуемую сыворотку по одной большой капле капают на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна эритроциты исследуемой крови и наносят их по 1 маленькой капле рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухими стеклянными палочками. Через 1 мин в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 мин.

Возможные варианты реакций:

1) реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие агглютиногенов, т. е. на принадлежность исследуемой крови к группе 0(I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0(I) и положительную – с эритроцитами групп А(II) и В(III);

2) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена А. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и А(II), но положительную – с эритроцитами группы В(III);

3) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и В(III), но положительную – с эритроцитами группы А(II);

4) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, т. е. не содержит агглютининов.

Определение резус-фактора методом конглютинации с применением желатина. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой-антирезус, содержащей неполные антитела-резус, в коллоидной среде – растворе желатина. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание – конглютинация, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь изотонического раствора хлорида натрия. Резус-отрицательные эритроциты не склеиваются.

Для реакции используют стандартные сыворотки-антирезус с неполными антителами двух различных серий (группа стандартной сыворотки должна быть совместима с группой исследуемой крови), 10 %-ный раствор желатина в ампулах заводского изготовления, 0,85 %-ный раствор хлорида натрия, 3,8 %-ный раствор цитрата натрия, стандартные эритроциты для контроля.

В одну пробирку вносят 0,05 мл исследуемых эритроцитов. В другую пробирку помещают 0,05 мл стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой кровью. В третью пробирку – по 0,05 мл стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл 10 %-ного раствора желатина, предварительно подогретого до 48 °C. Слегка встряхивают для перемешивания. После этого в первую пробирку вводят 0,1 мл сыворотки-антирезус одной серии, во вторую – по 0,1 мл сыворотки-антирезус второй серии. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и все пробирки помещают в водяную баню при 48 °C на 5 мин или термостат при той же температуре на 30 мин. После прогревания приливают по 8–10 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия, содержимое пробирок перемешивают и затем просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Когда кровь резус-положительна, в пробирке наблюдаются легко различимые красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на прозрачном, почти обесцвеченном фоне. Если эритроциты резус-отрицательны, в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки-антирезус. В контрольных образцах стандартные резус-положительные эритроциты одноименной группы или группы 0(I) с сывороткой-антирезус должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы – отрицательный. Кроме того, отрицательный результат должен быть также во всех пробирках третьего ряда, т. е. без сыворотки-антирезус.

Определение неполных антител. Как к изоантителам, так и к аутоантителам могут относиться тепловые антитела (оптимум действия при 37 °C), главным образом класса IgG. Они называются неполными, унивалентными и, покрывая поверхность эритроцитов, не вызывают их агглютинации в солевом растворе, однако могут склеивать эритроциты в среде с высокой концентрацией белка (альбумина или сыворотки). Тепловые антитела класса IgG редко обладают способностью фиксировать комплемент, вызывая лизис эритроцитов, т. е. выступать в качестве гемолизинов. Обычно эритроциты, покрытые антителами IgG, секвестрируются селезенкой, где они теряют часть оболочки, что приводит к фрагментации и сфероцитозу, или агглютинируют (в среде с высокой концентрацией белка) и захватываются макрофагами. Фиксированные на эритроцитах неполные антитела выявляются прямой пробой Кумбса (антиглобулиновой пробой).

Суть метода состоит в агглютинации эритроцитов, покрытых антителами класса IgG, антисывороткой кролика против γ-глобулина человека. Непрямая проба Кумбса определяет неполные антитела, содержащиеся в сыворотке крови и могущие быть как аутоантителами, так и изоантителами. В этой пробе эритроциты донора инкубируют с исследуемой сывороткой крови, затем отмывают и соединяют с антиглобулиновой сывороткой, т. е. проводят пробу Кумбса, с помощью которой устанавливают, имеются ли на поверхности донорских эритроцитов неполные антитела. При положительном варианте происходит агглютинация эритроцитов.

Определение ристомицин-агрегации (агглютинации) в богатой тромбоцитами исследуемой плазме отражает взаимодействие фактора Виллебранда (ФВ) с собственными тромбоцитами пациента. При исследовании in vitro ристомицин способствует связыванию ФВ с тромбоцитарным рецептором ГП1 в. Процесс агрегации, индуцируемый добавлением к богатой тромбоцитами исследуемой плазме стандартного количества ристомицина, регистрируется фотометрически по падению ее оптической плотности. Измерения проводятся в агрегометре или на модифицированном фотоэлектроколориметре, снабженном перемешивающим и записывающим устройствами. Ристомицин-агрегация тромбоцитов может снижаться как при качественных, так и при количественных дефектах ФВ.

Определение активности фактора Виллебранда (ристомицин-кофакторной активности – РКА) исследуемой плазмы основано на его способности вызывать в присутствии ристомицина агглютинацию нормальных донорских тромбоцитов. В классическом методе, предложенном H. I. Weiss, предлагается использование суспензии свежеприготовленных отмытых донорских тромбоцитов для измерений, проводимых в агрегометре. При этом взвесь отмытых и ресуспендированных донорских тромбоцитов должна иметь концентрацию около 250 × 10^9/л. В кювету агрегометра добавляют взвесь доведенной исследуемой бедной тромбоцитами плазмы и стандартизованное количество ристомицина. Последующий агрегационный процесс регистрируется в течение нескольких минут с помощью записи увеличения трансмиссии. Угол наклона полученной кривой пропорционален РКА исследуемого образца плазмы. РКА исследуемой плазмы определяется в процентах по калибровочной кривой зависимости максимального изменения трансмиссии за минуту от уровня РКА. Для ее построения используется серия разведений стандартной коммерческой или пулированной плазмы, в которых РКА соответствует 100, 50, 25 %-ному уровню.

В модификациях данного метода предусмотрено использование не свежих, а фиксированных формалином донорских тромбоцитов. Такая обработка тромбоцитов способствует длительному хранению их без потери рецепторов к ФВ. Для этого из донорской крови, взятой на ЭДТА-формалиновом растворе (соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в соотношении 9: 1, готовится бедная тромбоцитарная плазма. Полученный после ее удаления тромбоцитарный осадок дважды отмывается ЭДТА-буферным раствором и разводится в буфере до концентрации тромбоцитов 200–250 × 10^9/л. Полученный тромбоцитарный реагент может храниться.

В настоящее время коммерчески доступны тест-наборы, основанные на регистрации агглютинации лиофилизированных фиксированных тромбоцитов как методами агрегатометрии, так и слайд-тестами. Определение РКА в слайд-тестах требует меньших затрат времени и характеризуется более высокой точностью.

Иммуногематологические анализаторы

В настоящее время широко применяются автоматические и полуавтоматические иммуногематологические анализаторы, благодаря чему определение группы крови становится менее трудозатратным и более точным процессом.

Анализаторы групп крови/скрининг антител, автоматические и полуавтоматические. Применяются при предварительном определении группы крови накануне переливания, идентификации эритроцитарных антител, эритроцитарного фенотипирования донорских образцов для определения совместимости (перед переливанием, трансплантацией). В спектр анализов могут входить определение группы крови по системе AB0, резус-фактора и пр. Возможно задействование серологических методов с применением микропланшетов, кассет, технологий колоночной агглютинации.

Анализаторы иммуногематологические, автоматические и полуавтоматические. Применяются для определения группы крови, скрининга и идентификации антител, фенотипирования эритроцитов, прямых антиглобулиновых анализов, перекрестной совместимости клинических образцов. Работа основана на одном или нескольких иммунологических методах, в том числе на микропланшетной агглютинации, агглютинации в колонках, нефелометрии, ферментативной, фотометрической, радиометрической системе детектирования. В состав анализатора могут входить обработка проб, программы для обработки данных.

Глава 2

Биохимические методы исследования в клинической лабораторной диагностике

Техническое оснащение биохимических методов исследования в клинико-диагностических лабораториях

В настоящее время компьютеризация и автоматизация изменили характер работы клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений.

Выполнение практически всех биохимических и других видов лабораторных исследований становится возможным на автоанализаторах. Подключение их к компьютерам значительно облегчает формирование серии исследований для одного пациента, хранение в памяти результатов, подготовку ответа клиницисту и др.

Арсенал современных анализаторов и технических средств для проведения биохимических исследований разнообразен: стекло и посуда, вакуумные системы забора крови – Вакуэт, разнообразные дозирующие устройства, обычные и программируемые фотометры, высокопроизводительные биохимические анализаторы.

Появление новых методов анализа, новых совершенных технологий (одной из основных развивающихся технологий сегодня в клинической биохимии становится «сухая химия») способствует ежегодному обновлению на рынке лабораторного оборудования, постоянному изменению условий работы на нем известных фирм, появлению новых компаний, слиянию их между собой, быстрому решению сложных научно-технических проблем, не имеющих равных себе по сложности в других областях приборостроения.

Автоматизация выполнения лабораторных исследований изменила выпуск наборов реагентов для клинической лабораторной диагностики. В России начат серийный выпуск наборов реагентов. Все выпускаемые в настоящее время наборы реагентов, стандартные, контрольные, калибровочные образцы стандартизированы и зарегистрированы в Минздраве РФ.

Данные наборы перед регистрацией проходят серьезные испытания в ведущих лабораториях и медицинских центрах страны. Такая стандартизация позволяет получать в разных лабораториях сопоставимые результаты исследований.

Наборы контролируются системой Государственного контроля качества, в случаях несоответствия которой они могут быть сняты с производства. Лаборатории при наличии дефектов в работе наборов могут предъявлять рекламации фирме-изготовителю и требовать замены их на качественную продукцию.

Характеристика абсорбциометрических приборов

В клинико-диагностических лабораториях при исследовании показателей обмена используются фотометрические приборы.

Приборы проводят фотометрическое детектирование результатов: энергия светового потока измеряется с помощью фотодетектора, преобразующего световую энергию в электрический сигнал.

Фотометрические методы анализа делятся на следующие:

1) абсорбционный (поглощение раствором световой энергии);

2) нефелометрический (рассеяние световой энергии дисперсной средой);

3) флуориметрический (излучение раствором световой энергии, вызванной световой энергией возбуждения);

4) рефлектометрия (измерение интенсивности энергии, отраженной от твердофазной среды);

5) турбидиметрический (сочетание поглощения и рассеяния световой энергии дисперсной средой);

6) хемилюминесцентный (излучение раствором световой энергии в результате химической реакции).

В настоящее время в практических лабораториях можно встретить самые различные по конструкции и характеристикам колориметры, фотометры и спектрофотометры.

Их различия связаны с формой выдачи информации (единицы светопропускания, оптической плотности, концентрации или другие значения, по которым проведена калибровка прибора); со способом построения и хранения калибровочных значений (автоматическое, ручное, длительное или краткосрочное); со способом подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутированная кювета, кювета специальной конструкции и др.); с конструкцией оптической системы (одноканальные или многоканальные); с видом источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания с телом накала из вольфрама, импульсные, газоразрядные лампы, светодиоды, лазеры).

Каждый из используемых в лабораториях фотометров имеет следующие характеристики:

1) спектральный диапазон – длины волн, в которых работает прибор. В большинстве случаев фотометры работают в спектральном диапазоне 340–700 нм;

2) динамический диапазон измерения. Обычно диапазону оптических плотностей от 0 до 2 соответствует диапазон по светопропусканию от 100 до 1 %;

3) максимальный и минимальный объем фотометрируемого раствора. Эти объемы определяются объемами измерительных кювет, при этом минимальный допустимый объем раствора – объем, при котором возможно получение гарантированных результатов измерений. На современных фотометрах можно работать в диапазоне 10–500 мкл;

4) метрологические характеристики фотометрических приборов;

5) градуировка прибора – процесс построения калибровочной кривой, по которому в дальнейшем проводится градуировка прибора. Приборы высокого класса имеют энергонезависимое запоминающее устройство, позволяющее сохранять градуировочные характеристики в течение длительного времени;

6) способы отображения и регистрации информации. В приборах используются стрелочные, цифровые и алфавитно-цифровые индикаторы, принтеры самых разных конструкций.

В клинико-диагностических лабораториях в настоящее время используются самые разные виды фотометров. Это обычные фотометры типа КФК-2, КФК-3, ФЭК, программируемые фотометры типа МИНИЛАБ 501 (программируемый фотометр для биохимических исследований по конечной точке в моно- и бихроматическом режиме). В памяти фотометра хранится до 50 программ, он имеет встроенный термостат, объем кюветы 1 мл; МИНИЛАБ 502 – кинетический программируемый фотометр для исследования активности ферментов и определения концентрации метаболитов кинетическими методами с встроенным термостатом.

Все более широкое распространение получают биохимические анализаторы типа Стат Факс 1904. Анализатор предназначен для выполнения биохимических исследований кинетическим методом и по конечной точке. Производительность: кинетическим методом – до 40 исследований в час, по конечной точке – до 200 исследований в час.

Средства подготовки проб

На качество проводимых в лаборатории исследований существенное влияние оказывает аккуратное и точное выполнение операций дозирования. Основными режимами дозирования являются: прямое дозирование, обратное дозирование, многократное дозирование, разведение. Лабораторные дозирующие устройства подразделяются на пипеточные, клапанные, перистальтические дозаторы. Пипеточные механические дозаторы появились в лабораториях в 1960-е гг. и значительно повысили точность, воспроизводимость дозирования, снизили риск развития профессиональных заболеваний.

Забор дозирующей жидкости проводится в съемный наконечник. Для точности дозирования имеют значение материал, из которого изготовлен наконечник, и его форма. Фирмы-изготовители пипеточных дозаторов не гарантируют высокой точности при применении наконечников, не включенных в соответствующий перечень. Многие пипеточные дозаторы имеют устройства для сброса наконечников.

Пипеточные дозаторы нашли самое широкое применение в работе клинико-диагностических лабораторий.

По способу установки дозы дозаторы делятся на дозаторы с фиксированным объемом дозы, дозаторы с регулируемыми переменными объемами дозы; по количеству каналов дозирования – на одноканальные и многоканальные.

Особые виды дозаторов – специальные устройства, встроенные в автоматические анализаторы и робототехнические разливочные системы или дозирующие автоматы.

В настоящее время все большую популярность обретают электронные, или автоматические, дозаторы. Электронные дозаторы снабжены электронными дисплеями. Отличаются они конструкцией, оформлением, размерами дисплеев, разрешенными объемами пробы и пр. Существуют одно- и многоканальные дозаторы. Электронные дозаторы обладают более высокой точностью, чем механические. Это обеспечивается микропроцессорным управлением, жидкокристаллическим дисплеем, аккумуляторной батареей.

Центрифугирование

Центрифугирование проводит разделение смесей, состоящих из двух или нескольких компонентов с разной удельной плотностью. Разделение частиц с помощью центрифугирования основано на разной скорости осаждения частиц в центробежном поле.

В лабораторной практике чаще всего применяют препаративное центрифугирование, основанное на различиях в скорости седиментации частиц, отличающихся друг от друга плотностью и размерами. Разделяемый материал (в лабораториях это чаще всего кровь) по мере увеличения скорости центробежного ускорения распределяется по плотности и размерам частиц вдоль пробирки. На дно пробирки осаждаются форменные элементы крови, в надосадке – плазма или сыворотка крови. Препаративные центрифуги подразделяются на 3 группы:

1) центрифуги общего назначения;

2) скоростные центрифуги;

3) препаративные центрифуги.

Для разделения крови в лабораториях используют центрифуги общего назначения. Они обеспечивают центрифугирование со скоростью до 8000 об./мин, относительное центробежное ускорение до 6000 g. Отличаются друг от друга емкостью, рядом сменных роторов. Во всех центрифугах данного типа роторы жестко крепятся на валу привода, центрифужные пробирки должны быть вместе с находящимся в них биоматериалом тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. При неполной загрузке ротора пробирки должны быть размещены симметрично, одна против другой. Таким образом обеспечивается равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Например, мини-центрифуга СМ-6 со скоростью вращения ротора 1000, 1500, 2750 об./мин рассчитана на 12 пробирок в роторе, применяется для разделения растворов на фракции. Данная центрифуга используется в клинической биохимии, биологии, аналитической химии и т. д.

Мини-центрифуга СМ-70 имеет счетчик определения гематокритного числа. Ее конический ротор рассчитан на 8 капилляров, помещаемых в съемные адаптеры. Система управления обеспечивает поддержание оборотов и автоматическое отключение через заданный интервал времени.

Скоростные центрифуги обладают скоростью до 25 тыс. об./мин. Камера ротора снабжена охлаждающим устройством для предотвращения нагревания, возникающего при его вращении.

Препаративные центрифуги производят центрифугирование со скоростью до 75 тыс. об./мин.

Рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой являются центрифугами специального назначения.

Для изучения чистых препаратов макромолекул применяется аналитическое центрифугирование, которое обеспечивает данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала. Аналитические центрифуги развивают скорость до 100 тыс. об./мин.

Термостатирующие и перемешивающие устройства

Термостатирующие и перемешивающие устройства могут иметь разное конструктивное исполнение, могут в качестве блоков входить в общую структуру автоматических анализаторов.

По принципу передачи тепловой энергии термостаты разделяются на жидкостные, суховоздушные и сухие.

В жидкостных термостатах передача тепла к объекту происходит от источника тепла к объекту термостатирования через жидкую среду. В суховоздушных термостатах тепловая энергия передается при участии циркулирующего потока воздуха. В сухих термостатах передача тепловой энергии происходит через металлический блок. Выбор способа термостатирования определяется индивидуально в зависимости от емкости и формы термостатируемого объекта.

Перемешивающие устройства предназначены для перемешивания реакционной смеси с целью ускорения проведения реакции и повышения воспроизводимости результатов. Тип перемешивания и его характеристики зависят от назначения перемешивающего устройства.

В автоматических анализаторах перемешивание обеспечивается струей реагента, впрыскиваемого в кювету.

Методы исследования показателей белкового обмена

При обследовании больных с нарушениями белкового обмена диагностическое значение имеет определение общего белка, альбуминов и белковых фракций. В клинической практике в качестве единого метода определения общего белка принят колориметрический биуретовый метод. Достоинством метода является возможность его использования как при работе в неавтоматизированных лабораториях с отечественными реактивами и реактивами фирмы «Лахема», так и при работе на аналитических системах типа ФП-900 фирмы «Лабсистемс» (Финляндия). В ряде клинико-диагностических лабораторий для оценки состояния белкового обмена применяют простые коллоидные реакции, позволяющие косвенно выявлять изменения в составе белков сыворотки крови. Положительный результат коллоидно-химических проб связан с изменениями соотношения между белковыми фракциями. Чаще всего из флокуляционных проб используют тимоловую пробу.

Также разработаны флюориметрические, поляриграфические методы и атомно-абсорбционная спектрофотометрия. Они характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Но данные методы в настоящее время в клинической практике широко не используются, поскольку для них требуется специальная аппаратура, высокая квалификация специалиста, и стоимость таких анализов достаточно высока. Данные методы в настоящее время применяются преимущественно в научно-исследовательской практике.

Определение общего белка сыворотки крови биуретовым методом

Принцип метода

Белки сыворотки (плазма) крови, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Эта специфическая биуретовая реакция, характерная для пептидов и белков, применима для фотометрического определения.

В сыворотке здоровых людей содержится 65–78 г/л общего белка, у детей до 6 лет – 5,6–8,5 г/л, у новорожденных – 5,3–8,9 г/л, в моче – 25–70 мг/сутки, в ликворе – 15–45 мг на 100 мл.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.

2. Натр едкий, 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.

3. Калия йодид, 30 ммоль/л (раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра): 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль).

5. Меди сульфат 5-водный.

6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5 %-ного раствора йодида калия. Раствор стабилен.

8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой сыворотки): 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.

Ход определения

Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 7.

Таблица 7

Приготовление калибровочного раствора

Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30–60 мин измеряют на фотометре, как в опыте против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина.

Нормальные величины: 65–85 г/л (6,5–8,5 г на 100 мл).

Оценка аналитической надежности метода

Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. Воспроизводимость (V) составляет 1,5–3,5 %. На правильность метода влияют качество калибровочного материала и корригирование результатов со значением холостой пробы на реактивы и сыворотку. Небольшое число веществ оказывают интерферирующее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкмоль/л, триглицериды – больше 11,4 ммоль/л. Для устранения интерференции, вызванной липидемией (присутствием хиломикронов), применяют экстракцию диэтиловым эфиром. Большинство лекарств не вызывают интерференции.

Клинико-диагностическое значение

Результаты определения общего белка сыворотки крови могут быть ложно завышены при наличии липидемии, желтухи, гемолиза. Продолжительное наложение жгута повышает концентрацию всех белков в пробе.

Пробы, полученные выше места внутривенной инфузии, могут дать ошибочно заниженные результаты из-за локальной гемодилюции.

Увеличение содержания белка более 90 г/л имеет место при гипериммуноглобулинемии, поликлональных или моноклональных гаммопатиях.

Снижение содержания белка ниже 60 г/л в сочетании с потерей белка наблюдается при белоктеряющих гастроэнтеропатиях, острых ожогах, нефротическом синдроме.

Понижение содержания белка, вызванное снижением синтеза белка, наблюдается при белковой недостаточности (тяжелая форма), хронических болезнях печени, синдроме мальабсорбции, нарушениях питания, α-γ-глобулинемии.

Спектрофотометрические методы определения общего белка

Данная группа методов основана на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Характерные длины волн для поглощения растворов белка – 200–225 нм (обуславливается пептидными связями) и 270–290 нм (обусловлено присутствием ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан, фенилаланин в молекуле белка).

Данный метод характеризуется высокой погрешностью и недостаточно высокой эффективностью, поскольку содержание ароматических аминокислот отличается в различных белках сыворотке крови.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза

При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется зональный электрофорез с поддерживающей средой-носителем.

Принцип метода

Под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, имеющие отрицательный заряд, движутся по смоченной буферным раствором бумаге по направлению к положительному электроду со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются на 5 фракций: альбумины, α_1-, α_2-, β-, γ-глобулины.

Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой, поэтому они продвигаются в электрическом поле с наибольшей скоростью и дальше других фракций отстают от линии старта. С меньшей скоростью движутся α_1-, α_2– и β-глобулины.

Наименьшей скоростью продвижения отличаются γ-глобулины, они практически остаются на линии старта. γ-глобулины – крупные белковые молекулы, их заряд близок к нейтральному.

Окрашенные пятна белковых фракций, полученные методом электрофореза на бумаге или других носителях, носят название электрофореграммы.

Измерения и Расчет содержания белковых фракций проводят при денситометрическом сканировании электрофореграмм. Получаемые денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности и подвижности каждой фракции. Площадь пика пропорциональна количеству белков, находящихся в соответствующей фракции.

Каждая фракция имеет определенный состав белков. Процентное содержание отдельных белковых фракций меняется при многих заболеваниях, хотя общее содержание белка в сыворотке крови может оставаться в пределах нормы (диспротеинемия).

С помощью электрофореза можно провести первый этап оценки следующих патофизиологических процессов: иммунодефицит, активация гуморального звена иммунитета, воспалительный процесс, активация комплемента, снижение синтеза белка, состояние потери белка, внутрисосудистый гемолиз, генетические варианты белков, моно- и поликлональные γ-патии (парапротеинемии).

У здоровых людей содержание альбумина составляет 56,3–68,8 %, α_1-глобулинов – 3–5,8 %, α_2-глобулинов – 6,9–10,5 %, β-глобулинов – 7,3–12,5 %, γ-глобулинов – 12,7–19,2 %.

Унифицированный метод электрофоретического разделения на пленках из ацетата целлюлозы

Необходимые реактивы

1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.

2. Лимонная кислота.

3. Барбитал-цитратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6: 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (мединала), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверяют рН и доводят водой до метки.

4. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор.

5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная ртуть).

6. Уксусная кислота ледяная.

7. Пунцовый С.

8. Кислотный красный 2Ж.

9. Трихлоруксусная кислота, раствор 50 г/л.

10. Растворы для окрашивания:

– раствор бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлористой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в небольшом количестве воды при нагревании на водяной бане, непрерывно помешивая до полного растворения сулемы. Отдельно растворяют 0,5 г бромфенолового синего в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят водой до метки;

– раствор пунцового С: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты;

– раствор кислого красного 2Ж: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.

11. Отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л раствор.

12. Просветляющие растворы:

– вазелиновое масло;

– смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон (1: 1).

Специальное оборудование

1. Прибор для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

2. Пленка из ацетата целлюлозы.

3. Денситометр.

Ход определения

Подготовка прибора: прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией заполняют камеры прибора буферным раствором. Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым в обеих камерах.

Подготовка пленок из ацетата целлюлозы: смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны провисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150 В в течение 5 мин, после чего выключают ток.

Нанесение сыворотки: на катодный край пленки наносят 1–4 мкл сыворотки в виде узкой полоски, так чтобы полоски не доходили до края пленки.

Проведение электрофореза: включают ток и проводят электрофоретическое разделение в течение 20 мин при напряжении 150 В и силе тока 1 мА на 1 см поперечного сечения полоски.

Обработка пленок из ацетата целлюлозы: выключают ток, вынимают пленки, высушивают их вначале на воздухе в течение 5–10 мин, затем (для фиксации) в сушильном шкафу при 100 °C в течение 10 мин. Окрашивают в течение 15 мин одним из указанных красителей, после чего пленки несколько раз отмывают от избытка красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до исчезновения фона (3–4 раза). После отмывки пленки промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Затем пленки просветляют в одном из просветляющих растворов.

Расчет

Измерение проводят на денситометре. Результаты выражают в процентах.

Примечания

1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) буфер такого же состава, как и для электрофореза на бумаге.

2. После проведения электрофореза буфер из катодной и анодной камер смешивают, что дает возможность использовать его несколько раз.

Электрофоретическое разделение на бумаге

Необходимые реактивы

1. Буфер. Можно использовать различные виды буферов – мединал-вероналовый, боратный, трис-буфер:

– мединал-вероналовый буфер рН 8,6: 10,3 г мединала и 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л водой;

– трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил) – аминометан – 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 6 г, борная кислота – 4,6 г, вода – до 1 л.

2. Раствор красителя. Используют различные красители – бромфеноловый синий, амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфенолового синего и 20 г двухлористой ртути (сулемы) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной уксусной кислоты и доводят водой до 2 л. Хранят в посуде из темного стекла.

3. Раствор для элюирования – натр едкий, 0,03 моль/л.

Специальное оборудование

1. Прибор для электрофореза на бумаге.

2. Хроматографическая фильтровальная бумага марки «Б» (качество фильтровальной бумаги имеет большое значение: она должна быть однородной и плотной).

Ход определения

Подготовка прибора: в камере необходимо поддерживать определенную влажность воздуха, чтобы предохранить фильтровальную бумагу от высыхания. Для этого прибор закрывают крышкой. Буферный раствор в разных отделах камеры должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать переливания жидкости через ленту.

Подготовка бумаги: полосы фильтровальной бумаги смачивают раствором свежего буфера. Избыток буфера удаляют, отжимая полосы между лентами фильтровальной бумаги, и помещают их в электрофоретическую камеру.

Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизонтальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.

Нанесение сыворотки: на край ленты наносят по 5–10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступив на 0,5 см от краев.

Проведение электрофореза: камеру закрывают крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6–24 ч при напряжении от 3 до 8 В на 1 см пути тока. Продолжительность электрофореза устанавливают в зависимости от силы и напряжения тока, вида буферного раствора, рН, длины, ширины и толщины бумажных полос.

Обработка бумажных полос: выключают ток, вынимают ленты, помещают в сушильный шкаф на 10 мин при температуре 105 °C и красят, погружая в раствор красителя на 20 мин. Краситель сливают и ленты несколько раз промывают 20 г/л раствором уксусной кислоты до устранения фона (окрашенные участки бумаги, свободные от белка). Ленты вновь просушивают на воздухе.

Расчет

Измерение проводят на денситометре или на фотометре после элюирования. Результаты выражают в процентах.

Элюирование: кусочки ленты, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки для элюирования. Для этого в каждую пробирку с глобулиновой фракцией приливают по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбуминовой фракции – 20 мл и оставляют в течение 1–2 ч. Измерение проводят в кювете с толщиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора NaOH при 500–560 нм (зеленый светофильтр). Величину экстинкции альбуминов умножают на 2. Определяют сумму экстинкции всех фракций, принимая ее за 100 %, и вычисляют долю каждой фракции.

Клинико-диагностическое значение

Альбумин является основным онкотическим компонентом плазмы, служит в ней основным резервом азота, его роль в транспорте билирубина, желчных кислот, ионов металлов, лекарств существенно зависит от концентрации.

Абсолютной гиперальбуминемии не существует. Любое состояние, связанное с потерей воды, повышает концентрацию всех белков плазмы, включая альбумин, вызывая относительную гиперальбуминемию.

Снижение содержания альбумина встречается при многих заболеваниях: остром и хроническом воспалении, ревматических болезнях, термических ожогах, грануломатозных процессах, большинстве бактериальных инфекций, вирусных инфекциях с разрушением тканей, некрозах ткани (в частности, при злокачественных процессах), васкулитах, язвенных поражениях кишечника, серозитах, подостром бактериальном эндокардите, некоторых паразитарных поражениях.

Снижение его синтеза в печени обнаруживается при следующих процессах: острые и хронические заболевания печени, амилоидоз, нарушение питания, злокачественные новообразования, застойная сердечная недостаточность, перикардит, поражение клапанов сердца, врожденная анальбуминемия.

Увеличение потери через поверхность тела происходит при нефротическом синдроме, термических ожогах, травмах и раздавливании тканей, транссудации и экссудации из полых органов или эпителиальных поверхностей, после кровотечения и введения кровозамещающих жидкостей, желудочно-кишечных и лимфатических фистулах, повторных торакоцентезах или парацентезах, энтеропатиях, связанных с повышенной чувствительностью к пищевым продуктам (к глютену в злаках).

Повышение катаболизма отмечается при повышенной температуре тела, действии антиметаболитов, некоторых состояниях гиперметаболизма гормонального происхождения (болезнь Кушинга, тиреотоксикоз, преэклампсия).

Повышение объема крови (гиперволемия) характерно для таких состояний, как беременность, введение экзогенных эстрогенов, моноклональные иммунопатии, застойная сердечная недостаточность.

α_1-фракция содержит в основном α_1-антитрипсин, кислый α_1-гликопротеин (орозомукоид), протромбин, тиреоидсвязывающий глобулин. Из перечисленных белков α_1-антитрипсин – белок острой фазы, повышен при многочисленных острых, подострых, хронических воспалительных и неопластических заболеваниях, а также при заболеваниях печени. Снижение содержания имеет место при наследственном дефиците α_1-антитрипсина.

α_2-глобулиновая зона содержит α_2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин, α-липопротеид, эритропоэтин. – Увеличение α_2-фракции имеет место при нефротическом синдроме, некоторых подострых и хронических воспалительных и неопластических заболеваниях, стадиях восстановления после термических ожогов. Снижение содержания α_2-фракции развивается при сахарном диабете, панкреатите, гемолизе.

β-фракция содержит трансферрин, гемопексин, β-липопротеиды. Увеличение содержания β-глобулинов развивается при первичных или вторичных гиперлипопротеинемиях (особенно II типа), моноклональных β-патиях. Снижение содержания белка имеет место при гипо-β-липопротеинемиях, дефиците IgA.

γ-фракция содержит иммуноглобулины G, A, D, М. Наличие на электрофореграммах пиков М-белков во фракциях γ-, β- или α_2-глобулинов требует проведения иммуноэлектрофореза для уточнения характера моноклональных γ-патий.

Увеличение содержания γ-глобулинов встречается при поликлональных γ-патиях – хронических заболеваниях печени, хронических инфекциях, некоторых аутоиммунных заболеваниях; моноклональных γ-патиях – заболеваниях, протекающих с дискразией или лимфопролиферацией клеток лимфоидной ткани (миелома, макроглобулинемия, амилоидоз, лимфома, хроническая лимфоцитарная лейкемия).

Снижение содержания γ-глобулинов встречается при иммунодефицитах или иммуносупрессиях, лимфопролиферативных заболеваниях.

Унифицированный метод проведения тимоловой пробы

Тимоловая проба относится к коллоидно-осадочным, или флокуляционным, реакциям белков плазмы. Флокуляция (осаждение) белков обычно наступает при изменении их заряда, снижении количества воды в сольватной оболочке, увеличении размеров коллоидных частиц.

Принцип метода

Тимоловая проба основана на помутнении смеси при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере (табл. 8).

При взаимодействии тимоло-вероналового буфера с крупнодисперсными белками плазмы (β- и γ-глобулинами) помутнение образует глобулиново-тимол-липидный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Тимол, 100 г/л спиртовой раствор: 10 г очищенного тимола растворяют в 96 %-ном этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Очистка тимола: 100 г тимола растворяют в 100 мл 96 %– ного этилового спирта, фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холодной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин.

Затем фильтруют; кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза холодной водой, сушат до постоянной массы вначале на фильтровальной бумаге, затем в течение 2–3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом кальция.

2. 5,5-диэтилбарбитуровая кислота (веронал), фарм.

3. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.

4. Буферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют и доводят водой до 1 л. Хранят в холодильнике; при появлении осадка раствор не годится к употреблению.

5. Тимолово-вероналовый буфер рН 7,55–7,6: в мерной колбе вместимостью 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки. Проверяют рН.

6. Бария хлорид.

7. Калибровочный раствор:

– раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида бария растворяют и доводят до 100 мл водой;

– серная кислота, 0,1 моль/л.

Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хлорида бария наливают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 моль/л раствором серной кислоты, при температуре 10 °C (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат). Суспензию сульфата бария готовят перед употреблением.

Ход определения

К 6 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и затем измеряют оптическую плотность при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) против тимолово-вероналового буфера в кюветах с толщиной слоя в 1 см. Реакцию проводят при комнатной температуре.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора сульфата бария (суспензии) готовят разведения, соответствующие единицам помутнения по Шенк – Хогланд. Калибровочные растворы хорошо встряхивают и тотчас при длине волны 630–690 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см против воды измеряют.

Таблица 8

Тимоловая проба

Примечание

Можно использовать готовый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоловая проба» («Лахема»), в состав которого входят трис-буфер и малеиновая кислота.

Подобно всем флокуляционным тестам, тимоловая проба является неспецифической реакцией.

Однако она достаточно информативна для оценки функционального состояния печени. Проба положительна в 90–100 % случаев при вирусном гепатите уже в преджелтушной стадии, при безжелтушной форме заболевания, а также при токсическом гепатите, постнекротическом циррозе печени, коллагенозах, малярии, вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна.

Норма – 0,4 единицы.

Определение компонентов остаточного азота

Азотистый обмен включает реакции синтеза и распада белков, нуклеиновых кислот, аминокислот, нуклеотидов, а также ряда других азотсодержащих соединений. Для оценки состояния азотистого обмена определяют фракции остаточного азота в сыворотке или в цельной крови. Остаточный азот – это небелковый азот или азот, который остается в центрифугате (фильтрате) сыворотки крови или другой биожидкости после осаждения белков трихлоруксусной, фосфорно-молибденовой или фосфорно-вольфрамовой кислотой. Содержание остаточного азота и его компонентов в сыворотке крови в норме:

1) остаточный азот – 14,3–28,6 ммоль/л;

2) мочевина – 2,50–8,33 ммоль/л;

3) аминоазот (азот аминокислот)– 0,02–0,05 г/л;

4) мочевая кислота М – 0,24–0,50 ммоль/л, Ж – 0,16–0,44 ммоль/л;

5) креатин – 102–408 мкмоль/л;

6) креатинин М – 71–115 мкмоль/л, Ж – 53–97 мкмоль/л;

7) индикан – 0,87–3,13 мкмоль/л;

8) аммиак (цельная кровь) – 17–34 мкмоль/л;

9) ксантопротеиновая реакция – 20 условных единиц.

Увеличение концентрации остаточного азота выше 0,4–0,5 г/л обозначается термином «азотемия». Абсолютная азотемия связана либо с задержкой азотистых шлаков при нарушении функции почек (почечная или ретенционная азотемия) либо с их усиленным образованием (внепочечная или продукционная азотемия). Относительная азотемия наблюдается при дегидратации организма.

Считается, что резкое повышение фракций остаточного азота является плохим прогностическим признаком. Однако следует иметь в виду, что при острых заболеваниях азотемия может носить временный характер.

Основным компонентом фракций остаточного азота является азот мочевины, на долю которого приходится более половины всего остаточного азота.

Методы исследования мочевины сыворотки крови

Из всего разнообразия методов исследования мочевины в качестве унифицированных в лабораториях утверждены следующие:

1) экспресс-метод определения содержания мочевины с использованием реактивной бумаги «Уратест»;

2) диацетилмонооксимный метод, который может быть применен при работе как с отечественными реактивами, так и с наборами реактивов фирмы «Лахема»;

3) ферментативный метод с применением кристаллического препарата уреазы.

Диацетилмонооксимный метод определения мочевины

Принцип метода

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 100 г/л.

2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный раствор. Реактив стабилен.

3. Тиосемикарбазид, 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидрохлоридом; последний применяется в виде 3,2 г/л водного раствора.

Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Серная кислота концентрированная.

5. Ортофосфорная кислота 85 %-ная.

6. Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85 %-ной ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.

7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.

8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15–20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2–3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Еоп / Ек × Ск,

где Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

Ск – концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.

Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.

Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

Мсут = Ск × Еоп × а × К / Ек × б,

где Мсут – количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

Ск – содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;

а – суточное количество мочи, мл;

б – количество мочи, взятое на анализ, мл;

К – коэффициент разведения мочи.

Примечания

1. Измерение проводят не позже чем через 15 мин после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.

2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий нагревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.

3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.

4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разделить на 2,14.

Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины

Принцип метода

Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.

Необходимые реактивы

1. Уреаза. Для определения пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.

2. Этилендиамин-N, N, N’, N’-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (трилон Б).

3. ЭДТА-буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5: 0,50 г трилона Б растворяют в 30–40 мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в мерной колбе до 50 мл.

4. Основной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в 10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависимости от активности фермента. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

5. Рабочий раствор уреазы. Перед началом определения берут необходимое количество основного раствора уреазы и разводят бидистиллированной водой в отношении 1: 4.

6. Фенол.

7. Натрия нитропруссид 2-водный.

8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

9. Натр едкий, 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорит натрия. Приготовление основного раствора гипохлорита: 100 г хлорной извести размешивают в течение 15 мин с 170 мл воды, после чего прибавляют при непрерывном помешивании раствор, состоящий из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Определение активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовленного 50 г/л раствора йодида калия и 10 мл 6 моль/л раствора НСl. Титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (готовят из фиксанала). Как только раствор приобретает слабо-желтую окраску, добавляют 10 капель 1 %-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:

К = а × 0,709,

где К – концентрация активного хлора, г/100 мл гипохлорита натрия;

а – количество тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;

0,709 – коэффициент пересчета 1 мл тиосульфата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.

11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержанием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объемом 0,26 моль/ л раствором едкого натра (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют не реже одного раза в 2 недели. Рабочий раствор содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л едкого натра. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.

12. Мочевина.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

15. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

Специальное оборудование

1. Спектрофотометр или колориметр с кюветой для микроизмерений.

2. Полуавтоматические микропипетки.

Ход определения

Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1: 9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 37 °C. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20–30 мин при температуре 37 °C. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор NaCl.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет количества мочевины в ммоль/л ведут по формуле:

Еоп / Ек × 0,5 × 10,

где Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

0,5 – концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;

10 – коэффициент разведения.

Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется до 33 ммоль/л.

Примечание

Объемы сыворотки и реактивов можно пропорционально увеличивать.

Содержание мочевины сыворотки крови – 2,5–8,3 ммоль/ л; мочевина суточной мочи – 333–583 ммоль/л.

Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница референтных величин содержания мочевины в сыворотке может быть повышена даже до 10 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

При трактовке результатов анализа следует исходить из того, что диета с низким содержанием белка может уменьшить концентрацию мочевины, а избыточное питание азотистыми продуктами повышает уровень мочевины. Диета, бедная ионами хлора, также нередко приводит к повышению концентрации мочевины. Поэтому в большинстве случаев повышение концентрации мочевины до 12 ммоль/л считается физиологически допустимым. Однако существует мнение, что всякое повышение мочевины в крови выше 10 ммоль/л нужно рассматривать выходящим за пределы нормы, так как едва ли какой-либо пищевой режим способен поднять содержание мочевины крови выше этого уровня при отсутствии выделительных расстройств.

Из других физиологических состояний следует отметить беременность, при которой концентрация мочевины в крови часто падает ниже 4,5 ммоль/л.

Повышение уровня мочевины в сыворотке крови наблюдается не только при почечной недостаточности, но и при ряде других патологических состояний: рефлекторной анурии, камнях и злокачественных новообразованиях в мочевыводящих путях, болезни предстательной железы, отравлении сулемой, болезни Аддисона, усиленном распаде белков (острой желтой атрофии печени, тяжелых инфекционных заболеваниях: брюшном тифе, холере и др.), при непроходимости кишечника (илеусе), перитоните, шоке, ожогах, обеднении организма ионами хлора (хлорипривная азотемия, уремия), а также при дизентерии, обезвоживании (в последнем случае уремия носит не абсолютный, а относительный характер). Поскольку мочевина образуется главным образом в печени (существует мнение, что синтезировать мочевину в небольших количествах могут и другие ткани), вполне понятно, что при ее заболеваниях в первую очередь страдает мочевинообразовательная функция. Поэтому при паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, декомпенсированном циррозе уровень мочевины в крови уменьшается, хотя концентрация остаточного азота при этом может не изменяться или даже несколько увеличиваться (за счет возрастания содержания азота аминокислот и аммиака). Особенно показательно в этом отношении изменение коэффициента urea ratio (азот мочевины / остаточный азот × 100, норма – 48–60 %, при хронических нефритах возрастает до 90 % и более), который резко снижается (в противоположность значительному повышению при недостаточности почек). Повышение содержания мочевины в моче наблюдается при злокачественной анемии, лихорадке, гиперпротеиновой диете, после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором; понижение – при уремии, нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, прогрессирующем циррозе.

Методы исследования креатинина сыворотки крови

Креатинин является продуктом белкового обмена, он образуется при взаимодействии аминокислот глицина, аргинина, метионина. Креатинин присутствует в крови в свободном виде и в виде креатинфосфата в мышцах и миокарде.

Креатинин – ангидрид креатина, образуется в мышцах из креатинфосфата, вместе с креатином содержится во фракции остаточного азота крови.

Креатинин является постоянной составной частью мочи. Суточное выделение креатинина с мочой постоянно и пропорционально общей мышечной массе тела.

В качестве унифицированного метода при определении концентрации креатинина в крови и моче предложен метод Поппера, основанный на реакции Яффе. Отечественные и импортные наборы для определения уровня креатинина содержат все необходимые реагенты для выполнения исследования данным методом.

Принцип метода Поппера

В щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски (реакция Яффе – образование таутомера пикрата креатинина), которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования, в моче – после разведения водой. Определение не совсем специфично, интерферируют вещества с активной метиленовой группой и некоторые восстанавливающие вещества, например глюкоза, ацетон, ацетоуксусная и пировиноградная кислоты. Содержание креатинина сыворотки крови:

1) мужчины – 61–115 мкмоль/л или 0,061–0,115 ммоль/л;

2) женщины – 53–97 мкмоль/л или 0,053–0,097 ммоль/л.

Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100 (результат умножают на 50).

Необходимые реактивы

1. Пикриновая кислота, насыщенный раствор. Товарная пикриновая кислота содержит 15–20 % влажности. Кислоту не сушить! Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании на горячей водяной бане. После этого раствор оставляют стоять на 24 ч, периодически перемешивая. Затем раствор фильтруют. Реактив стабилен. Хранят в темной посуде.

2. НСl, 0,1 моль/л.

3. Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л: 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором НСl. Хранят в холодильнике в посуде с притертой пробкой. Для определения креатинина в сыворотке крови рабочий калибровочный раствор получают разведением основного раствора водой в 100 раз; 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина.

4. Натр едкий, 2,5 моль/л.

Ход определения

Определение креатинина в сыворотке крови: 2 мл сыворотки смешивают с 6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15–20 с в кипящую водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае раствор еще раз центрифугируют. Затем раствор доводят до объема 10 мл водой. Через 10 мин (не позже 20 мин) измеряют в кювете с толщиной слоя в 2 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят до объема 10 мл водой.

Расчет производят по калибровочному графику (табл. 9).

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведения, как указано ниже.

Таблица 9

Определение креатинина сыворотки крови

Через 10 мин производят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Калибровочная кривая линейна до 260 мкмоль/л креатинина.

Определение уровня креатинина в моче

В мерной колбе или цилиндре вместимостью 100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного количества) с 3 мл раствора пикриновой кислоты. Смесь тщательно встряхивают и добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Доводят объем до 100 мл водой. Измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят водой до объема 100 мл. Расчет производят по формуле при сравнении с калибровочной пробой.

Калибровочная проба: к 0,5 мл основного калибровочного раствора прибавляют 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы обрабатывают так же, как опытные.

К = Ск × Еоп × а / Ек × б,

где К – количество креатинина в суточной моче, мкмоль;

Ск – количество креатинина в калибровочной пробе, 50 мкмоль;

Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

а – суточное количество мочи;

б – количество мочи, взятой для анализа.

Клинико-диагностическое значение

Нарушение выделения креатинина почками наблюдается лишь при далеко зашедших патологических процессах в них. Устойчивое повышение уровня креатинина в крови аналогично повышению уровня мочевины указывает на нарушение работы почечного фильтра и может считаться ранним показателем почечной недостаточности. Повышение содержания креатинина в сыворотке крови отмечается не только при почечной недостаточности и прогрессирующих диффузных заболеваниях почек, но также при закупорке мочевых путей, кишечной непроходимости (илеусе), тяжелом диабете, декомпенсации сердца, острой желтой атрофии печени, механической желтухе, гипофункции надпочечников, хлорипривной азотемии, голодании и беременности. Азотемия при простатите не дает повышения креатинина.

Понижение уровня креатинина отмечается при анемии, после введения АКТГ.

Содержание креатинина в моче зависит от питания. Помимо эндогенного креатинина, в моче содержится креатинин экзогенный, поступающий из мясной пищи.

Повышение содержания его в моче наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях (при которых происходит более интенсивный распад белков протоплазмы), пневмонии, недостаточности печени.

Понижение уровня наблюдается при мышечной атрофии, дегенерации почек, амилоидозе почек, лейкемии.

Одновременное определение у одного и того же пациента концентрации креатинина в крови и моче значительно расширяет возможности исследования функционального состояния почек, позволяя получить более надежную информацию о процессах фильтрации, реабсорбции и секреции.

Проба Реберга

В клинической практике для обнаружения и диагностики заболевания почек часто используется проба Реберга, позволяющая рассчитать клиренс креатинина. Клиренс креатинина рассчитывается по результатам исследования содержания креатинина в сыворотке крови и моче. Клиренс креатинина или коэффициент очищения показывает, какой объем плазмы крови полностью очищается от данного вещества за минуту. Он является характеристикой клубочковой фильтрации и рассчитывается по формуле:

С = U × V / Р,

где С – клиренс креатинина, мл/мин;

U – содержание креатинина в моче, мкмоль/л;

Р – содержание креатинина в сыворотке крови, мкмоль/л;

V – минутный диурез, мл/мин.

Вместе с тем протеинурия и выраженная почечная недостаточность делают клиренс креатинина ненадежным показателем скорости клубочковой фильтрации. При повышении его концентрации в сыворотке крови Расчет клиренса дает завышенные величины скорости клубочковой фильтрации.

Проведение пробы

Исследуемый натощак выпивает 400–500 мл воды или слабого чая и мочится (эту порцию мочи не исследуют и выливают). Время мочеиспускания точно отмечают. Ровно через 1 ч собирают мочу (полностью). В середине этого часа пунктируют локтевую вену и получают 5–8 мл крови. По объему собранной мочи устанавливают минутный диурез. В крови и моче определяют концентрацию креатинина. Фильтрацию и реабсорбцию рассчитывают по формулам:

клубочковая фильтрация (мл/мин) =

= концентрация креатинина в моче (ммоль/л) ×

× минутный диурез (мл) / концентрация креатинина в крови (мкмоль/л);

реабсорбция (%) = клубочковая фильтрация —

– минутный диурез × 100 / клубочковая фильтрация.

Клубочковая фильтрация в норме составляет 80–120 мл/ мин, реабсорбция – 97–99 %.

Критерии снижения скорости клубочковой фильтрации:

1) пограничное – 62–80 мл/мин;

2) незначительное – 52–63 мл/мин;

3) легкое – 42–52 мл/мин;

4) умеренное – 28–42 мл/мин;

5) выраженное – менее 28 мл/мин.

Методы исследования мочевой кислоты сыворотки крови

Мочевая кислота является продуктом распада пуриновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, макроэргических соединений, некоторых коферментов. Из эндогенных нуклеотидов в организме человека образуется около 500 мг мочевой кислоты, из поступающих с пищей – примерно 200 мг. Большая часть мочевой кислоты, образовавшейся в тканях, выделяется с мочой (до 75 %), остальная часть экскретируется с калом. Величина экскреции мочевой кислоты с мочой зависит от присутствия пуринов в пище: при обычной диете с мочой ежедневно выделяется до 0,7 г мочевой кислоты, при богатой пуринами диете – до 1 г. В клинико-диагностических лабораториях для определения мочевой кислоты используют колориметрический и ферментативный методы.

Нормальные величины:

1) мужчины до 60 лет – 0,1–0,40 ммоль/л (4,0–8,5 мг/дл); мужчины старше 60 лет – 0,25–0,47 ммоль/л;

2) женщины до 60 лет – 0,24–0,50 ммоль/л (2,8–7,5 мг/дл); женщины старше 60 лет – 0,19–0,43 ммоль/л.

Принцип метода

Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета.

Необходимые реактивы

1. Серная кислота, 0,35 моль/л: к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты относительной плотности 1,84 и доводят объем водой до 500 мл.

2. Натрий вольфрамовокислый двухводный (Na_2WO_4 × 2H_2O), 100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.

3. Натрия карбонат, 103 г/л: растворяют 51,5 г натрия карбоната в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.

4. Ортофосфорная кислота 85 %-ная.

5. Лития сульфат.

6. Лития карбонат.

7. Фосфорно-вольфрамовый реактив; в круглодонную колбу вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамовокислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл 85 %-ной ортофосфорной кислоты и несколько стеклянных бусинок. Осторожно кипятят в течение 2 ч на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником.

Охлаждают до комнатной температуры и доливают водой до 1 л. Добавляют 32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

8. Мочевая кислота.

9. Формалин, не ниже 37,5 %-ной концентрации.

10. Основной калибровочный раствор мочевой кислоты, 6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 °C. Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в предварительно нагретую колбу вместимостью 1 л, вливают теплый раствор карбоната лития и быстро встряхивают. После растворения мочевой кислоты колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 20 мл раствора формалина, наливают 300–350 мл воды. Добавляют несколько капель раствора метилового оранжевого, затем встряхивают, медленно добавляют 20–22 мл 0,35 моль/л серной кислоты до изменения цвета в розовый. Доливают колбу до метки водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла; 1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой кислоты.

11. Рабочий калибровочный раствор мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл водой. Стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

Ход определения

Опытная проба: к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл 0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают. Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамовокислого натрия и тщательно перемешивают. Через 5–10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната, перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 590–700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл воды.

Расчет ведут по формуле при сравнении с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят и измеряют так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл рабочего калибровочного раствора.

Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л:

Еоп / Ек × Ск × 10,

где Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

Ск – концентрация рабочего калибровочного раствора, 0,03 ммоль/л;

10 – пересчет на объем сыворотки (в опытную пробу берут 0,3 мл, т. е. в 10 раз меньше, чем в калибровочную пробу).

Клинико-диагностическое значение

Исследование содержания мочевой кислоты в сыворотке крови имеет значение для диагностики начальных стадий поражения почек и подагры.

Считают, что при поражении клубочков почки (острый и хронический нефрит, первично- и вторично-сморщенная почка) в первую очередь страдает выделение мочевой кислоты и индикана, вследствие чего наблюдается гиперурикемия. При очаговых нефритах и нефрозах выделение мочевой кислоты не нарушается.

При подагре наблюдается нарушение обмена нуклеопротеидов, вызывающее отложение солей мочевой кислоты в суставах и различных тканях тела.

Много мочевой кислоты определяется в крови и моче при патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеидов: лейкозах, лейкемии, после облучения рентгеновскими лучами, лейкопении, полицитемии, эритремии, гемолитической желтухе, злокачественной анемии в стадии ремиссии, злокачественных новообразованиях, а также при сердечной и печеночной недостаточности, диабете, голодании, усиленном потреблении жирной пищи, аллергии, гипертрофии предстательной железы, илеусе, артрите, ацидозе, пневмонии в стадии резорбции, отравлении свинцом и угарным газом.

Снижение содержания кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и АКТГ.

Методы исследования пигментного обмена

В основе образования билирубина лежит деградация гема гемоглобина и других гемсодержащих белков и ферментов. Гем распадается до биливердина, который восстанавливается в билирубин.

Свободный билирубин токсичен, не растворяются в воде и циркулирует в крови в комплексе с альбуминами. Этот билирубин дает непрямую реакцию Ван ден Берга (после осаждения альбуминов спиртом), поэтому называется непрямым.

Непрямой билирубин, будучи связанным с альбуминами, не проходит через неповрежденные мембраны почечных клубочков и не фильтруется в мочу.

Выведение билирубина осуществляется с желчью через кишечник. Билирубин, связанный с альбуминами, доставляется кровью в печень. Билирубин легко проникает через мембраны гепатоцитов, альбумины остаются в кровотоке.

В гепатоцитах билирубин подвергается конъюгации с глюкуроновой кислотой, превращаясь в билирубинмоно- и диглюкуронид.

Образованные билирубинглюкурониды нетоксичны, легко растворимы. Они направляются с желчью в кишечник для выведения из организма.

Из кишечника билирубинглюкурониды частично поступают в кровоток и, находясь в крови, представляют собой фракцию прямого билирубин, который дает прямую реакцию Ван ден Берга. Прямой билирубин в отличие от непрямого легко проникает через почечные фильтры и может выделяться с мочой.

В физиологических условиях сыворотка крови содержит примерно 25 % прямого билирубина (связанного с глюкуроновой кислотой) и 75 % непрямого билирубина (альбумин-билирубина).

Таким образом, общий билирубин крови представляет собой суммарное количество непрямого и прямого билирубина.

У здоровых людей в сыворотке крови содержится: общего билирубина 3,4–20,5 мкмоль/л; прямого (конъюгированного) – 0,86–5,3 мкмоль/л; непрямого (свободного) – 1,7–17,1 мкмоль/л.

Для определения билирубина используется колориметрический метод, основу которого составляет реакция Ван ден Берга. Реакция протекает в 2 стадии: на первой под воздействием соляной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь, в результате чего образуются два дипиррола, на второй – оба дипирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин. Фракционное содержание билирубина определяется с помощью модифицированного метода Ван ден Берга, предложенного Ендрассиком. Метод принят в качестве унифицированного.

Принцип метода Ван ден Берга

Билирубин вступает в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием раствора азокрасителя. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию билирубина и выявляется фотометрически.

Оригинальным методом Ван ден Берга устанавливается лишь характер реакции (прямая, непрямая, замедленная), т. е. отмечается преобладание в сыворотке крови того или иного билирубина. Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа дает возможность фракционно определять содержание билирубина. Он прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.

Определение рекомендуется проводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

Унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика – Клеггорна – Грофа)

Принцип метода

Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина, в результате чего образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Необходимые реактивы

1. Кофеин.

2. Натрия бензоат.

3. Натрия ацетат 3-водный.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до температуры 50–60 °C, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 мл. Раствор стабилен в течение 2 недель.

5. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки водой.

6. НСl концентрированная.

7. Сульфаниловая кислота.

8. Диазосмесь. Диазореактив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300–400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСl. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 л. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II – натрия нитрит, 5 г/л (0,07 моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2–3 недель при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.

9. Билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон», содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 × 10^4 л при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного NаСО_3 растворяют и доливают до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л: 25 мл ледяной уксусной кислоты доливают до 100 мл водой.

Ход определения

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице 10.

Таблица 10

Диазореакция

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.

Построение калибровочного графика

Способ I – Шелонга – Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30–35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na_2CO_3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков.

Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа_2СО_3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают.

При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней.

Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/ л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора.

Чтобы исключить при Расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30 %-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (табл. 11), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Таблица 11

Определения связанного билирубина

Способ II – калибровочный график строится по готовому набору реактивов «Билирубин-эталон» («Лахема»).

Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» включает:

1) билирубин лиофилизированный (точная концентрация билирубина приведена на этикетке флакона);

2) альбумин лиофилизированный.

Способ приготовления растворов билирубина указан в инструкции к набору.

Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.

Примечание

На правильность метода влияет способ построения калибровочной кривой. Ряд веществ – гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота – вызывают интерференцию.

Клинико-диагностическое значение

При печеночных желтухах (гепатиты, циррозы) в крови отмечается резкое увеличение содержания билирубинглюкуронида, происходящее главным образом от разрушения печеночных клеток. Повреждение мембран гепатоцитов приводит к выходу в кровь и прямого, и непрямого билирубина.

Некоторое возрастание количества свободного билирубина наступает вследствие нарушения функции печени (уменьшения активности трансглюкуронидазы и других ферментных систем, участвующих в глюкуронидировании).

Значительное увеличение содержания билирубина сыворотки при механических (застойных) желтухах обусловлено переполнением желчных путей вследствие закупорки, разрыва их и перехода желчи в русло крови.

Обтурационные желтухи сопровождаются резким увеличением прямого билирубина в крови. Длительный застой желчи в печени может вызвать воспалительные изменения в гепатоцитах с последующим увеличением содержания непрямого билирубина сыворотки крови.

Резкое возрастание количества свободного билирубина при гемолитической желтухе происходит в результате гемолиза, приводящего к усиленному образованию непрямого билирубина.

Ряд лекарственных препаратов оказывает влияние на содержание общего билирубина. Они усиливают распад эритроцитов. К ним относятся ацетилсалициловая кислота, тетрациклин, хинин и др.

Могут увеличивать уровень прямого билирубина в плазме препараты, вызывающие задержку желчи в печени: пенициллин, эритромицин, сульфаниламидные препараты, эстрогены, пероральные контрацептивы, андрогены, никотиновая кислота.

Методы исследования показателей липидного обмена

К липидам относятся нейтральные жиры (триглицериды), холестерин (общий, свободный и связанный), фосфолипиды, гликолипиды.

Исследования обмена липидов и липопротеинов (ЛП), холестерина (ХС), в отличие от других диагностических тестов имеют социальное значение, так как требуют неотложных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний.

Проблема коронарного атеросклероза показала четкую клиническую значимость каждого биохимического показателя как фактора риска ишемической болезни сердца (ИБС), и в последнее десятилетие изменились подходы к оценке нарушений липидного и липопротеинового обменов.

Риск развития атеросклеротического поражения сосудов оценивают по следующим биохимическим тестам:

1) содержание триацилглицеринов (ТГ) в сыворотке крови;

2) содержание общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови;

3) содержание холестерина, входящего в состав липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП);

4) содержание холестерина, входящего в состав липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП);

5) определение отношений ОХС/ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП.

Триглицериды

ТГ – нейтральные нерастворимые липиды, поступающие в плазму из кишечника или из печени.

В тонком кишечнике ТГ синтезируются из экзогенных, т. е. поступивших с пищей жирных кислот, глицерола и моноацилглицеролов. Образованные ТГ первоначально поступают в лимфатические сосуды, затем в виде хиломикронов (ХМ) через грудной лимфатический проток поступают в кровоток. Время жизни ХМ в плазме невелико, они поступают к жировым депо организма.

Наличием ХМ объясняется белесый цвет плазмы после приема жирной пищи. ХМ быстро освобождаются от ТГ при участии липопротеинлипазы (ЛПЛ), оставляя их в жировых тканях. В норме после 12-часового голодания ХМ не определяются в плазме. В связи с низким содержанием белка и высоким количеством ТГ ХМ при всех видах электрофореза остаются на линии старта.

Наряду с поступающими с пищей ТГ в печени из эндогенно синтезированных жирных кислот и трифосфоглицерола, источником которого является обмен углеводов, образуются эндогенные ТГ. Эти ТГ транспортируются кровью к жировым депо организма в составе липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПОНП являются главной транспортной формой эндогенных ТГ. Содержание ЛПОНП в крови коррелирует с подъемом уровня ТГ. При высоком содержании ЛПОНП плазма крови выглядит мутной.

Для исследования ТГ используется сыворотка крови или плазма крови после 12-часового голодания. Хранение образцов возможно в течение 5–7 дней при температуре 4 °C, не допускаются повторное замораживание и оттаивание проб.

Холестерин

ХС является составной частью всех клеток организма. Он входит в состав клеточных мембран, ЛП, является предшественником стероидных гормонов (минерало- и глюкокортикоидов, андрогенов и эстрогенов).

ХС синтезируется во всех клетках организма, однако основная его масса образуется в печени и поступает с пищей. В сутки организм синтезирует до 1 г ХС.

ХС – гидрофобное соединение, основной формой транспорта которого в крови являются белок-липидные мицеллярные комплексы ЛП. Их поверхностный слой образуют гидрофильные головки фосфолипидов, аполипопротеинов. ХС эстерифицированный более гидрофилен, чем ХС, поэтому эфиры ХС с поверхности перемещаются в центр липопротеиновой мицеллы. Основная часть ХС транспортируется кровью в виде ЛПНП от печени к периферическим тканям. Аполипопротеином ЛПНП является апо-В. ЛПНП взаимодействуют с апо-В-рецепторами плазматических мембран клеток, захватываются ими путем эндоцитоза. Освобождающийся в клетках ХС используется для построения мембран и эстерифицируется. ХС с поверхности клеточных мембран вступает в мицеллярный комплекс, состоящий из фосфолипидов, апо-А, и образует ЛПВП. ХС в составе ЛПВП подвергается эстерификации под действием лецитинхолестеролацилтрансферазы (ЛХАТ) и поступает в печень. В печени поступивший в составе ЛПВП ХС подвергается микросомальному гидроксилированию, превращается в желчные кислоты. Выделение его происходит как в составе желчи, так и в виде свободного ХС или его эфиров.

Исследование уровня ХС не дает диагностической информации об определенном заболевании, а характеризует патологию обмена липидов и ЛП. Наиболее высокие цифры ХС имеют место при генетических нарушениях обмена ЛП, таких как семейная гомо- и гетерозиготная гиперхолестеринемия, семейная комбинированная гиперлипидемия, полигенная гиперхолестеринемия. При ряде заболеваний развивается вторичная гиперхолестеринемия: нефротический синдром, сахарный диабет, гипотиреоз, алкоголизм.

Для оценки состояния липидного и ЛП обмена определяют величины ОХС, ТГ, ХС ЛПВП, ХС ЛПОНП, ХС ЛПНП.

Определение этих величин позволяет рассчитать коэффициент атерогенности (Ка):

Ка = ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПОНП,

а также другие показатели. Для Расчетов необходимо также знание следующих пропорций:

ХС ЛПОНП = ТГ (ммоль/л) / 2,18;

ХС ЛПНП = ОХС – (ХС ЛПВП + ХС ЛПОНП)

Методы определения содержания триглицеридов

В отечественных лабораториях уровень ТГ чаще всего определяют с помощью химических методов по уровню глицерина, образующегося при гидролизе. Это может приводить к получению завышенных результатов, так как повышение уровня глицерина в крови вызывают некачественное взятие крови (выброс адреналина во время стресса), физические упражнения, состояния, сопровождающиеся метаболическим стрессом.

Наиболее предпочтительными являются ферментные методы исследования содержания ТГ с учетом содержания в холостой пробе свободного глицерина.

Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с ацетилацетоном

Принцип метода

Триглицериды экстрагируются из сыворотки крови. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерин окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся формальдегид образует с ацетилацетоном в слабом уксусном растворе 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию триглицеридов.

Необходимые реактивы

1. Гептан.

2. Изопропиловый спирт (изопропанол).

3. 0,08 н серная кислота (примерно 2,2 мл концентрированной H_2SO_4 на 1 л воды).

4. Едкий калий, 6,25 моль/л: 17,8 г KOH растворяют в 50 мл, осторожно добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и перемешивая.

5. Уксусная кислота, 50 г/л.

6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO_4 × 2H_2O (перйодная кислота) в 100 мл 5%-ной уксусной кислоты.

7. Аммония ацетат, 2 моль/л: растворяют 154 г ацетата аммония в воде, объем доводят до 1 л.

8. Ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона (СН_3СО СН_2СОСН_3) разводят раствором уксуснокислого аммония до суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде из темного стекла.

9. Калибровочный раствор триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта. Можно использовать и другие калибровочные растворы, перечисленные в примечании.

Примечание

Если использовать для калибровки раствор триолеина в изопропиловом спирте, то после экстракции и расслоения объем верхней фазы в калибровочных пробах оказывается больше, чем в опытных, что приводит к заниженным результатам анализа. Чтобы избежать этой ошибки, рекомендуют калибровочный раствор готовить по следующей прописи: 510 мг триолеина растворить в 100 мл изопропилового спирта, из полученного исходного калибровочного раствора с содержанием 6 ммоль/л готовить по мере необходимости рабочий калибровочный раствор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 объем исходного калибровочного раствора 4 объемами воды.

Ход определения

К 0,5 мл сыворотки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н серной кислоты, перемешивают и через 5 мин центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н КОН. Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 70 °C. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, после перемешивания снова закрывают пробкой и нагревают еще 10 мин при 70 °C. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды; развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л. Расчет проводят по правилу пропорций или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, уже содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.

Примечание

При отсутствии триолеина или трибутирина для калибровки можно использовать растительное масло, принимая, что образующие его триглицериды имеют ту же молекулярную массу, что и триолеин. Можно проводить калибровку, используя раствор глицерина в этаноле, в этом случае его непосредственно добавляют к щелочному раствору едкого калия.

Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с хромотроповой кислотой

Принцип метода

Триглицериды гидролизуются с освобождением глицерина, который окисляется перйодатом натрия до формальдегида. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие перйодаты восстанавливаются избытком бисульфита натрия, после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хромотроповой кислотой.

Ферментативный метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови

Принцип метода

Триглицериды ферментативно гидролизуются до глицерола в соответствии со следующей схемой реакции:

триглицериды ↔ глицерол + жирные кислоты;

глицерол + АТФ ↔ глицерол-3-Ф + АДФ;

глицерол-3-Ф + О_2 ↔ фосфоглицероальдегид + Н_2О_2;

Н_2О_2 + 4-аминоантипирин + n-хлорфенол ↔ Н_2О_2 + хинонимин.

Образующаяся в ходе ферментативной реакции окраска пропорциональна содержанию ТГ. Нормальные возрастные величины триглицеридов:

– до 5 лет – 0,1–1,1 ммоль/л;

– 6–11 лет – 0,36–1,12 ммоль/л;

– 12–15 лет— 0,4–1,56 ммоль/л;

– 16–29 лет – 0,45–1,45 ммоль/л;

– 30–39 лет – 0,43–1,81 ммоль/л;

– 40–49 лет – 0,5–2,1 ммоль/л;

– 50–59 лет – 0,62–2,79 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

Увеличение концентрации ТГ (гипертриглицеридемия) наблюдается при эссенциальной гиперлипемии и первичной (семейной) гиперлипопротеидемии. Считают, что определение ТГ является одним из решающих показателей для диагностики отдельных типов врожденного нарушения обмена липидов.

К вторичному повышению концентрации триглицеридов приводят ожирение, нарушение толерантности к глюкозе, эрозивные или плоскоклеточные ксантомы, вирусный гепатит, алкоголизм, алкогольный цирроз, билиарный цирроз, внепеченочная обтурация желчных путей, острый и хронический панкреатит, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность, гипертоническая болезнь, острый инфаркт миокарда, хроническая ИБС, тромбоз сосудов мозга, гипотиреоз, сахарный диабет, подагра, беременность, гликогенозы I, III, IV типов, большая талассемия, синдром Дауна, респираторный дистресс-синдром, невротическая анорексия, идиопатическая гиперкальциемия, острая перемежающаяся порфирия, стресс.

Снижение ТГ наблюдается при α-β-липопротеидемии, гиполипопротеидемии, хронических обструктивных заболеваниях легких, инфаркте мозга, гипертиреозе, гиперпаратиреозе, недостаточности питания, синдроме мальабсорбции, лимфангиоэктазии кишечника, поражении паренхимы печени.

Методы определения содержания холестерина сыворотки крови

Методы определения общего холестерина подразделяются на:

1) колориметрические. Насчитывается около 150 колориметрических методов, основывающихся на реакциях образования цветных комплексов;

2) нефелометрические методы, основанные на сравнении степени мутности стандартного и исследуемого растворов;

3) титрометрические методы;

4) флюориметрические методы, позволяющие определять холестерин в микрообъемах сыворотки крови (например, в 0,01 мл ее);

5) газохроматографические и хроматографические методы;

6) гравиметрические методы.

Метод определения общего холестерина в сыворотке крови, основанный на реакции Либермана – Бурхарда (метод Илька)

Принцип метода

В сильнокислой безводной среде ХС взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. В ходе реакции ХС последовательно окисляется. При этом каждая стадия реакции сопровождается образованием молекулы ХС, которая имеет на одну двойную связь больше, чем соединение, из которого она образовалась. В результате конечного окисления иона получается окрашенное соединение, растворенное в серной кислоте и дающее максимум абсорбции при 410 и 610 нм. Из-за неустойчивости окраски соединения время фотометрирования должно быть точно выдержано.

Реакционная смесь со стандартным раствором ХС имеет изумрудный цвет. Однако пробы сыворотки могут давать зеленый, голубой, бурый цвета. Это связано с тем, что в результате образования эндогенного тепла в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови. Кроме того, в реакции Либермана – Бурхарда свободный ХС и его эфиры образуют цветные комплексы с разным коэффициентом молекулярного поглощения. В случае высокого содержания эфиров ХС оптическая плотность оказывается более высокой. Поскольку на прямое определение ХС влияют многие факторы, реакцию ХС со смесью Либермана – Бурхарда нельзя считать специфичной.

Прямой метод определения ХС относительно прост в исполнении и недорог. Однако токсичность и способность вызывать коррозию системы в современных анализаторах ограничивают применение метода. В крупных лабораториях предпочтение отдают ферментативным методам определения ХС.

Референтные величины: холестерин 4,65–6,46 ммоль/л (180–250 мг/дл).

При концентрации холестерина в пробе выше 16 ммоль/л сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 1 (результат).

Реакция чувствительна к изменению температуры, поэтому необходимо особенно соблюдать охлаждение реакционной смеси после добавки серной кислоты.

Билирубин в концентрации выше 50 мкмоль/л влияет на результат анализа. Интерференцию билирубина можно исправить Расчетом. Содержание 17 мкмоль/л билирубина приводит к завышению содержания холестерина в сыворотке примерно на 0,1 моль/л.

Сыворотка должна быть негемолизированной.

Необходимые реактивы

1. Ледяная уксусная кислота.

2. Концентрированная серная кислота.

3. Уксусный ангидрид.

4. Абсолютный этиловый спирт.

5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Хранить в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.

6. Калибровочный раствор: 232 мг холестерина растворяют в 2–3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л.

Ход определения

К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 мин в термостат или на водяную баню при температуре 37 °C, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм.

Построение калибровочной кривой и Расчет: к 0,05–0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при температуре 37 °C, так же как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л; пробы, в которую взято 0,1 мл, – содержанию 6 ммоль/л и т. д.

Примечания

1. Попадание воды приводит к помутнению раствора.

2. Следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причинами завышенных результатов.

3. Можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси удваивают, а количество исследуемого материала остается прежним.

Метод определения содержания холестерина в сыворотке крови, основанный на холестеролоксидазной реакции

Принцип метода

Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеинов детергентами. Холестеринэстераза гидролизует эфиры. В результате последующего ферментативного окисления холестерина холестериноксидазой образуется Н_2О_2.

Эфир холестерина + Н_2О_2 ↔ холестерин + жирные кислоты;

холестерин + О_2 ↔ холестен-3-ОН + Н_2О_2;

Н_2О_2 + n-хлорфенол + 4-аминоантипирин ↔

↔ хинониминовый краситель + Н_2О_2.

Уровни нормы ХС, выявленные при обследовании «в целом здорового населения», относительно высоки. С точки зрения риска развития ишемической болезни сердца уровни ХС желательны:

1) рекомендуемый – менее 5,18 ммоль/л;

2) умеренный риск – 5,18–6,19 ммоль/л;

3) высокий риск – более 6,22 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

Увеличение концентрации ХС наблюдается при полигенной гиперлипопротеидемии типа II А и II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типов, вторичной, приобретенной гиперлипопротеидемии, отмечается также при заболеваниях печени, внутри- и внепеченочном холестазе, гломерулонефрите, нефротическом синдроме, ХПН, злокачественных опухолях поджелудочной железы, простаты, гипотиреозе, подагре, ИБС, беременности, диабете, алкоголизме, анальбуминемии, дисглобулинемии, острой перемежающейся порфирии.

Снижение концентрации холестерина обнаружено при дефиците α-липопротеида (болезнь Танжера), гипо- и α-β-липопротеидемии, некрозе печеночных клеток, злокачественных опухолях печени, гипертиреозе, нарушении всасывания, нарушении питания, мегалобластной анемии, сидеробластной анемии, талассемии, острых тяжелых заболеваниях, обширных ожогах, хронических обструктивных заболеваниях легких, умственной отсталости, ревматоидном артрите, лимфангиоэктазии кишечника. Отмечены сезонные колебания уровня ХС: более высокие осенью и зимой, более низкие весной и летом. Повторное определение ХС после инфаркта миокарда необходимо проводить через 3 месяца.

Метод определения содержания липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови

Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и низкой плотности (ЛПНП) в противоположность липопротеинам высокой плотности (ЛПВП) образуют нерастворимые комплексы с гепарином в присутствии ионов марганца. В надосадочной жидкости, оставшейся после осаждения ЛПНП и ЛПОНП, остается α-холестерин или ЛПВП.

Нормальное содержание ХС ЛПВП в сыворотке крови составляет 0,9–1,9 ммоль/л.

Рекомендуются следующие показатели оценки вероятности развития атеросклероза (табл. 12).

Таблица 12

Оценка вероятности развития атеросклероза

Принцип метода

Хиломикроны, ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности) и ЛПНП (липопротеины низкой плотности) осаждаются добавлением фосфорно-вольфрамовой кислоты и хлорида магния.

После центрифугирования супернатант содержит ЛПВП (липопротеины высокой плотности) – фракцию, содержание холестерина в которой определяется ферментативно.

Полученные значения достоверны, если:

1) в пробе нет хиломикронов;

2) концентрация триацилглицеридов не превышает 400 мг/ 100 мл;

3) в пробах не обнаруживается следов III типа дислипопротеинемии.

Таблица 13

Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации

При измерении на Hg 546 нм происходит завышение количества ЛПВП холестерина спектром поглощения гемоглобина, которое можно игнорировать при значениях до 200 мг Нb/100 мл.

Полученный при центрифугировании супернатант должен быть прозрачен. Если проба содержит большое количество триглицеридов (более 1000 мг/100 мл), осаждение липопротеинов может быть неполным (мутный супернатант) или часть осадка может плавать на поверхности. В этих случаях следует развести образец 1: 1 0,9 %-ным раствором NaCl и повторить осаждение.

Клинико-диагностическое значение ХС-ЛПВП

Эпидемиологические исследования показали обратную зависимость между уровнями ХС-ЛПВП и распространенностью ИБС. Определение ХС-ЛПВП способствует выявлению риска развития ИБС. Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации представлена в таблице 14.

Повышению уровня ХС-ЛПВП способствуют такие заболевания, как первичный билиарный цирроз, хронический гепатит, алкоголизм, прочие хронические интоксикации.

Увеличение общих липидов наблюдается через 4 ч после приема пищи.

Основными заболеваниями, сопровождающимися возрастанием общих липидов, являются: ожирение, атеросклероз, сахарный диабет, злоупотребление алкоголем и др.

При ишемической болезни сердца, заболеваниях печени, поражении почек, гипотиреозе, алкоголизме регистрируется повышение общего холестерина.

Уменьшение содержания общего холестерина регистрируется при голодании, злокачественных новообразованиях, заболеваниях органов дыхания, повышенной функции щитовидной железы, анемии, лихорадочных состояниях, обширных ожогах, гнойно-септических заболеваниях и др.

Методы исследования углеводного обмена

Уровень глюкозы в крови, плазме (сыворотке) – лабильный показатель. Он отражает ее содержание в крови только в течение 15 мин. Повторное определение (после 15 мин) может показать другой уровень из-за быстрого изменения ее концентрации. Содержание глюкозы в моче характеризует ее уровень за 4–6 ч, в суточной моче – за 24 ч.

При исследовании глюкозы крови необходимо иметь в виду, что пациент должен перед исследованием голодать не менее 6–8 ч, быть в спокойном состоянии, перед анализом не должен курить, выполнять физическую работу.

Хранение пробы в холодильнике, длительное стояние пробы приводят к заниженным результатам. Несмотря на высокую точность глюкозооксидазного метода определения глюкозы, красители, используемые для измерения продукции перекиси водорода, могут подвергаться окислению и приводить к завышенным результатам.

Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке) и спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом

Принцип метода

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.

Нормальное содержание глюкозы – 4,1–5,9 ммоль/л; в возрасте от 60 до 90 лет – 4,6–6,4 ммоль/л; у детей – 3,3–5,6 ммоль/л.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSО_4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH_3COONa × 3Н_2О в 1 л).

6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. Желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3 %-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает Расчеты при калибровке.

Ход определения

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой – величину экстинкции.

Примечания

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотонический раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфата цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно ежедневно обрабатывать холостую пробу и 2–3 точки в диапазоне 3–9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

Изучение углеводного обмена методом нагрузок

Исследование углеводного обмена в клинике обычно начинают с анализа мочи на присутствие сахара и кетоновых тел, поскольку появление последних тесно связано с нарушениями углеводного обмена.

Таблица 14

Диагностический уровень концентрации глюкозы (ммоль/л)

Диагноз сахарного диабета подтверждается наличием гипергликемии. Диагноз диабета ставится при уровне глюкозы натощак более 7,8 ммоль/л или если при случайном определении он составляет 11,1 ммоль/л (табл. 15).

Глюкозурия не может подтверждать диагноз, так как глюкоза в моче может появиться в результате нарушения канальцевой реабсорбции.

У части пациентов уровень глюкозы в крови может быть повышен, но не достигать значений, при которых ставится диагноз «сахарный диабет». В этих случаях за пациентами устанавливают наблюдение, им рекомендуют диету с ограничением приема углеводов. В данном случае говорят о «нарушении толерантности к глюкозе». Тест на толерантность к глюкозе (ТТГ) проводят в случае, если диагноз не ясен:

1) сомнительные результаты при исследовании глюкозы крови натощак или случайно;

2) неожиданная глюкозурия, в том числе при беременности;

3) клинические признаки сахарного диабета при нормальном уровне глюкозы крови;

4) диагностика акромегалии.

Тест на толерантность к глюкозе

Тест на толерантность к глюкозе заключается в следующем.

Пациент в течение 3 дней должен придерживаться обычного питания с содержанием углеводов не более 250 г в день, а перед исследованием не наедаться на ночь. Утром натощак у больного берут кровь из пальца для определения содержания глюкозы, после чего ему дают выпить заранее приготовленный раствор, содержащий 75 г глюкозы в 200 мл теплой кипяченой воды или в 200 мл жидкого чая с лимоном. Глюкоза может быть заменена сахаром.

Время, в течение которого обследуемый больной пьет раствор, не должно превышать 5 мин, затем через 60 и 120 мин у него берут из пальца кровь для определения уровня глюкозы.

У детей сахарную нагрузку проводят так же, как и у взрослых, изменяя лишь дозы вводимой глюкозы. Так, детям в возрасте от 1,5 до 3 лет следует давать глюкозу исходя из соотношения 2 г/кг; от 3 до 12 лет – 1,75 г/кг; после 12 лет – 1,25 г/кг, но не более 25 г глюкозы.

На основании полученных данных строят кривую, откладывая на вертикальной оси концентрацию сахара в ммоль/л, а на горизонтальной – время в минутах.

Гликемические кривые у детей имеют тот же характер, что и у взрослых, с тем лишь отличием, что повышение концентрации сахара в крови у детей достигает меньших величин.

Референтные пределы уровня глюкозы при проведении ТТГ (ммоль/л): натощак – 3,9–5,8; через 30 мин – 6,1–9,4; через 60 мин – 6,7–9,4; через 90 мин – 5,6–7,8; через 120 мин – 3,9–6,7.

В конце пробы у больного собирают мочу для исследования на наличие сахара. Установлено, что сахар в моче здоровых людей при этой нагрузке приблизительно в половине случаев не появляется вовсе либо отмечается только в момент наибольшего повышения его в крови, т. е. в промежутке от 30 до 60 мин. Если в моче обнаруживается сахар, то в большинстве случаев это свидетельствует о той или иной форме эндокринной глюкозурии. Из неэндокринных заболеваний только тяжелое поражение печени может привести к появлению глюкозы в моче при проведении данной пробы, но и то в небольших количествах.

При подборе лечения больным сахарным диабетом назначают проведение гликемических и глюкозурических профилей с исследованием уровня глюкозы каждые 3 ч. Исследование глюкозы проводят перед каждым приемом пищи и на ночь. Чтобы не пропустить ночную гипогликемию, определяют глюкозу в ночное время. При проведении глюкозурического профиля мочу собирают в промежутках между исследованиями крови.

Назначение профилей преследует 2 задачи:

1) определить дозы инсулина;

2) оценить питание больного и избежать гипогликемических состояний.

При сахарном диабете уровень сахара крови натощак бывает повышенным, нарастание гликемической кривой происходит медленнее, достигая через 60–150 мин значительной величины (более чем на 80 % выше исходного уровня сахара крови). Снижение же кривой затягивается, гипогликемическая фаза спада за время проведения пробы обычно не выявляется (отсутствует). Нагрузка глюкозой сопровождается в большинстве случаев появлением сахара в моче.

Чем тяжелее диабет, тем позже достигает максимума гликемия, и тем он выше. Понижение кривой происходит очень медленно, чаще оно растягивается на 3–4 ч. Все порции мочи, как правило, содержат сахар. Подобный характер кривой можно объяснить нарушением выделения инсулина, что влечет за собой замедление отложения гликогена и торможение окисления глюкозы.

Повреждение печени характеризуется быстро нарастающей гликемической кривой в результате ослабления ассимиляционной способности печени.

Однако максимальный подъем не достигает таких величин, как при диабете.

Заболевания щитовидной железы, связанные с ее гиперфункцией, характеризуются гликемическими кривыми с более быстрым, чем в норме, нарастанием концентрации сахара, что, возможно, связано с более интенсивным обменом веществ и возбуждением симпатического отдела вегетативной нервной системы.

Причины гипергликемии: сахарный диабет у взрослых и детей, физиологические факторы (энергичные физические упражнения, сильные эмоции, выброс адреналина при инъекциях, шоке, ожогах, инфекциях), эндокринные заболевания (феохромоцитома, тиреотоксикоз, акромегалия, гигантизм, синдром Кушинга, глюкагонома, соматостатинома), заболевания поджелудочной железы (острый и хронический панкреатит, панкреатит при паротите, муковисцидозе, гемохроматозе, опухоли поджелудочной железы), гипергликемии, связанные с кровоизлиянием в мозг, острым инфарктом миокарда, тяжелой стенокардией, хроническими заболеваниями печени, хроническими заболеваниями почек.

Гипергликемия может сопровождаться глюкозурией, особенно в тех случаях, когда содержание сахара в крови превышает почечный порог (при упомянутых выше патологических состояниях почечный порог для глюкозы может и снижаться).

Причины гипогликемии: опухоль островковых клеток, дефицит глюкагона, другие опухоли (рак надпочечников, рак желудка, фибросаркома), тяжелые заболевания печени (отравления мышьяком, тетрахлоридом углерода, хлороформом и др.), эндокринные заболевания (гипопитуитризм, болезнь Аддисона, гипотиреоз), функциональные нарушения (постгастроэктомические синдромы, гастроэнтеростомия, поражения вегетативной нервной системы), у детей – недоношенность, рождение от матери, больной сахарным диабетом, кетонемическая гипогликемия.

Методы исследования активности ферментов

Определение активности ферментов наиболее широко используется при диагностике как первичных врожденных ферментопатий, так и вторичных, т. е. развивающихся в результате патологических нарушений на клеточном и субклеточном уровнях.

Изменение активности одних и тех же ферментов может наблюдаться при самых различных заболеваниях и, следовательно, не является специфичным для какой-либо патологии.

В связи с этим определение активности ферментов имеет диагностическую значимость только при сопоставлении с изменениями других показателей и клинической картиной заболевания в целом.

Чаще всего для определения активности ферментов в клинико-диагностических лабораториях используют плазму. Ферменты, выявляемые в плазме, условно делятся на 3 группы:

1) собственные ферменты плазмы, выполняющие свои функции только в сосудистом русле (ферменты свертывания крови, холинэстераза, церулоплазмин);

2) экскреторные ферменты, попавшие в плазму из секретов (дуоденального сока, слюны);

3) клеточные ферменты, попавшие в плазму из поврежденного органа.

Появление, степень, длительность сдвига ферментативной активности ферментов в плазме или сыворотке крови обусловлены несколькими причинами: размерами и степенью повреждения клеток, величиной молекул фермента, его внутриклеточной локализацией, прочностью связей со структурными элементами клеток, влиянием разных факторов на активность и скорость деградации фермента в клетках.

Каждый орган в организме имеет определенный спектр ферментов. Его характеристикой может быть более или менее типичная группа ферментов, типичная энзиматическая констелляция. Это позволяет с помощью определения группы органоспецифических ферментов получать сведения о функциях отдельных органов организма. Обычно ферментодиагностика – это определение ряда ферментов. Моноорганоспецифических ферментов практически не существует.

Измеряемая в сыворотке крови активность ферментов – результат совместной и согласованной работы клеточных структур (процессов синтеза и распада ферментов), функции мембран, скорости инактивации. Кроме того, на активность ферментов в крови значительное влияние оказывает продолжительность жизнедеятельности. Для основного числа ферментов период полураспада составляет от 10 до 120 ч. При этом ферменты с коротким периодом полураспада лучше отражают процессы, протекающие в органе.

Определение активности ферментов в сыворотке или плазме крови начато с 1954 г., когда было выяснено диагностическое значение нарастания активности ACT и АЛТ. Последующие годы подтвердили, что ряд заболеваний (в первую очередь инфаркт миокарда) вызывает преходящий подъем активности ряда ферментов плазмы и сыворотки крови. Каждый фермент в процессе заболевания отличает время первоначального появления в сыворотке и плазме, достижение максимальной активности, инактивация.

По мере развития патологического процесса в органе происходят прогрессирующее нарушение целостности клеточных стенок и утечка ферментов.

В плазме или сыворотке накапливается добавочное количество ферментов, набор которых характеризует их состав в пораженном органе. Абсолютное повышение активности определенного фермента связано со степенью повреждения ткани, его активность зависит от молекулярной массы и количества фермента в органе. Длительность периода полураспада ферментов является главным фактором, определяющим период времени, когда активность фермента повышена в плазме или сыворотке крови.

Определение активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ)

АЛТ (АлАТ) присутствует в очень больших количествах в печени и почках, в меньших – в скелетных мышцах и сердце. ACT (АсАТ) распределена во всех тканях тела. Наибольшая активность имеется в печени, сердце, скелетных мышцах и эритроцитах.

Принцип метода

Аспартат-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2- оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающий при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Аланин-аминотрансфераза катализирует реакцию между L- аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.

Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках больных диабетом) вызывает завышение активности ферментов ACT и АЛТ.

Гемолиз повышает активность ACT или АЛТ в сыворотке крови. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства.

Пределы активности:

АЛТ 5 – 30 Ед/л × 0,017 или 0,09–0,51 мккат/л;

ACT 7–18 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,31 мккат/л.

Метод определения активности АСТ

Необходимые реактивы

1. Калия фосфат однозамещенный (КН_2РО_4).

2. Калия фосфат двузамещенный (К_2НРО_4 × 3Н_2О).

3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.

4. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40–160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

5. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L- аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40–50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют примерно 20–26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH × Na_2 × 4H_2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 × 10^2 м^2 × моль–1 при 340 нм.

7. α-кетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 5 моль/ л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α- кетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды, раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.

8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD + оксидоредуктаза). Суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 17 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, ЛДГ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.

10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

11. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Примечание

Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют отечественные реактивы или импортные, например реактивы фирмы «Reanal». Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °C. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов.

Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.

Специальное оборудование

Спектрофотометр с термостатированной кюветой. Измерение проводят при 340 нм.

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60: 1: 1: 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 15).

Таблица 15

Определение активности АСТ

Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔЕ / Δt)оп – (ΔЕ / Δt)хол = (ΔЕ / Δt)скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших Расчетах. Расчет производят по формуле:

Активность, моль / (с × м^3) = нмоль / (с × л) × 10^6 =

= Vр. с / ε × l × Vсыв × (ΔЕ / Δt)скор,

где Vр. с – объем реакционной смеси, мл;

Vсыв – объем сыворотки, мл;

t – время реакции, с;

ΔЕ / Δt – изменение экстинкции за 1 с;

ε – коэффициент молярной экстинкции НАДН в м^2 × моль–1;

l – толщина слоя жидкости в кювете в сантиметрах.

Примечание

Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60: 1: 1: 1. Опытная проба включает смесь реактивов – 0,630 мл, сыворотку – 0,10 мл, α- кетоглутаровую кислоту – 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.

Метод определения активности АЛТ

Необходимые реактивы

1. Калия фосфат однозамещенный (КН_2РО_4).

2. Калия фосфат двузамещенный (К_2НРО_4 × 3Н_2О).

3. Фосфатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40–60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

4. L-aльфа-аланин.

5. Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4: 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Стабилен в течение 2 месяцев при хранении в холодильнике.

6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л (коэффициент молярной экстинкции не ниже 5,6 × 10^2 м^2 × моль–1 при 340 нм): 16 мг НАДН × Na_2 4H_2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике.

7. Натр едкий, 5 моль/л.

8. α-кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л: 0,245 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике.

10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Все реактивы лучше готовить на бидистиллированной воде.

Специальное оборудование то же, что для АсАТ.

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН и ЛДГ в соотношении 60: 1: 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 16).

Таблица 16

Определение активности АЛТ

Перемешивают, через 60 с (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Измерение опытной и холостой проб проводят против воды при 340 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔЕ / Δt)оп – (ΔЕ / Δt)хол = (ΔЕ / Δt)скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших Расчетах. Расчет производят по формуле:

Активность, моль / (с × м^3) = нмоль / (с × л) × 10^6 =

= Vр. с / ε × l × V × (ΔЕ / Δt)скор.

Условные обозначения те же, что для определения АсАТ.

Примечание

Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН и ЛДГ в соотношении 60: 1: 2. Опытная проба включает: смесь реактивов – 0,630 мл; сыворотку – 0,10 мл; α-кетоглутаровую кислоту – 0,02 мл. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.

Клинико-диагностическое значение

Значительное повышение активности АЛТ (в 2 раза выше нормы и более) развивается при некрозе печеночных клеток любого происхождения, тяжелом шоке, правосердечной недостаточности, острой аноксии, обширной травме печени, левосердечной недостаточности. Подъем активности имеет место также при циррозе печени, механической желтухе, опухоли печени, обширном инфаркте миокарда, миокардите, миозите, мышечной дистрофии. Иногда активность увеличивается при гемолитической болезни, преэклампсии, умеренной мышечной травме, жировой печени, хроническом алкоголизме, тяжелых ожогах, выраженном панкреатите.

Значительное повышение активности ACT развивается при гепатитах вирусного происхождения. Подъем активности имеет место также при некрозе клеток печени или их повреждении любой этиологии, включая холестатическую и обструктивную желтуху, хронические гепатиты, лекарственное повреждение печени, алкогольный гепатит (обычно ACT более АЛТ), вирусные и хронические гепатиты (АЛТ более ACT в большинстве случаев, плохой прогноз при ACT более АЛТ), при метастазах в печень и гепатомах, инфекционном мононуклеозе, некрозе или травме сердечной или скелетной мышцы, воспалительных заболеваниях скелетной или сердечной мышцы, после острого инфаркта миокарда (ACT более АЛТ), при тяжелой физической нагрузке, сердечной недостаточности, тяжелых ожогах, тепловом ударе, гипотиреозе (40–90 % случаев), обструкции кишечника, молочнокислом ацидозе, злокачественной гипотермии, посткомиссуротомном синдроме, ревматической полимиалгии, тифоидной лихорадке, большой талассемии, токсическом шоке.

Определение активности γ-глутамилтранспептидазы (ГГТП)

ГГТП катализирует перенос γ-глутамила с глутатиона на аминокислоту или пептид. Фермент занимает важное место в метаболизме аминокислот. В почках фермент играет главную роль в реабсорбции аминокислот из первичной мочи.

ГГТП располагается в основном на мембранах клеток, обладающих высокой секреторной активностью, – эпителиальных клеток, выстилающих желчные пути, печеночные канальца, проксимальные канальца нефрона, клеток панкреатической экзокринной ткани, выводных протоков, ворсинчатых клеток тонкой кишки. В порядке снижения активности ГГТП ткани располагаются почки, печень, поджелудочная железа, щеточная кайма клеток тонкой кишки. Предполагают, что в печени ГГТП связывает молекулы веществ, которые необходимо экскретировать.

Повышение активности ГГТП сопровождает все заболевания печени. Наиболее часто увеличение активности ГГТП при заболеваниях печени и желчевыводящих путей считают результатом нарушения оттока желчи и повышения содержания ГГТП в гепатоцитах. Регургитация желчи, поступление ее в кровоток, с одной стороны, освобождает ГГТП из мембран эпителия, выстилающего желчные пути, с другой – повышает активность фермента в крови.

Увеличение активности ГГТП всегда сопровождается внутри- и внепеченочной обтурацией желчных протоков, а также вторичным вовлечением печени в онкологические процессы организма путем метастазирования.

Желтуха всегда сопровождается увеличением активности ГГТП. Высокая активность фермента связана с нарушением проходимости желчных протоков, менее высокая соответствует острому гепатоцеллюлярному поражению. При остром вирусном гепатите многократное исследование активности ГГТП позволяет следить за течением болезни, постоянное повышение активности ГГТП свидетельствует о развитии хронической формы заболевания.

Исследование активности ГГТП применяется для выявления лиц, принимающих алкоголь, при контроле над хроническими алкоголиками в процессе их лечения.

Принцип метода

γ-глутамилтрансфераза (ГГТ, γ-ГТФ) переносит глутамиловый остаток с γ-L-(+)глутамил-4-нитроанилина на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновременно и буфером.

Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют фотометрически, после остановки ферментативной реакции подкислением.

Пределы активности:

1) мужчины – 11–49 Ед/л × 0,017 или 0,19–0,83 мккат/л;

2) женщины – 7–32 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,54 мккат/л.

Необходимые реактивы

1. L-γ-глутамил-п-нитроанилид.

2. Натрия хлорид.

3. Глицилглицин, 0,55 моль/л, рН 8,3: 3,63 г глицилглицина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки водой и растворяют (буферный раствор).

4. Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды, добавляют 0,028 г L-γ-глутамил-п-нитроанилида и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 с. Затем раствор охлаждают до температуры 37 °C и добавляют 2,5 мл буферного раствора.

Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37 °C. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторить не более 2 раз.

5. Уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л: 10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.

6. Основной калибровочный раствор п-нитроанилина: 0,0829 г п-нитроанилина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки водой и растворяют. Для определения активности γ-ГТФ можно пользоваться набором реактивов «Лахема».

Ход определения

Опытная проба: в пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37 °C, приливают 0,05 мл сыворотки крови; содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин при температуре 37 °C. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭК при длине волны 400–500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет активности производят по калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой: из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 17.

Таблица 17

Определение активности γ-глутамилтранспептидазы

В каждую из шести пробирок наливают по 0,05 мл рабочих калибровочных растворов № 1–6, прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кислоты, перемешивают и измеряют экстинкцию против раствора уксусной кислоты при тех же условиях, что и опытную пробу. По полученным значениям экстинкции строят калибровочную кривую. Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Значительное повышение активности ГГТП имеет место при обструктивных поражениях печени, внепеченочной обтурации желчных протоков. Повышение активности возникает при таких заболеваниях печени, как цирроз, гепатит, при инфекционном мононуклеозе, пересадке почки, гипертиреоидизме, сахарном диабете, панкреатите, алкоголизме, при раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, гепатоме.

Метод исследования активности креатинкиназы (КК)

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют 3 активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95 % общей активности КК, около 5 % приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4–6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12–36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Принцип метода

Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиево-молибденовой кислоты.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значительное повышение концентрации креатинкиназы в сыворотке крови.

Пределы активности:

1) мужчины – 10–65 Ед/л × 0,017 или 0,17–1,11 мккат/л;

2) женщины – 7–55 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,94 мккат/л.

Необходимые реактивы

1. Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

2. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

3. Креатин.

4. Магния сульфат 7-водный.

5. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70–80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

6. Натрия сульфат безводный.

7. Натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия).

8. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

9. Серная кислота, 2,5 моль/л.

10. НСl, 0,1 моль/л.

11. Трис-(оксиметил) – аминометан (трис).

12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50–60 мл воды, устанавливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.

13. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70–80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления). Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в холодильнике.

14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70–80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5–10 мин на водяной бане при температуре 40–45 °C). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной колбе до 100 мл.

15. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50–60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

16. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1: 1: 6).

17. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления калибровочного раствора): 0,0169 г КН_2РО_4 растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование

Фотоэлектроколориметр.

Ход определения

Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °C. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.

Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37 °C на 30 мин. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содержится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добавляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600–700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см.

Расчет производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика; готовят калибровочные пробы так, как указано в таблице 18.

Таблица 18

Исследование активности креатинкиназы

Из каждого калибровочного раствора берут по 0,4 мл и обрабатывают так, как опытные пробы. В холостую пробу вместо калибровочных растворов берут по 0,4 мл воды.

Примечание

Если активность КК превышает 500 нмоль/(с×л), то время инкубации сокращают до 15 или 10 мин; полученные величины активности умножают соответственно на 2 или 3. Разбавлять сыворотку не рекомендуется, так как активность фермента при разведении сыворотки изменяется непропорционально.

Клинико-диагностическое значение

Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта.

Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97 %, специфичность 67 % для инфаркта миокарда.

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Лактатдегидрогеназа – гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного акцептора водорода требуется НАД.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

L-лактат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н+.

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента.

Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях. В сыворотке крови обнаружены 5 изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.

Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 – из печени.

В отличие от последней ЛДГ1 обладают большей устойчивостью к действию мочевины.

Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.

Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.

Принцип метода

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции.

Пределы активности:

1) ЛДГ при температуре 37 °C – 0,66–2,66 мккат/л;

2) доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), – 60–80.

Необходимые реактивы

1. Молочная кислота 80 %-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80 %-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия пирофосфат (Na_4P_2O_7 × 10 Н_2О).

5. НСl 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

7. НАД-окисленная форма. Готовят из Расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1: 2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °C. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °C, и инкубируют смесь при температуре 37 °C в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице 19.

Таблица 19

Исследование активности лактатдегидрогеназы

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют так же, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду. Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, серповидно-клеточной анемиях, тромбоцитопениях, инфекционных мононуклеозах, а также прогрессивной мышечной дистрофии. Все заболевания, протекающие с некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатиты, панкреатиты, опухоли), как правило, сопровождаются резким повышением активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови. При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови повышена в первые недели желтушного периода, при легкой и среднетяжелой формах заболевания активность фермента возвращается к нормальному уровню довольно быстро. При заболеваниях печени процент мочевиностабильной фракции ЛДГ падает (< 20).

У больных инфарктом миокарда повышение активности фермента в сыворотке крови отмечается через 8–10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24–28 ч. Активность остается повышенной на протяжении первой недели заболевания. К 8–9-му дню активность ЛДГ нормализуется. Активность сывороточной лактатдегидрогеназы при инфаркте миокарда дольше сохраняется повышенной, чем активность других ферментов. Ценность определения данного фермента особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине. При стенокардии активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови не увеличивается. Инфаркт миокарда сопровождается возрастанием (> 40 %) мочевиностабильной фракции ЛДГ.

Метод исследования активности щелочной фосфатазы (ЩФ)

ЩФ – фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, присутствует в каждом органе, больше всего вырабатывается в печени, костях, кишечнике, эндометрии (плаценте), легких. Активность фермента возрастает у детей в периоде быстрого роста, у женщин – в последнем триместре беременности, после менопаузы.

Располагается ЩФ на поверхности цитоплазматических мембран; наличие изоформ ЩФ в сыворотке крови связано с тем, что в организме человека биосинтез фермента кодируют 3 гена: печеночный, костный и почечный.

Принцип метода

Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в N-метил-D-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофенола и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором ЩФ, который блокирует активный центр фермента.

Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации ЩФ 30 мккат/л. Методом константного времени можно без разведения анализировать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации ЩФ, превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умножить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотношений объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси.

Пределы активности ЩФ при температуре 37 °C (мккат/л):

1) мужчины – 0,90–2,29;

2) женщины – 0,74–2,10;

3) дети до 12 лет – 1,20–6,30.

Необходимые реактивы

1. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

2. Соляная кислота, 0,001 моль/л.

3. п-нитрофенилфосфат натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора НСl: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/ л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 г/л раствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НСl в процессе растирания соли в ступке в течение 10 мин. Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую.

Через 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху – бутанол, внизу – постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2–3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1–2 раза. Реактив не должен содержать свободного п-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный п-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз – эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют. Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2–3 недель.

4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

5. Магния хлорид 6-водный.

6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа.

7. Буферный раствор – 0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния – 95 мг/л: 375 мг глицина и 10 мг MgCl_2 × 6Н_2О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя – 1 см, длина волны – 400–420 нм). В противном случае раствор не годится или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2–3 дней.

9. п-нитрофенол – калибровочный раствор 5 × 10–5 моль/ л: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

Ход определения

Опытная проба: в пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при температуре 37 °C в течение 5 мин, затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °C. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 мин пробы измеряют на ФЭК при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице 20, и измеряют оптическую плотность растворов при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/л раствора едкого натра.

Таблица 20

Исследование активности щелочной фосфатазы

Клинико-диагностическое значение

Увеличение активности встречается при повышенном метаболизме в костной ткани: при заживлении переломов, при первичном и вторичном гиперпаратиреодизме (с явным вовлечением скелета), остеомаляции, недостатке витамина D в пище, заболеваниях костей.

Основные показатели биохимических исследований в состоянии нормы

В настоящее время действует форма справки на биохимический анализ крови № 228/у, утвержденная Минздравом СССР 04.10.1980 года. В нее включено 40 показателей крови. В большинстве случаев ограничиваются меньшим количеством показателей. Наиболее часто используемые на практике показатели приведены в таблице. Следует иметь в виду, что показатель нормы может варьироваться в зависимости от применяемого лабораторного метода.

Таблица 21

Основные показатели биохимического анализа

Биохимические анализаторы

Применение биохимических анализаторов позволяет быстро определить параметры биохимического состава крови. Помимо автоматических биохимических анализаторов, определяющих один параметр, существуют и работающие со спектром параметров. На рынке медицинского оборудования в настоящее время представлен широкий выбор анализатроов различного типа.

Основные параметры биохимических анализатоов:

1. Аналитические характеристики. Большинство моделей поддерживает возможность выполнения фотометрических и турбидиметрических исследований как «по конечной точке», так и в кинетическом режиме. В большинстве моделей также содержатся программы работы с нелинейными калибровками, верификация результатов по Вестгарду, возможность построения карт Леви-Дженнингса.

2. Тип анализатора: автоматический или полуавтоматический. При работе полуавтоматического анализатора оператор занимается смешиванием реактивов и заготовкой проб. Все остальные процессы, включая дозирование, исследование оптической плотности реагента, выполняются автоматически. Результаты исследования выводятся на экран и могут быть распечатаны или сохранены на цифровом носители. Полуавтоматические анализаторы невелики по габаритам и отличаются более низкой ценой. При работе с автоматическими анализаторами требуется минимальный контроль со стороны врача-лаборанта. Анализатор данного типа способствует экономии времени на исследования. Возможности автоматического анализатора: пипетирование, смешивание реагентов, доведение реагентов до требуемой температуры, проведение анализа, обработка данных. Задача оператора заключается в сведении данных и обработке емкостей.

3. Производительность. Нередко данный показатель выступает в качестве ключевых при выборе прибора. Тестирование осуществляется по монореагентным методикам двух типов: кинетические и по конечной точке. Анализаторы 1-го класса выполняют обработку данных кинетическим способом более медленно. Анализаторы 2-го и 3-го класса показывают равные по скорости результаты при работе с монореагентными методиками. При этом даже наиболее высокопроизводительные модели могут работать медленнее при выполнении биреагентных методик.

4. Тип системы в зависимости от применяемых реагентов: открытая и закрытая. Для работы анализаторам закрытого типа требуются исключительно фирменные реагенты производителя, обычно отличающиеся высокой стоимостью. Анализаторы открытого типа оборудованы светофильтрами, благодаря чему возможно проведение наиболее популярных методик с использованием наличествующих в лаборатории или свободном доступе реагентов.

5. Количество проб. От данного параметра зависит производительность лаборатории и оптимизация работы персонала. При отсутствии требуемых реагентов возникает необходимость остановки прибора, что снижает скорость работы. В состав наиболее компактных анализаторов входит от 10 до 15 загружаемых позиций, чего достаточно для выполнения среднего количества анализов. В работе крупной клиники или частной лаборатории может потребоваться 20–35 позиций для загрузки. Подобным требованиям отвечают анализаторы 2-го класса. При необходимости выполнить дополнительные исследования придется устанавливать дополнительные реактивы. Оптимальным выбором для подобных целей считаются анализаторы 2-го класса, включающие 35–40 позиций для реактивов. Анализаторы 3-го класса располагают 50–60 позициями, чего достаточно для установки практически любых реагентов. Некоторые модели анализаторов способны до начала работы самостоятельно определить и сигнализировать, на какое количество анализов хватит установленных реактивов.

6. Последовательность определения показателей крови:

– доступ Batch, или система «тест за тестом» – последовательное определение параметров исследования для каждого из образцов. Характерна для анализаторов с проточной кюветой. Данная система удобна для проведения научных исследований, поскольку практически отсутствует риск смешивания реактивов из наборов. Отрицательная сторона системы, особенно для лабораторий, занятых обслуживанием стационаров – невозможность быстрого получения исследований по каждому из пациентов;

– доступ Random Access, или свободный доступ – возможность работы в двух режимах. Режим «определение одного параметра во всех образцах» работает аналогично системе «тест за тестом». Режим «определение всех параметров для одного образца» позволяет провести исследование одного образца по всем требуемым показателям. При работе с данной системой неободимо правильно выстраивать очередность тестов, промывать оборудование между определенными видами анализов. Эта проблема решена в современных анализаторах: в них есть возможность ввести списки тестов, запрещенных в последовательной постановке.

7. Дополнительные характеристики:

– возможность управления и наличие меню на русском языке;

– количество потребляемой воды;

– возможность запуска срочной пробы;

– возможность охлаждения.

Виды биохимических анализаторов

Анализатор выдыхаемого водорода. Используется с целью измерения концентрации водорода (hydrogen (H_2)) в образце выдыхаемого воздуха. Применяется для определения наличия анаэробных бактерий, связанных с нарушениями ЖКТ (желудочно-кишечный бактериальный гиперрост, обструкция, нарушение всасывания).

Анализатор выдыхаемого воздуха жидкостный сцинтилляционный. Автоматический анализатор. Применяется для количественного определения углерода С 14 (14С) или иного бета-излучателя в жидком растворе. Сфера применения: выявление наличия бактерии Helicobacter pylori. Работа прибора основана на применении жидкостно-сцинтилляционной методологии, призванной обнаруживать бета-излучающие 14C, освобожденые после гидролиза мочевины.

Анализатор гликированного гемоглобина (HbA1C). Применяется для количественного определения гликогемоглобина в клиническом образце. Принцип работы: технология разделения на основе разницы зарядов. Применяются методы ионобменной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, электрофореза. При работе прибора на основе химического анализа задействуются методы колориметрии, спектрофотометрии. При работе на основе разницы структур используются иммуноанализ и аффинная хроматография.

Анализатор масс-спектрометрический для определения состава выдыхаемого воздуха. Автоматический. Применяется для количественного определения изотопа углерода С 13 (13С) в образце выдыхаемого воздуха, с последующим премом внутрь определенной дозы мочевины 13С. Сфера применения: выявление наличия бактерии Helicobacter pylori. Работа прибора основана на применении масс-спектрометрического анализа, для сравнения используется базовый образец.

Анализатор метана в выдыхаемом воздухе. Применяется для определения содержания метана в пробе выдыхаемого воздуха, обычно показатели выражаются в промилле. Многие анализаторы данного типа поддерживают выявление водорода, гелия, дуокиси углерода в пробе, что позволяет применять их для определения дисфункций токого кишечника по причине избыточного разрастания кишечной флоры и дефектов расщепления углеводов бактериями. Принцип работы может быть основан на методах электрохимического анализа или газовой хроматографии.

Анализатор содержания алкоголя в биологических жидкостях организма. Применяется для определения в образце биологической жидкости (обычно крови) концентрации алкоголя. Используется при работе с пациентами с сахарным диабетом и подозреваемыми в алкогольной интоксикации.

Анализаторы биохимические метаболического профиля. Полуавтоматические, автоматические, портативные. Применяется для качественного и количественного определения параметров и создания метаболического профиля. В спектр выполняемых анализов могут быть включены рН, параметры газов крови (в частности, pO_2, pCO_2), электролиты (в частности, натрий (Na2+), калий (K+), хлорид (Cl-), глюкоза, мочевина, креатинин, показатели гемоксиметрии.

Анализаторы биохимические многоканальные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для качественного или количественного определения показателей крови в клиническом образце. В спектр определяемых показателей могут входить электролиты, липиды, специфические белки, аналиты функционального исследования печени, почек, сердца. Принцип работы задействован на применении двух и более технологий и может включать микрогидродинамику, спектрофотометрию, электрометрию, флуорометрию, радиометрию, хемилюминесценцию. Обычно в работе анализатора задействуются определенные тестовые наборы реагентов.

Анализаторы биохимические на сухой химии. Полуавтоматические и автоматические. Применяется для качественного и количественного определения параметров и создания метаболического профиля. В спектр выполняемых анализов могут быть включены рН, параметры газов крови (в частности, pO_2, pCO_2), электролиты (в частности, натрий (Na2+), калий (K+), хлорид (Cl-), глюкоза, мочевина, креатинин, печеночные ферменты. Принцип работы основан на измерении количества света, отраженного от ламинированной плетки, пропитанной сухими реагентами, или стрипов. На пленку размещается клинический образец.

Анализаторы биохимические центрифужные. Полуавтоматический или автоматический. Для переноса и смешивания жидкостей задействуются центробежные силы. Реакции, протекающие в центрифуге, контролируются фотомером.

Анализаторы биохимические, одноканальные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для качественного или количественного определения множественных показателей в клиническом образце, в том числе глюкозы, кетона, специфических белков, субстратов клинической химии, ферментов, липидного профиля. В работе анализаторов данного типа применяется одна технология, в частности, электрометрия, флуорометрия, спектрофотометрия, радиометрия или хемилюминесценция.

Анализаторы глюкозы. Полуавтоматические или автоматические. Используется для определения уровня глюкозы в цельной крови, сыворотке, плазме или прочих жидкостях организма.

Анализаторы ионоселективные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для количественного определения электролитов и прочих ионов в клиническом образце. Принцип работы основан на действии ион-специфических мембран с целью выборочного измерения электрического потенциала на контрольном электроде, благодаря чему возможно определение концентрации ионов-мишеней.

Анализаторы липидного профиля. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для определения показателей липидного профиля, таких как холестерин, жирные кислоты, липиды, липопротеины, триглицериды.

Анализаторы проводимости пота. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для количественного измерения электропроводности образца пота, что показывает общее содержание электролитов. Измерение осуществляется путем применения проточной ячейки, в которой поддерживается определенная температура. Для получения результатов применяются калибровочные растворы и контрольные материалы. Данный анализ находит применение в качестве вспомогательного при диагностировании муковисцидоза.

Билирубинометр. Применяется для определения концентрации билирубина в крови или другом клиническом образце, задействует метод прямого или непрямого измерения. Обычно применяется для быстрого определения гипербилирубинемии у новорожденных. Принцип работы обычно основан на спектрофотометрии или гемофлуорометрии.

Раман-спектрометр. Применяется для скрининга или диагностики клинического образца. Принцип работы основан на упругом рассеивании монохроматического света. Используется при измерении молекулярных колебаний и идентификации патологических изменений в биомолекулах, таких как липиды, белки, нуклеиновые кислоты. Прибор представляет собой оптическую систему, в которую обычно включены аппаратный блок (такой, как кабельная система, рамановский зонд, диодный лазер, спектрограф, ПЗС-детектор) и встроенное программное обеспечение.

Глава 3

Исследование водно-солевого обмена

Вода является самым распространенным веществом организма. На ее долю приходится 60 % массы тела у мужчин и 52 % у женщин.

Все биохимические реакции протекают в водных растворах внутри клеток и во внеклеточном пространстве. Водонерастворимые органические вещества, например жиры, транспортируются в виде комплексов с водорастворимыми белками. Неорганические и многие органические вещества присутствуют в растворах в виде ионов.

Концентрация ионов во внутри- и внеклеточных растворах (крови, лимфе, желудочном соке, моче и др.) существенно различается. Через полупроницаемые клеточные мембраны, разделяющие различные водные пространства, движение молекул происходит не только по концентрационному градиенту, но и против него, например перенос ионов калия внутрь клетки и ионов натрия наружу, путем сложного механизма трансмембранного переноса. Вода свободно перемещается через мембраны в сторону того пространства, где концентрация органических и неорганических веществ выше, выравнивая осмотическое давление.

Благодаря различной концентрации катионов и анионов внутри и вне клеток на их мембране создается определенный электрический заряд, имеющий большое значение для функции клеток, особенно нервных.

Нарушение концентрации ионов, в первую очередь натрия, калия, кальция, хлоридов и бикарбонатов, может быть причиной существенных расстройств различных систем и органов, а в тяжелых случаях может даже привести к смерти.

Натрий

Натрий – основной катион внеклеточного пространства, играет главную роль в поддержании осмотического давления.

Нормальная концентрация: в цельной крови – 70–98 ммоль/л, в плазме – 130–156 ммоль/л, в слюне – 6,5–21,7 ммоль/л, в эритроцитах – 13–22 ммоль/л.

Общее содержание в организме – 2700–3000 ммоль (1 ммоль – 23 мг), запас в костных депо – 800–1000 ммоль.

Суточная потребность в виде NaCl – 29–87 мг на кг массы тела.

Суточное выведение: с мочой – 1–150 ммоль/л, с потом – 15–70 ммоль/л, с калом – до 10 ммоль/л в сутки.

У здорового человека постоянство концентрации натрия в организме регулируется почками с участием определенных гормонов – при большом поступлении излишки натрия выводятся с мочой, при низком содержании в пище выведение уменьшается. Гипонатриемия представляет собой снижение концентрации натрия в плазме крови ниже 135 ммоль/л.

Снижение концентрации натрия в крови происходит при длительном применении мочегонных средств (диуретиков), частых поносах и рвоте, обширных ожогах, при заболеваниях почек, сопровождающихся потерей натрия, сахарном диабете, недостаточности коры надпочечников. Снижение концентрации натрия в моче отмечается при интенсивном потоотделении, низком содержании соли в пище, приеме стероидных препаратов, хроническом нефрите.

Различают следующие виды снижения концентрации натрия:

1) эуволемическая гипонатриемия, при которой объем циркулирующей крови и плазмы в нормальных пределах, объем внеклеточной жидкости и общее содержание натрия также не изменено;

2) гиповолемическая гипонатриемия.

Гипернатриемия возникает при концентрации натрия в сыворотке крови выше 150 ммоль/л. Ее могут вызывать:

1) солевая перегрузка, которая может возникнуть при кормлении через зонд в бессознательном состоянии, после операций на головном мозге, при питании через гастростому;

2) водное истощение, возникающее при одышке, лихорадке, проведении искусственной вентиляции легких, открытом лечении ожогов;

3) несахарный диабет;

4) заболевания почек, протекающие с олигурией;

5) гипеаральдостеронизм.

В зависимости от нарушений водного баланса выделяют гипернатриемию:

1) гиперволемическую;

2) эуволемическую.

Гиперволемическая гипернатриемия возникает в результате потери воды по сравнению с потерями натрия. Это может привести к гиперволемическому шоку.

При несахарном диабете и потерях воды через кожу и дыхательные пути возникает эуволемическая гипернатриемия.

Гиперволемическая гипернатриемия возникает при введении гипертонических растворов.

Гипернатриемия сопровождается жаждой, дрожью, мышечными подергиваниями, спутанностью сознания, судорожными припадками, коматозным состоянием.

Калий

Калий – основной внутриклеточный катион, участвующий в поддержании осмотического давления, кислотно-щелочного баланса, некоторых функций клеток, особенно нервных и мышечных. Концентрация калия в организме существенно влияет на работу сердца.

Нормальная концентрация: в крови – 38,4–64,0 ммоль/ л, в плазме – 3,4–5,3 ммоль/л, в эритроцитах – 79,8–99,3 ммоль/ л, в моче – 80–100 ммоль/л.

Общее содержание в организме – 2300–3200 ммоль.

Суточная потребность – 0,3–1,0 ммоль на кг массы тела, с пищей поступает около 50–200 ммоль.

Суточное выведение: с мочой – до 60 ммоль, с потом – до 10 ммоль, с калом – до 7 ммоль.

Отсутствие «депо» калия в организме ведет к тому, что повышение его потерь сразу же сказывается на внутриклеточном содержании и функции клеток и проявляется в первую очередь нарушениями в работе сердца.

Снижение концентрации калия в крови (гипокалиемия) возникает при недостаточном поступлении с пищей, увеличении потерь с мочой и калом, при рвоте, поносе, применении калийистощающих мочегонных средств, стероидных препаратов, при некоторых гормональных нарушениях, внутривенном введении больших объемов жидкости, не содержащей калия. Симптомы гипокалиемии возникают при снижении уровня калия до 3 ммоль/л. Наиболее часто встречающимися симптомами являются: мышечная слабость, общая заторможенность, запоры, в тяжелых случаях – мышечные параличи. Со стороны сердца выявляется синусовая брадикардия, тахикардия, типичные признаки на ЭКГ.

Повышение калия в плазме крови происходит при заболеваниях, сопровождающихся распадом клеток: некроз тканей, ожоги, опухоли, тяжелые травмы, анафилактический шок, при поражениях почек, при заболеваниях, сопровождающихся обезвоживанием.

Симптомами гиперкалиемии могут быть: чувство мышечной слабости, апатия, затруднения речи. Очень серьезным симптомом является изменение сократимости миокарда при уровне калия свыше 7,0 моль/л. В этих случаях существует опасность остановки сердца и развития внезапной коронарной смерти. Таким больным требуется неотложная терапия, направленная на снижение содержания калия в крови.

Несмотря на то что физиологические функции натрия и калия в организме различны, для их определения используют одинаковые физические принципы. Подавляющая часть калия в организме находится внутри клеток, и его концентрация в плазме, которая лишь приблизительно отражает общее содержание элемента в организме, может колебаться в значительных пределах, особенно у тяжелобольных. Она тесно связана с состоянием кровообращения и кислотно-щелочного равновесия, поэтому определение калия в плазме или сыворотке – один из важнейших показателей в реанимационной клинике.

Натрий – это почти исключительно внеклеточный элемент, его общее количество хорошо коррелирует с объемом межклеточной жидкости. У каждого человека концентрация натрия в плазме поддерживается с большим постоянством, физиологические колебания, как правило, меньше, чем точность обычных лабораторных методов.

При получении сыворотки в процессе формирования сгустка угольная кислота теряется, при этом изменяются соотношения эритроцитарного и плазматического объемов, что сказывается на концентрации натрия, колебания которого в сыворотке больше, чем в плазме. По этой причине для точного определения надо анализировать плазму, полученную с гепарином, так как солевые антикоагулянты, изменяя осмотическую концентрацию среды, вызывают сморщивание эритроцитов и разведение плазмы. Некоторые препараты гепарина содержат много натрия, тогда надо вводить на него поправку. Результаты определения натрия в плазме в целом имеют то же клиническое значение, что и результаты определения осмотической концентрации.

Выведение натрия с мочой относительно равномерно на протяжении суток, в то же время экскреция калия имеет четкий пик в утренние часы, соответственно возрастает и отношение K / Na, которое коррелирует с активностью глюкокортикоидов. Минералокортикоид альдостерон вызывает задержку натрия в организме, увеличивая отношение K / Na мочи.

Унифицированный метод фотометрии пламени. Определение в сыворотке и плазме крови

Принцип метода

Разведенная водой плазма или сыворотка крови распыляется и в виде мельчайших капелек с током воздуха поступает в пламя газовой горелки, которому калий придает слабое красно-фиолетовое, а натрий ярко-желтое окрашивание. Интенсивность окраски измеряется фотоэлементом. В связи с тем, что концентрация калия в плазме невелика, при его определении калибровочный раствор должен содержать также соли натрия, а при некоторых конструкциях прибора – и соли кальция. Натрия в плазме много, и он ярко окрашивает пламя, поэтому калибровочный раствор может содержать только соли натрия.

Приготовление калибровочных растворов

Есть 2 способа приготовления калибровочных растворов. В первом случае сначала готовят серию основных калибровочных растворов, концентрации электролитов в которых перекрывают возможный диапазон колебаний состава плазмы, а затем эти растворы разводят так же, как и исследуемую плазму. Этот способ позволяет в максимальной степени избежать погрешностей, связанных с неточностями пипеток, используемых при разведении, но необходим двойной набор посуды – для основных и рабочих растворов. В другом случае сразу готовят рабочие калибровочные растворы, которые имитируют состав разведенной для сжигания плазмы; такой раствор может быть использован лишь в том случае, если плазма всегда разводится совершенно одинаково. Считают, что первый более подходит для лабораторий, где электролиты определяются не очень часто, второй – для лабораторий, где проводится много определений, а методику можно считать хорошо налаженной.

При приготовлении калибровочных растворов используют соли натрия, калия и кальция, высушенные в сушильном шкафу при температуре 100–120 °C.

1. Натрия хлорид. Исходный калибровочный раствор, содержащий 1000 ммоль/л. Готовят, растворяя 11,69 г NaCl (поваренной соли) в воде и доводя объем до 200 мл.

2. Калия хлорид. Исходный калибровочный раствор с концентрацией 100 ммоль/л. Готовят, растворяя 0,746 г КСl в воде и доводя объем до 100 мл.

3. Кальция карбонат. Исходный калибровочный раствор, содержащий 100 ммоль/л. Готовят, растворяя 1,001 г СаСО_3 (кальция карбоната) в 1 н НСl и доводя объем до 100 мл той же кислотой.

4. Основной калибровочный раствор для определения калия готовят из исходных калибровочных растворов.

При построении калибровочного графика из основного калибровочного раствора готовят рабочие калибровочные растворы путем разведения водой во столько же раз, во сколько разводят и исследуемую плазму или сыворотку, желательно с использованием тех же пипеток, дозаторов и мерных колб.

5. Если чувствительность пламенного фотометра такова, что исследуемую плазму крови для определения надо разводить в 20 раз, рабочие калибровочные растворы для определения калия могут быть приготовлены также более простым способом. Для этого в мерную колбу вместимостью 1 л вносят 7 мл исходного калибровочного раствора NaCl с концентрацией 1000 ммоль/л и 2,5 мл исходного раствора СаСО_3 с концентрацией 100 ммоль/ л и доводят объем водой до 1 л. Получают фоновый раствор с концентрацией натрия и кальция 7 и 0,25 ммоль/л. Готовят также калибровочный раствор калия с содержанием 5 ммоль/л, для чего исходный раствор с концентрацией 100 ммоль/л разводят водой в 20 раз в мерной колбе вместимостью 100 мл. Смешивают оба раствора согласно приведенной ниже таблице 22.

Таблица 22

Определение электролитов в сыворотке и плазме крови

6. Основной калибровочный раствор для определения натрия готовят, помещая в мерную колбу вместимостью 100 мл 12–18 мл исходного раствора с концентрацией Na 1000 ммоль/ л, затем доводят водой до метки. Получается серия основных калибровочных растворов, которые содержат натрий в концентрациях от 120 до 180 ммоль/л. Для построения калибровочного графика каждый из этих растворов разводят в 100 раз, желательно с помощью тех же пипеток или дозаторов и мерных колб, которые используются при разведении исследуемого материала.

7. Рабочий калибровочный раствор для определения натрия в плазме крови можно приготовить также по следующей прописи: 2 мл исходного калибровочного раствора с содержанием натрия 1000 ммоль/л вносят в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят до метки водой. Из этого раствора, содержащего 10 ммоль/л, берут по 12–18 мл и вносят в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Получается серия растворов, содержащих натрий в концентрациях от 1,2 до 1,8 ммоль/л, т. е. в таких, которые соответствуют содержанию натрия в плазме крови от 120 до 180 ммоль/л, при условии, что исследуемый материал разводился перед определением в 100 раз.

Ход исследования

При определении калия в плазме крови очень важно, чтобы не было гемолиза, так как эритроциты значительно богаче этим элементом, чем плазма, и разрушение даже небольшого их количества приводит к завышенным результатам. Если есть хоть малейшее сомнение в том, что эритроциты удалены полностью, плазму или сыворотку надо повторно центрифугировать. В связи с тем что калий, хотя и медленно, но выходит из эритроцитов через неповрежденную мембрану, предпочтительнее использовать для исследования плазму, которую получают центрифугированием в течение 15 мин при скорости 3000 об./ мин не позднее чем через 45–60 мин после взятия крови.

Обычно для определения калия исследуемую плазму разводят водой в 20 раз, а для определения натрия – в 100 раз, но разведения могут быть и другими в зависимости от чувствительности прибора.

Определение начинают с того, что сжигают серию калибровочных растворов, затем исследуемые пробы и снова калибровочные растворы. Определение считают успешным, если калибровка, полученная вначале, совпадает с полученной в конце.

Результаты рассчитывают по калибровочному графику. После окончания анализа надо с особой тщательностью промыть и просушить распылитель согласно заводской инструкции. Это очень ответственная и легко повреждаемая деталь прибора, коррозия которой или засорение делает невозможным выполнение анализа.

Содержание натрия в плазме крови определяют так же, как и содержание калия, с той разницей, что исследуемый материал разводят, как правило, в 100 раз и используют калибровочный раствор для определения натрия.

Унифицированный метод определения натрия и калия в моче

Принцип метода

Определение натрия и калия в моче аналогично их определению в плазме крови с той разницей, что размах физиологических колебаний здесь больше, а различие между концентрациями Na и К не так велико, как в плазме, поэтому требования к точности меньше, следовательно, можно работать с общим калибровочным раствором.

Приготовление калибровочного раствора

Используют те же исходные калибровочные растворы, что и при анализе плазмы. Для приготовления основного калибровочного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 8 мл исходного калибровочного раствора хлорида натрия, содержащего 1000 ммоль/л, и 20 мл раствора хлорида калия, содержащего 100 ммоль/л, и доводят водой до метки 100 мл. Получается раствор, содержащий 80 ммоль/ л Na и 20 ммоль/ л К. Из него готовят разведения согласно таблице 23.

Таблица 23

Определение электролитов в моче

Ход исследования

Если в исследуемом материале имеется осадок, его тщательно перемешивают, 0,5 мл мочи вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки водой либо 1 мл вносят в колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. На пламенном фотометре сжигают сначала калибровочные растворы, затем исследуемые и снова повторяют калибровку.

Унифицированный метод определения в эритроцитах

Принцип метода

Эритроциты отделяют центрифугированием, гемолизируют водой и определяют содержание электролитов методом фотометрии пламени. В связи с тем что между эритроцитами всегда остается некоторое количество плазмы, большое значение имеет единообразие режимов центрифугирования; приведенный ниже режим рекомендован в качестве унифицированного.

Приготовление калибровочных растворов

В качестве исходных используют те же растворы, что и при определении натрия и калия в плазме.

1. Рабочий калибровочный раствор для определения калия в эритроцитах.

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 3,84 мл исходного калибровочного раствора КСl, содержащего 100 ммоль/л, и доводят объем водой до 100 мл; получается основной калибровочный раствор с концентрацией 3,84 ммоль/л. Из него готовят разведения согласно таблице 24.

Таблица 24

Определение электролитов в эритроцитах

2. Рабочий калибровочный раствор для определения натрия в эритроцитах.

В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 33 мл исходного калибровочного раствора КСl, содержащего 100 ммоль/л, и доводят до 1 л; получается фоновый раствор, содержащий 3,3 ммоль/л КСl. В колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл исходного калибровочного раствора NaCl, содержащего 1000 ммоль/л, и доводят до объема 100 мл фоновым раствором, содержащим 3,3 ммоль/л КСl; получается раствор, содержащий 10 ммоль/л NaCl и 3,3 ммоль/л КСl. Из полученных растворов готовят разведение согласно таблице 25.

Таблица 25

Определение натрия в эритроцитах

Ход исследования

Кровь для исследования берут с гепарином из Расчета 5 мг (650 ЕД) на 1 мл, центрифугируют в течение 15 мин при скорости 3000 об./мин, отсасывают плазму с верхним слоем эритроцитов и снова центрифугируют в течение 30 мин при скорости 3000 об./мин и удаляют верхний слой.

Из упакованного слоя эритроцитов берут пробу, которую разводят водой для определения калия в 260 раз, а для определения натрия – в 26 раз. Пробы сжигают одновременно с калибровочными растворами. Расчет проводят по калибровочному графику.

Кальций

Кальций – основной компонент костной ткани и зубов, участвует в свертывании крови, сокращении мышц, деятельности некоторых эндокринных желез. Всасывание и выведение кальция находятся под контролем гормонов (кальцитонина, паратиреоидного гормона) и активных метаболитов витамина D. 99 % кальция находится в костях, где он вместе с фосфором образует кристаллы гидроксиапатита, составляющего минеральную основу скелета. Несмотря на то что лишь около 1 % фиксированного кальция свободно обменивается с его растворенными фракциями, это существенно влияет на состояние костной ткани и ее механическую прочность.

Около 40 % всего кальция плазмы крови связано с белком, еще примерно 5 % образует комплексы с лимонной, фосфорной или угольной кислотой, остальной кальций находится в физиологически активном, ионизированном состоянии. Доля кальция, связанного с белками (так называемый неультрафильтруемый кальций), зависит от содержания протеина в плазме крови, поэтому четкой количественной связи между общим и ионизированным кальцием не существует, оба параметра имеют клиническое значение.

Во многих физиологических и патологических ситуациях представляет интерес именно содержание ионизированного кальция, но оно может быть определено лишь с помощью специальных кальциевых электродов, аналогичных электродам для определения рН.

Нормальная концентрация кальция в крови – 2,3–2,75 ммоль/л.

В крови кальций находится в трех формах:

1) около 0,9 ммоль/л связано с белками;

2) около 0,25 ммоль/л в комплексе с анионами (цитратом, лактатом, фосфатом, бикарбонатом);

3) 1,25 ммоль/л (около 50 %) в свободной или ионизированной форме.

Наибольшей физиологической активностью обладает ионизированный кальций.

Одним из наиболее распространенных заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция, является остеопороз. Это системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы костей и нарушениями в их строении, которые приводят к значительному увеличению хрупкости костей и возможности их переломов. У здоровых людей старше 20–25 лет с возрастом происходит уменьшение костной массы со скоростью 0,5–1 % в год. У женщин в постменопаузе, а также у мужчин и женщин старческого возраста среднее уменьшение массы костей может составить 3–5 % и более в год. Риск развития остеопороза повышают такие факторы, как дефицит эстрогенов (особенно в постменопаузе), недостаток кальция и витамина D в пище, алкоголь, курение, гиподинамия.

При первичном остеопорозе уровень кальция в крови остается, как правило, в норме. При вторичном остеопорозе, который возникает в результате нарушения кальциевого обмена под действием лекарственных веществ и глюкокортикоидов, при нарушениях всасывания кальция в кишечнике, выделения почками, концентрация кальция в крови снижена.

Увеличение концентрации кальция в крови наблюдается при гиперфункции или опухолях паращитовидных желез и повышенном образовании паратиреоидного гормона, а также при различных злокачественных опухолях с метастазами в кости и заболеваниях крови (миеломная болезнь, лимфома, лимфосаркома). Уменьшение продукции паратиреоидного гормона (по разным причинам) сопровождается снижением концентрации кальция в крови.

Предложено много химических методов определения кальция в сыворотке крови и в моче; они основаны главным образом на способности образовывать окрашенные соединения с комплексонами, т. е. веществами, образующими прочные комплексы с металлами. Здесь можно выделить 2 подгруппы – либо общее количество комплекса непосредственно определяется фотометрией, либо окрашенный комплекс используется лишь как индикатор конца титрования. Методы второй группы сейчас практически не находят применения.

Основными методами определения общего кальция являются:

1) метод Вилькинсона – титрование ЭДТА в присутствии мурексида;

2) калориметрический метод с использованием креозолфталеина;

3) калориметрический метод с использованием метил-тимолового голубого;

4) флуореметрический метод с использованием кальцеина;

5) пламенная эмиссия;

6) референсный метод (атомно-абсорбционная спектрофотометрия).

Посуда для выполнения анализа должна быть изготовлена из материала, который не содержит ионы кальция. Проба берется натощак, сыворотку быстро отделяют от сгустка.

Унифицированный метод по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Принцип метода

Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь добавляют 8-оксихинолин, который связывает металлы, мешающие определению, но образует с кальцием менее прочный комплекс, чем крезолфталеинкомплексон.

Необходимые реактивы

1. Боратный буфер: 200 г борной кислоты (Н_3ВО_3, ортоборная кислота) растворяют при нагревании в 300 мл воды, добавляют 580 мл 5 н КОН, объем доводят водой в мерной колбе до 1 л, при температуре ниже 56 °C из раствора могут выпадать кристаллы.

2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворяют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и доводят объем до 50 мл, для консервации добавляют 2 капли хлороформа, хранят в холодильнике.

3. 8-оксихинолин (оксин), 1 %-ный раствор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсолютного спирта.

4. Рабочий буферный раствор: к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают и устанавливают величину рН в пределах 10,5–10,6 с помощью 5 н КОН, добавляют 50 мл 1%-ного раствора оксихинолина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят до метки водой, после чего снова проверяют рН.

5. Крезилфталеинкомплексон, 0,1 %-ный раствор: 10 мг крезолфталеинкомплексона растворяют в 100 мл основного буферного раствора (при хранении в холодильнике реактив стоек не более 2–3 дней); калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий кальций в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 250 мг кальция карбоната (СаСО_3) в 5 мл 1 н НСl. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Для консервации добавляют 2 капли хлороформа. Одновременно готовят раствор соли магния 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния (MgCl_2 × 6Н_2О) в 100 мл воды. Из этих растворов готовят рабочие калибровочные растворы согласно таблице 26.

Таблица 26

Определение кальция по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Ход исследования

К 3 мл рабочего раствора крезолфталеинкомплексона добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.

Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего раствора крезолфталеинкомплексона. Одновременно обязательно ставят хотя бы одну калибровочную пробу. Расчет ведут по калибровочной кривой либо по правилу пропорций.

Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в раствор соли кальция, поэтому лабораторную посуду, особенно пробирки, желательно предварительно прокипятить в соляной кислоте. Определение желательно проводить в сыворотке или в плазме, полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислоты и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут помешать определению.

Метод определения кальция по цветной реакции с глиоксаль-бис-2-оксианилом

Принцип метода

Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации кальция.

Необходимые реактивы

1. Метиловый спирт (метанол), безводный.

2. Глиоксаль-бис-2-оксианил (ГБОА), 0,05 %-ный раствор в метаноле, 50 мг препарата растворяют в 100 мл этанола (раствор нестойкий).

3. Боратный буфер рН 12,6 – растворяют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г тетрагидробората натрия (Na_2B_4O_7 × 10Н_2О), объем доводят до 1 л в мерной колбе.

4. Ацетон.

5. Смесь метанола и ацетона 9: 1 (по объему).

6. Калибровочные растворы. Основной калибровочный раствор, содержащий 25 ммоль/л Са, готовят растворяя 100 мг карбоната кальция (СаСО_3) в 5 мл 1 н НСl и доводя объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы с концентрацией 1,5–3,5 ммоль/л, отбирая 6–14 мл в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводя объем водой до метки (приготовление аналогично методу, описанному в предыдущем методе, но без солей магния).

Ход исследования

К 1,5 мл боратного буферного раствора прибавляют 0,02 мл исследуемой сыворотки и через l,5 мин 0,5 мл 0,05 %-ного раствора ГБОА в метаноле и еще через 1,5 мин 1 мл смеси метанола и ацетона. Фотометрируют точно через 5–10 мин после добавления 0,05 %-ного раствора ГБОА при длине волны 540–550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду. Одновременно ставят также калибровочную пробу.

Расчет выполняют по калибровочному графику либо по правилам пропорции.

ГБОА в щелочной среде распадается с образованием анилина и глиоксаля, который затем окисляется в глиоксалевую кислоту, способную образовывать комплексы с кальцием. Даже в растворе абсолютного метанола на протяжении нескольких недель реактив разрушается. Накапливающаяся глиоксалевая кислота в значительно большей степени сказывается на экстинкции опытных, нежели калибровочных, проб. Поэтому измерение оптической плотности должно проводиться в совершенно определенное время, причем при длине волны 540–550 нм показания стабильнее, чем при длине 530 нм, при которой наблюдается максимум пика.

Метод определения кальция по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина

Принцип метода

Мурексид образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина.

Необходимые реактивы

1. Мурексидглицериновый реактив – 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина.

2. Калибровочные растворы готовят так же, как и в предыдущем методе.

Ход исследования

В 0,3 мл воды вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда же добавляют 3 мл мурексидглицеринового реактива, перемешивают и через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 490 нм против холостой пробы, в которой вместо исследуемой сыворотки применяют воду. Одновременно ставят калибровочную пробу, в которую вместо сыворотки берут 0,1 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по калибровочному графику.

Определение уровня ионизированного кальция

В современных газовых анализаторах имеется встроенный блок для определения концентрации ионизированного кальция.

Фосфор и фосфорсодержащие вещества

Фосфор находится в организме в форме неорганических фосфатов, в комплексе с липидами (липидный фосфор) и нуклеотидами (кислоторастворимый фосфор). Входит в состав скелета, фосфолипидов мембран, 2,3-дифосфоглицерата (вещества, определяющего способность гемоглобина присоединять кислород), участвует в процессах накопления и освобождения энергии в клетках (в составе АТФ, АДФ, АМФ), в ферментативных реакциях (в составе НАДФ). Поступает с пищей; всасывание в тонком кишечнике фосфора и кальция тесно связано и регулируется кальциферолом. Выведение с мочой зависит от функционального состояния почек.

Нормальная концентрация в крови: фосфор неорганический – 1–2 ммоль/л, фосфор липидный – 2,0–3,5 ммоль/л, в эритроцитах – 3–5 ммоль/л, фосфор кислоторастворимый (эритроциты) – 7–14 ммоль/л, в моче (неорганический фосфор) – 25,8–48,4 ммоль/сутки.

Определение концентрации фосфора в крови чаще всего назначается при нарушениях обмена кальция, так как наибольшее диагностическое значение имеет соотношение количества кальция и неорганического фосфора.

Увеличение концентрации отмечается при почечной недостаточности, передозировке витамина D, недостаточности паращитовидных желез, в некоторых случаях при миеломной болезни, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор). Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью.

Снижение концентрации происходит при дефиците витамина D, первичном гиперпаратиреозе, диабетическом кетоацидозе, алиментарной недостаточности, респираторном алкалозе, болезни Крона, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желез.

Определение неорганического фосфора

Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению фосфорно-молибденовой гетерополикислоты

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.

Необходимые реактивы

1. Кислота трихлоруксусная, раствор 100 г/л (10 %-ный).

2. Кислота серная 5 н.

3. Аммоний молибденовокислый, 5 %-ный раствор готовят, растворяя 5 г (NH_4)6Мо_7О_2 × 4Н_2О в 100 мл 5 н серной кислоты.

4. Натрий кислый сернистокислый NaHSO_3 (в такой форме соль существует только в растворе, это скорее коммерческое, нежели химическое название). При кристаллизации выпадает пиросернистокислый натрий (Na_2S_2O_5), который называют также метабисульфитом. Все 3 названия – бисульфит, пиросульфит и метабисульфит – синонимы. Препараты с этими названиями могут быть с равным успехом использованы для определения фосфора.

5. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия Na_2SO_3.

6. Эйконоген, раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита натрия в 20–25 мл воды, вносят в этот раствор 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), который также должен полностью раствориться, на что уходит некоторое время.

7. Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют.

8. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120 °C однозамещенного фосфата калия КН_2РО_4 в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1, 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1, 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.

Ход исследования

К 1 мл прибавляют 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин центрифугируют или фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата добавляют 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Через 20 мин фотометрируют при длине волны 630–690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта. Одновременно ставят холостой опыт, в который вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные опыты, в которые вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.

Расчет проводят по калибровочному графику или правилу пропорций.

Чувствительность метода можно значительно повысить, если после добавления эйконогена пробы нагревать в течение 7 мин на кипящей водяной бане и фотометрировать при длине волны 830 нм. В этом случае вместо 5 %-ного раствора молибденового аммония берут 0,5 %-ный раствор в 0,5 н серной кислоте, остальные реактивы те же. Согласно унифицированному методу окончательный объем фотометрируемых проб составляет 8 мл. Если объем кюветы меньше, все дозировки можно пропорционально уменьшить.

Метод определения фосфора по образованию окрашенного комплекса малахитового зеленого с фосфорно-молибденовой кислотой

Принцип метода

Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя с основным красителем – малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание.

Если фосфора нет, то малахитовый зеленый в кислой среде окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не мешает проведению реакции, поэтому депротеинизацию не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляется твин 20.

Необходимые реактивы

1. Малахитовый зеленый.

2. Аммоний молибденовокислый.

3. Цветной реактив – 1,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл воды, одновременно растворяют 10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл 5 н НСl. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют, за это время цвет реактива меняется.

4. Твин 20, 1,5 %-ный раствор – 0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды.

5. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль/л, готовят, растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого фосфата калия КН_2РО_4, высушенного при температуре 120 °C до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

Ход исследования

0,02 мл сыворотки вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют 2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5 %-ного раствора твина. Через 10–15 мин фотометрируют при длине волны 600–650 нм против холостого опыта, который ставят так же, как и основной опыт, но без сыворотки.

Для построения калибровочного графика берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного раствора, т. е. 10, 20 и 30 нмоль фосфора, доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной реактив и раствор твина так же, как в основном опыте. Калибровочная проба, в которую взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответствует опытной пробе, у которой взята сыворотка, содержащая фосфор в концентрации 1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сывороткам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора в 1 л. По этим данным строится калибровочная кривая, которая и используется для Расчета.

Определение липидного фосфора

Унифицированный метод определения фосфора после осаждения белков трихлоруксусной кислотой

Принцип метода

При осаждении белков крови трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды осаждаются вместе с белковым сгустком, а неорганический и кислоторастворимый фосфор остаются в растворе. Белковый сгусток минерализуется нагреванием с хлорной кислотой, и фосфор определяется эйконогеновым методом. В связи с тем что белки плазмы не содержат фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной кислотой фосфор входит в состав фосфолипидов.

Необходимые реактивы

1. Кислота хлорная 57 %-ная, ее концентрация должна быть 5,7 н, что проверяется титрованием. Если концентрация значительно ниже, что часто случается, так как препарат может содержать 40 или 50 % НСlО_4, соответственно увеличивается количество реактива, используемого при минерализации.

2. Кислота трихлоруксусная, 100 г/л (10 %-ный).

3. Аммоний молибденовокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя 4 г (NH_4) Mo_7O_24 × 4H_2O в 100 мл воды.

4. Натрий кислый сернистокислый.

5. Натрий сернистокислый безводный.

6. Эйконоген, раствор.

7. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, разводят водой в 50 раз; получается раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.

Ход исследования

К 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно 3 мл 10 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 1–2 мин центрифугируют, надосадочную жидкость сливают – пробирку переворачивают и дают стечь жидкости. К осадку добавляют 1 мл 57 %-ной хлорной кислоты; если ее концентрация ниже, соответственно увеличивают количество кислоты, переносят в колбу или в большую пробирку для сжигания и минерализуют.

Минерализация – наиболее ответственный этап определения. Дигидрат хлорной кислоты НСlО_4 × 2Н_2О кипит при температуре 203 °C, при более низкой температуре из пробы удаляют воду, а при повышении температуры начинает улетучиваться сама хлорная кислота. Температурный режим должен быть подобран так, чтобы пары дигидрата хлорной кислоты конденсировались на стенках и в виде капелек опускались на дно, где опять испарялись, и т. д. При оптимальных условиях минерализация заканчивается за несколько часов; если температура слишком низкая, она затягивается, если слишком высокая, хлорная кислота улетучивается, и проба будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы в больших пробирках 20 × 200 мм, которые устанавливают в подогреваемом электричеством металлическом блоке (каждую пробирку в отдельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают специальными затычками или колпачками, на которых также конденсируются и стекают вниз пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2–3 см; большая часть пробирки, которая находится над блоком, остается свободной и относительно холодной, на ней и конденсируется хлорная кислота. Желательно, чтобы температура в блоке поддерживалась на уровне 200–210 °C с помощью электронного реле, соединенного с контактным термометром (как в термостате). Такое устройство позволяет сжигать большое количество проб с наименьшими затратами времени лаборанта, но можно работать также с круглодонными колбами с длинными горлышками (колбы Кьельдаля) на песчаной бане, но это требует большего внимания к ходу минерализации. Внешний признак того, что минерализация окончилась, – просветление проб, но он может быть обманчивым. В то же время слишком длительное нагревание приводит к потерям, поэтому перед началом серийных анализов надо отработать режим сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.

После охлаждения к минерализованной пробе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл раствора эйконогена, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин фотометрируют в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 630–690 нм против холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную реакцию так же, как и в опыте.

Для построения калибровочной кривой минерализуют калибровочные пробы, содержащие 0,2–1 мкмоль фосфора. Для этого к ним прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят нагревать вместе с опытными пробами, после чего проводят цветную реакцию. По калибровочному графику вычисляют содержание фосфора в пробе, эту величину умножают на 5 и получают концентрацию мкмоль/мл или ммоль/л.

После минерализации образовавшийся неорганический фосфор может быть определен любым методом, в том числе и наиболее чувствительным с малахитовым зеленым. Иногда в процессе минерализации образуется некоторое количество пирофосфата, что приводит к заниженным результатам анализа. В этом случае пробу после разведения водой ставят на несколько минут на кипящую водяную баню, при этом пирофосфат гидролизуется.

Определение фосфонуклеотидов

Определение нуклеотидов эритроцитов электрофоретическим методом

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждают трихлоруксусной кислотой, надосадочную жидкость подвергают электрофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1. Пятна АТФ и АДФ идентифицируют в ультрафиолетовом свете, вырезают, элюируют и количественно определяют прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовом свете при длине волны 260 нм.

Необходимые реактивы

1. Натрия цитрат трехзамещенный.

2. Гепарин, ампулированный препарат, активность 5000 ЕД/мл.

3. Натрия хлорид 0,85 %-ный раствор (физиологический раствор).

4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15 %-ный раствор).

5. НСl 0,01 н.

6. Цитратный буфер рН 5,1 готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кислоты. Объем доводят до 1 л.

7. Бумага для электрофореза, разрезанная на ленты 35 × 200 мм.

Ход исследования

Кровь берут с гепарином из Расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки дважды промывают изотоническим раствором натрия хлорида при температуре 4 °C, каждый раз центрифугируя, отсасывая надосадочную жидкость и вновь ресуспендируя в новой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной взвеси добавляют 0,5 мл 15 %-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой, выдерживают при температуре 4 °C в течение 10 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бумагу для электрофореза согласно правилам работы на приборе. На место старта равномерной поперечной полосой наносят 0,05 мл исследуемого трихлоруксусного экстракта и проводят электрофорез при напряжении 12–14 В/см при силе тока 0,5–1 мА на 1 см поперечного сечения ленты в течение 3,5 ч. После этого электрофореграммы высушивают в темноте и рассматривают при освещении коротким ультрафиолетовым светом (длина волны меньше 300 нм, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюмберга или другим аналогичным прибором). Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в виде темных пятен. Ближе к старту находится АДФ, дальше от старта – АТФ. Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н НСl в течение 4 ч. Одновременно экстрагируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов; этот раствор используют в качестве холостого опыта. Экстинкции всех растворов измеряются при длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, из первой величины вычитают вторую.

Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинкции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этими небольшими различиями можно пренебречь и принять его равным 14,2 × 10^3. Это значит, что такая величина оптической плотности получится, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 см раствор концентрации 1 моль/л и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/л величина будет 0,0142.

В данном методе окончательное разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из 25 мкл эритроцитной массы оказываются в 5 мл), поэтому Расчет производят по формуле:

Е × 200 / 0,0142 = Е × 14 085 мкмоль / л эритроцитарной массы,

где Е – разность оптических плотностей, измеренных при длинах волн 260 и 290 нм.

Нормальные величины: для АТФ – 600–1400 мкмоль/л, для АДФ – 250–800 мкмоль/л, отношение молярных концентраций АТФ / АДФ в норме 2.

Определение адениловых нуклеотидов эритроцитов методом тонкослойной хроматографии

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждаются хлорной кислотой, избыток которой удаляется в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат хроматографируется в тонком слое на пластинах «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в ультрафиолетовом свете и определяются по светопоглощению элюатов.

Необходимые реактивы

1. Диоксан.

2. Изопропиловый спирт.

3. Аммиак, концентрированный раствор.

4. Кислота хлорная, 0,8 н (8 %-ная НСlО_4).

5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л готовят, растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ, К_2СО_3) в воде, объем доводят до 100 мл. В случае необходимости препарат предварительно сушат при температуре 105–110 °C.

6. Подвижная фаза для хроматографии – смешивают 40 мл диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл воды и 10 мл концентрированного раствора аммиака. Можно использовать и более простую систему, которую готовят без изопропанола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды и 10 мл раствора аммиака.

7. НСl, 0,1 н.

8. Натрия хлорид, 0,85 %-ный раствор (изотонический раствор).

9. Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол».

Ход исследования

Кровь берут с гепарином, добавляя его из Расчета 12 ME на 1 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза промывают холодным изотоническим раствором натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по 20 мин при скорости 3000 об./мин.

К 1 мл эритроцитной массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивают и через несколько минут осадок отделяют центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляют на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05–0,1 мл холодной надосадочной жидкости (если она согреется, кристаллы частично растворяются) наносят в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хроматографию в течение 60–90 мин в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака.

Перед началом хроматографии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти расстояние не менее 3/4 пластины; если он не пройдет его, то наиболее вероятная причина этого – плохое насыщение камеры парами подвижной фазы или плохая герметизация камеры.

Вынутые из камеры пластины высушивают на воздухе и просматривают в коротком ультрафиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюмберга или другом аналогичном приборе), находят пятна нуклеотидов и обводят их острым предметом. В этой системе быстрее всего движется АМФ, медленнее – АТФ. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливают и элюируют 3 мл 0,1 н НСl. Определяют светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм.

При налаживании методики рекомендуется провести определение в калибровочном растворе, содержащем в 1 мл 30–60 нмоль (15–30 мкг) ампулированного препарата АТФ, который непосредственно наносят на хроматографическую пластину так же, как и нейтрализованный хлорный экстракт. Эти препараты обычно помимо АТФ содержат также АДФ и АМФ.

Расчет проводят исходя из молярных коэффициентов экстинкции: для АТФ – 14 600, для АДФ – 15 000, для АМФ – 14 700. Если для хроматографии было взято 0,1 мл нейтрализованного экстракта и окончательный объем после элюации был 3 мл, разведение составляет 1: 63, поэтому для того чтобы выразить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо величину умножить на 4315, для АДФ коэффициент составляет 4200, для АМФ – 4286. Если же для хроматографии берут 0,05 мл нейтрализованного экстракта, коэффициенты должны быть в 2 раза выше.

Нормальные величины: содержание АТФ – 726 × 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ – 262 × 1,2 мкмоль/л, АМФ – 4,1 × 1,3 мкмоль/л.

Магний

Магний – второй по концентрации после калия внутриклеточный катион, входит в состав ряда ферментов. Наиболее необходим для функционирования сердца, нервной и мышечной ткани. Он содержится в мышечной и костной ткани. Активность многих ферментов зависит от магния.

Нормальная концентрация: в плазме – 0,7–1,2 ммоль/л, в моче – 3–5 ммоль/сутки.

Общее содержание в организме – около 1640 ммоль, из них:

1) в скелете – около 50 %;

2) в мышцах – около 30 %.

Суточная потребность – 300–400 мг.

Снижение концентрации магния обнаруживается одновременно в крови и моче при больших потерях воды (продолжительные поносы, полиурия при заболеваниях почек, прием мочегонных средств), при нарушениях всасывания в кишечнике, хроническом алкоголизме, в период беременности. Недостаток магния проявляется нарушениями сердечной деятельности, а при значительном дефиците – судорогами.

Избыточное содержание магния отмечается при хронической почечной недостаточности, гипофункции щитовидной железы и вызывает замедление проведения нервного импульса в проводящей системе сердца, блокаду нервно-мышечной передачи.

Методы определения магния во многом близки методам определения кальция, так как и в том и в другом случае на первом месте по точности стоит атомная абсорбция, на втором – химические методы, основанные на образовании окрашенных комплексных соединений.

Хотя магний, подобно кальцию, только частично находится в плазме крови в ионизированном состоянии, а частично связан с белками и низкомолекулярными комплексообразователями – лимонной и фосфорной кислотами, клиническое значение имеет только определение общего магния.

Известно много веществ, образующих окрашенные или флюоресцирующие комплексы с магнием, аналитическая пригодность их определяется чувствительностью и способностью избирательно реагировать с магнием в присутствии кальция. Однако абсолютной избирательности достичь очень трудно, поэтому приходится использовать составные калибровочные растворы, в которых присутствуют несколько веществ.

Давно известен не очень чувствительный метод определения с титановым желтым, который достаточно специфичен, но требует предварительной депротеинизации, благодаря чему может быть использован для определения магния в эритроцитах. Значительно чувствительнее метод с магоном (ксилидиновым синим II) или его сульфопроизводным (ксилидиновым синим I). В кислой среде это вещество существует в виде окрашенного в красный цвет недиссоциированного соединения, в слабощелочной – в виде однозарядного иона синего цвета, а в сильнощелочной – в виде двухзарядного иона красного цвета. С ионом магния образуют устойчивый окрашенный в красный цвет комплекс два однозарядных иона.

Определение магния по цветной реакции с титановым желтым

Принцип метода

Магний в щелочной среде образует комплекс красного цвета с титановым желтым, присутствие гидроксиламина стабилизирует окраску. При анализе сыворотки или эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия, моча предварительно разводится до нужной концентрации.

Необходимые реактивы

1. 0,075 %-ный раствор титанового желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл воды, хранят в холодильнике в темной склянке (реактив очень светочувствителен, годен не более 10 дней).

2. 2 %-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина: 2 г гидроксиламина гидрохлорида растворяют в 100 мл воды.

3. 0,1 %-ный раствор метилового красного в 95 %-ном этиловом спирте (индикатор с зоной перехода рН 4,4–6,2).

4. 0,2 н NaOH.

5. 1,5 н NaOH.

6. 10 %-ный раствор вольфрамовокислого натрия: 10 г вольфрамата натрия (Na_2WO_4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

7. 0,67 н серная кислота.

8. Калибровочный раствор магния сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния (MgSO_4 × 7H_2O) растворяют в воде, объем доводят в мерной колбе до 1 л.

Ход исследования

К 2 мл воды добавляют 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 10 %-ного вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н серной кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой, а затем через 10–15 мин центрифугируют или фильтруют. В градуированную пробирку или мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают 2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют каплю индикатора метилового красного и 0,2 н NaOH до установления желтой окраски. После этого прибавляют 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 1 мл 0,075 %-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH и доводят объем водой до 10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500–560 нм против холостого опыта, в котором вместо сыворотки крови берут 1 мл воды.

Для построения калибровочного графика в серию пробирок вносят от 0,2 до 1 мл калибровочного раствора 1 ммоль/л, доводят водой до объема 6 мл, прибавляют по 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 0,075 %-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH. Окраска раствора, в который добавлено 0,2 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию магния в плазме 0,4 ммоль/л, раствора, в который добавлено 0,5 мл, – концентрации 1 ммоль/л и т. д.

При определении содержания магния в эритроцитах 0,5 мл эритроцитарной взвеси, полученной так же, как и при определении в клетках калия и натрия, вносят в 2,5 мл воды. Через несколько минут, когда взвесь просветлеет (станет лаковой), что свидетельствует о завершении гемолиза, добавляют вольфрамат натрия, серную кислоту и так далее аналогично определению в плазме. Метод пригоден также для определения магния в моче. В этом случае ее разводят водой в 10 или 20 раз (так как концентрация может сильно колебаться), к 0,5 мл приливают 5,5 мл воды, по 1 мл растворов гидрохлорида гидроксиламина и 0,075 %-ного титанового желтого, а также 2 мл 1,5 н NaOH и фотометрируют.

Определение магния по цветной реакции с магоном

Принцип метода

Магний дает с магоном (ксилидиловым синим II) яркое окрашивание, белки сыворотки не препятствуют его развитию. В связи с тем что на интенсивности окраски сказывается присутствие других катионов, используют комплексный калибровочный раствор.

Необходимые реактивы

1. Раствор магона, содержащий 0,28 ммоль/л: 115,4 мг магона при нагревании растворяют в 50 мл диметилформамида, объем доводят до 1 л 96 %-ным этиловым спиртом.

2. 0,02 М боратный буфер рН 9,5: примерно в 800 мл воды растворяют 7,63 г буры (Na_2B_4O_7 × 10Н_2О), прибавляют 79 мл 0,1 н NaOH и проверяют рН, добавляют столько щелочи, сколько необходимо, чтобы рН был 9,5, после чего водой доводят объем до 1 л.

3. Рабочий раствор магона – в день определения смешивают равные части раствора магона и боратного буфера; реактив нестоек, годен в течение одного рабочего дня.

4. Комплексный калибровочный раствор: 200 мг металлического магния в виде стружки промывают разбавленной НСl, водой, спиртом и эфиром, высушивают сначала в токе азота, затем под вакуумом и растворяют в 15 мл концентрированной НСl, добавляют около 200 мл воды и 2,5 г кальция карбоната (СаСО_3), 2,86 г калия хлорида (КСl) и 65,4 г натрия хлорида (NaCl); после растворения всех ингредиентов объем доводят водой до 1 л. Получается раствор, содержащий 200 мг магния в 1 л, перед употреблением его разводят водой в 10 раз, получается рабочий калибровочный раствор, содержащий 0,823 ммоль/л магния (2 мг%).

Ход исследования

К 4 мл рабочего раствора магона прибавляют 30 мкл исследуемой сыворотки или спинномозговой жидкости, перемешивают и фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 505 нм против холостого опыта, в котором вместо сыворотки берут воду. Одновременно ставят калибровочный опыт, в котором вместо сыворотки берут 30 мкл рабочего калибровочного раствора, содержащего 0,823 ммоль/л магния. Расчет ведут по правилу пропорций.

Хлориды

Хлориды поступают в организм в виде солей натрия, кальция, магния, которые при растворении диссоциируют на катионы и анионы хлора. Ионизированный хлор играет большую роль в поддержании кислотно-щелочного равновесия и баланса воды в организме.

Нормальная концентрация в крови:

1) новорожденные до 30 дней – 98–113 ммоль/л;

2) взрослые – 97–108 ммоль/л, в моче – 150–250 ммоль/сутки;

3) взрослые старше 90 лет – 98–111 ммоль/л.

У здоровых людей, несмотря на избыточное или недостаточное поступление хлористого натрия (поваренной соли), в крови сохраняется нормальная концентрация ионов хлора благодаря регулированию их выведения с мочой.

Клиническое значение определения хлоридов такое же, как и натрия.

Увеличение концентрации хлоридов в крови – признак обезвоживания – может возникать при недостаточном поступлении жидкости, нарушении мочеотделения при заболеваниях почек или закупорке мочеточников, при несахарном диабете, респираторном алкалозе, повышенной функции коры надпочечников, травмах головы, сопровождающихся повреждением гипоталамуса.

Снижение концентрации хлоридов в крови возникает при избыточном потоотделении, рвоте, респираторном и метаболическом ацидозе, применении диуретиков, появлении отеков, истощении запасов натрия при потерях солей из ткани мозга после травмы головы, острой порфирии, синдроме неадекватной секреции антидиуретического гормона.

Повышенное выведение с мочой отмечается при недостаточности коры надпочечников, истощении запасов натрия, хроническом нефрите; уменьшенное выведение – при развитии отеков, голодании, рвоте, усиленном потоотделении.

Концентрация хлоридов резко возрастает в поте и слюне при муковисцидозе.

Хлор, как и натрий, – внеклеточный элемент, поэтому их определение имеет аналогичное клиническое значение с той разницей, что физиологические механизмы поддерживают концентрацию натрия в значительно более узких пределах. Происходит это потому, что натрий – основной катион внеклеточных жидкостей, на его долю приходится 92–93 % всех положительных зарядов, в то время как главных анионов три: хлор, бикарбонат и органические кислоты, причем на долю хлора приходится лишь 2/3 их общего количества. Хотя сумма анионов так же постоянна, как и сумма катионов, но колебания хлора относительно больше, чем натрия, так как уравновешиваются изменениями других анионов.

Определение натрия в биологических жидкостях на пламенном фотометре просто и надежно; для хлора аналогичного метода нет, поэтому натрий определяют в биохимических лабораториях значительно чаще, чем хлор. Однако в некоторых случаях, если речь идет об анализе отдельных проб в небольших лабораториях, особенно при исследовании мочи, определение хлора предпочтительнее, так как не требует почти никакого оборудования. Одновременное определение и хлора, и натрия вместе с другими неорганическими ионами плазмы иногда используют для того, чтобы вычислить содержание органических кислот, которое соответствует разности между суммами неорганических катионов и анионов.

Хлор чаще всего определяют титрованием, так как, подобно другим галогенам, Сl— образует плохо растворимые соли с ионами серебра и ртути. Основная методическая проблема – как установить конец титрования, т. е. появление избытка серебра или ртути. Для этого используются электрохимические методы или обратное титрование, когда ионы хлора осаждаются ионами серебра, а их избыток затем оттитровывается роданид-ионами, используя в качестве индикатора конца титрования соли железа. Однако практичнее всего прямой метод, при котором к исследуемому раствору добавляются соли ртути, а в осадок выпадает нерастворимая каломель. Эти методы возможны благодаря эффективным индикаторам на ртуть – органическим веществам, ртутные соли которых окрашены. Когда весь хлор удален из раствора, новые порции титранта окрашивают его. На этом основан унифицированный метод, в котором в качестве индикатора на ртуть используется дифенилкарбазон.

Самые распространенные методы определения хлора – аппаратурные, в которых используется кулонометрическое титрование. Оно заключается в том, что измеряется количество электричества, необходимое для того, чтобы удалить весь хлор из раствора. Анализ сводится к тому, что небольшое количество исследуемой жидкости (порядка 0,01–0,02 мл) – плазмы, сыворотки, мочи или пота – разводится буферным раствором, содержащим соли азотной кислоты. В раствор погружены 3 электрода: рабочий, индикаторный и индифферентный. К рабочему (серебряному) электроду прилагается положительный электрический потенциал, в результате чего через раствор течет ток, количество которого измеряется специальной электронной схемой – кулонометром. Атомы серебра на рабочем электроде превращаются в ионы Ag+, которые сразу же реагируют с ионами Сl—, в результате чего выпадает нерастворимое хлорное серебро. Когда весь хлор удален из раствора, концентрация в нем резко возрастает; это улавливается индикаторным электродом, сигнал с которого останавливает титрование. Содержание хлора в пробе вычисляется по формуле Фарадея, которая связывает количества электрического тока и выделившегося серебра, потребовавшегося, чтобы связать весь хлор.

Унифицированный меркуриметрический метод определения хлора

Принцип метода

Исследуемая биологическая жидкость титруется раствором азотнокислой ртути, образующаяся каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор связан, избыток ионов ртути образует с индикатором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое окрашивание, что служит признаком конца титрования.

Необходимые реактивы

1. Ртуть азотнокислая, раствор 6 ммоль/л: 2 г Hg(NO_3)2 × 0,5Н_2О растворяют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н азотной кислоты и доводят водой до 1 л.

2. Дифенилкарбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96 %-ного этилового спирта, хранят в посуде из темного стекла в холодильнике (стоек в течение месяца).

3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл концентрированной азотной кислоты (плотность 1,4) разводят в 100 мл воды.

4. Калибровочный раствор, 10 ммоль/л: хлорид натрия (поваренная соль) высушивают до постоянной массы при температуре 120 °C, 584 мг препарата растворяют в воде и доводят объем до 1 мл.

Ход исследования

Сначала устанавливают величину фактора раствора для титрования (титранта). Для этого в маленький стаканчик или колбочку вносят 2 мл калибровочного раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенилкарбазона, постоянно перемешивая, титруют раствором азотнокислой ртути до появления темного окрашивания. Фактор титранта вычисляют, разделив 20 (количество микромолей хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число миллилитров, пошедших на титрование. Фактор указывает, какому количеству микромолей хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта.

При исследовании опытной пробы поступают аналогично: в маленький стаканчик или колбочку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, добавляют 4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и титруют раствором азотнокислой ртути при постоянном перемешивании до появления темной окраски. Удобнее всего перемешивать магнитной мешалкой. На титрование сыворотки должно пойти примерно 3 мл титранта.

Раствор азотнокислой ртути можно приготовить из красной окиси ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты и доводят объем водой до 1 л. Раствор дифенилкарбазона должен быть красно-оранжевого цвета; если окраска становится желтой или вишнево-красной – реактив непригоден.

Микроэлементы

К микроэлементам относят химические элементы, содержание которых в организме колеблется от нескольких микрограммов до нескольких нанограммов. Несмотря на такое мизерное количество, их влияние на биохимические процессы и функции организма очень существенно, так как они входят в состав ферментов, комплексы белков и нуклеиновых кислот, являются катализаторами многих процессов. Избыток или недостаток микроэлементов может приводить к тяжелым расстройствам функций клеток и органов. Определение концентрации микроэлементов проводят только в специализированных лабораториях и в особых случаях, так как, во-первых, нарушение баланса микроэлементов как самостоятельная причина заболеваний встречается редко, и, во-вторых такой анализ продолжителен и дорогостоящ в силу сложности и трудоемкости.

Для анализа используют не только кровь, мочу или ткани, но и волосы, иногда – ногти, где микроэлементы накапливаются и долго сохраняются.

Ниже мы остановимся только на тех показателях, которые имеют наибольшее диагностическое значение.

Железо

Железо входит в состав молекул гемоглобина, миоглобина, цитохромов и некоторых ферментов. Общее содержание в организме – 4–5 г. Основная часть, около 70 %, входит в состав гемоглобина, 20–25 % находится в запасных депо (в печени, селезенке, костном мозге) в виде ферритина и гемосидерина. Переносится в организме в составе специального транспортного белка – трансферрина. Из пищи усваивается около 10–15 % железа, поэтому суточная потребность составляет 12–15 мг.

Лабораторными анализами определяется плазменное железо, которое в основном связано с трансферрином, ферритином и внеэритроцитарным (внутрисосудистым) гемоглобином. В норме трансферрин насыщен железом примерно на 30 %. Дополнительное количество железа, которое может связаться с трансферрином, определяется как «ненасыщенная железосвязывающая способность сыворотки крови» (НЖСС). Максимальное количество железа, которое может присоединить трансферрин, обозначается как «общая железосвязывающая способность сыворотки крови» (ОЖСС).

Нормальная концентрация плазменного железа у мужчин – 12–32 мкмоль/л, ОЖСС – 54–72 мкмоль/л, НЖСС – 26,9–41,2 мкмоль/л; у женщин эти показатели на 10–15 % ниже.

Нормальное насыщение трансферрина железом: у мужчин – 25,6–48,6 %, у женщин – 25,5–47,6 %.

Железо, высвобождающееся при разрушении старых эритроцитов, не выводится из организма, а используется повторно для синтеза гемоглобина. Наибольшая потеря железа происходит при кровопотерях – физиологических (менструация) и патологических (желудочные, кишечные, легочные, маточные, геморроидальные и другие кровотечения). В связи с этим у женщин потребность в железе примерно вдвое выше, чем у мужчин. При беременности женщина теряет около 350 мг железа, которое идет на формирование депо у ребенка.

Причинами дефицита железа могут быть его недостаточность в пище (однообразное питание с низким содержанием животных белков и зелени) и нарушение всасывания при недостатке витамина С, заболеваниях желудка и кишечника (атрофические процессы, удаление части желудка, воспалительные процессы), злокачественных заболеваниях. На начальных этапах недостаток поступления или большие потери железа компенсируются его запасами из депо. Выраженная недостаточность проявляется снижением содержания гемоглобина и цветного показателя – железодефицитной анемией.

Это весьма распространенное заболевание, особенно у беременных. Определение уровня сывороточного (плазменного) железа и трансферрина позволяет проводить дифференциальную диагностику железодефицитной анемии с другими формами анемий, назначать соответствующее лечение и объективно судить об его эффективности.

Значительное увеличение сывороточного железа с высоким (до 85 %) насыщением трансферрина отмечается при различных по природе (наследственных или приобретенных) гемохроматозах – заболеваниях, характеризующихся повышенным всасыванием железа в кишечнике и отложением в органах и тканях железосодержащих пигментов.

Подавляющая часть всего железа человеческого организма находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина. Каждая его молекула содержит 4 атома двухвалентного железа, на долю которых приходится 0,334 % ее массы, что при концентрации гемоглобина в крови 140 г/л соответствует содержанию железа 500 мг/л крови. Определение содержания железа в цельной крови не имеет практического значения, так как определять гемоглобин значительно проще. Иное дело плазма крови, содержание железа в которой примерно в 300 раз ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая часть находится в окисленном состоянии, т. е. трехвалентна, и связана с белком трансферрином (сидерофилином); кроме того, в плазме имеются геминовое железо, ферритин и внутрисосудистый гемоглобин. Так называемое геминовое железо входит в состав молекул, содержащих только по одной порфириновой группе. Это продукты неполного синтеза или распада гемоглобина и дыхательных ферментов, они связаны с транспортным сывороточным белком гемопексином. Ферритин – самый богатый железом сывороточный белок, в его составе находится мицелла, содержащая до 4300 атомов окисленного железа. Молекулы гемоглобина, образовавшиеся в результате внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфириновых кольца, они связываются не с гемопексином, а с гаптоглобином. Разрушение эритроцитов и увеличение содержания в плазме свободного гемоглобина почти неизбежны при взятии крови. Считается, что при соблюдении всех предосторожностей (игла с широким просветом, свободное вытекание крови, центрифугирование в течение 45 мин при скорости 2500 об./мин, отсасывание сыворотки и повторное центрифугирование) удается уменьшить количество свободного гемоглобина в сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что соответствует содержанию железа 100 мкг/л или примерно 1/15 всего железа сыворотки. Используемые при получении плазмы антикоагулянты сами связывают железо, поэтому рекомендуется исследовать содержание железа именно в сыворотке.

Железо поступает в организм через желудочно-кишечный тракт, а выводится почти исключительно с калом (конечно, если нет кровотечения или гематурии), поэтому содержание его в моче у здоровых людей очень мало – 0,7–5,7 нмоль/сутки (0,04–0,3 мкг), это количество не может быть уловлено обычными методами. После приема некоторых железосодержащих препаратов или комплексообразователя десферала, который способствует опустошению депо, выведение железа с мочой значительно увеличивается и может быть измерено. Состояние обмена железа лучше всего характеризует количество негеминового сывороточного железа, т. е. железа трансферрина и ферритина, так как это основной резерв, который используется организмом в случае необходимости. Общее количество трансферрина, связанного с железом и свободного, может быть определено также иммунологическими методами. Определяют количество свободного трансферрина и по его способности связывать радиоактивное железо. Для практических лабораторий, использующих обычные биохимические методы, наибольшее значение имеет определение негеминового железа сыворотки, а также ее железосвязывающей способности, т. е. того максимального количества трехвалентного железа, которое может связаться с белками сыворотки.

Прочность комплекса трансферрин – железо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы буферного раствора. При увеличении кислотности, а также восстановлении железа комплекс распадается. Другие соединения, например гемоглобин, в этих условиях не разрушаются или разрушаются лишь незначительно, поэтому кислотноотщепляемое, или негеминовое, железо лучше других компонентов плазмы характеризует резервы железа в организме.

Существуют несколько вариантов методов определения негеминового железа. В частности, некоторые рекомендуют проводить нагревание на водяной бане для лучшего разрушения комплекса, но при этом всегда существует угроза, что разрушатся и другие железосодержащие соединения, поэтому результаты анализа будут завышенными.

Известно много цветных реактивов как на восстановленное (Fe+2), так и на окисленное (Fe+3) железо; лучшие результаты получаются с батофенантролином, который образует наиболее прочный и ярко окрашенный комплекс. Но батофенантролин не растворяется в воде, поэтому его надо предварительно обработать хлорсульфоновой кислотой либо использовать спиртовой раствор. При определении железа после минерализации с серной кислотой надо всегда иметь в виду, что почти неизбежно образующаяся в этих условиях пирофосфорная кислота, связывая железо, мешает проведению цветной реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая на водяной бане слегка разбавленный минерализат.

Условия взятия материала

Определение сывороточного железа обычно проводят для выявления железодефицитного состояния, поэтому, как правило, информативно уменьшение его содержания. Обследуемые по крайней мере в течение 2 недель перед взятием крови не должны получать железосодержащих препаратов. Кровь надо брать широкими иглами. Сыворотка должна быть свободна от видимых следов гемолиза.

Определение железа по цветной реакции с сульфонированным батофенантролином

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, которая при прогревании разрушает также комплекс железа с трансферрином. Для установления оптимальной величины рН 4,8–5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа – гидразин. Двухвалентное железо образует окрашенный комплекс с батофенантролином, который переведен в сульфатированную форму добавлением хлорсульфоновой кислоты.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 20 %-ная.

2. Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония (CH_3COONH_4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл, препарат гигроскопичен.

3. Гидразина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды.

4. Раствор сульфонированного батофенантролина: в пробирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане в течение 5 мин и разбавляют 100 мл воды, добавляя 5 н NaOH, устанавливают рН 4,0 и доводят объем водой до 200 мл.

5. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сначала готовят раствор соли Мора (железо-аммиачные квасцы, аммоний-железо II сернокислое), FeSO_4 × (NH_4)SO_4 × 6H_2O, содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н НСl и доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температурой 90–95 °C. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70 %-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:

Еоп1 – Еоп2 / Ек1 – Ек2 × 30,

где Еоп1 и Еоп2 – отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;

Ек1 и Ек2 – соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при Расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.

Определение железа по цветной реакции со спиртовым раствором батофенантролина

Принцип метода

Сывороточное железо восстанавливают тиогликолевой кислотой, белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате устанавливают нужную величину рН, добавляя ацетат натрия, и проводят цветную реакцию с батофенантролином. В связи с тем что он в воде не растворяется, используют спиртовой раствор.

Необходимые реактивы

1. Кислота тиогликолевая, кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

2. Натрия ацетат, насыщенный раствор (в случае необходимости его очищают от следов железа, растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °C). К прозрачной надосадочной жидкости добавляют раствор батофенантролина из Расчета 10 мл на 1 л и этиловый спирт в количестве, равном количеству надосадочной жидкости; на холоде выпадают кристаллы СН_3СООNа × 3Н_2О.

3. Батофенантролин, 40 мг в 100 мл этанола.

4. НСl 1 н раствор.

5. Калибровочный раствор железа: 100 мг мягкой железной проволоки растворяют в 4 мл концентрированной НСl и разводят до 1 л водой, получается раствор, содержащий 100 мкг/мл. Из него разведением в 60 раз получают раствор, содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

Учитывая, что метод определения очень чувствительный, необходимо принять все меры, чтобы реактивы и посуда не содержали железа, присутствие которого выявляется при постановке холостых проб. Посуду, в том числе пробирки для взятия крови, необходимо обрабатывать разбавленной НСl; должна использоваться только деионизированная или перегнанная в стеклянной посуде вода; реактивы очищаются перекристаллизацией.

Ход исследования

К 0,7 мл сыворотки прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н НСl, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Энергично размешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при скорости 2500 об./мин. В пробирку с притертой пробкой отбирают из надосадочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска развивается за 20–30 с. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 536 нм против холостой пробы, в которой вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновременно обрабатывают и калибровочную пробу, в которой вместо сыворотки используют 0,7 мл калибровочного раствора, содержащего 30 мкмоль железа в 1 л.

Расчет проводят по правилу пропорций.

Определение железосвязывающей способности сыворотки крови

Принцип метода

Исследуемую сыворотку выдерживают с раствором трехвалентного железа, при этом весь трансферрин насыщается. Избыток солей железа удаляют адсорбцией на карбонате магния и определяют содержание железа в надосадочной жидкости одним из приведенных выше методов.

Необходимые реактивы

1. Железо хлорное, 5 мг/мл: 2,42 г FeCl_3 × 6H_2O растворяют в 100 мл 0,005 н HCl.

2. Магния карбонат в порошке.

3. Все реактивы, необходимые для определения сывороточного железа одним из описанных выше методов.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин прибавляют порошок магния карбоната в объеме примерно 0,5 мл, встряхивают в течение 10–15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше методов. Полученный результат умножают на 3 (разведение сыворотки).

Определение железа в моче по цветной реакции с сульфонированным батофенантролином

Принцип метода

Моча минерализуется с серной кислотой, образовавшийся пирофосфат железа разрушается гидролизом на кипящей водяной бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммония, железо восстанавливается сульфатом гидразина, и проводится цветная реакция с сульфонированным батофенантролином.

Необходимые реактивы

1. Кислота серная концентрированная.

2. Перекись водорода, 30 %-ный раствор в воде (пероксид).

3. Сульфат гидразина, насыщенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл воды.

4. Аммония ацетат, насыщенный раствор: к 148 г соли добавляют 100 мл воды.

5. Раствор сульфонированного батофенантролина.

6. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л.

Ход исследования

В колбу Кьельдаля помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на электрической плитке с закрытой спиралью или на песчаной бане; не должно быть бурного кипения и образования пены, которая поднималась бы в горлышко колбы. В конце сжигания должны образовываться тяжелые белые пары, занимающие нижнюю часть колбы. Когда материал потемнеет и объем его уменьшится примерно наполовину, добавляют несколько капель пергидроля, что способствует просветлению пробы. Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не станет совсем светлым. После охлаждения доливают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную баню на 5–10 мин, после чего объем пробы доводят водой до 20 мл. Отбирают 4 мл, к которым прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора сульфата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора ацетата аммония, после чего фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, прибавляют 0,5 мл раствора сульфонированного батофенантролина и оставляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех же условиях.

В норме этим методом железо в моче не определяется.

Медь

Медь входит в состав ферментов, участвующих в процессах кроветворения, иммунных реакциях.

Нормальная концентрация в сыворотке крови – 11–24 мкмоль/л. 90–92 % этого количества связано с α2-глобулинами, в частности церулоплазмином, и менее 10 % находится в свободном состоянии.

Снижение концентрации меди в крови – характерный признак болезни Коновалова – Вильсона – наследственно обусловленного снижения синтеза (вплоть до полного прекращения) церулоплазмина и нарушения транспорта меди, приводящих к увеличению содержания меди в тканях, прежде всего в печени и головном мозге. При этом концентрация не связанной с церулоплазмином меди значительно увеличивается.

Повышение уровня церулоплазмина и соответственно меди в крови отмечается при многих заболеваниях, но не является для них информативным анализом. У рабочих медных рудников может развиваться профессиональный гиперкупреоз – избыточное содержание меди.

Йод

Йод – элемент, теснейшим образом связанный с тканью и функцией щитовидной железы. В организме содержится около 50 мг йода, 30–50 % которого находится в щитовидной железе. Скорость поглощения йода тканью железы пропорциональна ее функциональной активности. На этом основан широко используемый метод определения функционального состояния щитовидной железы по скорости поглощения радиоактивного йода.

Йод поступает с пищей, водой, поваренной солью.

Суточная потребность в йоде (мг/сутки): младенцы – 0,05–0,08; дошкольники – 0,10–0,12; школьники, подростки – 0,14–0,20; взрослые – 0,18–0,20; беременные, кормящие женщины – 0,23–0,26.

Однако и вода, и почва на большей части территории России не содержат достаточного количества йода, особенно горные и предгорные районы Северного Кавказа, Урала, Алтая, Сибири, Дальнего Востока. Центральноевропейская территория считается зоной легкой степени йодной недостаточности. Но даже при использовании йодированных пищевых добавок (йодированной соли, морской капусты и др.) организм может не получать необходимого количества йода из-за нарушения его всасывания при различных заболеваниях кишечника.

Нормальная концентрация в сыворотке крови – 0,67 ± ± 0,22 ммоль/л, белковосвязанный йод в составе тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) – 0,32–0,63 ммоль/л.

Постоянно низкая концентрация йода в крови может приводить у взрослых людей к разрастанию (гипертрофии) щитовидной железы – зобу. Это заболевание нередко бывает эндемичным, т. е. характерным для определенных территорий с низким природным содержанием йода. Из-за недостатка йода может снижаться синтез гормонов щитовидной железы и развиваться гипотиреоз, который проявляется очень широким спектром признаков, так как тиреоидные гормоны оказывают влияние на общий обмен веществ, функции сердца, нервной системы и др. Особенно опасен дефицит йода в младенческом возрасте, так как приводит к развитию умственной недостаточности.

Повышение концентрации йода, которое может возникнуть при избыточном поступлении, приводит к увеличению продукции гормонов щитовидной железы – гипертиреозу, который проявляется столь же широким спектром нарушений, как и гипотиреоз, но противоположной направленности.

Постоянные длительные контакты с йодом в производственных условиях могут приводить к профессиональной интоксикации.

Наиболее частой причиной накопления определенных элементов в организме человека является постоянный и длительный контакт с ними на производстве или в быту, редко – при техногенных авариях со значительным выбросом в атмосферу или воду отходов производства.

Дефицит микроэлементов может возникать при голодании, однообразном несбалансированном или искусственном (парентеральном) питании, при нарушении всасывания в кишечнике, а также при низком содержании какого-либо элемента в почве или воде данной местности. Недостаток того или иного микроэлемента, как правило, не имеет четко выраженных клинических признаков и проявляется неспецифическими симптомами, такими как головокружение, шум в ушах, утомляемость, быстрое уставание при физической работе, сухие ломкие волосы, плохой сон, нервозность, белые пятна на ногтях и др.

Глава 4

Исследование гормонального статуса

Железы внутренней секреции и гормоны

Железы внутренней секреции, или эндокринные железы (гипофиз, эпифиз, щитовидная и паращитовидные железы, надпочечники, поджелудочная железа, мужские и женские половые железы), получили свое название в связи с тем, что выделяют синтезируемые ими вещества – гормоны – непосредственно в кровь. Это обеспечивается очень развитой сосудистой сетью желез. Гормоны представляют собой соединения различной химической структуры, которые обладают способностью после выведения из клеток, в которых они образуются, достигать клеток-мишеней и вызывать в них изменения метаболизма.

Гормоны обладают высокой биологической активностью и способны в очень малых концентрациях оказывать значительное влияние на обмен веществ в клетках и через него на функции систем и органов, массу тела и, в определенной степени, на поведение. Гормоны действуют на ткани избирательно, что связано с неодинаковым количеством рецепторов и чувствительностью тканей к разным гормонам.

Продукция гормонов находится под контролем нервной системы, которая через гипоталамус осуществляет регуляцию синтеза гормонов в гипофизе. Гипоталамические гормоны либерины (кортиколиберин, соматолиберин и др.) оказывают активирующее влияние на гипофиз, а статины (соматостатин, меланостатин и др.) – тормозящее.

Гипофиз секретирует большую группу так называемых тропных гормонов, каждый из которых регулирует синтез соответствующего гормона в периферической железе. Гормоны периферических желез, в частности мозгового слоя надпочечников, в свою очередь, контролируют секрецию гипоталамических гормонов. Благодаря такому тесному взаимному влиянию и контролю железы внутренней секреции образуют единую эндокринную систему. Поэтому повышение или снижение содержания гормона в организме может возникать не только из-за изменений в самой железе (опухоли, атрофии, склероза и др.), но и в результате нарушения регуляции со стороны других систем.

Лабораторные исследования играют важную роль в диагностике нарушений гормонального статуса, поскольку окончательный диагноз большинства эндокринных заболеваний может быть установлен только после проведения специальных тестов и функциональных проб. Получить информацию об активности эндокринной железы можно путем непосредственного определения уровня соответствующего гормона, промежуточных продуктов его синтеза или превращения, а также определяя биохимические, физиологические и другие параметры процессов, на которые влияет тот или иной гормон. Некоторые эндокринные нарушения возникают из-за образования антител к гормонам и веществам, участвующим в их образовании. В таких случаях определение уровня (титра) антител позволяет точно определить механизмы гормонального нарушения.

В современных специализированных лабораториях широко используются радиоиммунологические методы определения гормонов, которые очень точны, специфичны, хотя и дороги.

Гипофиз

Гипофиз – железа, располагающаяся в основании мозга. Синтезирует большую группу тропных гормонов, которые регулируют функции половых желез, надпочечников, щитовидной железы, почек, мозга, влияют на рост органов и тканей. В передней доле гипофиза синтезируются соматотропин, адренокортикотропин, тиротропин, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон (лютропин), лактогенный гормон (пролактин), меланоцитостимулирующий гормон (интермедин), эндорфин, энкефалин. В задней доле гипофиза синтезируются вазопрессин и окситоцин.

Адренокортикотропный гормон (АКТГ) – гормон передней доли гипофиза, регулирующий синтетические процессы в организме, важнейший стимулятор синтеза гормонов коры надпочечников. Определяется радиоиммунологическим методом.

Нормальная концентрация в плазме – 10–80 пг/мл, 16,4–32,8 нмоль/л.

Концентрация гормона возрастает при болезнях Иценко – Кушинга, Аддисона, врожденной гиперплазии надпочечников, опухоли или гиперплазии передней доли гипофиза, стрессовых состояниях, снижается при опухолях и вторичной недостаточности надпочечников.

Соматотропный гормон (СТГ) – гормон роста, стимулирует рост костей, мышц, органов.

Нормальная концентрация в сыворотке у мужчин – 2–10 нг/мл; у женщин несколько выше, чем у мужчин.

Основное количество соматотропного гормона секретируется в ночное время и во время глубокого сна, особенно это выражено у детей.

Повышенное выделение гормона наблюдается:

1) при физической работе;

2) во время глубокого сна;

3) при употреблении пищи, богатой белком;

4) при гипогликемии.

Повышенное выделение соматотропного гормона гипофизом в период роста ребенка приводит к гигантизму, а у взрослых – к акромегалии. Анализ назначается при: задержке роста, остеопорозе, мышечной слабости, порфирии, склонности к понижению сахара, нарушении роста волос. В сомнительных случаях определение гормона проводят несколько раз с интервалом в 1–2 месяца. При установленном диагнозе акромегалии определение СТГ проводится для контроля над эффективностью медикаментозного или оперативного лечения.

Снижение концентрации отмечается при гипофизарном нанизме. Диагноз устанавливается после функциональных проб.

Пролактин активизирует лактацию, проявление материнского инстинкта, стимулирует рост и развитие молочных желез, во время беременности он поддерживает существование желтого тела и выработку прогестерона. Пролактин принимает участие в регуляции водно-солевого обмена, стимулирует всасывании кальция, принимает участие в формировании полового поведения.

У мужчин он влияет на рост простаты и семенных пузырьков. Нормальная концентрация в крови у мужчин – 80–265 мкЕД/ мл, у женщин детородного возраста – 130–540 мкЕД/мл, у женщин в менопаузе —107–290 мкЕД/мл.

Повышение концентрации определяется: при беременности, кормлении, а также при опухолях гипофиза, аменорее, первичном гипотиреозе, поликистозе яичников, действии больших доз эстрогенов, хронической почечной недостаточности, циррозе печени, аутоиммунных заболеваниях, гиповитаминозе В.

Прием лекарственных препаратов может привести к изменению нормальных показателей пролактина. Повышение концентрации может возникнуть при приеме нейролептиков, эстрогенов, фуросемида, кальцитонина и др. Снижение концентрации возникает при приеме дексаметазона, допамина, апоморфина, эстрогенов и др.

У мужчин повышенная продукция пролактина вызывает нарушение потенции.

Тиреотропный гормон (ТТГ) – гормон передней доли гипофиза – стимулирует процессы йодирования тирозина и распад тиреоглобулина в щитовидной железе. Отмечаются суточные колебания ТТГ: максимальные величины регистрируются к 2–4 ч ночи, минимальные значения – в 17–18 ч. Накануне исследования исключаются физические нагрузки, не разрешается прием алкоголя, курение.

Определяется радиоиммунологическим методом.

Нормальная концентрация в крови: в возрасте 21–54 года – 0,4–4,2 мЕД/л, 55–87 лет – 0,5–8,9 мЕД/л.

Определение уровня ТТГ является наиболее точным методом оценки функционального состояния щитовидной железы и используется как для диагностики, так и для контроля эффективности лечения.

Уровень гормона повышается при первичном гипотиреозе, тиреоидитах, введении йодида калия; снижается при вторичном гипотиреозе, аденоме щитовидной железы, тиреотоксикозе, тяжелых соматических и психических заболеваниях, чрезмерных физических нагрузках, приеме ряда лекарственных средств (противосудорожных средств, адреноблокаторов, нейролептиков, противорвотных средств и др.).

Снижение концентрации может возникнуть при голодании, психологическом стрессе, токсическом зобе, травме гипофиза, гипертиреозе беременных.

Для определения содержания тиреотропного гормона в сывортке крови используются иммунохемилюминесцентный анализ, РИА и ИФА. Первый метод является очень чувствительным. Диагностические наборы III поколения позволяют обнаруживать концентрацию тиреотропного гормона менее 0,01 мМЕ/л, что дает возможность разграничить гипертиреоз и эутиреоз.

Вазопрессин (антидиуретический гормон) усиливает реабсорбцию воды в почках, способствует задержке в организме натрия, калия, хлоридов. В больших количествах оказывает сосудосуживающее действие.

Нормальная концентрация в крови – 3,4–11,7 пг/мл.

Повышение концентрации встречается исключительно редко. Снижение выработки вазопрессина отмечается при несахарном диабете; вместе с тем значительная часть случаев несахарного диабета обусловлена снижением чувствительности определенных участков почки к вазопрессину или выработкой его в неактивной форме. Поэтому отделение его концентрации при несахарном диабете играет вспомогательную роль.

Окситоцин – гормон, влияющий на сократимость матки. С диагностической целью не определяется. Широко используется в акушерской практике для стимуляции родовой деятельности.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ, фоллитропин) – гонадотропный гормон, стимулирующий развитие у мужчин семенных канальцев и сперматогенез, у женщин – развитие фолликулов. Нормальная концентрация в сыворотке крови: у мужчин – 3,4–15,8 мЕД/мл, у женщин в фолликулярную фазу – 2,7–10,5 мЕД/мл, в лютеиновую фазу – 1,7–6,5 мЕД/ мл.

Подготовка для сдачи анализа:

1) за 3 дня до взятия крови исключаются спортивные тренировки и повышенные физические нагрузки;

2) за 1 час до взятия крови запрещается курение;

3) кровь берется натощак.

В диагностических тяжелых случаях производят забор крови 3-кратно через 30 мин. Повышение показателей регистрируется при:

1) первичном гипогонадизме;

2) беременности;

3) нарушении формирования половых желез;

4) кистах яичников;

5) дисфункциональных маточных кровотечениях;

6) синдроме Шерешевского – Тернера;

7) почечной недостаточности;

8) воздействии рентгеновских лучей.

Снижение концентрации отмечается:

1) при вторичной недостаточности яичников;

2) гипофункции гипоталамуса, предстательной железы;

3) действии эстрогенов, пероральных контрацептивов;

4) гиперпролактинемии.

Лютеинизирующий гормон (ЛГ) – гонадотропный гормон, стимулирующий секрецию эстрогенов и прогестерона у женщин и тестостерона у мужчин.

Нормальная концентрация в сыворотке крови: у мужчин – 6–23 мЕД/мл, у женщин в фолликулярную фазу – 5–30 мЕД/ мл, в середине цикла – 41–154 мЕД/мл, в лютеиновую фазу – 30–40 мЕД/мл.

Повышение отмечается при первичной дисфункции половых желез, снижение – при нарушении функций гипофиза или гипоталамуса, вторичной недостаточности половых желез, приеме больших доз эстрогенов, прогестерона.

Определение ЛГ в моче используется для диагностики эндокринных нарушений у детей с признаками раннего созревания.

Щитовидная железа

Щитовидная железа – орган, состоящий из двух долей, соединенных перешейком, расположен на передней поверхности шеи выше межключичной ямки; синтезирует тироксин (тетрайодтиронин) и трийодтиронин. Увеличение щитовидной железы можно обнаружить визуально или прощупать. Это является признаком нарушений ее функции. В щитовидной железе находится 2 типа клеток, которые образуют тиреоидные гормоны Т3 и Т4, между ними находятся С-клетки, которые секретируют кальцитонин, регулирующий обмен кальция.

Тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3) регулируют интенсивность обмена белков, жиров, углеводов, теплопродукцию, влияют на деятельность сердечно-сосудистой, дыхательной систем, сократимость и утомляемость мышц, возбудимость и лабильность нервной системы, устойчивость организма к инфекциям.

Активность Т3 в 6–10 раз выше активности Т4.

Нормальная концентрация в крови: Т3 – 1,08–3,14 нмоль/ л, Т4 – мужчины – 59–155 нмоль/л, женщины – 71–142 нмоль/ л.

Повышение уровня Т3 и Т4 отмечается при гипертиреозе, Т3-тиреотоксикозе, зобе, сопровождающемся дефицитом йода. Снижение уровня гормонов происходит при гипотиреозе, при состояниях, сопровождающихся уменьшением синтеза тироксинсвязывающего глобулина, при действии дексаметазона.

Характер изменений, происходящих в организме при избытке или недостатке гормонов щитовидной железы, зависит от пола и возраста. При исследовании функции щитовидной железы, кроме Т3, Т4 и тиреотропного гормона, информативным показателем является количество связанного с белками йода (СБИ). Тест весьма точно характеризует содержание тиреоидных гормонов в крови, поскольку более 99 % тироксина связано с белками крови. Нормальная концентрация СБИ – 320–640 мкМ/л. Снижение уровня СБИ свидетельствует о гипотиреозе, повышение – о гипертиреозе.

Кальцитонин – пептидный гормон, синтезируемый С-клетками щитовидной и паращитовидных желез. Он состоит из 30 аминокислот. Участвует в регуляции кальциевого обмена и действует как антагонист паратиреоидного гормона.

Нормальная концентрация в крови – 0–150 пг/мл (нг/л).

Повышение концентрации происходит при беременности и очень резко при медуллярном раке щитовидной железы, заболеваниях легких, пернициозной анемии, болезни Педжета, злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, печени, почек.

Снижение уровня гормона отмечается с возрастом.

Паращитовидные железы

Паращитовидные (околощитовидные) железы – очень маленькие эпителиальные образования (чаще всего 4), располагающиеся около щитовидной железы; вырабатывают паратиреоидный гормон (паратгормон).

Паратгормон регулирует обмен кальция и фосфора (эффект зависит от уровня витамина D).

Показатели концентрации существенно различаются при использовании различных методов и наборов реактивов, поэтому величины нормы конкретной лаборатории указываются в бланке анализа.

Уровень паратгормона повышается при первичном и вторичном гиперпаратиреозе, внежелезистой продукции гормона (рак почек, бронхогенный рак), дефиците витамина D; снижение отмечается при гипопаратиреозе после удаления щитовидной железы.

Для определения функциональной активности паращитовидных желез используется тест с трилоном Б (ЭДТА) и определением концентрации кальция в крови. При первичном гиперпаратиреозе концентрация кальция в крови превышает норму, а выведение с мочой значительно увеличивается. При гипопаратиреозе и недостатке витамина D концентрация кальция в крови снижена.

Поджелудочная железа

Поджелудочная железа – относительно большой продолговатый орган, расположенный горизонтально в верхней части брюшной полости.

Поджелудочная железа является железой смешанной секреции, т. е. обладает внешнесекреторной (экзокринной) функцией – выделяет сок (комплекс пищеварительных ферментов) в двенадцатиперстную кишку и внутрисекреторной (эндокринной) функцией – выделяет гормоны в кровь.

Эндокринная ткань поджелудочной железы – островки Лангерганса – составляет около 3 % общей массы. В них различают α-клетки, синтезирующие гормон глюкагон, и β-клетки, синтезирующие инсулин. Кроме них поджелудочная железа выделяет в кровь ряд гормоноподобных веществ.

Инсулин – основной гормон поджелудочной железы, повышающий проницаемость клеточных мембран для глюкозы, благодаря чему глюкоза переходит из крови внутрь клеток. Инсулин способствует синтезу гликогена из глюкозы и тормозит его распад. Радиоиммунологическим методом определяется так называемый иммунореактивный инсулин (ИРИ). Нормальная концентрация в сыворотке крови – 6–24 мкЕД/мл.

Основным стимулом для секреции инсулина является повышение концентрации глюкозы в крови. При проведении перорального теста толерантности к глюкозе концентрация инсулина изменяется следующим образом: через 30 мин – 25–231 мкЕД/мл, 60 мин – 18–276 мкЕД/мл, 120 мин – 16–166 мкЕД/мл, 180 мин – 4–38 мкЕД/мл.

При этой пробе концентрация инсулина выше нормы у некоторых больных с реактивной гипогликемией, с поражением печени, синдромом Кушинга; ниже нормы – при сахарном диабете, гипофункции надпочечников. Наиболее существенное повышение ИРИ отмечается при инсулиноме – гормонопродуцирующей опухоли поджелудочной железы из β-клеток. При соотношении показателей инсулина (в мкЕД/мл) и глюкозы (в мг/дл) больше 0,25 вероятно наличие инсулиномы.

Определение инсулина применяется также для подтверждения диагноза диабета у людей с пограничными нарушениями толерантности к глюкозе. Сахарный диабет I типа (инсулинзависимый) характеризуется понижением уровня инсулина, сахарный диабет II типа (инсулиннезависимый) – нормальным или повышенным уровнем.

С-пептид – фрагмент молекулы проинсулина, при отщеплении которого образуется инсулин. Инсулин и С-пептид секретируются в кровь в пропорциональных количествах. Так как лечебные препараты инсулина не содержат С-пептида, его определение позволяет точно оценить функцию β-клеток и количество собственного инсулина у больных сахарным диабетом, получающих инсулин.

Нормальная концентрация в сыворотке крови – 0,5–3,0 нг/мл.

После нагрузки глюкозой отмечается 5–6-кратное увеличение уровня С-пептида, которое сохраняется значительно дольше, чем уровень инсулина.

Косвенным показателем уровня инсулина в организме является концентрация глюкозы в крови.

Глюкагон – пептидный гормон, противоположный по физиологическим эффектам инсулину, увеличивает концентрацию глюкозы в крови за счет стимуляции распада гликогена в печени, повышает основной обмен, потребление кислорода. Обеспечивает контроль за поддержанием постоянства уровня глюкозы в крови – низкая концентрация глюкозы вызывает выброс глюкагона, а гипергликемия снижает его количество. Определяется радиоиммунологическим методом.

Нормальная концентрация в плазме – 30–120 пг/мл.

Значительное увеличение количества глюкагона – признак опухоли из α-клеток – глюкагономы. Снижение концентрации может свидетельствовать об уменьшении массы поджелудочной железы; отмечается у больных муковисцидозом, хроническим панкреатитом, после удаления поджелудочной железы. У больных сахарным диабетом угнетения выделения глюкагона при гипергликемии не происходит, а даже отмечается его повышение.

Надпочечники

Надпочечники – парные железы, располагающиеся в области верхушек почек. Состоят из мозгового и коркового слоев, различающихся по структуре и секретируемым гормонам.

Корковый слой вырабатывает около 30 стероидных гормонов – кортикостероидов, которые разделяют на 3 группы:

1) минералокортикоиды – альдостерон, дезоксикортикостерон. Участвуют в регуляции минерального и водного обменов;

2) глюкокортикоиды – кортизон, гидрокортизон (кортизол), кортикостерон. Оказывают преимущественное влияние на углеводный обмен, угнетают воспалительные реакции;

3) половые гормоны – андрогены, эстрогены, прогестерон. Влияют на половое развитие и половые функции.

Кортикостероидные гормоны быстро разрушаются в печени и преобразуются там в водорастворимые формы, которые выводятся почками.

Содержание производных кортикостероидов в моче точно отражает степень активности коры надпочечников.

Альдостерон – основной гормон минералокортикоидного ряда, регулирует водно-солевой обмен. Секреция связана с почечной гемодинамикой. Определяется радиоиммунологическим методом.

Нормальная концентрация в крови: в положении лежа – 15–70 нмоль/л.

У здоровых людей концентрация альдостерона повышается при диете, бедной натрием (в 2–5 раз), беременности.

Патологическое увеличение уровня гормона происходит при увеличении (гиперплазии) надпочечников. Повышение показателей альдостерона выявляется при: синдроме Конна, вторичном альдостеронизме, гиперплазии надпочечников, гепатитах, сердечной недостаточности, лечении препаратами калия, отеках с задержкой натрия.

Опухоли надпочечников – альдостеромы – бывают столь малых размеров, что не выявляются ни ультразвуковым сканированием, ни компьютерной томографией, и уровень гормона в крови в таком случае – это наиболее объективный показатель патологического процесса.

Пониженная концентрация альдостерона отмечается при: болезни Аддисона, гипофункции надпочечников, острой алкогольной интоксикации, эклампсии, избыточном введении глюкозы, синдроме Тернера и некоторых других заболеваниях.

В сложных случаях используют тесты, влияющие на продукцию альдостерона.

При невозможности непосредственного определения альдостерона может быть использовано соотношение концентраций калий / натрий в крови. Увеличение этого коэффициента выше 32 является достоверным признаком альдостеронизма.

Кортизол – основной гормон глюкокортикоидного ряда, участвует в регуляции углеводного, белкового и жирового обменов, играет ключевую роль в защитных реакциях организма на стресс. Для него характерен суточный ритм секреции, при котором максимум определяется в 6–8 ч утра, минимум – в вечерние часы.

Накануне исследования исключаются физические нагрузки, курение, прием лекарственных препаратов.

Секреция стимулируется АКТГ. Кортизол, как и другие глюкокортикоиды, усиливает образование глюкозы из белков и аминокислот и синтез гликогена, ограничивает синтез антител, снижает аллергические реакции, оказывая десенсибилизирующее действие. Определяется радиоиммунологическим методом.

Нормальная концентрация в крови – 140–640 нмоль/л.

Снижение концентрации происходит при: болезни Аддисона, адреногенитальном синдроме, а также хронической недостаточности надпочечников, которая выявляется функциональными пробами с препаратами АКТГ; при снижении функций щитовидной железы, циррозе печени, резком снижении веса, состояния после приема глюкокортикоидов.

Повышение концентрации отмечается при болезни и синдроме Иценко – Кушинга, аденоме и раке надпочечников, сахарном диабете, ожирении, циррозе печени, депрессии.

17-оксикортикостероиды (17-ОКС) – комплекс глюкокортикоидных гормонов и их метаболитов. В тех случаях, когда недоступно определение глюкокортикоидных гормонов в крови радиоиммунологическим методом, можно определять 17-ОКС в суточном объеме мочи.

Нормальная концентрация в крови у взрослых – 866–4434 нмоль/л, в моче у мужчин – 35–70 мкмоль/сутки, у женщин – 17,5–52,5 мкмоль/сутки.

В каждой лаборатории имеется собственная норма этого показателя, так как существуют различные модификации метода определения.

Повышение экскреции (выделения) 17-ОКС с мочой наблюдается при болезни и синдроме Иценко – Кушинга, ожирении, тиреотоксикозе, акромегалии, опухоли яичка, синдроме поликистозных яичников.

Снижение экскреции наблюдается при болезни Аддисона, гипотиреозе, недостаточности надпочечников, вторичном недоразвитии половых желез у женщин, снижении функции гипофиза, недоразвитии половых желез у мужчин, при поражениях печени.

Для дифференцированной диагностики синдрома и болезни Иценко – Кушинга, а также ожирения проводят дексаметазоновый тест Лиддла.

Половые гормоны – мужские (андрогены) и женские (эстрогены) и прогестерон, вырабатываемые в надпочечниках, имеют большое значение для развития половой системы в детском возрасте, когда еще отсутствует эндокринная функция половых желез.

Повышенная секреция гормонов в детском возрасте ведет к раннему половому созреванию, а пониженная – к его задержке. У взрослых людей основная доля половых гормонов вырабатывается половыми железами, однако усиленная экскреция гормонов при опухолях надпочечников может вызвать феминизацию у мужчин (уменьшение роста бороды и усов, отложение жира по женскому типу, атрофию яичек и др.) и маскулинизацию у женщин (оволосение лица, увеличение мышц, изменение голоса и др.).

Мозговой слой надпочечников вырабатывает катехоламины – адреналин и норадреналин (предшественник – дофамин), которые являются медиаторами симпатической нервной системы. В надпочечниках и плазме адреналина содержится в 3–10 раз больше, чем норадреналина. Адреналин повышает артериальное давление, суживает периферические сосуды, учащает ритм сердечных сокращений, тормозит моторику кишечника, повышает концентрацию глюкозы в крови, усиливает поступление из депо в кровоток жирных кислот, повышает уровень холестерина, влияет на клетки иммунной системы.

Нормальная концентрация в крови – 1,92–2,46 нмоль/л, в моче – 16,4–81,9 нмоль/сутки.

У здоровых людей повышение уровня адреналина в крови происходит при эмоциональном стрессе, физической нагрузке.

Значительное увеличение концентрации в крови и моче отмечается при феохромоцитоме – гормонально активной опухоли мозгового слоя надпочечников, снижение концентрации – при поражении гипоталамуса, миастении, синдроме Иценко – Кушинга.

С диагностической целью определяют как концентрацию самого адреналина, так и продуктов его превращения – ванилил-миндальной, гомойанилиновой кислот. Стойкое повышение уровня этих веществ наблюдается при феохромоцитоме, нейробластоме (злокачественной опухоли в симпатической части нервной системы).

Норадреналин действует на обмен веществ аналогично адреналину, но менее выраженно; не влияет на частоту сердечных сокращений, уровень глюкозы и потребление кислорода.

Нормальная концентрация в крови – 3,84–5,31 ммоль/л, в моче – 59,1–236,6 ммоль/сутки.

Определение концентрации норадреналина имеет такое же диагностическое значение, как и адреналина.

Увеличение экскреции одного или двух катехоламинов одновременно более чем на 30 % по сравнению с верхней границей нормы свидетельствует о наличии феохромоцитомы. При этом заболевании концентрация катехоламинов может повышаться в 10 и более раз.

Половые железы

Мужские половые железы (семенники) и женские (яичники, а во время беременности и плацента) являются железами смешанной секреции. Внешняя секреция половых желез заключается в образовании и выведении половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток.

Внутрисекреторная деятельность связана с образованием и выделением в кровь мужских половых гормонов (андрогенов) и женских (эстрогенов).

Оба типа гормонов образуются и в мужском, и в женском организме, но у мужчин значительно преобладают андрогены, а у женщин – эстрогены.

После достижения половой зрелости секреция гонадотропных и половых гормонов у женщин принимает циклический характер с периодичностью около месяца, а у мужчин происходит сравнительно равномерно.

Яичники – парные женские половые органы, расположенные под брюшной полостью – в малом тазу. Секретируют прогестерон, эстриол, эстрон, эстрадиол. Эстрогены обеспечивают развитие половых органов, продукцию половых клеток, психофизиологические особенности полового поведения и все этапы и аспекты беременности (табл. 27).

Таблица 27

Нормальная концентрация половых гормонов в крови у женщин

Их секреция регулируется гонадотропными гормонами гипофиза – фолликулостимулирующим (ФСГ) и лютеинизирующим (ЛГ) и опосредованно – фоллиберином и люлиберином гипоталамуса. Эстрогены образуются из холестерина, метаболизируются в печени.

Нарушение функции печени у мужчин, например при циррозе, сопровождается накоплением эстрогенов. Продукты превращения выводятся с мочой.

Концентрация эстрогенов в крови колеблется в соответствии с фазами овариального цикла (цикла созревания яйцеклетки):

1) фолликулиновая фаза. В яичнике происходят развитие фолликула (тканевого пузырька, содержащего яйцеклетку), овуляция (выход яйцеклетки из фолликула); в матке – пролиферация эпителия;

2) лютеиновая фаза. В яичнике происходит образование желтого тела (эндокринная железа, формирующаяся после выхода яйцеклетки, продуцирует прогестерон); в матке – секреция слизи, набухание слизистой оболочки.

Если не произошло оплодотворения, слизистая оболочка матки отторгается, что сопровождается кровотечением (менструацией), желтое тело в яичнике редуцируется.

Повышение концентрации эстрогенов наблюдается при опухолях яичников, коры надпочечников. Снижение концентрации отмечается при недостаточности яичников из-за их врожденного недоразвития, аутоиммунного поражения, облучения, склерокистозного перерождения, а также при нарушении секреции гонадотропных гормонов надпочечниками и гипоталамо-гипофизарной системой. Эстрогенная недостаточность – одна из причин бесплодия.

Некоторые опухоли яичников секретируют андрогены, что сопровождается повышением их концентрации в крови и существенными изменениями половых признаков – вирилизацией.

При наступлении менопаузы циклические изменения секреции гонадотропинов и эстрогенов прекращаются, уровень ФГС и ЛГ значительно возрастает, уровень эстрогенов снижается.

Плацента – орган, образующийся на время беременности и опосредующий обмен веществ между организмами матери и ребенка. Является также эндокринной железой и секретирует хорионический гонадотропин и плацентарный лактоген.

Хорионический гонадотропин способствует сохранению желтого тела яичника и стимулирует продукцию прогестерона.

Уровень гормона нарастает в начале беременности с максимумом в конце I триместра, а затем снижается.

Определение концентрации используется для диагностики беременности, начиная с 8–10-го дня после оплодотворения, а также для выявления наследственных заболеваний и пороков развития плода.

Гормон состоит из α- и β-хорионического гонадотропина. Исследование на β-ХГ производится для подтверждения беременности (табл. 28).

Таблица 28

Уровень хорионического гонадотропина при беременности

Уровень хорионического гонадотропина быстро нарастает в первом триместре, самый высокий уровень наблюдается на 10–12-й неделе беременности, затем медленно понижается, а во второй половине беременности остается постоянным.

Повышение этого показателя во время беременности может отмечаться при:

1) токсикозе;

2) многоплодии;

3) сахарном диабете;

4) синдроме Дауна у плода;

5) приеме синтетических гестагенов.

Пониженный показатель у беременных регистрируется при:

1) внематочной беременности;

2) задержке развития плода;

3) угрозе выкидыша;

4) гибели плода;

5) хронической плацентарной недостаточности.

У мужчин и небеременных женщин повышение уровня ХГ может определяться при:

1) онкологических заболеваниях;

2) опухолях яичек;

3) пузырном заносе;

4) хорионкарциноме.

Семенники (яички) – парные мужские половые органы, расположенные в мошонке.

Секретируют мужские половые гормоны, наиболее активным из которых является тестостерон, образующийся в клетках Лейдинга.

Тестостерон влияет на развитие половых органов, рост мышц, костей, вторичные половые признаки, психофизиологические особенности полового поведения. Трансформируется в печени, выводится с мочой.

Нормальная концентрация в крови у мужчин – 19,8 × 5,5 нМ/л.

Повышение концентрации происходит при гиперфункции надпочечников и раннем половом созревании, некоторых опухолях яичек, продуцирующих тестостерон.

Снижение концентрации гормона наблюдается при врожденной и приобретенной недостаточности семенников (гипогонадизме), нарушениях продукции гонадотропных гормонов гипоталамуса и гипофиза, наследственных заболеваниях, вызванных нарушением числа половых хромосом (встречаются редко). Пониженная концентрация андрогенов – одна из причин мужского бесплодия.

Синтетические производные тестостерона – анаболические стероиды – значительно усиливают синтез белков и рост мышц, что используется спортсменами (тяжелоатлетами, культуристами) для быстрого наращивания мышечной массы.

Однако длительное применение анаболических стероидов сопровождается подавлением секреции собственного тестостерона, а также фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов, что приводит к атрофии яичек, подавлению образования сперматозоидов и другим изменениям в половой сфере, а также нарушениям функций печени, почек, поджелудочной железы, сердечно-сосудистой системы. Некоторые нарушения проходят через 2–6 месяцев после отмены анаболиков, отдельные изменения носят необратимый характер.

17-кетостероиды (17-КС) – производные андрогенов, образующиеся у женщин в основном в коре надпочечников, у мужчин – в коре надпочечников (около 2/3) и в яичках (около 1/3). Выделение с мочой в течение суток неравномерно, поэтому содержание 17-КС определяют в суточном объеме мочи.

Нормальное содержание в моче:

1) у мужчин – 10–25 мг/сутки;

2) у женщин – 7–20 мг/сутки;

3) у детей до 8 лет – 0,3 мг/сутки.

В связи с использованием различных методов определения в каждой лаборатории имеются собственные величины нормы этого показателя.

Повышение содержания 17-КС в моче отмечается при опухолях яичников и надпочечников, беременности, продолжительном стрессе.

Снижение экскреции происходит при гипофункции гипофиза или половых органов, тиреотоксикозе, нефротическом синдроме.

Современные методы исследования гормонального статуса

Благодаря современным методам исследования появилась возможность выявить наличие даже небольшого количества гормонов, как полипептидных, так и стероидных. Широко применяются иммунологические методы, призваные выявить содержание гормонов гипоталамуса, гиповиза, яичников, надпочечников и прочих эндокринных желез и тканей в крови. Исследования на содержание гормонов в суточной моче применяются реже. В частности, таким образом можно выявить метаболиты андрогенов 17-КС (дегидроэпиандростерон, андростерон, андростендион), образующиеся в яичниках и надпочечниках организма женщин.

Гормональные функциональные пробы применяются при необходимости топической и дифференциальной диагностики эндокринных заболеваний. Также путем применения гормональных проб возможно уточнить функциональное состояние различных отделов гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы. Функциональные пробы подразделяются на стимуляционные и супрессивные. Стимуляционные пробы представляют собой введение в организм веществ, активирующих работу пораженных тканей, и назначаются при гипофункции желез. Если концентрация гормона растет в ответ на пробу, значит, причина патологии заключается в отсутствии рациональной центральной регуляции. При отсутствии изменений заболевание связано с поражением органа. Супрессивные пробы осуществляются при гиперфункции гормональных желез, в кровь пациента вводятся блокаторы деятельности желез. Если железа функционирует автономно, концентрация гормонов не изменится. Диагностические пары представляют собой анализ, назначаемый при подозрении на патологию эндокринных желез. Берутся анализы не только на гормоны, вырабатываемые эндокринной системой, но и на гормоны гипофиза. Показатель первичного поражения эндокринной железы – повышение уровня гормонов гипофиза и снижение уровня гормонов в периферических железах. Показатель гормоноактивного новообразования – снижение гормонов гипофиза и повышение гормонов периферических желез.

Методы определения содержания гормонов в крови

Иммунологические методы. Представляют собой определение содержания гормонов по их иммунологической активности. Путем применения данной группы методом измеряются антигенные детерминанты и характеризуется концентрация гормонов. Принцип действия иммунометодов – узнавание антигенов специфическими антителами, выработанными против гормона. Данная группа методов считается недостаточно точной, в ряде случаев клиническая картина заболевания отличается от предполагаемой согласно выявленному уровню гормона в крови. При этом задействуются более точные методы.

Биологические методы. Представляют собой методы определения уровня гормона по его биологической активности. Путем применения биометодов возможно измерение функционального влияния гормонов и получение характеристики гормональной активности. Биометоды дают представление о биологической мощности гормона. Биометоды должны соответствовать ряду важных требований. Прежде всего, они должны характеризоваться высокой чувствительностью для измерения более низкого уровня гормона в плазме по сравнению с нижним уровнем «нормы», обладать стабильной воспроизводимостью, отличаться технической простотой и специфичностью для определяемых молекул или их фракций.

Методы масс-спектрометрии. Основаны на применении технологии масс-спектрометрии и жидкостного хроматографа с высоким разрешением. Данная группа методов характеризуется высокой производимостью, специфичностью, требуемой чувствительностью и воспроизводимостью.

Виды иммунологических методов:

1. Радиоиммунологическое определение гормонов в различных средах и тканях организма. Данный метод позволяет адекватно оценить функциональное состояние как эндокринной, так и других физиологических систем организма.

2. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). В качестве твердофазного носителя применяются полистироловые микропланшеты. При данном виде анализов используются конъюгаты антител с ферментом, при реакции с соответствующими составами образующие окрашенные соединения с определенными оптическими характеристиками. Применение специальных анализаторов позволяет достичь высокой точности измерений.

3. Флуоресцентный иммуноанализ. Принцип работы: применение в качестве метки редкоземельного элемента европия. Путем применения данного метода возможно определить пиктограммовые количества стероидных гормонов и концентрации 0,03–0,15 мЕд/л гиповизарных гормонов.

4. Метод усиленной люминесценции. Относится к методам люминесцентного иммуноанализа. Получил наиболее широкое применение. Принцип работы основан на усилении реакции люминесценции путем добавления люминогенного субстрата (люминол или изолюминол) и особого усилителя, увеличивающего интенсивность и продолжительность свечения. Метод характеризуется высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Световой сигнал регистрируется люминометром, особым анализатором.

Глава 5

Исследование желудочного содержимого

В состоянии покоя (натощак) из желудка здорового взрослого человека можно извлечь небольшое количество (в среднем 50 мл) желудочного содержимого обычно слабокислой или нейтральной реакции, состоящего из желудочного сока, поглощенной слюны, а также из заброшенного в желудок содержимого двенадцатиперстной кишки. Всего за сутки выделяется около 2 л желудочного сока. Объем сока в период желудочного пищеварения определяется уровнем плазмореи через слизистую оболочку желудка.

Желудочный сок – секрет желез его слизистой оболочки, образуется через 5–10 мин после приема пищи. Представляет собой бесцветную прозрачную жидкость кислой реакции, содержащую, помимо воды, в качестве основных составных частей соляную кислоту, протеазы, липазу, гастромукопротеин, белковые вещества, образующие слизь (мукопротеозы и мукопротеины). Кроме того, в желудочном соке обнаруживают хлориды калия, натрия, аммония, фосфаты, сульфаты и в небольшом количестве органические соединения (молочную кислоту, мочевину, креатин- и аденозинфосфатные кислоты, глюкозу).

Одним из основных компонентов желудочного сока является соляная кислота, выделяемая в полость желудка обкладочными клетками. Соляная кислота выполняет многообразные физиологические функции: создает оптимум pH для ферментов желудка, способствует набуханию белковых коллоидов пищи, подготавливая их к гидролитическому расщеплению, участвует в гормональном возбуждении деятельности главных желез желудка и экзокринной секреции панкреатической железы, является одним из регуляторов моторики желудка и тонкой кишки, оказывает бактерицидное действие и т. д.

Главными клетками желудка выделяются протеазы, которые осуществляют ферментативный гидролиз белковых субстратов пищи. Из них наибольшей протеолитической активностью обладает пепсин. Оптимум его действия при рН 1,5–2,0. Другие протеазы (гастриксин, катепсины, желатиназа, химозин) проявляют свою деятельность в более широких пределах рН.

Липаза желудочного сока – малоактивный фермент, который в зоне рН от 5,5 до 7,9 расщепляет жиры.

Слизь из желудочного сока является секретом клеток поверхностного эпителия, пилорических желез и добавочных клеток. Основу ее составляет комплекс мукопротеинов и мукопротеоз, осуществляющих защиту слизистой оболочки от протеолитического действия желудочного сока. Крупномолекулярные соединения придают ей буферные свойства (1 г муцина способен связать около 18 мл раствора соляной кислоты или 12 мл раствора щелочи).

Гастромукопротеин (внутренний фактор Кастла) необходим для всасывания в кишечнике витамина В_12.

В желудочном соке, кроме того, присутствует ряд биологически активных крупномолекулярных соединений, обладающих противосвертывающим действием, липотропной активностью, способностью стимулировать эритропоэз.

Небольшое количество аммиака, мочевины и мочевой кислоты рассматривается как проявление экскреторной функции желудка.

Зондовые методы исследования

Исследование желудочного содержимого, полученного путем зондирования, служит одним из методов диагностики заболеваний желудка. Если зондирование проводят толстым зондом и получают одну порцию желудочного содержимого, то говорят об одномоментном зондировании. Если получают несколько порций желудочного содержимого, то говорят о фракционном зондировании. Фракционное зондирование проводят тонким зондом без оливы. Одномоментный метод не позволяет получить истинную картину желудочной секреции в динамике, а дает лишь ориентировочные сведения о секреторной и моторной функциях желудка.

Полное представление о секреторной функции желудка можно получить, сравнивая показатели работы желез желудка в покое и после их возбуждения каким-либо раздражителем. Базальной называют секрецию голодного желудка. В этом случае желудочный сок выделяется в ответ на раздражение слизистой оболочки желудка зондом. Исследование проводят в течение 1 ч, откачивая шприцем через каждые 15 мин все содержимое желудка. Получают 4 порции. Стимулируемой называют секрецию, возникающую в ответ на введение раздражителя. Ее также определяют в течение 1 ч через каждые 15 мин.

Применяют энтеральные и парентеральные раздражители секреции желудка. Из энтеральных унифицирован и широко применяется капустный «завтрак» – 7 %-ный отвар сухой капусты (21 г сухой капусты заливают 500 мл воды, кипятят в течение 30–40 мин до объема отвара 300 мл, фильтруют через 2 слоя марли и хранят в холодильнике). Унифицированным парентеральным раздражителем признан гистамин. При субмаксимальной стимуляции фосфат гистамина вводят подкожно из Расчета 0,01 мг на 1 кг массы тела обследуемого, дигидрохлорид гистамина – 0,008 мг на 1 кг массы. При максимальной стимуляции по Кею доза фосфата гистамина определяется из Расчета 0,04 мг/кг, дигидрохлорида гистамина – 0,024 мг/кг.

После введения гистамина отмечаются сосудистые реакции, которые обычно непродолжительны. Однако применению увеличенной дозы должно предшествовать введение антигистаминных препаратов (2 мл 2%-ного раствора супрастина). Максимальная проба с гистамином позволяет судить о предельных возможностях желудка выделять кислоту и имеет преимущество для выявления истинной ахлоргидрии.

Созданы синтетические аналоги гастрина – пентагастрин, тетрагастрин, применение которых в качестве стимуляторов желудочной секреции перспективно ввиду выраженного сокогонного эффекта и практического отсутствия побочных явлений при их введении. Достоинствами парентеральных раздражителей по сравнению с энтеральными являются, помимо сильного секреторного эффекта, возможность точного дозирования, а также получение сразу чистого желудочного сока.

Если применен энтеральный раздражитель, то первую порцию откачивают через 10 мин после его поглощения в количестве 10 мл (эта порция представляет собой смесь желудочного сока с жидким раздражителем). Через следующие 15 мин удаляют все содержимое желудка и продолжают откачивать чистый желудочный сок еще в течение 1 ч (через каждые 15 мин, всего 4 порции). В результате получают так называемую последующую секрецию (следующую после удаления пробного завтрака).

При применении парентерального раздражителя (гистамина) сразу извлекают чистый желудочный сок, меняя банку-приемник каждые 15 мин (всего 4 порции в течение 1 ч). Это соответствует «часовому напряжению секреции» в ответ на раздражитель.

Соблюдение стандартных условий изучения базальной и стимулированной секреций делает сопоставимыми результаты исследования.

Беззондовые методы исследования

Некоторым больным зондирование противопоказано. В этих случаях для изучения секреторной функции желудка используют беззондовые методы. К беззондовым методам относятся: десмоидная проба по Сали, метод ионообменных смол, ацидотест, гастротест. Данные беззондовых исследований менее точны и дают лишь ориентировочное представление о желудочной секреции.

Десмоидная проба по Сали. Метиленовый синий помещают в мешочек из тонкой эластичной резины. Этот мешочек завязывают кетгутовой нитью. В процессе исследования больной натощак проглатывает мешочек, а затем завтракает. В желудке соляная кислота и пепсин переваривают кетгут, и мешочек открывается. Метиленовый синий всасывается в кровь и выводится с мочой. За время исследования собирают порции мочи через 3, 5 и 20 ч. Отмечают время появления и интенсивность окраски мочи. При нормальной секреции 1-я порция мочи не окрашена, 2-я – бледно-зеленого цвета, 3-я – сине-зеленого цвета.

Метод ионообменных смол. Основан на приеме внутрь ионообменных смол, связанных с каким-нибудь низкомолекулярным соединением – хинином, парааминосалициловой кислотой и т. д. В желудке при наличии свободной соляной кислоты ионы индикаторов обмениваются на такое же количество водородных ионов соляной кислоты, при этом индикатор освобождается из смолы, всасывается в кишечнике и выделяется с мочой. Для проведения исследования серийно выпускаются ионообменные смолы в виде драже под названием «Гастротест», «Диагнес-блю», «Ацидотест». К каждой пробе прилагаются инструкция по применению и цветная шкала для сравнения окраски.

Исследование кислотообразующей функции

Исследование включает определение общей кислотности свободной соляной кислоты, связанной соляной кислоты, молочной кислоты.

Кислотообразующую функцию желудка характеризуют следующие показатели:

1) общая кислотность – сумма всех кислых продуктов, содержащихся в желудочном соке;

2) свободная соляная кислота;

3) связанная соляная кислота;

4) абсолютное количество соляной кислоты, выделившейся за определенное время;

5) кислотный остаток, все кислые соли и органические кислоты, кроме соляной кислоты.

Метод Тепфера

Реактивы:

1) 1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина;

2) 0,5 %-ный спиртовой раствор диметиламиноазобензола;

3) 1 %-ный водный раствор ализаринсульфоновокислого натра;

4) 0,1-ный нормальный раствор едкого натра.

В 2 колбы наливают по 5 мл желудочного содержимого. В первую добавляют 1–2 капли 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина и 1–2 капли 0,5 %-ного спиртового раствора 4-диметиламидоазобензола; в присутствии свободной соляной кислоты проявляется красное окрашивание. Заметив первоначальный уровень 0,1 г раствора щелочи в бюретке, производят титрование при постоянном встряхивании содержимого до появления оранжево-желтого цвета (цвета семги). Потребовавшееся для этого количество миллилитров едкого натра, умноженное на 20, соответствует содержанию в исследуемом материале свободной соляной кислоты (в титрационных единицах и моль/л). Затем продолжают титрование, пока снова не появится красное окрашивание (реакция фенолфталеина), что свидетельствует о полной нейтрализации желудочного содержимого. Количество 0,1 г щелочи, израсходованное в обе фазы титрования, умноженное на 20, соответствует общей кислотности.

Во 2-ю колбу прибавляют 1–2 капли 1 %-ного водного раствора ализаринсульфоновокислого натра, титруют до исчезновения желтой и появления слабо-фиолетовой окраски. В присутствии этого индикатора нейтрализуются все кислореагирующие вещества, за исключением связанной соляной кислоты. Количество 0,1 г щелочи, требуемой для титрования, умноженное на 20, вычитают из цифры общей кислотности и узнают количество связанной соляной кислоты.

Появление фиолетового окрашивания после добавления в желудочное содержимое ализаринсульфоновокислого натра свидетельствует об отсутствии не только свободной, но и связанной кислоты.

Метод Михаэлиса

Реактивы:

1) 1 %-ный раствор фенолфталеина;

2) 0,5 %-ный спиртовой раствор диметиаминоазобензола;

3) 0,1 %-ный нормальный раствор едкого натра.

К 5 мл профильтрованного желудочного содержимого прибавляют 1–2 капли индикаторов фенолфталеина и диметиламидоазобензола и титруют 0,1 г раствором натра. Отмечают первоначальный уровень в бюретке, уровень щелочи при переходе первоначального красного цвета в цвет семги, уровень щелочи при переходе цвета семги в ярко-желтый, уровень щелочи при переходе окраски в стойкий розовый цвет.

Количество щелочи, пошедшее на титрование от первоначального уровня до уровня при переходе окраски в цвет семги, соответствует содержанию свободной соляной кислоты. Количество щелочи, пошедшее на титрование от начального уровня до уровня при установлении стойкого розового цвета, составляет общую кислотность. Количество щелочи, пошедшее на титрование от начального уровня до уровня, который соответствует среднему арифметическому между уровнями щелочи, отмеченными при переходе окраски в ярко-желтый цвет и в стойкий розовый, равно сумме свободной и связанной соляной кислоты (общей соляной кислоте). Связанную соляную кислоту определяют вычитанием цифры свободной соляной кислоты из цифры, соответствующей общей соляной кислоте. Разность между общей кислотностью и суммой свободной и связанной соляной кислоты равна кислотному остатку (органические кислоты и кислореагирующие фосфаты). При Расчете все указанные показатели приводят к 100 мл желудочного сока, т. е. умножают на 20.

Микрохимический способ определения кислотности (по Горбенко). Метод применяется в случаях извлечения малого количества желудочного содержимого или при необычной его окраске (примесь крови, желчи). Используют те же реактивы, что при методе Михаэлиса.

В стаканчик помещают 1 мл желудочного сока и 5 мл дистиллированной воды, определяют свободную соляную кислоту и общую кислотность, титруя из микробюретки или пипетки. Содержание свободной соляной кислоты вычисляют, умножив количество щелочи, пошедшей на титрование до цвета семги, на 100. Общую кислотность узнают путем умножения на 100 количества щелочи, затраченной на все титрование и умноженной на 0,05 (величину индикаторной поправки).

Определение дебета соляной кислоты. Для более объективной оценки кислотообразующей функции желудка вычисляют абсолютную кислотную продукцию за единицу времени, обычно за 1 ч (дебит-час). В зависимости от используемого при Расчете показателя кислотности различают дебит-час свободной соляной кислоты и дебит-час соляной кислоты (общая кислотная продукция за час).

Дебит-час (Д-Ч) выражают в миллимолях (или в мг) и вычисляют:

Д-Ч = Y_1 × E_1 × 0,001 + Y_2 × E_2 × 0,001 +

+ Y_3 × E_3 × 0,001 + … + Yn × En × 0,001,

где Y – объем порции желудочного сока, мл;

Е – концентрация свободной соляной кислоты (или общая кислотность), титр. ед. (моль/л);

0,001 – количество миллимолей соляной кислоты в 1 мл желудочного содержимого при ее концентрации, равной одной титрационной единице.

Для выражения дебита (Д) в мг каждое из слагаемых умножают на 36,5 – молекулярную массу соляной кислоты. Число слагаемых в формуле равно числу порций желудочного содержимого, полученного за время исследования (при Расчете Д-Ч их обычно 4). Поскольку величина дебит-часа зависит от часового напряжения секреции и величины кислотности, следует добиваться полного извлечения желудочного содержимого.

Общую кислотную продукцию в период базальной секреции обозначают ВАО (basal acid output), при максимальной – МАО (maximal acid output), при субмаксимальной стимуляции гистамином – SAO. Показатели МАО находятся в зависимости от массы обкладочных клеток.

Определение дефицита соляной кислоты. Принцип определения основан на добавлении к желудочному содержимому соляной кислоты до появления качественной реакции на свободную соляную кислоту. К 5 мл профильтрованного желудочного содержимого добавляют 1 каплю 0,5 %-ного спиртового раствора диметиламидоазобензола (при отсутствии свободной соляной кислоты цвет желтый) и титруют 0,1 г раствором соляной кислоты до появления красного цвета. Израсходованное количество, умноженное на 20, соответствует дефициту соляной кислоты.

Согласно Ламблингу, дефицит соляной кислоты 40 мл и более указывает на полное прекращение секреции соляной кислоты. Если величина дефицита меньшая, то соляная кислота выделяется, но либо полностью нейтрализуется бикарбонатом, либо после нейтрализации бикарбонатом остается часть соляной кислоты, которая, соединяясь со слизью, образует кислый муцин – относительная, или химическая, ахлоргидрия.

Определение молочной кислоты. Молочная кислота образуется палочками молочнокислого брожения в застойном желудочном содержимом при отсутствии свободной соляной кислоты, а также как продукт метаболизма раковых клеток. На наличие молочной кислоты исследуют порции, полученные натощак, используя качественную реакцию Уффельманна.

Реактивами служат 1 %-ный раствор карболовой кислоты и 10 %-ный раствор полуторахлористого железа, из которых приготовляют свежий реактив Уффельманна (2–3 мл карболового раствора и 1 капля полуторахлористого железа). Полученный раствор темно-фиолетового цвета разводят водой до светло-фиолетового и приливают к нему по каплям профильтрованный желудочный сок.

В присутствии молочной кислоты появляется лимонно-желтое окрашивание вследствие образования молочнокислого железа.

Электрометрическое измерение рН желудка. Наиболее точные данные об истинной кислотности желудочного содержимого дает измерение концентрации свободных водородных ионов с помощью интрагастральной рН-метрии. О концентрации водородных ионов судят по электродвижущей силе (э. д. с.), возникающей между парами электродов, которые могут быть вмонтированы в зонд или капсулу. В настоящее время широко используют электронные пары, состоящие из сурьмяного (стеклянного) и каломелевого, сурьмяного и хлорсеребряного электродов.

Установка для внутрижелудочной рН-метрии с использованием зонда состоит из следующих частей:

1) рН-олива;

2) рН-зонд;

3) штепсель, осуществляющий соединение с регистрирующим прибором;

4) рН-регистратор.

Зонд вводят через рот на глубину 55–60 см (под рентгеновским контролем) таким образом, чтобы датчики зонда располагались в антральном отделе желудка, в проксимальном и дистальном отделах двенадцатиперстной кишки. В этих случаях одновременно оценивается кислотообразующая функция желудка и ощелачивающая способность двенадцатиперстной кишки. Регистрацию производят через определенные промежутки времени (каждые 10–15 мин) до и после применения раздражителя. Получают ацидограмму, отражающую динамику рН за время исследования.

По Линару, нормальным цифрам кислотности, определенным с помощью титрационного метода (20–40 ммоль/л свободной соляной кислоты), соответствует рН в пределах 1,7–1,3, пониженным – более 1,7 и повышенным – менее 1,3–1,0.

Нормальные показатели секреции желудочного сока

По Ю. И. Фишзону-Рыссу, нормальные показатели «голодного» желудочного остатка следующие: объем желудочного содержимого – не более 50 мл; общая кислотность – до 40 титр. ед. (моль/л); свободная соляная кислота – до 20 титр. ед. (моль/ л); общая кислая продукция (дебит соляной кислоты) – до 70 мг (2 ммоль); дебит свободной соляной кислоты – не выше 40 мг (1 ммоль); концентрация пепсина – 0,21 мг/ 100 мл; дебит по Туголукову – до 10 мг.

Таблица 29

Нормативы секреции желудочного сока

Нормативы показателей базальной секреции в ответ на пищевой раздражитель, на субмаксимальную и максимальную стимуляции гистамином представлены в таблице 29. Нормативы базальной и последующей секреции почти совпадают, из чего следует, что только субмаксимальная и максимальная стимуляции обеспечивают выявление истинных функциональных возможностей желудочных желез. При этом величины максимальной кислотной продукции (МАО) в большей степени отражают структурное состояние слизистой оболочки желудка, во многом определяясь массой обкладочных клеток. Сопоставление показателей базальной и максимальной секреций дает представление о роли гуморальных механизмов и морфологических изменений в нарушении деятельности железистого аппарата.

Исследование ферментообразующей функции желудка

Методы основаны на определении переваривающей способности желудочного содержимого в отношении различных белковых субстратов. Это методы Мета, Уголева, Пятницкого, Туголукова и др. Последний метод определения пепсина унифицирован.

Метод Туголукова. В основе лежит определение протеолитической активности желудочного сока по количеству расщепленного белка.

Реактивы:

1) 2 %-ный раствор сухой плазмы на 0,1 г в растворе хлористо-водородной кислоты (НСl);

2) 10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

О содержании пепсина судят по количеству переваренного белкового субстрата. В специальную центрифужную пробирку (с оттянутым и градуированным нижним концом) вносят 1 мл профильтрованного и предварительно разведенного (1: 100) дистиллированной водой желудочного содержимого. В контрольную пробирку помещают 1 мл прокипяченного разведенного желудочного содержимого. В обе пробирки добавляют по 2 мл 2%-ного раствора сухой плазмы (в 0,1 г растворе НСl), инкубируют в течение 20 ч при 37 °C. После инкубации добавляют 2 мл 10 %-ного раствора трихлор-уксусной кислоты и тщательно перемешивают до получения однородной суспензии. Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об./мин. Измеряют величину осадка в пробирках и вычисляют показатель переваривания субстрата по формуле:

М = (А – В) × 40 / А,

где М – показатель переваривания;

А – величина осадка в контроле;

В – величина осадка в опытной пробе;

40 – постоянная величина, выведенная экспериментально.

По таблице 30 пересчета показателей переваривания белкового субстрата на содержание пепсина определяют концентрацию пепсина в мг на 100 мл желудочного сока.

Таблица 30

Пересчет показателей переваривания белкового субстрата (раствора сухой плазмы) на содержание пепсина в желудочном содержимом

Микроскопическое исследование желудочного содержимого

Микроскопическое исследование дает возможность оценить эвакуаторную функцию желудка, а также состояние его слизистой оболочки.

Исследованию подлежат порции желудочного содержимого, полученного натощак. После отстаивания или центрифугирования осадок выливают в чашку Петри, выбирают слизь и различные образования, отличающиеся цветом и формой от окружающего фона, помещают на предметные стекла, закрывая покровным стеклом. Из каждой порции необходимо приготовить не менее 3 препаратов: нативный неокрашенный и окрашенные раствором Люголя (1 г йода, 2 г йодида калия, 50 мл дистиллированной воды) и Суданом-3 (10 мл 96-градусного спирта, 90 мл ледяной уксусной кислоты, 2 г Судана-3). Данные микроскопического исследования позволяют судить о нарушениях эвакуаторной функции желудка и состоянии его слизистой оболочки.

У здорового человека в нативных препаратах находят преимущественно плоский эпителий и лейкоциты, попадающие в желудок из полости рта.

Элементами, указывающими на нарушение эвакуации пищи из желудка, служат мышечные волокна, растительная клетчатка, жир, дрожжевые грибы (овальные преломляющие свет клетки, несколько меньше эритроцита). Если застойное желудочное содержимое имеет кислую реакцию, в нем обнаруживаются сарцины – кокки в виде перевязанных тюков; при отсутствии свободной соляной кислоты встречаются палочки молочнокислого брожения – длинные, грубые, изогнутые, лежащие под углом.

Микроскопически непереваренные мышечные волокна имеют удлиненную цилиндрическую форму с хорошо сохранившимися прямыми углами и ясно выраженную поперечную исчерченность. Слабопереваренные волокна имеют выраженную цилиндричекую форму со слегка сглаженными углами.

Микроскопически неперевариваемая клетчатка имеет разнообразные резкие очертания, правильный рисунок с наличием толстых двухконтурных целлюлозных оболочек коричневой, желтой и серой окраски. Перевариваемая клетчатка отличается нежными контурами и наличием зерен крахмала или красящих пигментов. Глыбки и капли жира окрашиваются Суданом-3 в красный цвет.

Из элементов слизистой оболочки желудка выявляются лейкоциты (при наличии свободной соляной кислоты – в виде голых ядер нейтрофилов), цилиндрический эпителий (клетки конической формы, в суженной части которых можно видеть овальное ядро; располагаются рядами или комплексами; при наличии свободной соляной кислоты – голые, овальной или округлой формы ядра), эритроциты (редко встречаются в неизмененном виде; об их присутствии судят по участкам окрашенной в коричневый цвет слизи – отложению хлорида гематита).

Исследование на элементы злокачественного новообразования

Эксфолиативная цитология является одним из доступных методов диагностики ранних стадий рака желудка. Этот метод основывается на свойстве раковых клеток более легко (из-за непрочности их взаимосвязи) по сравнению со здоровой тканью сгущаться в просвете желудка. Для усиления отслаивания применяют специальные желудочные зонды, снабженные раздуваемыми баллонами с шероховатой поверхностью. Материалами для изучения служат осадок желудочного содержимого и промывные воды. Последние получают путем промывания желудка через зонд изотоническим раствором хлорида натрия (двумя порциями по 300–500 мл). Во избежание разрушения клеток материал исследуют быстро, из осадка готовят либо нативные препараты, которые просматривают в световом или фазово-контрастном микроскопе после окраски флюорохромами, либо сухие мазки, которые окрашивают по Романовскому – Гимзе или гематоксилин-эозином и микроскопируют с масляной иммерсией. Идентифицируют раковые клетки на основании выявления признаков атипизма – ядерного и клеточного полиморфизма.

Опухолевые клетки чаще представлены в виде клеток плоскоклеточного (с ороговением или без него), железистого рака или аденокарциномы. Возникают трудности в дифференцировке опухолевых клеток и метаплазированных клеток плоского или цилиндрического эпителия. Опухолевые клетки характеризуются полиморфизмом (могут быть гигантских размеров), увеличением и гиперхромией ядра и ядрышек с нуклеолами и митозами, базофилией цитоплазмы, способностью к фагоцитозу. При этом достоверно лишь обнаружение конгломератов, комплексов опухолевых клеток. Подозрение на опухолевые клетки при изучении нативного препарата подтверждается тщательным цитологическим исследованием окрашенных препаратов (окраска азурэозином).

Изменения желудочного содержимого при патологии

Язвенная болезнь желудка представляет собой хроническое рецидивирующее заболевание с чередованием периодов обострения и ремиссии, основным признаком которого является образование дефекта в стенке желудка или двенадцатиперстной кишки.

Язвенная болезнь характеризуется различной интенсивностью желудочного сокоотделения в зависимости от локализации язвы. Исследование кислотообразующей функции желудка проводят с помощью РН-метрии.

При локализации язвы в двенадцатиперстной кишке желудочная секреция носит непрерывный характер. В межпищеварительном периоде (порция натощак) отмечается не только увеличение объема желудочного содержимого, но и значительное повышение его кислотности. Общая кислотность может достигать 60–80 титрационных единиц, на ацидограмме рН 0,8–1,0 регистрируется с начала исследования, величина «голодного дебита» свободной соляной кислоты нередко превышает 3 ммоль. Подобному увеличению этого показателя придают особое значение, так как оно редко встречается при других заболеваниях гастродуоденальной системы. При желудочной локализации язвы усиление кислотообразования в межпищеварительном периоде отмечается вдвое реже.

У больных дуоденальной язвой базальное (и последующее) кислотообразование увеличено по сравнению с нормой в 2–3 раза, в то время как при язвенной болезни желудка в среднем оно мало отличается от нормы. Дебит-час свободной соляной кислоты в период базальной секреции, превышающий 12 ммоль, или ВАО выше 15 ммоль с большой долей вероятности указывают на дуоденальную язву.

При дуоденальной локализации язвы увеличена в 1,5–1,8 раза по сравнению с нормой и кислотная продукция в ответ на максимальную стимуляцию гистамином (МАО), которая в среднем составляет 30–35 ммоль. Чем более проксимально расположена язва (препилорическая зона, область угла желудка, тело желудка), тем ниже средние показатели максимального кислотоотделения. Поэтому цифры МАО, превышающие 35–40 ммоль у мужчин и 25–30 ммоль у женщин, свидетельствуют о язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Максимальная гистаминовая нагрузка вызывает при дуоденальной язве значительное (почти в 4 раза по сравнению с базальной секрецией) повышение часового дебита пепсина, что определяется гистологически установленным увеличением массы не только обкладочных клеток, но и главных клеток.

С повышенной секреторной активностью протекают язвы пилорического отдела и антральные язвы у молодых лиц. При язвах тела желудка секреторные показатели мало отличаются от нормы или снижены (из-за сопутствующего гастрита) и лишь в отдельных случаях умеренно повышены. Выявление ахлоргидрии при гистаминовой стимуляции у больного с язвой желудка может расцениваться как указание на малигнизацию.

Крайняя степень увеличения как максимальной, так и базальной кислотной продукции (БАО выше 20 ммоль и составляет 60 % МАО) представлена при синдроме Цоллингера – Эллисона (ульцерогенная аденома поджелудочной железы, обильно продуцирующая гастриноподобное вещество).

Рубцово-язвенная деформация луковицы со стенозом привратника характеризуется увеличением объема порции натощак (вследствие нарушения эвакуаторной функции желудка) с обнаружением в ней остатков съеденной пищи и других элементов застойного желудочного содержимого.

Хронический гастрит представляет собой хроническое воспаление слизистой оболочки желудка, сопровождающееся расстройством секреции, моторики и эвакуации пищи.

Заболевание характеризуется тенденцией к снижению показателей желудочной секреции, однако может протекать и на фоне нормальной или даже повышенной секреторной функции желудка. Во многом это зависит от особенностей локализации, характера изменений слизистой оболочки желудка, возраста больного и длительности заболевания. Хронический гастрит с гиперсекрецией чаще встречается у молодых лиц, чем у лиц более зрелого возраста. Поэтому обнаружение гиперсекреции у пожилых людей с длительным желудочным анамнезом заставляет думать о язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, а не о гастрите.

Повышенная секреторная функция встречается при очаговом антральном гастрите. При поверхностном гастрите тела желудка и гастрите с поражением желез без атрофии может наблюдаться нормальная, пониженная, диссоциированная (пониженное кислотообразование при нормальном содержании пепсинов) секреторная функция. В отдельных случаях гастрита без атрофии отмечается повышенная концентрация соляной кислоты и пепсина при небольших значениях часового напряжения секреции.

Сочетание повышенных относительных показателей секреции с низкими абсолютными (дебит-час) указывает на преимущественное поражение поверхностного ямочного эпителия и антральных желез.

При антральном гастрите, как правило, выявляется недостаточность секреторной функции желудка. Степень снижения кислотной продукции зависит от выраженности атрофических изменений. Повторное обнаружение гипо- и особенно ахлоргидрии при обычном зондовом исследовании свидетельствует о наличии гастрита. Наибольшее диагностическое значение имеет снижение максимальной кислой продукции. При МАО менее 5 ммоль практически ни у одного больного не обнаруживается нормальной слизистой. Гистаминрефрактерная ахлоргидрия, сочетающаяся со значительным снижением и тем более полным прекращением выработки пепсина (ахилия), свидетельствует о далеко зашедшем атрофическом гастрите. В таких случаях рН желудка при электрометрическом измерении не ниже 6,0 на протяжении всего исследования.

Функциональные заболевания желудка:

1) «раздраженный желудок». Показатели секреторной функции повышены, однако гистологическая картина слизистой оболочки желудка остается нормальной; очень характерна избыточная реакция на слабые раздражители при отсутствии существенных отклонений в характере реакции на максимальную стимуляцию (гиперреактивный тип секреции);

2) «функциональная ахлоргидрия». При исследовании секреторной функции обнаруживают гистаминположительную ахлоргидрию, в редких случаях и гистаминрефрактерную, при этом патологические изменения отсутствуют (гипореактивный тип секреции).

Рак желудка. Для рака желудка наиболее характерно снижение показателей желудочной секреции и особенно продукции соляной кислоты. По данным разных авторов, гипо- и ахлоргидрия встречаются в 55–60 % случаев рака желудка, причем у 40 % больных ахлоргидрия является гистаминрефрактерной. Однако наличие сохранного (на более ранних этапах болезни) и даже повышенного (при первичноязвенных формах и у молодых лиц) кислотообразования не исключает диагноза рака желудка.

Обнаружение в желудочном содержимом молочной кислоты не является ранним признаком рака желудка. Однако при формах, сопровождающихся ахлоргидрией и нарушением опорожнения желудка, положительная реакция на молочную кислоту может иметь дополнительное значение наряду с такими признаками, как увеличение количества извлеченного натощак содержимого и присутствие в нем съеденной накануне пищи.

Для ранней диагностики рака желудка большую ценность имеют метод гастроскопии с прицельной биопсией, а также гастрохромоскопия с метиленовым синим и эксфолиативная цитология.

Глава 6

Исследование содержимого двенадцатиперстной кишки

Дуоденальное зондирование

Для получения содержимого двенадцатиперстной кишки используют тонкий зонд длиной не менее 1,5 м с оливой. Метки на зонде расположены через каждые 10 см. Для данного исследования важно обратить внимание на метки, расположенные на уровнях: 0,45–0,5 м (расстояние до кардиальной части желудка), 0,65–0,7 м (вход в привратник), 0,9 м (расстояние до двенадцатиперстной кишки) от оливы. Зонд вводят утром натощак, в сидячем положении, до метки 0,45–0,5 м. Затем укладывают больного на кушетку без подушки на правый бок. На область проекции печени кладут теплую грелку и подкладывают валик так, чтобы нижняя часть туловища была приподнята. В таком положении пациент проглатывает зонд до метки 0,65–0,7 м. В течение 40–60 мин зонд втягивается в двенадцатиперстную кишку благодаря перистальтике желудка и продвигается до метки 0,8–0,9 м. Свободный конец зонда опускают в одну из пробирок. Первая порция желчи вытекает самостоятельно. Дальнейшее зондирование можно проводить двумя методами: классическим (трехфазным) и многомоментным (фракционным).

Трехфазный метод

Фаза I – получение порции А (дуоденальная желчь). Поступает самостоятельно из общего желчного протока. Это прозрачная соломенно-желтого цвета жидкость щелочной реакции. При примешивании желудочного содержимого эта порция может быть мутноватой. Мутная желчь выделяется при наличии в ней слизи, гноя. Появление этих элементов указывает на патологическое состояние. Все патологические элементы подвергаются затем микроскопированию.

Фаза II – получение порции В (пузырная желчь). Получают из желчного пузыря, для чего необходимо вызвать сокращение его и раскрытие мышечного жома (сфинктера), стягивающего проток желчного пузыря. Это достигается введением через зонд желчегонных средств (33 %-ного раствора сульфата магния, 10 %-ного раствора сорбита, 10 %-ного раствора пептона). В качестве раздражителя используют внутривенно вводимый холецистокинин. Раздражители применяют сразу после получения порции А, а после введения их на зонд накладывают зажим. Через 10–15 мин зажим снимают и собирают выделившуюся желчь. Она коричневого или темно-желтого цвета, прозрачная, щелочной реакции, вязкая. Темно-коричневая или зеленовато-коричневая желчь выделяется при застое в желчном пузыре.

Фаза III – получение порции С (печеночная желчь). Постепенно пузырная желчь начинает светлеть, и отделяется золотисто-желтая жидкость, прозрачная, щелочной реакции. Эта порция выделяется из печеночных ходов. Обычно собирают не более 2 пробирок печеночной желчи и на этом заканчивают зондирование. Полученную желчь исследуют немедленно в течение 30 мин с момента получения.

Многомоментное фракционное зондирование

При данном исследовании желчь собирают в отдельные пробирки через 5–10 мин, фиксируют время истечения каждой порции желчи, ее количество, результаты отражают в диаграммах.

При многомоментном дуоденальном зондировании регистрируют 5 фаз.

Фаза I (желчь А) – выделение дуоденального содержимого от момента попадания зонда в двенадцатиперстную кишку до введения холецистокинетического средства. Эта так называемая дуоденальная желчь (смесь секрета поджелудочной железы и печеночной желчи, поступающей из общего желчного протока) обычно прозрачная, янтарного цвета, нейтральной или слабощелочной реакции, с относительной плотностью 1008–1012, билирубиновым индексом 100 единиц. О гипосекреции свидетельствует уменьшение количества желчи, а выделение более светлой желчи определяется при поражении печеночной паренхимы, нарушении проходимости общего желчного протока. Гиперсекрецию регистрируют при холецистэктомии, обострении холецистита, гемолитической желтухе. Прерывистое выделение диагносцируется при гипертонусе сфинктера Одди. Порция А отсутствует в период разгара вирусного гепатита.

Билирубиновый индекс по Мейленграхту – ориентировочное определение интенсивности (концентрация билирубина) порций А, В и С, которое применяют во время зондирования. Он вычисляется путем сравнения порции желчи с раствором бихромата калия известной концентрации. Берут 0,05 г бихромата калия, растворяют в небольшом количестве воды, прибавляют 2 капли 10 %-ной серной кислоты и доводят водой до объема 500 мл. В калиброванную пробирку наливают стандартный раствор, в другую – 0,5 мл исследуемой желчи, к которой приливают воду до одинакового цвета со стандартом. Расчет проводят по формуле:

(0,5 + Y) / 0,5 = билирубиновые единицы («иктерус индекс» по Мейленграхту),

где Y – объем добавленной к желчи воды, мл.

Целесообразно прослеживать данную порцию в течение 20–40 мин с регистрацией количества и других особенностей ее на диаграмме каждые 5–10 мин. У здорового взрослого человека за этот период получают от 20 до 35 мл секрета. Выделение происходит равномерно (без толчков), вначале со скоростью 1 мл/мин, через 10–12 мин замедляется и может временами останавливаться. В патологии отмечаются гиперсекреция (выделение более 45 мл содержимого) и гипосекреция (менее 15 мл за 30 мин наблюдения).

Фаза II (фаза закрытого сфинктера Одди) – время от введения холецистокинетического средства до появления в зонде желчи. В качестве холецистокинетического средства чаще применяют 33 %-ный раствор сульфата магния, который вводят в количестве 30–40 мл через зонд в подогретом виде медленно (в течение 7 мин). Хорошее желчегонное действие оказывает введение в двенадцатиперстную кишку 50 мл 10 %-ного раствора сорбита, оливкового масла (10–40 мл). Наилучшим холекинетическим действием обладает холецистокинин-панкреозимин, вводимый парентерально.

Для практического применения используют шведский препарат «Cecekin», содержащий 75 единиц холецистокинина в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия (положительный эффект достигается в большинстве случаев при внутривенном введении половинной дозы – 37,5 единиц). После введения холецистокинетического средства обычно в течение 3–6 мин (время контролируется) выделение через зонд прекращается. Если применялся сульфат магния, то после окончания вливания его через зонд последний на 2–3 мин закрывают и после открытия получают лишь 3–5 мл бесцветной жидкости (остатки раздражителя).

Укорочение этой фазы определяется при гипотонии сфинктера Одди, при повышении давления в общем желчном протоке.

Удлинение этой фазы обычно связано с гипертонусом сфинктера Одди или стенозом дуоденального сосочка, а также может возникнуть при желчнокаменной болезни.

Фаза III (латентный период пузырного рефлекса) – от начала открытия сфинктера Одди до появления темной пузырной желчи (пузырный рефлекс). В нормальных условиях количество выделившейся светлой желчи из внепеченочных желчных протоков составляет 3–5 мл и продолжается 3–4 мин, т. е. до тех пор, пока сокращение желчного пузыря не преодолеет тонус пузырного протока. Эту порцию обозначают как порцию А1. Удлинение третьей фазы наблюдается при атонии желчного пузыря, при камнях в желчном пузыре. Уменьшение количества желчи этой фракции наблюдается при тяжелых поражениях печени или расширении общего желчного протока.

Фаза IV (опорожнение желчного пузыря) характеризуется выделением более густой, темно-желтого (оливкового) цвета желчи. Эта так называемая порция В с билирубиновым индексом 300–400 единиц, относительной плотностью 1016–1034 начинает течь со скоростью 2–3 мл/мин, затем медленнее. У здоровых людей за 30–40 мин выделяется 30–60 мл желчи этой порции – «рефлекс», причем, как правило, во время рефлекса не наблюдается резких колебаний интенсивности окраски или количества выделяемой желчи. В ряде случаев выявляется порция ВС – вялое и позднее сокращение желчного пузыря (вытекание одновременно с более светлой желчью порции С тонкой струйки темной пузырной желчи по стенке стеклянной трубочки, укрепленной в конце дуоденального зонда). В пробирке эти порции смешиваются, и только при микроскопическом обнаружении элементов желчного пузыря можно заподозрить позднее добавочное его сокращение.

Если пузырный рефлекс в течение 30 мин отсутствует или выделяется незначительное количество желчи, необходимо ввести спазмолитики (подкожно атропин или через зонд 20 мл повторно холецистокинетические средства; можно в сочетании с 5–10 единицами питуитрина Р внутримышечно), но лучший эффект достигается при введении холецистокинина. Ускорение времени выделения желчи порции В возникает при гипермоторной дискинезии желчного пузыря в случае сокращения его нормального объема.

Уменьшение количества желчи возникает при уменьшении объема желчного пузыря.

Отсутствует фракция желчи порции В при:

1) закупорке пузырного протока камнем;

2) нарушении сократительной способности желчного пузыря;

3) при невозможности концентрировать желчь желчным пузырем при воспалительных процессах;

4) отсутствии «пузырного рефлекса».

Фаза V (порция С) – выделение через зонд после окончания пузырного рефлекса (а при его отсутствии сразу после введения раздражителя) вновь светлой желчи из печеночных протоков. Желчь порции С янтарно-желтого цвета (обычно немного светлее, чем порция А) с билирубиновым индексом около 100 единиц, относительной плотностью 1007–1010, вытекает с такой же скоростью, как и содержимое порции А. Ее собирают по частям с 5–10-минутными интервалами в течение примерно 30 мин. Медленное (8–20 капель в минуту) и с паузами отделение желчи порции С может вызываться нарушениями экскреторной функции гепатоцитов.

Все порции желчи могут отсутствовать при зондировании при сдавлении общего желчного протока, при тяжелых поражениях печеночной паренхимы.

Для одновременного отсасывания желудочного содержимого и содержимого двенадцатиперстной кишки используют двухканальный зонд.

Он состоит из соединенных между собой методом вулканизации двух тонких зондов, один из которых – желудочный – заканчивается на 12 см выше оливы дуоденального зонда.

При нахождении оливы дуоденального зонда в среднем отделе двенадцатиперстной кишки отверстия, которыми снабжен желудочный зонд, открываются в антральном отделе желудка.

Аспирация желудочного содержимого производится с помощью системы отрицательного давления, присоединенной к желудочному зонду вместе с сосудом для сбора жидкости в течение всего времени зондирования (желудочное содержимое целесообразно подвергнуть химическому исследованию; наибольшая кислотность отмечается обычно в период истечения желчи порции В).

Комплексное гастродуоденальное зондирование с холецистографией (по В. Е. Медведеву)

Это исследование дает возможность оценить деятельность желудка, поджелудочной железы, желчевыводящей системы и печени.

Накануне пациент принимает йопагност или холевид (благодаря этому добиваются, с одной стороны, контрастирования желчного пузыря, с другой – избирательного окрашивания в зеленый цвет пузырной желчи). Утром натощак вводят двухканальный зонд. Место нахождения зонда контролируют рентгенологически и одновременно производят снимок желчного пузыря. Затем пациента укладывают на правый бок и начинают зондирование.

Этап I – получение базального желудочного и дуоденального содержимого. Базальную порцию дуоденального содержимого собирают в течение 20 мин (в отдельные пробирки с интервалом в 5 мин), при этом получают до 20 мл секрета. В базальной порции желудочного содержимого определяют рН и дебит соляной кислоты.

Этап II – получение и изучение секрета поджелудочной железы. Для этого интрадуоденально вводят 30 мл 0,5 %-ного теплого раствора соляной кислоты или внутривенно секретин (1,5 единицы на 1 кг массы).

Отмечают время от начала введения раздражителя до момента появления дуоденального содержимого (пауза зондирования, фаза закрытого сфинктера Одди). В норме выделение секрета возобновляется через 4–6 мин (при введении соляной кислоты) или через 1–2 мин (при введении секретина).

Максимальное количество секрета поджелудочной железы определяется в первые 20 мин этапа II, составляя 90–120 мл. Постепенно уменьшаясь, выделение секрета заканчивается по истечении 1 ч.

В ответ на введение раствора соляной кислоты после латентного периода, который составляет 15–20 мин, выделяется незначительное количество пузырной желчи (частичный пузырный рефлюкс), примешивающейся к панкреатическому секрету. Учитывают количество секрета, определяют активность панкреатических ферментов (липазы, трипсина, амилазы), бикарбонатную щелочность, содержание белка.

Этап III – изучение функционального состояния желчного пузыря (пузырный рефлюкс).

Собственно пузырный рефлекс получают в ответ на интрадуоденальное введение 20 мл теплого рафинированного подсолнечного масла или внутривенное введение панкреозимина (1,5 ЕД на 1 кг массы). Регистрируют латентный период пузырного рефлюкса, количество и время выделения желчи. Продолжительность пузырного рефлюкса в норме – 35–40 мин, за это время выделяется 50–60 мл желчи, окрашенной в зеленый цвет. Пузырную желчь подвергают микроскопическому и бактериологическому исследованиям. За исключением случаев «отключенного желчного пузыря» последовательное применение раздражителей (раствора соляной кислоты – масла, секретина – пакреозимина) дает возможность всегда получать пузырный рефлюкс.

После окончания вытекания пузырной желчи исследование прекращают, зонд вынимают и повторно производят снимок желчного пузыря. Все исследование продолжается 3–3,5 ч.

Физические свойства желчи

В понятие «физические свойства желчи» включают определение количества, цвета, прозрачности, консистенции, реакции, относительной плотности.

Количество желчи в порциях указано при описании методов получения при зондировании.

Цвет обусловлен наличием желчных пигментов. Наиболее концентрированной и интенсивно окрашенной является порция В.

Относительная плотность желчи измеряется ареометром (урометром) так же, как и мочи. Она равняется в порции А 1,007–1,015; в порции В – 1,016–1,034; в порции С – 1,007–1,010 и увеличивается при застойных явлениях в желчном пузыре и желчных протоках. Все порции здорового человека прозрачны. Помутнение чаще всего связано с наличием слизи, клеточных элементов, микроорганизмов.

Химическое исследование желчи

Химическое исследование желчи включает определение концентрации билирубина, холестерина и желчных кислот, вычисление холато-холестеринового индекса (х/х) и др.

Колориметрическим методом по Мейленграхту можно ориентировочно определить концентрацию билирубина. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия образуется диазофенилсульфоновая кислота (диазосмесь), которая дает со связанным (прямым) билирубином сыворотки розово-фиолетовое окрашивание. По его интенсивности судят о концентрации связанного билирубина, дающего прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный (непрямой) билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние и также дает розово-фиолетовое окрашивание с диазосмесью одновременно с прямым билирубином. По интенсивности окраски, образующейся после добавления кофеинового реактива, определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным (прямым) билирубином находят содержание несвязанного (непрямого) билирубина. В 3 пробирки (для общего билирубина, прямого и для контроля) вводят реактивы в порядке, указанном в таблице 31.

Для определения прямого билирубина в пробе измерения на ФЭКе производят спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при более длительном стоянии в реакцию вступает непрямой билирубин.

Таблица 31

Количество реактивов, участвующих в реакции

При определении общего билирубина пробу оставляют стоять 20 мин. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Контроль на мутность сыворотки ставят для каждого опыта.

Измерение экстинкции производят на ФЭКе при зеленом светофильтре (500–560 нм) против воды в кювете с толщиной слоя в 5 мм. Из показателей общего и прямого билирубина вычитают показатель контроля. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и прямого билирубина. Для определения непрямого билирубина из общего вычитают прямой билирубин.

Построение калибровочного графика удобно производить с помощью набора «Билирубин-эталон» (фирма «Лахема», Чехия). Набор содержит лиофилизированный (сухой) билирубин, альбумин и инструкцию по построению графика.

Результаты выражают в миллиграммах на литр. Для этого концентрацию билирубина, найденную по графику, умножают на 2000, так как для исследования было взято 0,5 мл сыворотки. Коэффициент пересчета в единицы СИ (мкмоль/л) равен 1,7104. В норме содержание общего билирубина – 8,5–20,5 мкмоль/л.

По соотношению концентрации билирубина в порциях С и В судят о концентрационной способности желчного пузыря (с учетом возможности снижения ее в порции В при разведении желчи воспалительным экссудатом). В норме в порции В содержится 3,4–6,8 ммоль/л (200–400 мг%), а в порции С – 0,17–0,34 ммоль/л (10–20 мг%) билирубина.

Цветная реакция Либермана и Бурхарда. С помощью этого метода производят количественное определение холестерина в желчи. Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание.

Для этого используют:

1) смесь из 1 части ледяной уксусной кислоты, 5 частей уксусного ангидрида и 1 части концентрированной серной кислоты; смесь должна быть бесцветной или желтоватой; хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в холодильнике;

2) стандартный раствор холестерина – 1800 мг/л (180 мг холестерина растворяют в 2,5 мл хлороформа в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят до метки абсолютным спиртом); раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой, которую парафинируют; 1 мл раствора содержит 1,8 мг холестерина.

К 2,1 мл смеси реактивов (1) добавляют 0,1 мл исследуемого материала (желчи). Пробирку энергично встряхивают 10–12 раз и ставят в термостат на 10 мин при температуре 37 °C. Измерения производят на ФЭКе против реактива 1 при красном светофильтре (630–690 нм) в кювете с толщиной слоя в 5 мм.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Для калибровочного графика готовят из основного стандартного раствора холестерина (2) ряд разведений (табл. 32).

Таблица 32

Ряд разведений из основного стандартного раствора холестерина

Рабочие стандартные растворы обрабатывают так же, как опытные пробы.

Известен ряд колориметрических методов на желчные кислоты, в которых используются реакция Петтенкофера и ее модификации, основанные на взаимодействии желчных кислот с сахаром в присутствии серной кислоты. В результате реакции образуется фурфурол, и раствор окрашивается в вишнево-красный цвет. Эта реакция специфична для холевой и парных (гликохолевой и таурохолевой) кислот, остальные желчные кислоты не вступают в данную реакцию.

В норме, согласно Н. А. Скуя, в порции А концентрация холестерина составляет 1,3–2,8 ммоль/л (50–110 мг%), холатов – 17,4–52,0 ммоль/л (670–2000 мг%); в порции В концентрация холестерина – 5,2–15,6 ммоль/л (200–600 мг%), холатов – 57,2–184,6 ммоль/л (2200–7100 мг%); в порции С содержание холестерина 1,1–3,1 ммоль/л (45–120 мг%), холатов – 13,0–57,2 ммоль/л (500–2200 мг%). Приведенные нормативы показывают большие физиологические колебания состава желчи. Н. А. Скуя предлагает считать гиперхолестеринохолией концентрацию холестерина выше 6,5 ммоль/л (250 мг%) в одной или нескольких печеночных (порции А и С) фракциях, а гипохолестеринохолией – концентрацию холестерина менее 2–2,6 ммоль/л (80–100 мг%) во всех печеночных фракциях.

Особое практическое значение имеет холато-холестериновый коэффициент (х/х). У здоровых лиц он обычно выше 10. Снижение х/х коэффициента (менее 10) является индикатором склонности к камнеобразованию в желчевыводящей системе. При оценке х/х коэффициента необходимо сопоставлять с данными микроскопического анализа (обнаружения скоплений кристаллов холестерина, аморфных масс билирубината кальция, микролитов).

Микроскопическое исследование

Непременным условием микроскопического анализа дуоденального содержимого служит незамедлительное его исследование по мере получения каждой очередной порции. Если исследование не может быть произведено сразу, материал сохраняют в течение 1–2 ч прибавлением к нему нейтрального формалина (10 %-ный раствор – 1/3 объема), трасилола (1 мл, т. е. 1000 единиц на 10–20 мл) или ЭДТА (2 мл 10 %-ного раствора на 10–20 мл). Исследуют осадок (капли желчи со дна пробирки) из нескольких порций и как можно большее количество хлопьев слизи. В хлопьях клеточные элементы, защищенные слизью, выявляются лучше, чем в осадке, где они смешиваются с желчными кислотами и детритом и быстро разрушаются. Желчь выливают в чашки Петри, выбирают пипеткой хлопья слизи, избегая брать муть – смесь дуоденального и желудочного содержимого, приготавливают нативные препараты и просматривают в световом или фазово-контрастном микроскопе. При микроскопии обнаруживаются клеточные элементы, кристаллические образования и паразиты.

Из клеточных элементов дуоденального содержимого для оценки состояния желчевыводящей системы и двенадцатиперстной кишки имеют значение лейкоциты и цилиндрический эпителий.

Лейкоциты обнаруживают в хлопьях слизи. Нельзя придавать диагностическое значение окрашенным желчью лейкоцитам, так как форменные элементы любого происхождения, утратив жизненную способность, быстро окрашиваются при добавлении к ним желчи, в то время как защищенные слизью клетки остаются неокрашенными (состояние парабиоза). Главными критериями происхождения лейкоцитов из того или иного отрезка желчевыводящей системы служат условия (из какой фракции дуоденального содержимого) и фон (в сочетании с каким видом цилиндрического эпителия) их выявления. Очень редко (только у больных с септическим холангитом и абсцессом печени) в желчи порции С их можно встретить в большом количестве. Чаще же, даже при явном воспалительном процессе в желчных путях или пузыре, лейкоциты обнаруживаются лишь в отдельных из просмотренных препаратов вместе с типичным эпителием этих отделов. В связи с неоднородностью хлопьев слизи и неравномерностью распределения в них лейкоцитов подсчет их в поле зрения микроскопа не проводится.

Эпителий. Цилиндрический эпителий находится в тяжах слизи одиночно и пластами. Возможно различать эпителий желчных протоков, пузыря и двенадцатиперстной кишки и таким образом проводить топическую диагностику воспалительного процесса, сопровождающегося слущиванием эпителиальных клеток. Эпителий печеночных желчных ходов – низкопризматический, круглые ядра расположены близко к основанию, кутикулы нет. Основной эпителий желчного пузыря – высокий призматический с относительно большим круглым (или овальным) ядром, расположенным близко к основанию, и нередко вакуолизированной цитоплазмой. Эпителий общего желчного протока – высокопризматический, выглядит особенно длинным и узким («спичечные» клетки), имеет такое же узкое, сжатое и длинное ядро. Эпителий двенадцатиперстной кишки – крупный, с большим круглым (овальным) ядром, веретенообразно вытягивающим нижнюю часть клетки, и утолщенной (в виде исчерченной каймы) кутикулой.

Лейкоцитоиды – круглые клетки, напоминающие лейкоциты, но отличающиеся более крупными размерами и отрицательной реакцией на пероксидазу. Образуются из эпителия двенадцатиперстной кишки в результате нервнорефлекторных, механических, осмотических и химических воздействий.

Лейкоцитоиды обнаруживаются в разных количествах (иногда покрывают все поле зрения) в крупных хлопьях слизи порций В и С (после введения в двенадцатиперстную кишку сульфата магния) как у здоровых, так и у больных людей.

Из кристаллических осадочных элементов желчи клиническое значение имеют микролиты, кристаллы холестерина, желчные кислоты, билирубинат кальция и жирные кислоты. Сочетание некоторых из них образует «песок», хорошо видимый под микроскопом, или «замазку» – макроскопически заметный осадок желчи.

Кристаллы холестерина имеют вид тонких бесцветных пластинок четырехугольной формы с обломанным концом. C целью уточнения их присутствия в скоплениях аморфных и кристаллических образований (песок) используют реакцию Сальникова: под покровное стекло вводят концентрированную серную кислоту, в результате действия которой кристаллы холестерина медленно плавятся, окрашиваясь в красный цвет. У больных с поражением желчевыводящей системы выпадение кристаллов холестерина наблюдается часто. Нахождение большого их количества не является прямым доказательством наличия желчных камней, но указывает на такую возможность, свидетельствуя о потере коллоидной стабильности желчи.

Билирубинат кальция – бурые, желтые или темно-коричневые глыбки пигмента, лишь изредка обнаруживаемые у здоровых людей.

Нахождение их в большом количестве (в хлопьях слизи и каплях) вместе с кристаллами холестерина является также индикатором изменения коллоидальных свойств желчи.

Желчные кислоты видны под микроскопом в виде мелких блестящих коричневатых или ярко-желтых зернышек, нередко покрывающих в виде аморфной массы все поле зрения. Обнаружение обильного осадка желчных кислот в «чистых» фракциях дуоденальной желчи с большой осторожностью можно расценивать как показатель дисхолии.

Жирные кислоты – кристаллы в виде длинных или коротких игл (мыла), часто сгруппированных в пучки.

Жирные кислоты отщепляются от лецитина желчи под действием фермента лецитиназы, активность которой повышается в присутствии дезоксихолевого натрия, а также бактерий. Поэтому обнаружение кристаллов жирных кислот в «чистой» пузырной желчи (при исключении попадания жирных кислот с содержимым из желудка) может расцениваться как указание на снижение рН желчи вследствие воспалительного процесса (бактериохолию), а также на понижение растворимости жирных кислот в желчи.

Микролиты (микроскопические камни) – темные, преломляющие свет круглые или многогранные образования, по своей компактности отличающиеся от скоплений кристаллов холестерина, а по размерам превышающие печеночный «песок». Они состоят из извести, слизи и лишь небольшого количества холестерина.

Микролиты чаще всего обнаруживаются в хлопьях слизи и каплях желчи (осадок) из порции ВС (необходимо просматривать большое количество препаратов).

«Песок» – скопление всех осадочных элементов желчи в хлопья слизи.

Паразиты. В дуоденальном содержимом можно обнаружить яйца двуусток (печеночной, кошачьей, китайской, ланцетовидной), нередко находят вегетативные формы лямблий.

Глава 7

Исследование мочи

Для исследования собирают всю порцию утренней мочи после тщательного туалета половых органов. Мочу необходимо собирать в совершенно чистую, сухую посуду; хранить до исследования можно не более 1,5 ч в холодном месте. Длительное стояние ее ведет к изменению физических свойств, размножению бактерий и разрушению элементов осадка мочи. Применение консервирующих веществ нежелательно, но допускается в виде исключения, если анализ не может быть произведен в положенное время. Для проведения обычных тестов подходит произвольно взятая порция мочи. При подозрении на диабет исследуют порцию мочи через 2 ч после приема пищи. При подозрении на нефрит собирают утреннюю порцию, так как она имеет более высокую плотность и более низкий рН. При сборе суточной мочи утром освобождается мочевой пузырь, а затем ее собираю 24 ч в стеклянный сосуд.

Физические свойства мочи

Количество

Количество выделяемой за сутки мочи (диурез) в норме у взрослых колеблется от 1000 до 2000 мл, составляя в среднем 50–80 % принятой жидкости. Дети в зависимости от возраста выделяют меньшее количество мочи. Ее суточное количество можно вычислить по формуле:

600 + 100 (х – 1)= мл за 24 ч,

где х – число лет ребенка от 1 года до 10 лет.

Количество выделенной мочи является показателем не только функционального состояния аппарата мочеотделения. На суточный диурез влияет ряд экстраренальных факторов. Диурез увеличивается при приеме большого количества жидкости, при употреблении пищевых веществ, повышающих диурез (арбуза, тыквы и др.). Ограничение приема жидкости, усиленное потоотделение, понос, рвота ведут к уменьшению диуреза. В патологии полиурия (свыше 2000 мл) наблюдается при заболеваниях почек (хронические нефриты и пиелонефриты, в период уменьшения отеков у почечных больных и др.), при сахарном диабете, алиментарной дистрофии и пр. Олигурия наблюдается при заболеваниях почек (острых диффузных нефритах), недостаточности кровообращения, повышенной гидрофильности тканей, задержке натрия в тканях и пр.

Анурия может быть следствием тяжелого поражения почечной паренхимы (при острых диффузных нефритах), почечнокаменной болезни (закупорка мочеточников). В результате болевых раздражений может возникнуть рефлекторная анурия. Длительная анурия (свыше 5–7 суток) ведет к уремии.

Ишурия – задержка мочи в мочевом пузыре при невозможности самостоятельного мочеиспускания. Причиной этого могут быть: аденома или рак предстательной железы, воспаление простаты, стриктуры уретры, закупорка камнем выхода из мочевого пузыря.

Количество утренней мочи (обычно 150–250 мл) не дает представления о суточном диурезе. Измерение объема утренней мочи целесообразно для интерпретации ее относительной плотности.

Цвет

Цвет нормальной мочи колеблется от светло-желтого до насыщенно-желтого. Окраска мочи в норме зависит от содержания пигментов урохрома, уроэретрина, уророзеина и др. Интенсивность окраски меняется параллельно с удельным весом и количеством выделенной мочи.

Моча насыщенно-желтого цвета обычно концентрированная, имеет высокий удельный вес и выделяется в небольшом количестве. Бледная моча чаще имеет низкий удельный вес, что наблюдается при полиурии.

В патологии цвет мочи может быть от зеленовато-желтого до коричневого в присутствии желчных пигментов; красный, бурый, красновато-желтый – от примеси крови, гемоглобина; темно-бурый и черный – при меланозах, алкаптонурии.

Цвет мочи может изменяться после приема медикаментов: красный или розовый цвет обусловливают пирамидон, антипирин, сульфонал; темно-бурый и черный – салол, нафтол и другие; синеватый – метиленовый синий; зеленовато-желтый и коричневый – ревень, александрийский лист и др.

Запах

Запах мочи особого диагностического значения не имеет. Свежевыделенная нормальная моча – без запаха. При стоянии мочи появляется аммиачный запах. В свежевыделенной моче аммиачный запах наблюдается при циститах, пиелитах, пиелонефритах и др. Резко зловонная моча наблюдается при употреблении в пищу чеснока, хрена. Наибольшее диагностическое значение имеет запах мочи у больных диабетом. В случае появления у них ацетоновых тел в моче отмечается «плодовый» или «яблочный» запах.

Прозрачность

В нормальной моче все составные части находятся в растворе, поэтому свежевыделенная моча совершенно прозрачна. Если моча оказывается мутной в момент выделения, то это обусловлено наличием в ней большого количества клеточных образований, солей, бактерий, жира.

Ориентировочно установить причину помутнения можно следующим образом: если при нагревании 4–5 мл мочи в пробирке она становится прозрачной, то помутнение было вызвано мочекислыми солями (уратами); если степень помутнения после нагревания не изменяется, то к моче прибавляют 10–15 капель уксусной кислоты, полное или даже частичное исчезновение мути после этого говорит о том, что она была вызвана фосфатами.

Помутнение, исчезающее при добавлении соляной кислоты, вызвано оксалатом кальция. Муть, обусловленная присутствием жира, исчезает при взбалтывании мочи со смесью эфира и спирта. Если моча остается мутной, несмотря на все эти процедуры, то муть, по всей вероятности, вызвана микробами, что распознается при микроскопическом исследовании (табл. 33).

Таблица 33

Изменение цвета мочи в зависимости от различных причин

Реакция мочи

Определение рН при помощи лакмусовой бумаги

Определение рН при помощи лакмусовой бумаги следует проводить одновременно двумя ее видами – синей и красной.

Трактовка результатов следующая: если синяя лакмусовая бумага краснеет, а красная не изменяет своего цвета – реакция кислая; если красная лакмусовая бумага синеет, а синяя не изменяет своего цвета – реакция щелочная; если же оба вида бумаги не меняют своего цвета – реакция мочи нейтральная.

Моча здоровых взрослых людей при обычном питании имеет средние значения рН 6,25 (от 5,0 до 7,0). Колебания рН мочи обусловлены составом питания: мясная диета обусловливает кислую реакцию мочи, растительная диета – щелочную.

В норме при смешанной пище в организме образуются главным образом кислые продукты обмена. Основания попадают в организм при приеме щелочных лекарств и питании богатой основаниями пищей (овощами, фруктами, молочными продуктами). Излишнее количество бикарбонатов выводится почками, при этом моча становится щелочной.

Органические кислоты и кислые соли неорганических кислот, содержащиеся в моче, диссоциируют в водной среде, выделяя известное количество свободных Н+. Концентрация (активность) свободных Н+-ионов представляет истинную реакцию мочи – активную кислотность (рН).

Щелочность мочи увеличивается при рвоте, особенно при высокой кислотности желудочного сока, ощелачивающей терапии, хронической инфекции мочевыводящих путей. Кислотность увеличивается при сахарном диабете, туберкулезе почек, почечной недостаточности.

Изменение рН мочи соответствует изменениям рН крови; при ацидозах моча имеет кислую реакцию, при алкалозах – щелочную.

Однако иногда наблюдается расхождение этих показателей. При хронических поражениях канальцевого аппарата почек в крови отмечается картина гиперхлоремического ацидоза, а реакция мочи щелочная, что связано с нарушением синтеза кислоты и аммиака в связи с поражением канальцев.

При гипокалиемическом алкалозе наблюдается ацидурия. Недостаток калия увеличивает секрецию Н+-ионов канальцами. В данной ситуации это физиологический ответ почечных канальцев, направленный на поддержание ионного равновесия между клетками и межтканевой жидкостью. Таким образом, определение рН мочи может иметь значение при дифференциальной диагностике алкалоза и ацидоза разной этиологии.

Унифицированный метод определения рН мочи с индикатором бромтимоловым синим

Необходимые реактивы

Бромтимоловый синий (31, 311-дибромтимолсульфофталеин) – 0,1 г растертого в фарфоровой ступке индикатора растворяют в 20 мл теплого этилового спирта и после охлаждения до комнатной температуры доводят водой до 100 мл.

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. К 2–3 мл мочи добавляют 1–2 капли рабочего раствора индикатора. Границы изменения окраски индикатора лежат в диапазоне значений рН 6,0–7,6; этот диапазон обеспечивает определение кислой и щелочной реакций. Желтый цвет соответствует кислой реакции, бурый – слабокислой, травянистый – нейтральной, буровато-зеленый – слабощелочной, зеленый и синий – щелочной. Практическое выполнение этой реакции очень просто и при большом количестве исследований значительно экономит время. Однако этот метод дает только ориентировочное представление о кислой или щелочной реакции, отличить мочу с нормальной кислотностью от патологически кислой не представляется возможным.

Универсальная индикаторная бумага также дает возможность определить рН (значения даны с интервалом 1,0 в широком диапазоне – от 1,0 до 10,0). Кроме того, некоторыми фирмами выпускаются специальные виды индикаторной бумаги, предназначенные для определения рН мочи (диапазон значений рН 5,0–8,0), или комбинированные экспресс-тесты, которые включают, кроме определения величины рН, несколько других показателей.

Относительная плотность мочи (удельный вес)

Относительная плотность мочи зависит от концентрации растворенных в ней веществ (белка, глюкозы, мочевины, солей натрия и др.). Каждые 3 г/л белка повышают относительную плотность мочи на 0,001, а каждые 10 г/л глюкозы увеличивают цифру плотности на 0,004. Цифры плотности утренней мочи, равные или превышающие 1,018, свидетельствуют о сохранении концентрационной способности почек и исключают необходимость ее исследования с помощью специальных проб. Очень высокие или низкие цифры плотности утренней мочи требуют выяснения причин, обусловивших эти изменения. Низкая относительная плотность связана с полиурией, а высокая при объеме утренней мочи 200 мл и больше чаще всего бывает при глюкозуриях.

Определение удельного веса мочи

Принцип метода определения удельного веса мочи – сравнение плотности мочи с плотностью воды при помощи ареометра (урометра) с диапазоном шкалы от 0,001 до 1,050.

Необходимое оборудование

1. Цилиндр вместимостью 50 мл.

2. Урометр.

Ход исследования

Мочу наливают в цилиндр, избегая образования пены, затем в нее осторожно погружают урометр. После прекращения его колебаний отмечают относительную плотность по положению нижнего мениска на шкале урометра. Урометр не должен касаться стенок цилиндра. Температура исследуемой мочи должна быть 15 ± 3 °C. Если мочи мало, то можно перед исследованием развести ее в 2–3 раза дистиллированной водой, а потом полученную цифру относительной плотности умножить на степень разведения.

Тестирование мочи с помощью экспресс-полосок

Экспресс-анализ мочи производится с помощью диагностических наборов инертных пластиковых полосок, на которых расположены бумажные подложки с наложением химических реактивов.

Показатели мочи, определяемые с помощью диагностических полосок:

1) глюкоза;

2) билирубин;

3) уробилиноген;

4) кетоны;

5) кровь;

6) эстераза лейкоцитов;

7) нитраты;

8) белок;

9) альбумин;

10) креатинин;

11) трипсиноген;

12) рН;

13) относительная плотность.

Ход исследования

Для исследования в мочу опускают диагностическую полоску, при этом происходит растворение реагентов на каждой подложке, результат химической реакции проявляется в изменении цвета подложки. После определенного интервала времени цвет полоски сравнивается со шкалой. Если результат невозможно определить полуколичественно, его оценивают как «положительный» либо как «отрицательный».

Химическое исследование мочи

Определение белка

Небольшое количество белка в суточной моче обнаруживается и у вполне здоровых лиц, однако такие небольшие концентрации не выявляют в разовых порциях используемыми в настоящее время методами. Приблизительно 70 % белков мочи здорового человека приходится на долю уромукоида – белка, являющегося продуктом почечной ткани; таким образом, доля гломерулярного белка в моче здоровых людей является ничтожно малой и протеинурия в норме составляет 50–150 мг/сутки, причем большинство белков мочи идентичны сывороточным.

Принято различать следующие формы протеинурии в зависимости от места возникновения: преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом; ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть разделена на клубочковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией. В зависимости от длительности существования выделяют постоянную протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и преходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации. Целесообразно различать вариабельность протеинурии: при суточной потере белка до 1 г – умеренную, от 1 до 3 г – среднюю и более 3 г – выраженную. Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи. Наиболее точны методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам, полученным этими методами, можно судить о селективности протеинурии.

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой

Необходимый реактив

20 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

Ход исследования

В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку прибавляют 6–8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной.

Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2–3 каплями 10 %-ного раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга – Робертса – Стольникова

В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция, в результате чего появляется белое кольцо.

Необходимый реактив

30 %-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой. Приготовление реактива Ларионовой: 20–30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.

Ход исследования

В пробирку наливают 1–2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутами указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз и т. д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л).

Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.

Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты

Принцип метода

Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы

1. 3 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

2. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина – 1 %-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9 %-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором.

Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN_3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.

Специальное оборудование – фотоэлектроколориметр.

Ход исследования

В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм.

Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9 %-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице 34.

Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают так, как опытные пробы.

Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при Расчете.

Таблица 34

Приготовление разведений для построения калибровочного графика

Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и высокими концентрациями в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод

Принцип метода

Пептидные связи белка с солями меди в щелочной среде образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы

1. 10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

2. 20 %-ный раствор меди (CuSO_4 × 5H_2O).

3. 3 %-ный раствор NaOH.

Ход исследования

К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO_4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс – оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.

Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок).

Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора. При 3,0–3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0–3,5 для протекания реакции. Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т. е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН < 3,0) – ложноотрицательные. Число реагирующих аминогрупп в составе отдельных белков различно, поэтому альбумины реагируют в 2 раза интенсивнее, чем такое же количество γ-глобулинов (белок Бенс-Джонса, парапротеины), и гораздо интенсивнее, чем гликопротеиды. Однако при большом количестве слизи с высоким содержанием гликопротеидов (при воспалении мочевыводящих путей) оседающие на индикаторной полоске хлопья слизи могут давать ложноположительные результаты. Чувствительность отдельных производственных серий индикаторной бумаги, равно как и отдельных видов бумаги, выпускаемой одной и той же фирмой, может быть различной, поэтому к количественной оценке белка этим методом следует относиться осторожно. Определение суточной потери белков с мочой при помощи индикаторной бумаги невозможно. Таким образом, индикаторная бумага уступает химическим пробам, в первую очередь пробе с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает возможность быстрого исследования серии образцов.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса

Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема.

Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.

Принцип метода

Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °C или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40–60 °C, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН < 3,0–3,5) или слишком щелочной (pH > 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.

Необходимый реактив

2 М ацетатный буфер рН 4,9.

Ход исследования

Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °C. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная.

С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Определение альбумоз (протеоз)

Альбумозы – это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде.

Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.

Необходимые реактивы

1. Насыщенный раствор хлорида натрия.

2. Концентрированный раствор едкого натра.

3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).

Ход исследования

К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.

При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.

Определение глюкозы мочи

Нормальную концентрацию глюкозы в моче (до 0,2 г/л) обычными пробами не обнаруживают. Появление глюкозы в моче может быть результатом физиологической гипергликемии (алиментарной, эмоциональной, лекарственной) и патологических изменений в организме.

Физиологическая глюкозурия наблюдается при введении с пищей большого количества углеводов (алиментарная), после эмоционального напряжения (эмоциональная глюкозурия), после приема некоторых лекарств (диуретина, кофеина, кортикостероидов), при отравлениях (морфином, хлороформом, фосфором). Реже наблюдается почечная (ренальная) глюкозурия, обусловленная повышенной проницаемостью почек в отношении глюкозы и появлением ее в моче при нормальном количестве сахара в крови.

Появление глюкозы в моче зависит от концентрации ее в крови, от процесса фильтрации в клубочках (гломерулярных клиренсов) и от реабсорбции глюкозы в канальцах нефрона. Патологические глюкозурии делятся на панкреатогенные и внепанкреатические. Важнейшая из панкреатогенных – диабетическая глюкозурия. Внепанкреатические глюкозурии наблюдаются при раздражении ЦНС, гипертиреозе, синдроме Иценко – Кушинга, патологии печени, почек.

Для правильной оценки глюкозурии (особенно у больных диабетом) необходимо исследовать на сахар мочу, собранную за сутки.

Унифицированный метод определения с помощью индикаторных полосок

Метод основан на специфическом окислении глюкозы с помощью фермента глюкозооксидазы; образовавшаяся при этом перекись водорода разлагается пероксидазой и окисляет краситель. Изменение окраски красителя при окислении свидетельствует о присутствии глюкозы в моче.

Реактивная бумага «Глюкотест» представляет собой полоски бумаги 0,5 × 5 см, имеющие поперечную полосу светло-желтого цвета, пропитанную раствором ферментов и красителя. С помощью бумаги «Глюкотест» можно обнаружить глюкозу в моче и ориентировочно определить ее концентрацию.

Ход исследования

Индикаторную бумагу погружают в исследуемую мочу, так чтобы желтая полоса с реактивами оказалась смоченной, после этого ее немедленно извлекают из мочи и на 2 мин оставляют на пластмассовой пластинке. По истечении 2 мин сразу же сравнивают изменившуюся окраску цветной полосы на бумаге со шкалой, имеющейся в комплекте.

Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.

Полоски хранят при температуре от +8 до +18 °C, избегая попадания на них прямых солнечных лучей; не рекомендуется дотрагиваться рукой до цветной шкалы полоски.

Исследуют свежесобранную мочу; при содержании в моче глюкозы более 20 г/л интенсивность окраски цветной полосы становится предельной (соответствует 2 % по шкале) и далее не меняется.

Унифицированные методы обнаружения глюкозы в моче

Проба Гайнеса

Можно использовать готовый набор реактивов.

Метод основан на способности глюкозы восстанавливать в щелочной среде при нагревании гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета).

Для того чтобы из гидрата окиси меди при нагревании не образовался черный осадок окиси меди, к реактиву добавляют глицерин, гидроксильные группы которого связывают гидрат окиси меди.

Необходимые реактивы

1. Реактив Гайнеса: 13,3 г кристаллического сульфата меди (СuSO_4 × 5Н_2О) растворяют в 400 мл дистиллированной воды.

2. 50 г едкого натра растворяют в 400 мл дистиллированной воды.

3. 15 г глицерина растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Далее первый и второй растворы смешивают и тотчас же приливают третий раствор. Реактив стоек.

Ход исследования

К 6–8 мл мочи прибавляют 20 капель реактива до появления голубоватой окраски, смешивают и нагревают верхнюю часть пробирки до начала кипения. Нижняя часть пробирки – контроль. При наличии глюкозы в моче появляется желтая окраска в верхней части пробирки.

При бактериурии глюкоза мочи быстро разлагается.

Проба Бенедикта

Реакция основана на свойстве глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в щелочной среде в гидрат закиси меди (желтый цвет) или закись меди (красный цвет).

Необходимые реактивы

1. В однолитровую мерную колбу наливают 700 мл воды, добавляют 173 г цитрата натрия, 100 г безводного (или 200 г кристаллического) карбоната натрия. Нагревают до растворения.

2. Отдельно растворяют 17,3 г сульфата меди в 100 мл воды.

Смешивают оба раствора, непрерывно взбалтывая, после охлаждения доливают водой до 1 л.

Ход исследования

В пробирку наливают 5 мл реактива и прибавляют 8–10 капель мочи. Пробу нагревают в течение 2 мин на пламени или 5 мин в кипящей водяной бане. Дают пробирке остыть в течение 5–7 мин. При наличии сахара появляется зеленая, желтая или красная окраска жидкости с осадком. При зеленой окраске без наличия осадка проба считается отрицательной.

Проба Бенедикта является самой надежной, так как при большом разведении мочи (8–10 капель мочи на 5 мл реактива) восстанавливающее действие других редуцирующих веществ мочи выражено слабо.

Проба Нилендера

Проба основана на восстановлении глюкозой нитрата висмута в металлический.

Необходимый реактив

2 г нитрата висмута растирают в ступке с 4 г сегнетовой соли, растворяют в 100 мл 10 %-ного едкого натра и фильтруют. Реактив бесцветный. Хранят в бутылке из темного стекла.

Ход исследования

К моче прибавляют реактив в соотношении 2: 1 и кипятят в течение 3 мин. В присутствии сахара появляется окраска от коричневой до черной, при стоянии образуется темный осадок. Эта проба чаще, чем другие, оказывается положительной при отсутствии сахара в моче. Положительный результат получается в присутствии других редуцирующих веществ, находящихся в моче (такие как белок, лекарственные вещества: антипирин, салициловая кислота, антибиотики – биомицин, тетрациклин).

Унифицированный поляриметрический метод определения содержания глюкозы

Метод основан на использовании свойства раствора глюкозы вращать плоскость поляризованного луча вправо. Угол вращения пропорционален концентрации глюкозы в растворе.

Необходимый реактив

30 %-ный раствор ацетата свинца.

Специальное оборудование – поляриметр.

Ход исследования

Исследуемая моча должна быть кислой реакции, прозрачной и не содержать белка. Белок удаляют кипячением с последующим фильтрованием. Необходимо также обесцветить мочу, так как некоторые пигменты могут быть оптически активны. Лучше всего обесцвечивание достигается обработкой ацетатом свинца, для этого к 10 мл мочи приливают 1 мл 30 %-ного ацетата свинца, подкисленного несколькими каплями уксусной кислоты (в щелочной среде свинец осаждает глюкозу), перемешивают, фильтруют. Исследовать можно только прозрачный фильтр. Затем трубку поляриметра наполняют прозрачным фильтратом, избегая попадания пузырьков воздуха, накрывают шлифованным стеклом, помещают в аппарат и через 2–3 мин проводят определение. Это время необходимо для затихания колебаний частиц жидкости. Определение ведут строго по инструкции, прилагаемой к данному аппарату.

Точность поляриметра проверяют, исследуя стандартный раствор глюкозы, но этот раствор годен для работы только через 24 ч после его приготовления.

Определению могут мешать β-оксимасляная кислота, препараты тетрациклинового ряда, стрептомицин.

Колориметрический метод Альтгаузена

Принцип метода

Используется цветная реакция, получаемая при нагревании раствора глюкозы со щелочью.

Необходимый реактив

10 %-ный раствор едкого натра.

Ход исследования

К 4 мл мочи приливают 1 мл 10 %-ной щелочи. Кипятят в течение 1 мин. Через 10 мин после кипячения цвет жидкости сравнивают с цветной шкалой. На шкале соответственно каждой окрашенной полоске обозначено процентное содержание сахара. Можно приготовить цветную шкалу в пробирках (стандарты). Приготавливают следующие растворы глюкозы: 0,5; 1; 1,5; 2; 3 и 4 %-ный и обрабатывают их так же, как исследуемую мочу. Пробирки закрывают пробками. Таким стандартом можно пользоваться примерно 7–10 дней, что удобнее, чем бумажная шкала.

Метод Альтгаузена прост и удобен в практической работе и может быть рекомендован в тех случаях, когда нет поляриметра, и для быстрого определения уровня сахара у постели больного.

Определение уровня сахара в моче по цветной реакции с ортотолуидином

Принцип метода

Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием синего хромогена. Обе реакции протекают одновременно при рН 4,8.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO_4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта (раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев, имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция).

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH_3COONa × 3Н_2О в 1 л).

6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена (желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера (реактив 5), в холодильнике можно хранить несколько дней).

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл (рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде; если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать).

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3 %-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл.

Ход исследования

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл мочи или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо мочи берут физиологический раствор хлорида натрия. При приготовлении калибровочного графика вместо проб мочи берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой – величину экстинкции.

Существуют другие методы определения уровня сахара в моче (титрационный, бродильный), которые редко применяют в практических лабораториях.

Определение уровня других видов сахаров (левулезы, лактозы, галактозы)

При необходимости пользуются различными пробами (цветные качественные, бродильные, вращение поляризованного света, образование озазонов и пр.).

Из этих проб специфическими являются только бактериальное разложение, хроматографическое исследование и энзимные пробы.

Определение уровня молочного сахара (лактозы)

Лактоза появляется в моче беременных и кормящих женщин. Положительная качественная реакция на лактозу позволяет исключить в этих случаях глюкозурию, которая обусловлена другой патологией. Лактоза дает те же реакции восстановления, что и глюкоза. Плоскость поляризации вращает вправо.

Необходимые реактивы

1. 10 %-ный раствор едкого натра.

2. Аммиак (не слабее 10 %).

Ход исследования

К 8–10 мл мочи приливают 4–5 мл аммиака и 5–10 капель щелочи, нагревают на водяной бане при температуре 60–70 °C. В присутствии лактозы появляется розовое окрашивание. Глюкоза дает желтое окрашивание.

Количество лактозы определяют в поляризационном аппарате. Полученный результат умножают на 0,947.

Определение фруктозы (левулезы)

Левулеза иногда встречается в моче при нарушении обмена веществ и при диабете (вместе с глюкозой).

Необходимые реактивы

1. Резорцин.

2. Соляная кислота концентрированная.

Ход исследования

Растворяют несколько зерен резорцина в 3 мл концентрированной соляной кислоты, прибавляют двойное количество мочи и быстро нагревают на водяной бане. Пробу не следует долго кипятить, так как при этом из глюкозы может образоваться левулеза. При наличии левулезы проба окрашивается в вишнево-красный цвет. Проба считается положительной при быстром появлении интенсивной окраски.

Моча, содержащая левулезу, дает все реакции на глюкозу и вращает плоскость поляризации влево. При определении ее количества в поляриметре полученный результат умножают на 0,54. Так как фруктоза большей частью встречается одновременно с глюкозой, то вращения влево обнаружить не удается.

Определение кетоновых тел

К кетоновым телам относятся ацетон, ацетоуксусная и β- оксимасляная кислоты.

В норме с мочой выделяется 20–50 мг кетоновых тел за 24 ч.

Чаще всего кетонурия наблюдается при диабете, что является критерием правильности подбора пищевого режима: если количество вводимых жиров не соответствует количеству усвояемых углеводов, то увеличивается выделение кетоновых тел. При уменьшении введения углеводов (лечение без инсулина) при обычном количестве жиров начинает выделяться ацетон; при лечении инсулином отсутствие глюкозурии достигается лучшим усвоением углеводов и не сопровождается кетонурией. Таким образом, исследование кетоновых тел в моче больных диабетом необходимо для коррекции диеты. Присутствие кетоновых тел наблюдается также при голодании, безуглеводной диете, лихорадке, у детей – при рвоте и поносе.

Кетоновые тела в моче в основном встречаются совместно, поэтому раздельное определение их клинического значения не имеет.

Большинство качественных реакций на кетоновые тела основано на их взаимодействии с нитропруссидом натрия в щелочной среде и появлении цветной реакции (образование комплексных соединений).

Унифицированная проба Ланге

Принцип метода

Нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами (ацетоуксусной кислотой, β-оксимасляной кислотой и ацетоном) с образованием комплекса красно-фиолетового цвета.

Необходимые реактивы

1. Раствор натрия нитропруссида готовят из Расчета 50 г/л перед употреблением.

2. Уксусная кислота концентрированная.

3. Аммиак водный (NH_4OH) – 25 %-ный раствор.

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 3 ч после мочеиспускания. В пробирку к 3–5 мл мочи приливают 5–10 капель раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл уксусной кислоты, смешивают, а затем осторожно, по стенке пробирки, пипеткой наслаивают 2–3 мл водного раствора аммиака. Пробу считают положительной, если в течение 3 мин на границе сред образуется красно-фиолетовое кольцо.

Модифицированная проба Ротеры

Принцип метода тот же, что и в пробе Ланге.

Необходимые реактивы

1. Натрия нитропруссид, раствор из Расчета 50 г/л готовят перед употреблением.

2. Аммония сульфат.

3. Аммиак водный (NH_4OH) – 25 %-ный раствор.

Ход исследования

Приблизительно 200 мг сухого сульфата аммония, 5 капель мочи и 2 капли раствора натрия нитропруссида тщательно смешивают в пробирке, а затем на эту смесь осторожно наслаивают 10–15 капель раствора водного аммиака. При наличии кетоновых тел на границе раздела в течение 3–5 мин образуется красно-фиолетовое кольцо, интенсивность окраски которого позволяет ориентировочно судить о концентрации кетоновых тел в моче (табл. 35).

Таблица 35

Ориентировочная количественная оценка кетоновых тел в моче

При незначительной концентрации кетоновых тел слабое кольцо может появиться на 8–10-й минуте.

Проба Легаля

Необходимые реактивы

1. Свежеприготовленный водный раствор нитропруссида натрия (5 %).

2. 10–15 %-ный раствор едкого натра.

3. Уксусная кислота ледяная.

Ход исследования

К 5–6 мл мочи прибавляют несколько капель водного раствора нитропруссида натрия и 0,5 мл раствора едкого натра. Получается красное окрашивание. Добавляют 0,5–1 мл ледяной уксусной кислоты.

Если красный цвет исчезает, проба отрицательная, если сохраняется – положительная. Если получается слабая розовая окраска, то проба считается также положительной.

Метод с готовым набором для экспресс-анализа ацетона в моче

Принцип метода тот же, что и в предыдущих двух пробах.

Ход исследования

На полоску фильтровальной бумаги помещают таблетку, на которую пипеткой наносят 2 капли исследуемой мочи. Через 2 мин окраску таблетки сравнивают с цветной шкалой. Наличие ацетона вызывает фиолетовое окрашивание разной интенсивности; согласно шкале реакцию оценивают как слабоположительную, положительную и резко положительную.

Ряд фирм выпускает экспресс-тесты для определения кетоновых тел; определение с помощью таких тестов проводят строго по инструкции.

Ацетоуксусная кислота в стерильной моче стабильна до 8–10 дней, при бактериурии или большом количестве дрожжевого грибка может полностью исчезнуть в течение 24 ч. Около 20 % ацетона при комнатной температуре исчезает за 24 ч, но сохраняется в холодильнике.

Кетоновые тела могут исчезать из мочи и in vivo при бактериурии.

Определение желчных пигментов

Моча здоровых людей содержит минимальные количества билирубина, которые не могут быть обнаружены качественными пробами, применяемыми в практической медицине. С мочой выделяется только билирубина глюкуронид (прямой билирубин), концентрация которого в норме в крови незначительна.

Билирубинурию наблюдают главным образом при поражениях паренхимы печени (паренхиматозных желтухах) и нарушении оттока желчи (обтурационных желтухах).

Для гемолитической желтухи билирубинурия нехарактерна, так как гемобилирубин (непрямой билирубин) не проходит через почечный фильтр.

Большинство качественных проб для обнаружения билирубина в моче основаны на его превращении под действием окислителя в зеленый биливердин или пурпурно-красные билипурпурины, которые, примешиваясь к биливердину, дают синее окрашивание.

Унифицированная проба Фуше

Необходимые реактивы

1. 15 %-ный раствор хлорида бария.

2. Реактив Фуше: 25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и приливают 10 мл 10 %-ного раствора хлорного железа (FeCl_3).

Ход исследования

К 10 мл мочи прибавляют 5 мл 15 %-ного раствора хлорида бария. Смешивают, фильтруют. На вынутый из воронки и расправленный на дне чашки Петри фильтр наносят 2 капли реактива Фуше. Появление на фильтре сине-зеленых пятен говорит о присутствии билирубина. Если реакция мочи щелочная, то необходимо подкислить ее несколькими каплями уксусной кислоты.

Унифицированная проба Розина

Необходимый реактив

1%-ный спиртовой раствор йода.

Ход исследования

В пробирку наливают 4–5 мл мочи и осторожно, по стенкам пробирки, наслаивают раствор йода. Появление на границе между жидкостями зеленого кольца говорит о наличии билирубина.

Проба Готфрида

Принцип метода

Билирубина глюкуронид (холебилирубин) при соединении с диазотированной сульфаниловой кислотой (диазобензосульфоновая кислота) дает розовую окраску за счет образования билирубина.

Необходимые реактивы

1. 10 %-ный раствор хлорида бария.

2. Диазореактив: диазораствор I – 5 г сульфаниловой кислоты растворяют в небольшом количестве воды, прибавляют 15 мл концентрированной HCl и доливают до 1000 мл дистиллированной водой.

3. Диазораствор II – 0,5 %-ный раствор нитрата натрия. Непосредственно перед определением смешивают 10 мл диазораствора I и 0,25 мл диазораствора II.

4. Спирт этиловый 96 %-ный.

5. 6 %-ный раствор двузамещенного фосфата натрия.

Ход исследования

К 10 мл мочи, подкисленной несколькими каплями уксусной кислоты, прибавляют 5 мл 10 %-ного раствора хлорида бария, перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтр раскладывают на дне чашки Петри и на осадок, содержащий билирубин, капают 1–2 капли свежеприготовленной диазосмеси, 4 капли спирта и 1 каплю двузамещенного фосфата натрия. При положительной пробе получается красно-фиолетовая окраска.

Этот принцип лег в основу экспресс-тестов для определения билирубина, выпускаемых зарубежными фирмами «Ames» (Англия), «Boehringer» (Германия) и др.

Определение содержания желчных кислот

В нормальной моче содержится минимальное количество желчных кислот. При механической желтухе оно постоянно повышено; часто отмечается увеличение его и при паренхиматозной желтухе. При гемолитической желтухе количество желчных кислот не увеличено.

Проба Гея

Необходимый реактив

Серный порошок.

Ход исследования

40–60 мл фильтрованной мочи оставляют в колбе на 20–30 мин. Затем на ее поверхность насыпают серный порошок. Если частицы серы начинают тонуть, проба положительная (так как уменьшается поверхностное натяжение вследствие увеличения выделения желчных кислот и солей). Проба отрицательная, если серный порошок задерживается на поверхности. Наилучшие результаты получаются при разведении мочи до удельного веса 1,015. Проба становится положительной при концентрации желчных кислот и солей выше 0,01 %.

Проба Петтенкофера

Необходимые реактивы

1. Раствор сахара.

2. Концентрированная серная кислота.

Ход исследования

К 10 мл мочи прибавляют небольшое количество раствора сахара и взбалтывают до образования пены. После этого добавляют по каплям концентрированную серную кислоту. При наличии желчных кислот пена становится пурпурно-красной.

Определение содержания уробилиноидов

В моче здорового человека содержатся следы уробилиногена, а за сутки выделяется не более 6 мг, у детей – не более 2 мг.

В свежевыпущенной моче содержится уробилиноген, который при стоянии мочи окисляется в уробилины. Все эти вещества являются производными билирубина и называются уробилиноидами.

Уробилиноиды образуются под действием ферментов бактерий и клеток слизистой оболочки кишечника из билирубина, выделившегося с желчью.

Определение уробилина имеет большое клиническое значение. Присутствие его в количествах, превышающих норму, может быть при гемолитических состояниях (таких как гемолитическая желтуха, гемоглобинурия, некоторые инфекции, например малярия, и др.), при заболеваниях печени (гепатитах, циррозе печени, отравлениях и пр.), при кишечных заболеваниях и лихорадочных состояниях, что связано с токсическим поражением печени. Большое диагностическое значение имеет исследование уробилина в моче при желтухах.

Полное отсутствие уробилина указывает на обтурационную желтуху. Повышение содержания уробилина обнаруживается при паренхиматозной и гемолитической формах желтухи.

Проба Шлезингера

Принцип метода

Появление флюоресценции уробилина за счет образовавшихся цинкуробилиновых комплексов.

Необходимые реактивы

1. Насыщенный спиртовой раствор ацетата цинка (10 г на 100 мл 96 %-ного спирта).

2. Раствор Люголя.

Ход исследования

К 4–5 мл мочи приливают равное количество реактива (реактив предварительно взбалтывают) и 1 каплю раствора Люголя. Оставляют на 10 мин, затем фильтруют. Пробирку просматривают на темном фоне в отраженном свете. При наличии уробилина образуется зеленая флюоресценция. Некоторые медикаменты, например атебрин, дают положительную пробу Шлезингера.

Для разграничения настоящей положительной пробы и медикаментозной прибавляют разведенную соляную или серную кислоту. Флюоресценция, вызванная уробилином, исчезает, медикаментозная остается.

Унифицированная проба Флоранса

Принцип метода

С НСl уробилин образует соединение, окрашенное в красный цвет.

Необходимые реактивы

1. Серная кислота концентрированная.

2. Диэтиловый эфир.

3. НСl концентрированная.

Ход исследования

Мочу в количестве 8–10 мл подкисляют в пробирке 8–10 каплями концентрированной серной кислоты, перемешивают, затем приливают 2–3 мл эфира и, закрыв пробирку пробкой, несколько раз осторожно пропускают эфир через слой мочи для экстрагирования уробилина. Затем эфирную вытяжку мочи наслаивают, лучше пастеровской пипеткой, на 2–3 мл концентрированной НСl, налитой в другую пробирку. При наличии уробилина на границе жидкостей образуется розовое кольцо. Интенсивность окраски пропорциональна количеству уробилина.

Проба настолько чувствительна, что даже в норме на границе между двумя жидкостями видно легкое розовое окрашивание. Этой пробой можно установить полное отсутствие уробилиноидов в моче.

Унифицированная проба Богомолова

Принцип метода

Уробилин с сульфатом меди образует соединение красно-розового цвета.

Необходимые реактивы

1. Меди сульфат, насыщенный раствор: 23 г CuSO_4 × 5H_2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2. Хлороформ.

Ход исследования

К 10–15 мл мочи приливают 2–3 мл насыщенного раствора сульфата меди.

Если образуется помутнение, то прибавляют несколько капель концентрированной НСl до прояснения раствора. Через 5 мин приливают 2–3 мл хлороформа и, закрыв пробирку пробкой, несколько раз встряхивают.

Если хлороформ окрашивается в розовый цвет, то концентрация уробилина в моче выше нормальной.

Унифицированная бензальдегидная проба Нейбауэра

Проба основана на том, что уробилиногеновые тела с пара-диметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) дают соединение красной окраски.

Необходимые реактивы

Реактив Эрлиха – 2 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 20 %-ного раствора соляной кислоты.

Ход исследования

К 3–4 мл свежевыпущенной мочи, охлажденной до комнатной температуры, прибавляют 3–4 капли реактива Эрлиха (1 каплю на 1 мл мочи). Окрашивание жидкости в красный цвет в течение первых 30 с говорит об увеличенном содержании уробилиногена в моче; если окрашивание развивается по прошествии 30 с, то концентрация уробилина в моче нормальная, а если через 30 с окраска не развивается, то это может быть вариантом нормы или можно говорить о полном отсутствии уробилиногена в моче.

Билирубин мешает определению уробилиноидов, поэтому, если он обнаружен в моче, его следует предварительно удалить, осаждая хлоридом бария с последующим фильтрованием. Для этого к 10–12 мл мочи приливают 5–6 мл 10 %-ного раствора ВаСl_2 и фильтруют. Затем фильтрат проверяют на полноту осаждения билирубина и процедуру повторяют, если первое осаждение было неполным.

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Уробилиноген с парадиметиламинобензальдегидом образует комплекс, окрашенный в красный цвет; интенсивность окраски пропорциональна содержанию уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген используют аскорбиновую кислоту и гидрат окиси железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют ацетат натрия.

Необходимые реактивы

1. 4-диметиламинобензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. НСl концентрированная; реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH_3COONa × 3H_2O (или 226 г CH_3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °C. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

4. Аскорбиновая кислота.

5. Натр едкий, 0,5 г/л раствора.

6. Бария хлорид, 100 г/л раствора.

7. Фенолсульфофталеин (феноловый красный). Используют для приготовления калибровочного раствора.

8. Основной калибровочный раствор: 20 мг фенолсульфо-фталеина растворяют в 100 мл 0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при хранении.

Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора 0,5 г/л раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен в течение недели с условием хранения при 20 °C.

Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске раствору уробилиногена – 0,345 мг на 100 мл. Точность приготовления можно проверить измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре: при длине волны 562 нм оптическая плотность раствора должна быть 0,380–0,390.

Специальное оборудование – фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Исследование проводят в первые 2–3 ч после мочеиспускания. При наличии мутности мочу центрифугируют, а затем проводят качественное определение билирубина. Если обнаруживают билирубин, то 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раствора хлорида бария и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25, чтобы внести поправку на разведение.

Ход исследования

100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой мочи и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки для опытной и холостой пробы. В пробирку с холостой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготовленной смеси одного объема раствора Эрлиха и двух объемов насыщенного раствора ацетата натрия.

В пробирку с опытной пробой прибавляют 1,5 мл раствора Эрлиха и немедленно приливают 3 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Через 5 мин измеряют экстинкцию обеих проб против воды на фотоэлектроколориметре при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см, на спектрофотометре при длине волны 562 нм.

Рабочий калибровочный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена). Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Едэ).

Расчет производят по формуле:

Едэ = Ео – Еx / Ек × 0,346 × 6,0 / 1,5 = Ео – Еx / Ек × 1,38,

где Ео – экстинкция опытной пробы;

Ех – экстинкция холостой пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

0,346 – концентрация уробилиногена в растворе (0,346 мг на 100 мл), окраска которого эквивалентна окраске калибровочного раствора фенолфталеина;

6,0 – объем пробы, мл;

1,5 – количество мочи в пробе, мл. Соотношение ингредиентов при определении уробилиногена в моче представлено в таблице 36.

Таблица 36

Соотношение ингредиентов (в мл) при определении уробилиногена в моче

Рекомендуется собирать мочу в посуду из темного стекла, так как при дневном свете окисление уробилиногена происходит значительно быстрее.

Для Расчета выделения уробилиногена за определенное время для исследования надо брать мочу из всего собранного за это время объема и, учитывая его, провести Расчеты по формуле:

Ео – Еx / Ек × 1,38 × V / 100,

где V – объем мочи, мл, выделенный за определенный промежуток времени;

1/100 – коэффициент для Расчета количества уробилиногена в 1 мл мочи.

Определение порфобилиногена

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с парадиметиламинобензальдегидом с образованием окрашенного в красный цвет соединения. Для повышения специфичности реакции добавляют ацетат натрия. Соединения, дающие аналогичную реакцию с парадиметиламинобензальдегидом (уробилиноген, производные индола, скатола и др.), удаляют путем экстракции хлороформом и бутанолом, в которых ПБГ нерастворим.

Необходимые реактивы

1. 4-(диметиламино) – бензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. Соляная кислота концентрированная.

3. Реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

4. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH_3COONa × 3Н_2О (или 226 г CH_3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °C. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

5. Хлороформ.

6. Бутиловый спирт.

7. Бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0–5,0).

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. Смешивают в пробирке 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают. Измеряют рН индикаторной бумагой; рН должен быть в интервале 4,0–5,0.

Если рН меньше 4,0, то добавляют раствор ацетата натрия до установления нужного рН. Если окраска не развивается, результат считают отрицательным. При развитии розовой или красной окраски к пробе добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний слой остается бесцветным или слегка желтоватым, то результат следует считать отрицательным. Если окраска остается в слое над хлороформом, то 6–8 мл из окрашенного слоя переносят в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 1: 2 и встряхивают. Если фазы не сразу разделяются, то смесь центрифугируют при переходе окраски в слой бутилового спирта – результат отрицательный, если же окраска остается в исследуемом слое, то в исследуемой моче концентрация ПБГ превышает нормальную.

Если концентрация ПБГ в моче нормальна (до 2 мг/л), то проба отрицательная. ПБГ данным методом обнаруживают при концентрации выше 6 мг/л.

При хранении мочи более 3 ч при комнатной температуре положительная реакция может стать отрицательной. Это можно объяснить превращением порфобилиногена в порфирин и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2 ч, то хранить ее надо в холодильнике при 4 °C, доведя рН мочи до 6,0–7,0, так как в этих условиях порфобилиноген стабилен длительное время.

Определение крови и кровяных пигментов

Кровь можно обнаружить в моче микроскопически (см. «Микроскопия осадка мочи») и с помощью химических реакций.

Химические реакции на кровь

Принцип методов

Каталитическое свойство гемоглобина и окисление веществ в присутствии окислителей (перекись водорода, озонированного скипидара и др.) с образованием цветной реакции.

Бензидиновая проба

Необходимые реактивы

1. Основной бензидин.

2. Раствор уксусной кислоты 50 %-ный, перед употреблением немного бензидина (на кончике ножа) растворяют в 5 мл уксусной кислоты.

3. Раствор перекиси водорода 3 %-ный или (лучше) пергидроль, разведенный в 10 раз.

Ход исследования

К 3–5 мл мочи добавляют 2–3 капли раствора бензидина в уксусной кислоте и столько же перекиси водорода, перемешивают. Положительная реакция на кровь дает зеленое или сине-зеленое окрашивание в течение первых 2 мин. Окрашивание, наступившее после 2 мин, не учитывается. Вместо перекиси водорода можно пользоваться перекисью бария. 0,025 г основного бензидина и 0,1 г перекиси бария растворяют в 5 мл 50 %-ной уксусной кислоты. Реактив готовят непосредственно перед употреблением.

Ход исследования

К 3–5 мл мочи добавляют 2–4 капли реактива, отмечают изменение цвета в первые 2 мин. В положительном случае появляется сине-зеленое окрашивание.

Бензидиновая проба считается наиболее чувствительной.

Проба с гваяковой смолой (Вебера – Ван-Деена)

Необходимые реактивы

1. Ледяная или 80 %-ная уксусная кислота.

2. Спирт 96 %-ный.

3. Эфир.

4. Свежеприготовленная гваяковая настойка: растертую в порошок гваяковую смолу, взятую на кончике ножа, всыпают в сухую пробирку, приливают 2–6 мл спирта, дают отстояться, для реакции берут отстоявшуюся жидкость без осадка.

5. 3 %-ная перекись водорода.

6. Хлороформ.

Ход исследования

3–5 мл мочи разводят уксусной кислотой и приливают равное количество эфира, тщательно размешивают и сливают в пробирку. Дают отстояться. Эфирный слой переносят в другую чистую пробирку, приливают 15–20 капель гваяковой настойки, 10–15 капель перекиси водорода. При наличии крови тотчас или через 1–3 мин появляется синее или фиолетовое окрашивание.

Упрощенная гваяковая проба

Небольшое количество мочи наносят на бумажный фильтр, положенный на чашку Петри. На него накапывают поровну (по 2–3 капли) уксусной кислоты, гваяковой настойки и перекиси водорода. В присутствии крови появляется сине-зеленое окрашивание.

Пирамидоновая проба

Необходимые реактивы

1. 5 %-ный спиртовой раствор пирамидона (амидопирина).

2. 30 %-ный раствор уксусной кислоты.

3. Перекись водорода.

Ход исследования

Берут равные количества мочи и раствора пирамидона (по 2–3 мл), прибавляют по 10–12 капель уксусной кислоты и перекиси водорода.

В присутствии крови появляется сине-фиолетовое окрашивание. Интенсивность и время появления окраски зависят от количества крови. Отрицательный ответ дается через 2–3 мин.

Определение гемоглобина

Для диагноза гемоглобинурии необходимо доказать наличие гемоглобина в моче одной из химических проб.

При отсутствии эритроцитов в осадке (при микроскопическом исследовании) желательно спектроскопически определить природу пигмента.

Определение гемосидерина. Реакция на берлинскую лазурь

Необходимые реактивы

1. 5 %-ный раствор соляной кислоты.

2. 2–5 %-ный водный раствор железисто-синеродистого калия (желтая кровяная соль).

Ход исследования

Центрифугируют 15 мл мочи. К осадку прибавляют несколько капель соляной кислоты и несколько капель железисто-синеродистого калия. Делают препарат и микроскопируют. Через 2–5 мин (возможно и раньше) в клетках в положительном случае видны сине-зеленые зернышки. При разрушении клеток гемосидерин лежит свободно.

Гемосидерин в моче встречается главным образом при гемолитических анемиях с внутрисосудистым гемолизом (болезнь Маркиафава – Микели и др.).

Определение порфиринов

Исследование мочи на порфирины связано со значительными техническими трудностями.

Большая часть качественных проб и количественных методов определения основывается на их свойстве флюоресцировать при ультрафиолетовом свете.

Определение миоглобина

Необходимый реактив

Кристаллический сульфат аммония.

Ход исследования

В 5 мл мочи растворяют 2,8 г кристаллического сульфата аммония и фильтруют. Если фильтрат имеет красно-коричневый цвет, то в моче имеется миоглобин (миоглобинурия); если цвет фильтрата нормальный, следовательно, в моче присутствовал гемоглобин, 80 % которого осаждается реактивом.

Миоглобинурии встречаются при тяжелых травмах мышц, электротравмах, тяжелых миозитах и др.

Определение индикана

В нормальной моче индикан содержится в незначительном количестве, которое не обнаруживается обычными качественными пробами.

Индиканурия встречается при интенсивном гниении белковых веществ в кишечнике (колит, непроходимость кишечника, рак, абсцесс кишечника, перитонит, запоры и пр.), а также при усиленном распаде белков в организме (опухоль, эмпиема, абсцессы и др.).

Принцип метода

Превращение индикана в индоксил минеральной кислотой и последующее окисление индоксила (хлорным железом или марганцовокислым калием) в индиго синее или красное.

Проба Яффе

Необходимые реактивы

1. Соляная кислота концентрированная.

2. Хлороформ.

3. 2 %-ный раствор марганцовокислого калия.

Ход исследования

8–10 мл мочи смешивают с равным объемом соляной кислоты, приливают 1–2 мл хлороформа и 1–2 капли марганцовокислого калия. Пробирку закрывают и многократно опрокидывают, не взбалтывая. В присутствии индикана хлороформ окрашивается в голубой, синий или розовый цвет. При наличии в моче йодистых солей хлороформ также дает розовую окраску. В таком случае добавляют кристаллик гипосульфита. Исчезновение розовой окраски хлороформа говорит о присутствии йодистых солей. При наличии индикана розовая окраска не исчезает.

Проба Обермейера

Необходимые реактивы

1. 0,2–0,4 г хлорного железа растворяют в 100 мл концентрированной соляной кислоты (реактив нестоек).

2. Хлороформ.

Ход исследования

10 мл мочи смешивают с равным объемом реактива, добавляют 1–2 мл хлороформа и опрокидывают пробирку несколько раз. Синее окрашивание хлороформа указывает на присутствие индикана в моче.

Микроскопическое исследование осадка мочи

Микроскопия нативного препарата

Принцип метода

Микроскопическое исследование нативных препаратов мочевого осадка, полученного при центрифугировании мочи.

Необходимое оборудование

1. Центрифуга.

2. Микроскоп.

3. Центрифужные пробирки.

4. Предметные и покровные стекла.

Ход исследования

Приготовление препаратов: в центрифужную пробирку помещают 10 мл утренней мочи после тщательного ее перемешивания. Центрифугируют в течение 5 мин при скорости 2000 об./мин. Затем быстрым наклоном пробирки сливают прозрачный верхний слой, а оставшийся осадок переносят пипеткой с тонко оттянутым концом на середину предметного стекла и покрывают покровным. Надо стараться перенести осадок с минимальным количеством жидкости, чтобы покровное стекло покрывало его полностью. Большая капля расплывается, колеблется, препарат становится многослойным, и это затрудняет микроскопические исследования. Изучение препарата начинают с малого увеличения (8 × 10) для общего обзора, а более детальное изучение препарата с количественной оценкой структур производят при большом увеличении (10 × 40). Если структуры встречаются в каждом поле зрения, то количественную оценку выражают их числом в поле зрения, при небольшом количестве структур, когда их встречают далеко не в каждом поле зрения, – числом в препарате.

Различают организованный и неорганизованный осадок.

Организованный осадок

Эритроциты имеют дискообразную форму, окрашены в характерный желто-зеленый цвет. Включения в цитоплазме отсутствуют. В концентрированной моче кислой реакции эритроциты могут приобретать звездчатую форму. При длительном пребывании эритроцитов в моче низкой относительной плотности они теряют гемоглобин и имеют вид одноконтурных или двухконтурных колец. Деление эритроцитов на измененные и неизмененные не имеет первостепенного значения для решения вопроса об источнике гематурии.

Дифференцировать эритроциты надо с дрожжевыми грибами и кристаллами оксалатов округлой формы. Грибы в отличие от эритроцитов чаще овальной формы, более резко преломляют свет, имеют голубоватый оттенок и почкуются. Оксалаты обычно имеют различную величину и резко преломляют свет. Прибавление к препарату осадка капли 5 %-ной уксусной кислоты приводит к гемолизу эритроцитов, оставляя грибы и оксалаты без изменения.

В норме эритроциты либо не встречаются, либо обнаруживаются единичные в препарате.

Гематурия может быть при поражении паренхимы почки (гломерулонефрите, пиелонефрите, опухолях и др.), при тяжелой физической нагрузке и при поражениях мочевыводящих путей (почечных лоханок, мочеточников, мочевого пузыря, уретры).

Лейкоциты в моче имеют вид небольших зернистых клеток округлой формы. При низкой относительной плотности мочи размер их увеличивается, и в некоторых из них («активных») можно наблюдать броуновское движение гранул. При бактериуриях в щелочной моче лейкоциты довольно быстро разрушаются.

Лейкоциты в моче представлены главным образом нейтрофилами, но иногда можно обнаружить лимфоциты и эозинофилы, которые отличаются обильной, равномерной, крупной, преломляющей свет зернистостью. Активные лейкоциты, так называемые клетки Штернгеймера – Мальбина, можно выявить следующими способами.

I способ

Реактив Штернгеймера – Мальбина.

Раствор I: 3 г генцианового фиолетового, 20 мл этилового спирта, 0,8 г оксалата аммония, 80 мл дистиллированной воды. Раствор II: 0,25 г сафранина, 10 мл этилового спирта, 100 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор: 3 части раствора I + 97 частей раствора II. Сохраняется в течение 3 месяцев.

Ход исследования

Центрифугируют свежую утреннюю мочу. К осадку прибавляют 1–2 капли реактива, размешивают, каплю берут на стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. При этом различают 2 вида лейкоцитов: одни имеют ядра пурпурно-красного цвета и бесцветную или бледно-розовую цитоплазму, другие бледно-синее, иногда бледно-фиолетовое ядро и почти бесцветную цитоплазму. Бледно-синие клетки называются клетками Штернгеймера – Мальбина, в цитоплазме некоторых из них заметно активное движение гранул.

II способ

Реактив – 250 мг эозина, 10 мл глицерина, 2 мл 1%-ного фенола, 0,5 мл 40 %-ного формалина, 87,5 мл дистиллированной воды.

Ход исследования

Такой же, как предыдущий. Клетки Штернгеймера – Мальбина не окрашиваются или имеют бледно-голубой цвет. Ядра всех остальных лейкоцитов окрашиваются в розовый цвет.

III способ

Реактив – 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в абсолютном алкоголе, 1,6 мл 1%-ного раствора КОН, 110 мл бидистиллированной воды.

Ход исследования

Каплю реактива наносят на предметное стекло рядом с каплей мочевого осадка. Смешивают и микроскопируют в первые 5–10 мин.

Клетки Штернгеймера – Мальбина бесцветные, ядра остальных лейкоцитов – синего цвета.

В норме в мочевом осадке у мужчин от 0 до 3 лейкоцитов в поле зрения, у женщин – от 0 до 5 лейкоцитов в поле зрения.

Увеличение числа лейкоцитов в мочевом осадке свидетельствует о воспалительных процессах в почках или мочевыводящих путях.

Наличие в моче «активных» лейкоцитов свидетельствует об интенсивности воспалительного процесса независимо от его локализации.

Эпителиальные клетки

Эпителиальные клетки в мочевом осадке имеют различное происхождение, т. е. десквамация их происходит с органов, покрытых различными видами эпителия (многослойного плоского, переходного и кубического призматического).

Клетки плоского эпителия полигональной или округлой формы, больших размеров, бесцветные, с небольшим ядром, располагаются в виде отдельных экземпляров или пластами.

Клетки переходного эпителия различной формы (полигональные, «хвостатые», цилиндрические, округлые) и величины, имеют желтоватую окраску, интенсивность которой зависит от концентрации мочи и наличия пигментов, содержат довольно крупное ядро.

Среди клеток можно встретить двуядерные. Иногда в клетках наблюдают дегенеративные изменения в виде грубой зернистости и вакуолизации цитоплазмы.

Клетки почечного эпителия неправильной круглой формы, угловатые или четырехугольные, небольших размеров (в 1,5–2 раза больше лейкоцита), слегка желтоватого цвета. В цитоплазме клеток обычно выражены дегенеративные изменения: зернистость, вакуолизация, жировая инфильтрация.

В результате этих изменений ядра часто не выявляются. Клетки почечного эпителия относятся к кубическому и призматическому эпителию, выстилающему почечные канальцы. Чаще они располагаются в виде групп, цепочек. В некоторых случаях встречаются в виде комплексов округлой или фестончатой формы, состоящих из большого количества клеток разной величины с явлениями жирового перерождения.

В мочевом осадке практически всегда встречают клетки плоского и переходного эпителия от единичных в препарате до единичных в поле зрения.

Единичные в препарате клетки почечного эпителия на фоне нормальной микроскопической картины мочевого осадка не дают основания говорить о патологии.

Особого диагностического значения клетки плоского эпителия, попадающие в мочу из влагалища, наружных половых органов и мочеиспускательного канала, не имеют, но если их обнаруживают расположенными пластами в моче, взятой катетером, то это может указывать на метаплазию слизистой оболочки мочевого пузыря. Такую картину можно наблюдать при лейкоплакии мочевого пузыря и мочеточников, что является предопухолевым состоянием.

Переходный эпителий выстилает слизистую оболочку мочевого пузыря, мочеточников, почечных лоханок, крупных протоков предстательной железы и простатического отдела мочеиспускательного канала.

Усиленная эксфолиация клеток этого эпителия может быть при острых воспалительных процессах мочевого пузыря и лоханок, интоксикациях, а также при мочекаменной болезни и новообразованиях мочевыводящих путей.

Клетки почечного эпителия можно выявить в мочевом осадке при поражении паренхимы почек (нефритах), интоксикациях, расстройствах кровообращения. Обнаружение клеток почечного эпителия в тесной связи с цилиндрами говорит о тяжелом поражении почек.

Цилиндры – элементы осадка – представляют собой белковые или клеточные образования канальцевого происхождения, имеющие цилиндрическую форму и различную величину. В мочевом осадке различают следующие виды цилиндров: гиалиновые, зернистые, восковидные, эпителиальные, эритроцитарные, пигментные, лейкоцитарные.

Гиалиновые цилиндры имеют нежные контуры, прозрачны, при ярком освещении плохо заметны. На поверхности может быть легкая зернистость за счет аморфных солей или клеточного детрита. Образуются из свернувшегося белка.

Появление гиалиновых цилиндров свидетельствует о развитии протеинурии, что является следствием повышенной проницаемости клубочковых капилляров. Они представляют собой коллоидную форму белка, возникающую при изменении рН. Постоянно гиалиновые цилиндры присутствуют при органических поражениях почек, лихорадочных состояниях.

Зернистые цилиндры имеют более резкие контуры и состоят из плотной зернистой массы желтоватого цвета. Они образуются при наличии в эпителильных клетках выраженной дегенерации.

Восковидные цилиндры имеют резко очерченные контуры и гомогенную с блеском, слегка желтоватую структуру. Образуются из уплотненных гиалиновых и зернистых цилиндров при задержке их в канальцах. Они обнаруживаются при тяжелых поражениях паренхимы почек.

Эпителиальные цилиндры имеют четкие контуры и состоят из слущенных и склееннных друг с другом эпителиальных клеток канальцев. Они появляются при нефрозах, нефросклерозах и других патологических процессах в почках.

Эритроцитарные цилиндры желтоватого цвета, состоят из массы эритроцитов, образуются при почечной гематурии. Они обнаруживаются почти у половины больных с острым гломерулонефритом, а также при почечных паренхиматозных кровотечениях.

Пигментные цилиндры могут быть обнаружены при гемоглобинурии и миоглобинурии; они коричневого цвета, имеют сходство с зернистыми.

Лейкоцитарные цилиндры образуются из массы лейкоцитов, обнаруживаются при гнойных процессах в почках, пиелонефритах.

Кроме цилиндров, образованных из белка и клеток, в мочевом осадке иногда встречаются образования цилиндрической формы из аморфных солей, не имеющие практического значения. Эти образования растворяются при подогревании препарата или прибавлении к нему капли щелочи или кислоты.

В нормальной моче можно встретить единичные гиалиновые цилиндры (1–2 в препарате).

Цилиндрурия является симптомом поражения паренхимы почки; хотя и считается, что вид цилиндров особого диагностического значения не имеет, гиалиновые цилиндры подтверждают ренальную протеинурию, а лейкоцитарные и эритроцитарные дают возможность предположить источник лейкоцитурии и гематурии.

Унифицированное определение числа форменных элементов в суточном объеме мочи по методу Каковского – Аддиса

Принцип метода

Подсчет числа форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров) в суточном объеме мочи с помощью счетной камеры.

Специальное оборудование

Микроскоп, счетная камера.

Классический вариант исследования требует строгого соблюдения правил хранения мочи на протяжении длительного периода. Мочу собирают в течение суток: утром больной освобождает мочевой пузырь, а затем в течение 24 ч собирает мочу в сосуд с несколькими каплями (4–5) формалина или 2–3 кристаллами тимола; желательно хранить мочу в холодильнике.

Во избежание получения заниженных данных, обусловленных распадом форменных элементов в нейтральной (щелочной) моче или при низкой ее плотности, надо назначать больному в течение суток, предшествовавших исследованию, мясную пищу с ограничением жидкости, чтобы получить мочу кислой реакции и более высокой концентрации. Если нет возможности собрать мочу с учетом описанных условий, то можно собирать ее в течение 10–12 ч. В этом случае точность результата страдает, но собрать мочу легче. Собирают мочу за ночное время следующим образом: в 10 ч вечера больной освобождает мочевой пузырь, мочу выливают, и до 8 ч утра мочеиспускания не должно быть (интервал времени – 10 ч); всю мочу, полученную в 8 ч утра, посылают в лабораторию для исследования. При никтурии такой вариант сбора мочи не подходит.

Ход исследования

Собранную мочу тщательно перемешивают и измеряют ее объем. Для исследования получают осадок из количества мочи, выделенной за 12 мин (1/5 ч), которое рассчитывают по формуле:

Q = V / 5t,

где Q – объем мочи, выделенной за 12 мин, мл;

V – объем мочи, собранной за время исследования, мл;

t – время сбора мочи, ч;

5 – коэффициент пересчета за 1/5 ч.

Рассчитанное количество мочи центрифугируют в мерной центрифужной пробирке при скорости 3500 об./мин в течение 3 мин или при скорости 2000 об./мин в течение 5 мин, отделяют верхний слой, оставляя 0,5 мл мочи с осадком. Если осадок превышает 0,5 мл, то оставляют 1 мл мочи. Осадок тщательно перемешивают и заполняют счетную камеру. Подсчитывают раздельно количество лейкоцитов, эритроцитов, цилиндров (эпителиальные клетки не считают) и рассчитывают содержание форменных элементов в 1 мкл осадка мочи.

Расчет

Если подсчет проводят в камере Горяева, объем которой равен 0,9 мкл, то количество форменных элементов в 1 мкл определяют по формуле:

Х = А / 0,9,

где X – число форменных элементов в 1 мкл;

А – число форменных элементов, подсчитанных во всей камере;

0,9 – объем камеры (мкл).

Для камеры Фукса – Розенталя, объем которой 3,2 мкл, Расчет производят по формуле:

Х = А / 3,2.

Количество форменных элементов, выделенных с мочой за сутки, рассчитывают по формуле:

В = Х × 500 × 5 × 24 = Х × 60 000,

если для исследования взять 0,5 мл (500 мкл) из 12-минутной порции мочи, или:

В = Х × 1000 × 5 × 24 = Х × 120 000,

если осадок был обильным и был оставлен 1 мл (1000 мкл),

где X – число форменных элементов в 1 мкл мочи, оставленной для исследования с осадком;

В – число форменных элементов, выделенных за сутки;

500 (или 1000) – количество мочи, мкл, оставленной с осадком из 12-минутной порции мочи. Умножение на 5 и 24 дает Расчет количества клеток за 24 ч.

Нормальные величины суточной экскреции форменных элементов с мочой – до 2 × 10^6 лейкоцитов, до 1 × 10^6 эритроцитов и 2 × 10^4 цилиндров.

Для подсчета цилиндров необходимо просмотреть не менее 4 камер с сеткой Горяева или одну камеру Фукса – Розенталя.

Унифицированное определение количества форменных элементов в 1 мл мочи методом Нечипоренко

Принцип метода

Определение количества форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров) в 1 мл мочи с помощью счетной камеры.

Специальное оборудование

Микроскоп, счетная камера.

Ход исследования

Берут одноразовую порцию мочи (желательно утреннюю) в середине мочеиспускания, определяют рН (в моче со щелочной реакцией может быть частичный распад клеточных элементов); 5–10 мл мочи центрифугируют при скорости 3500 об./ мин в течение 3 мин, отделяют верхний слой, оставляя вместе с осадком 0,5 мл (500 мкл) мочи при небольшом осадке или 1 мл (1000 мкл) – при большом. Хорошо перемешивают осадок и заполняют счетную камеру. Подсчитывают отдельно лейкоциты, эритроциты и цилиндры во всей сетке камеры.

Расчет

Рассчитывают количество клеток в 1 мкл осадка мочи по формуле Х = А / 0,9 или Х = А / 3,2 (см. выше).

Установив эту величину, рассчитывают число форменных элементов в 1 мл мочи по формуле:

N = х × 500 / V,

если оставлено 0,5 мл (500 мкл) мочи с осадком.

Или же:

N = х × 1000 / V,

если оставлен 1 мл (1000 мкл) мочи с осадком,

где N – число форменных элементов в 1 мл мочи;

х – число форменных элементов в 1 мкл мочи, оставленной вместе с осадком;

500 (или 1000) – объем мочи, мкл, оставленной вместе с осадком;

V – количество мочи, взятой для центрифугирования.

В 1 мл мочи выделяется до 2000 лейкоцитов и до 1000 эритроцитов; цилиндры отсутствуют или обнаруживаются в количестве не более одного на камеру Фукса – Розенталя или на 4 камеры Горяева (до 20 в 1 мл).

Определение количества форменных элементов, экскретируемых с мочой за 1 мин, по методу Амбурже

Принцип метода

Определение количества форменных элементов, выделенных с мочой за 1 мин, с помощью счетной камеры.

Специальное оборудование

Микроскоп, счетная камера.

Ход исследования

Мочу собирают в течение 3 ч (180 мин). Перемешивают и 10 мл центрифугируют в течение 5 мин при скорости 2000 об./мин.

Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя 1 мл, и после перемешивания заполняют камеру. Производят подсчет клеток в 1 мкл осадка мочи по формуле Х = А / 0,9 или Х = А / 3,2 (см. выше). Расчет числа форменных элементов, выделенных за 1 мин, проводят по формуле:

Н = х × 1000 / S × V / t,

где Н – число клеток в минутном объеме мочи;

х – число клеток в 1 мкл осадка;

V – объем мочи за 3 ч;

S – количество мочи, взятое для центрифугирования;

t – время, за которое собрали мочу, в минутах.

За 1 мин в норме с мочой выделяется до 2000 лейкоцитов и до 1000 эритроцитов.

Приведенные методы количественного исследования элементов мочевого осадка могут быть использованы для распознавания скрытой (не обнаруживаемой при ориентировочной микроскопии осадка) лейкоцитурии; для выяснения вопроса о преобладании лейкоцитурии или гематурии и оценки их степени, а также при динамическом наблюдении за этими симптомами для определения эффективности проводимой терапии.

При отрицательных результатах количественного исследования лейкоцитурии у пациентов с подозрением на латентно текущий хронический пиелонефрит повторный подсчет лейкоцитов следует проводить после провокационных проб (наиболее распространен преднизолоновый тест).

Преднизолоновый тест

Принцип метода

Введение гормона активирует воспалительный процесс, и количество лейкоцитов в моче возрастает. Степень лейкоцитурии определяют по методу Нечипоренко до и после внутривенного введения преднизолона.

Специальное оборудование

Микроскоп, счетная камера.

Ход исследования

Утром больной опорожняет мочевой пузырь, и мочу выливают. Через час собирают мочу (контрольная порция), после чего внутривенно вводят 30 мг преднизолона в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида.

После вливания с интервалами в 1 ч собирают 3 порции мочи, подлежащие, как контрольная порция, исследованию по Нечипоренко (собирая мочу, берут при мочеиспускании только среднюю порцию).

Еще раз исследуют мочу через 24 ч после вливания преднизолона.

Тест расценивают как положительный, если хоть в одной из порций мочи количество лейкоцитов увеличивается по сравнению с исходным в 2 раза и при этом выявляют активные лейкоциты.

Экспресс-метод определения скрытой лейкоцитурии (метод Gadeholt)

Принцип метода

При проведении пероксидазной реакции цитоплазма лейкоцита приобретает голубую или синюю окраску.

Необходимые реактивы

Краситель – 300 мг диаминофлуорена и 130 мг флюксина В растворяют в 70 мл 95 %-ного этанола. К этой смеси добавляют 11 г ацетата натрия (CH_3COONa × 3Н_2О), растворенного в 20 мл 0,5 %-ной уксусной кислоты, и 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Через 48 ч реактив фильтруют, и он становится годным к употреблению. Хранить его необходимо в темной, химически чистой посуде и периодически фильтровать.

Ход исследования

10 мл свежевыделенной мочи фильтруют через фильтровальную бумагу, после чего на бумагу наносят 3 капли красителя. При содержании в 1 мкл мочи более 10 лейкоцитов на месте нанесения краски появляется темно-синее пятно. Проба считается отрицательной, если пятно красного цвета, и сомнительной, если пятно голубого цвета.

Проба проста и достаточно надежна, ответ можно получить через несколько минут. Экспресс-метод выявления скрытой лейкоцитурии имеет большое значение при профилактических осмотрах, особенно детей в яслях, детских садах и школах.

При положительном значении этой пробы лейкоцитурия выявляется и всеми другими методами, используемыми для ее количественного определения.

Неорганизованный осадок мочи

Неорганизованный осадок мочи состоит из солей, выпавших в осадок в виде кристаллов или аморфных масс. Характер солей зависит от коллоидного состояния мочи, рН и других свойств. При кислой реакции мочи обнаруживаются:

1) мочевая кислота – полиморфные кристаллы (ромбической, шестигранной формы, вид бочонков, брусков и др.), окрашенные в желтый цвет (иногда бесцветные). Кристаллы мочевой кислоты растворяются в щелочах, не растворяются в кислотах, макроскопически в осадке мочи имеют вид золотистого песка. Кристаллы мочевой кислоты обнаруживаются при лихорадочных заболеваниях, сопровождающихся повышенным распадом тканей, при тяжелой физической нагрузке, потреблении только мясной пищи, мочекислом диатезе;

2) ураты – аморфные мочекислые соли. Располагаются кучками желтовато-коричневатого цвета. Растворяются при нагревании и при добавлении щелочей. При действии кислот (уксусной или соляной) постепенно превращаются в бесцветные кристаллы мочевой кислоты ромбической формы. Макроскопически ураты после центрифугирования имеют вид плотного кирпично-розового осадка. В таких случаях необходимо освободиться от солей, так как они мешают микроскопическому исследованию. С этой целью используют реактив Селена (4 г буры и 4 г борной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды). В центрифужную пробирку после удаления надосадочной мочи наливают реактив Селена, смешивают, центрифугируют вновь и микроскопируют осадок. Ураты в моче появляются при употреблении в пищу продуктов, содержащих нуклеиновые кислоты, а также при повышенном распаде клеток при лейкозах, опухолях;

3) щавелевокислая известь (оксалаты) встречается в кислой моче, но может быть и в моче со щелочной реакцией. Кристаллы имеют форму октаэдров («почтовых конвертов»), а также круглую или овальную форму. Растворяются в соляной кислоте, не растворяются в щелочи и уксусной кислоте. Выпадение солей щавелевокислой извести происходит при употреблении с пищей некоторых фруктов и овощей;

4) углекислый кальций обнаруживается в форме мелких шариков. Растворяется в кислотах, выделяя углекислоту.

При щелочной реакции мочи обнаруживают:

1) кислый мочекислый аммоний (в моче детей может быть при кислой реакции). Имеет форму гирь и шаров, часто с отростками. Растворяется при нагревании и в щелочах. При добавлении кислот (соляной или уксусной) образуются бесцветные ромбические кристаллы мочевой кислоты;

2) трипельфосфаты – бесцветные кристаллы в форме «гробовых крышек». Растворяются в кислотах, не растворяются в щелочах;

3) фосфаты – аморфные массы солей сероватого цвета часто вместе с трипельфосфатами. Растворяются в кислотах, не растворяются в щелочах. Макроскопически осадок белого цвета;

4) нейтральная фосфорнокислая известь – кристаллы клиновидной формы, часто располагающиеся розетками, бесцветные (иногда могут быть в моче при слабокислой реакции). Растворяются в кислотах, не растворяются в щелочах.

Особого диагностического значения неорганизованный осадок не имеет. Большое количество кристаллов мочевой кислоты и уратов встречается при лихорадочных состояниях, процессах, связанных с массивным распадом клеток (лейкозах, опухолях), при почечнокаменной болезни и др.

В патологической моче встречаются:

1) цистин. Имеет вид шестигранных бесцветных прозрачных плиток, обнаруживается при кислой реакции мочи. Растворяется в щелочах, аммиаке, минеральных кислотах. Не растворяется в уксусной кислоте, спирте, ацетоне, эфире;

2) тирозин – кристаллы в виде тонких игл, собранных в пучки. Обнаруживается в моче с кислой реакцией. Растворяется в щелочи, минеральных кислотах. Нерастворим в спирте, ацетоне, эфире;

3) лейцин – блестящие мелкие шары с радиальной и концентрической исчерченностью. Встречаются в моче с кислой реакцией. Растворяются в минеральных кислотах и щелочах. Нерастворимы в спирте, ацетоне, эфире.

Нахождение этих кристаллов имеет диагностическое значение, поэтому для распознавания их недостаточно одних морфологических признаков. Необходимо использовать все микрохимические реакции, характерные для них, так как некоторые формы этих кристаллов имеют сходство с кристаллами мочевой кислоты, жиром, нейтральной фосфорнокислой известью. Кристаллы лейцина, тирозина и цистина обнаруживаются при подострой дистрофии печени, отравлениях фосфором;

4) жирные кислоты имеют вид тонких игл, иногда собранных в пучки. Встречаются редко, при патологических процессах, сопровождающихся жировой дистрофией и распадом клеток;

5) холестерин имеет вид тонких четырехугольных бесцветных пластинок с обломанным углом. Обнаруживается при патологических процессах, сопровождающихся распадом и жировой дистрофией клеток. В моче встречается редко;

6) билирубин – кристаллы в виде мелких желтовато-коричневых иголок, складывающихся в пучки или в виде зернышек. Обнаруживается в моче с желчными пигментами. Билирубин растворяется в щелочах и хлороформе. С азотной кислотой дает зеленое окрашивание;

7) гематоидин – кристаллы в форме ромбов или иголок, которые могут складываться в пучки и звезды. Цвет золотисто-желтый. Являются продуктом распада гемоглобина. В своей молекуле не содержат железа. Образуются в некротизированной ткани, в глубине гематом и в больших участках кровоизлияний;

8) гемосидерин – золотисто-желтые аморфные зернышки, находящиеся внутри клеток (в отличие от гематоидина). Представляет продукт распада гемоглобина и дает положительную реакцию на берлинскую лазурь, так как содержит железо. Обнаруживается при внутрисосудистом гемолизе (болезнь Маркиафава – Микели);

9) липоиды обнаруживаются в поляризационном микроскопе, где они дают двоякое преломление света. Двоякопреломляющие свет капли жира (внутри- и внеклеточные) имеют вид блестящего креста на темном фоне. Обнаруживаются при нефрозах (особенно амилоидно-липоидных);

10) лекарственные кристаллы встречаются при приеме некоторых медикаментов. Кристаллы пирамидона выпадают в виде коричневатых иголок, похожих на кристаллы билирубина, но длиннее, образующих пучки и звезды. Цвет мочи при этом розовато-красноватый. Кристаллы сульфаниламидных препаратов отличаются большим полиморфизмом. Почти всегда окрашены в желтоватый цвет, имеют вид снопов, шаров, брусков и т. д. Многие из них имеют сходство с кристаллами мочевой кислоты. Распознавание их производится при помощи индикаторной бумажки.

Приготовление индикаторной бумаги

Фильтровальную бумагу пропитывают реактивом (см. ниже), высушивают, нарезают тонкими небольшими полосками, хранят в темном месте. Полоску бумаги опускают в осадок мочи. В присутствии кристаллов сульфаниламидных препаратов бумажка дает моментальное ярко-желтое окрашивание.

Необходимые реактивы

1 г парадиметиламидобензальдегида, 2 мл концентрированной НСl, 98 мл 2,24 %-ного раствора химически чистой щавелевой кислоты.

Исследование мочи на опухолевые клетки

Опухолевые клетки могут быть обнаружены в моче, в отсосе и смыве из мочевого пузыря.

Метод Эрлиха

Свежевыделенную утреннюю мочу отстаивают в течение 1–2 ч. Пипеткой со дна собирают осадок и центрифугируют. Отстоявшуюся мочу разливают небольшими порциями в чашки Петри, просматривают на черном и светлом фоне и извлекают (если есть) плотноватые частицы сероватого и красноватого цвета, которые помещают на предметное стекло, растягивают и покрывают покровным. Другие препараты готовят из осадка после центрифугирования. Мочу для исследования на опухолевые клетки нельзя брать после урологического инструментального обследования, так как травмирование слизистой оболочки может привести к повышенной эксфолиации клеток и к их деформации, в результате чего может быть ошибочное толкование.

Получение отсоса из мочевого пузыря

При подозрении на опухолевый процесс мочевого пузыря можно взять отсос из него. После опорожнения мочевого пузыря вводят катетер. На свободный конец катетера надевают шприц Жане и отсасывают содержимое пузыря. Из добытого материала готовят препараты.

Получение смыва мочевого пузыря

Смыв производится следующим раствором: спирта 96 %-ного (15 мл), 1 %-ного раствора новокаина (81 мл). Раствор готовят стерильно. Для процедуры необходимо 50–100 мл раствора.

Мочевой пузырь освобождают, промывают и на 10 мин вводят указанный выше раствор (для усиления эксфолиации клеток). Затем пузырь опорожняют (у женщин с помощью катетера). Полученный материал центрифугируют. Из осадка готовят препараты, которые сначала просматривают в нативном виде. При наличии подозрительных клеток фиксируют и красят по Романовскому. В нативном препарате не всегда можно уловить все признаки злокачественного перерождения клеток. Поэтому требуется обязательное сочетание исследования нативного и окрашенного препарата.

Признаки злокачественного перерождения клеток:

1) полиморфизм величины, а часто и формы клеток; отдельные клетки могут быть гигантских размеров;

2) нарушения ядерно-протоплазменного соотношения в сторону увеличения ядра, иногда до гигантских размеров;

3) неправильная, часто уродливая, форма ядра;

4) наличие в ядрах нуклеол, часто больших, множественных, неправильной формы;

5) часто встречающиеся клеточные митозы;

6) способность клеток к фагоцитозу;

7) химическая анаплазия, гиперхромия ядра и резкая базофилия цитоплазмы отдельных клеток.

Небольшое количество одиночно расположенных клеток с перечисленными признаками не считается достоверным. Для подтверждения диагноза необходимо искать групповое их расположение и расположение в виде комплексов. Для распознавания клеток с признаками злокачественного перерождения требуются просмотр большого количества препаратов и опыт исследователя.

Злокачественные опухоли могут подвергаться распаду и некрозу. Присутствие в препаратах клеток с дегенеративными явлениями (резкой вакуолизацией, жировой дистрофией, детритом) и продуктов тканевого распада (гематоидина, холестерина, некротизированных тканевых фрагментов) является подозрительным на злокачественную опухоль. Такой материал требует особо тщательного исследования. Клетки злокачественных опухолей находят в моче при опухолях мочевого пузыря, предстательной железы и др. При опухолях половых органов и женской половой сферы опухолевые элементы также могут попадать в мочу. При опухолях почек злокачественные клетки в моче находят чрезвычайно редко. Подозрительным признаком на злокачественный процесс почки является наличие в мочевом осадке кристаллов гематоидина, жироперерожденных клеток, мелких некротизированных фрагментов и эритроцитов.

Определение диастазы мочи

В нормальной моче диастаза содержится в небольшом количестве – 16–64 единицы. Количество выше 128 единиц указывает на патологию (панкреатит, некроз поджелудочной железы, заболевание желчных путей). При продолжительной закупорке протока поджелудочной железы количество диастазы в моче может снизиться. При почечной недостаточности диастаза в моче отсутствует.

Метод определения диастазы мочи основан на переваривании крахмала диастазой.

Необходимые реактивы

1. Физиологический раствор (0,85 %-ный раствор хлорида натрия).

2. Буферный раствор фосфата рН 7,2.

3. Толуол.

4. Раствор крахмала: 60–70 мл физиологического раствора нагревают до кипения. В отдельную пробирку наливают 2–3 мл физиологического раствора и всыпают туда 1 г растворимого крахмала, тщательно размешивают стеклянной палочкой, вливают его тонкой струей в кипящий физиологический раствор и смешивают. Пробирку несколько раз ополаскивают небольшими порциями физиологического раствора, выливая их в тот же стакан, дают вскипеть. После охлаждения переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают физиологический раствор до метки. Этот 1 %-ный раствор крахмала разводят в 10 раз физиологическим раствором. К 90 мл полученного 1 %– ного раствора крахмала приливают 10 мл буферного раствора фосфатов с рН 7,2 и 10 мл толуола (при хранении в прохладном и темном месте раствор стоек в течение 3 месяцев). При отсутствии фосфатного буфера 1 %-ный раствор крахмала годен в течение нескольких дней.

Для исследования необходим также приблизительно 0,02 н раствор йода: 20 мл 0,1 н раствора отмеривают в мерную колбу емкостью в 100 мл и доводят до метки водой. Можно пользоваться раствором Люголя.

Ход исследования

В штатив ставят 15 пробирок, разливают в каждую пробирку, кроме первой, по 1 мл физиологического раствора. В первую и вторую пробирку наливают по 1 мл испытуемой мочи, смешивают. Из второй пробирки переносят 1 мл смеси в третью, смешивают и 1 мл смеси переносят в четвертую и т. д. до пятнадцатой, из которой 1 мл смеси выливают. Объем жидкости в каждой пробирке 1 мл. Разведения смесей, начиная со второй пробирки: 2, 4, 8 и т. д.

В каждую пробирку наливают по 2 мл 1%-ного раствора крахмала и ставят весь штатив на 15 мин на водяную баню при 45 °C, после чего штатив переносят в холодную воду (для прекращения действия фермента).

После этого в каждую пробирку вносят по одной капле 0,02 н раствора йода и наблюдают за стойкостью окрашивания в пробирках (синего, красно-синего, красного или желтого). Если окраска исчезает быстро, то прибавляют по каплям йод, пока она не будет исчезать в течение нескольких минут.

Расчет

В той пробирке, где жидкость окрашена в синий цвет, диастатического действия нет. Оно закончилось в предыдущей пробирке, которую и берут для Расчета. Например: в шестой пробирке имеется непереваренный крахмал. Вычисляют, какое количество мочи содержится в пятой пробирке (разведение 1: 16), где нет синего оттенка. 1/16 мл мочи переваривает 2 мл крахмала, 1 мл мочи – 32 мл крахмала.

Результат

d (диастаза) 45° / 15 ‘ = 32 единицы.

Исследование мочевых камней

Мочевые камни могут быть мочекислыми, оксалатовыми, фосфатовыми, цистиновыми.

Необходимые реактивы

1. Соляная кислота.

2. Азотная кислота.

3. Аммиак.

4. Ледяная уксусная кислота.

5. Молибденовокислый аммоний.

6. 30 %-ный раствор едкого натра.

Ход исследования

Камень измельчают в ступке. Частицы камня сжигают на листочке платины. Если остаются преимущественно несгорающие частицы – это фосфаты, карбонаты, щавелевокислая известь.

Если частицы сгорают – это мочевая кислота, цистин, ксантин, фибрин. Присутствие оксалатов дает своеобразное красное тление, при этом образуется окись кальция, которая изменяет цвет фенолфталеиновой бумаги, смоченной в воде, на красный. Цистин горит синеватым пламенем и дает запах серной кислоты. Другую часть порошка растворяют в крепкой соляной кислоте. Та часть, которая растворяется, – раствор, нерастворенная часть – осадок.

Осадок

Нерастворенными остаются органические субстанции и мочевая кислота. Осадок отделяют центрифугированием. Часть его осторожно выпаривают в фарфоровом тигле с каплей азотной кислоты до высыхания: мочевая кислота дает покраснение, добавление аммиака – пурпурно-красное окрашивание, а добавление едкого натра – сине-фиолетовое (мурексидная проба).

Другую частицу сжигают на листочке платины. При сгорании мочекислых соединений появляется запах синильной кислоты.

Раствор (солянокислый) может содержать щавелевокислую и сернокислую известь, фосфаты, цистин, ксантин.

Прибавляют немного аммиака, выпадает осадок (II) из фосфатов и оксалатов.

Осадок II отделяют центрифугированием и прибавляют к нему ледяную уксусную кислоту и воду. Растворяются фосфаты (раствор II), нерастворимыми остаются оксалаты, а также цистин. Центрифугируют, получают осадок III.

Осадок III: оксалаты растворяют в соляной кислоте. При нейтрализации аммиаком они вновь выпадают. При сжигании частицы осадка происходит тление и образуется щелочно реагирующий порошок.

Раствор II. Уксуснокислый раствор делят на 2 пробирки. В одну прибавляют немного оксалата аммония. Если в растворе находилась фосфорнокислая известь, то она выпадает в виде кристаллов щавелевокислого кальция. Их отфильтровывают и к фильтрату (раствор II) прибавляют 1/3 объема аммиака. Появление кристаллического осадка указывает на присутствие магнезии и фосфорнокислых солей.

Во вторую пробирку прибавляют несколько капель азотной кислоты и молибденовокислого аммония, слегка подогревают. Пожелтение и выпадение небольшого осадка доказывает присутствие фосфорной кислоты. Это говорит о наличии фосфата кальция.

Проба на карбонаты

На предметное стекло помещают каплю соляной кислоты и немного измельченного камня. Под микроскопом наблюдают за выделением пузырьков углекислоты.

Проба на аммиак

Часть измельченного камня переносят в пробирку и взвешивают в воде, прибавляют немного 30 %-ного раствора едкого натра, слегка подогревают, держа над пробиркой красную лакмусовую бумажку. Пары аммиака вызывают посинение бумаги. Если обе последние пробы дают отрицательный результат, то камень не содержит магнезиальных соединений.

Тесты для выявления наследственных и приобретенных нарушений обмена веществ

Исследуют утреннюю порцию мочи.

Обнаружение белка

Проба с бромфеноловым синим

В норме белок в моче не обнаруживают.

Принцип метода

Изменение окраски индикатора в присутствии белка.

Необходимые реактивы

1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

2. Натрия ацетат (NaOOCCH_3 × 3Н_2О).

3. НСl 0,1 моль/л.

4. Барбитал-ацетатный буфер рН 8,6: 8,6 г мединала и 6,48 г ацетата натрия растворяют в 100 мл воды, добавляют 60 мл НСl и доводят до 1 л водой.

5. Бромфеноловый синий водорастворимый.

6. Цинка сульфат (ZnSO_4 × 7Н_2О).

7. Раствор индикатора: 0,5 г бромфенолового синего и 50 г сульфата цинка растворяют в 1 л воды.

8. Уксусная кислота: к 1 мл концентрированной уксусной кислоты добавляют 99 мл воды.

9. Раствор альбумина: 10 г альбумина растворяют в 1 л изотонического раствора хлорида натрия (9 г/л), рабочие растворы альбумина готовят путем разведения основного раствора в 2; 4; 8 и 16 раз водой.

10. Натр едкий 0,02 моль/л.

Ход исследования

На фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную барбитал-ацетатным буфером и высушенную, наносят 0,02 мл исследуемой мочи.

После высыхания бумагу с нанесенной пробой окрашивают индикатором, а избыток краски отмывают раствором уксусной кислоты в течение 5–7 мин.

Результат оценивают визуально, сравнивая окраску в опыте с окраской, которую дают стандартные растворы альбумина, обработанные так же, как и опытная проба. Метод позволяет обнаружить в моче белок, содержание которого составляет 2 мкг в пробе.

Проба на гипераминоацидурию

Выделение аминоазота за сутки не превышает 1–2 мг/кг. В ночное время выделяется 2/3–3/4 суточного количества аминоазота.

Гипераминоацидурия возникает при наследственной (синдром Дебре – де Тони – Фанкони) и приобретенной (гломерулонефрит) патологии в почках, а также при некоторых заболеваниях печени. Для выяснения причины гипераминоацидурии необходимы определение концентрации аминокислот в крови и моче и вычисление их клиренса.

Принцип метода

Аминокислоты при нагревании с нингидрином образуют соединения, окрашенные в сине-фиолетовый цвет.

Необходимые реактивы

1. Нингидрин.

2. Ацетон.

3. Уксусная кислота (ледяная).

4. Раствор нингидрина: 5 г нингидрина на 1 л смеси (к 0,5 г нингидрина прибавляют 95 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной воды).

5. Гликолол (глицин).

6. Раствор глицина: 150 мг глицина растворяют в 100 мл дистиллированной воды (1 мл раствора содержит 1,5 мг глицина, что соответствует 0,28 мг аминоазота). Из данного раствора глицина готовят серию разведений: 1; 3, 6; 9; 18; 24; 36; 54 мл раствора глицина доводят до 100 мл водой. Приготовленные растворы соответствуют 0,28; 0,84; 1,68; 2,52; 5,04; 6,72; 10,08; 16,12 мг аминоазота в 100 мл.

Растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.

Ход исследования

На фильтровальную бумагу наносят 0,02 мл мочи и после подсушивания окрашивают раствором нингидрина, затем высушивают на воздухе до полного исчезновения запаха уксусной кислоты и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °C на 15 мин.

Окраску опыта сравнивают с окраской стандартных растворов глицина, обработанных так же, как образец мочи, для чего берут по 0,02 мл каждого раствора. Результаты выражают в миллиграммах аминоазота, выделенного с мочой за сутки.

Обнаружение цистина и гомоцистина

Принцип метода

Азид натрия и йод образуют комплекс бурого цвета, который обесцвечивается в присутствии цистина и гомоцистина.

Необходимые реактивы

1. Натрия азид.

2. Йод кристаллический.

3. Раствор йода: 12,69 г кристаллического йода отвешивают в бюксе, растворяют в насыщенном растворе йодида калия (37 г KI в 26 мл дистиллированной воды), переносят в колбу и доливают дистиллированной водой до 1 л. Можно использовать фиксанал йода 0,1 н.

4. Этиловый спирт 96 %-ный.

5. Раствор азида натрия: 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл раствора йода и доводят объем этиловым спиртом до 100 мл. Раствор хранят в посуде темного стекла в холодильнике.

Ход исследования

Каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют 1 каплю раствора азида натрия. В течение 5 мин наблюдают за исчезновением бурой окраски.

По времени исчезновения окраски судят о наличии аминокислот в исследуемой моче. Для полуколичественной оценки результатов окраску пробы можно сравнивать с цветной шкалой, для получения которой готовят раствор цистина и гомоцистина, содержащий 0,6 мг каждой аминокислоты в 1 мл.

Из этого раствора готовят растворы с содержанием аминокислот от 0,6 до 0,3 мг/мл. Нижняя граница чувствительности пробы – 0,3 мг/мл.

Бурая окраска в норме исчезает через 2–3 мин после добавления азида натрия.

Ложноположительную реакцию дают ангидрид аргинин-янтарной кислоты, ацетон, некоторые лекарственные препараты.

Тест положительный при наследственной или приобретенной цистинурии или гомоцистинурии, в этом случае окраска остается более 5 мин.

Обнаружение пролина и других аминокислот

Пролинурия возможна при патологии почек и как симптом наследственного нарушения обмена.

Принцип метода

Изатин образует с некоторыми аминокислотами специфически окрашенные соединения.

Необходимые реактивы

1. Изатин.

2. Ацетон.

3. Раствор изатина в ацетоне 0,2 г/л (раствор хранят в холодильнике при температуре 4 °C.

4. Соляная кислота 1 моль/л.

Ход исследования

Фильтровальную бумагу пропитывают раствором изатина в ацетоне и высушивают. Затем наносят на нее одну каплю мочи и высушивают при 100 °C в течение 10 мин, смачивают раствором соляной кислоты и промывают водой.

Сине-серую окраску дает повышенное содержание фенилаланина, коричневую – триптофан, пурпурную – смесь различных аминокислот, а появление синей окраски в виде ободка свидетельствует о присутствии в моче свободного пролина (не менее 0,1 мг/мл). Можно сравнивать интенсивность окраски с цветной шкалой. Для приготовления стандартных растворов, содержащих от 0,1 до 0,5 мг/мл соответствующих аминокислот, используют растворы аминокислот с исходной концентрацией 0,5 мг соответствующей аминокислоты в 1 мл раствора.

Обнаружение кетокислот (проба с треххлористым железом)

Кетокислоты в большом количестве выделяются с мочой при нарушении различных обменных процессов, в частности цикла Кребса; производные фенотиазида или салицилата – при отравлениях ими; 3-оксиантраниловая кислота – при нарушениях обмена триптофана.

Принцип метода

Треххлористое железо в присутствии НСl дает с кетокислотами специфически окрашенные соединения.

Необходимые реактивы

1. Железо треххлористое (FeCl_3 × 6Н_2О), 10 %-ный раствор.

2. НСl, 10 %-ный раствор.

3. Аммиак водный концентрированный.

4. Магния хлорид (MgCl_2 × 6Н_2О): к 11 г хлорида магния прибавляют 20 мл концентрированного водного аммиака и объем доводят водой до 1 л.

Ход исследования

Вариант I – к 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа, при положительной реакции появляется темно-зеленый осадок.

Вариант II – для связывания фосфатов, мешающих реакции, к 4 мл мочи прибавляют 1 мл раствора хлорида магния, перемешивают и через 5 мин фильтруют. К фильтрату добавляют по 2 капли раствора соляной кислоты и раствора треххлористого железа; в течение 5 мин наблюдают развитие окраски.

О наличии кетокислот судят по характеру окраски, однако следует иметь в виду, что окраска может развиваться и за счет других соединений (табл. 37).

Таблица 37

Цветная реакция различных соединений с треххлористым железом

Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином

Принцип метода

Кетокислоты образуют с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенные гидразоны.

Необходимые реактивы

1. НСl, 2 моль/л.

2. 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ): 2 г 2,4-ДНФГ растворяют в 1 л 2 моль/л НСl.

3. Диэтиловый эфир.

4. Натрия карбонат (NaО_2СО_3), 100 г/л.

Ход исследования

Смешивают 1 мл раствора 2,4-ДНФГ и 0,25 мл мочи. Через 10 мин прибавляют 1,25 мл диэтилового эфира и перемешивают, эфирный слой отсасывают и переносят в пробирку, куда добавляют равный объем раствора натрия карбоната. Содержимое пробирки перемешивают.

При положительной пробе развивается окраска от желтой до оранжево-коричневой. В норме проба отрицательная, окраска не развивается.

Обнаружение гомогентизиновой кислоты

Принцип метода

В щелочной среде гомогентизиновая кислота окисляется с образованием соединений сине-фиолетового цвета.

Необходимый реактив

Едкий натр, 100 г/л.

Ход исследования

К 0,5 мл мочи прибавляют 3–4 капли раствора едкого натра, результат оценивают через 1–2 мин.

При положительной реакции развивается сине-фиолетовое окрашивание, при отрицательной окраска не возникает.

Обнаружение индикана

Принцип метода

Превращение индикана в индоксил после гидролиза эфирной связи сильной минеральной кислотой и последующее окисление индоксила треххлористым железом с образованием окрашенного соединения.

Необходимые реактивы

1. Свинца ацетат (СН_3СОО)Рb × 3Н_2О), 100 г/л раствора.

2. НСl концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl_3 × 6Н_2О).

4. Реактив Обермейра: 0,4 г треххлористого железа растворяют в 100 мл концентрированной НСl.

5. Хлороформ.

6. Натрия тиосульфат (Na_2S_2O_3 × 5H_2O), 200 г/л раствора.

Ход исследования

К 4 мл мочи прибавляют 0,4 мл раствора ацетата свинца для осаждения желчных пигментов, солей и других веществ, мешающих реакции.

Фильтруют, 1–2 мл фильтрата смешивают с равным объемом реактива Обермейра, прибавляют 0,5–1 мл хлороформа и осторожно перемешивают.

Если слой хлороформа окрашивается в синий или красный цвет, его отсасывают и добавляют к нему 2–3 капли тиосульфата натрия.

При положительной реакции окраска хлороформа не исчезает после добавления тиосульфата натрия. В норме реакция отрицательная.

Обнаружение фруктозы (проба Селиванова)

Принцип метода

При нагревании фруктозы с резорцином в кислой среде образуются соединения, окрашенные в красный цвет.

Необходимые реактивы

1. НСl, 1 моль/л.

2. Резорцин: 5 г в 1 л, 1 моль/л раствора НСl.

Ход исследования

К 2 мл мочи приливают 1 мл раствора резорцина и нагревают до закипания.

При положительной пробе развивается интенсивное красное окрашивание. В норме окраска не появляется.

Оценку пробы проводят в момент закипания, так как при длительном кипении окраска может развиться при наличии глюкозы. Пищевая нагрузка медом и фруктами может дать положительную пробу.

Обнаружение лактозы и мальтозы (проба Велька)

Принцип метода

Лактоза и мальтоза в щелочной среде при нагревании с аммиаком образуют окрашенные соединения.

Необходимые реактивы

1. Аммиак водный концентрированный.

2. Калий едкий, 200 г/л раствора.

Ход исследования

К 5 мл мочи приливают 2,5 мл аммиака и 0,2 мл раствора едкого калия. Нагревают на водяной бане в течение 30 мин при температуре 60 °C.

При положительной реакции на лактозу появляется коричневая окраска, а при наличии мальтозы – красная окраска. В норме окраска не развивается.

Обнаружение пентоз (проба Биаля)

Принцип метода

Пентозы с орцином и треххлористым железом при нагревании в кислой среде образуют окрашенные соединения.

Необходимые реактивы

1. 5-метилрезорцин (орцин).

2. НСl концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl_3 × 6Н_2О), 100 г/л раствора.

4. Реактив Биаля: 1 г орцина растворяют в 500 мл соляной кислоты и добавляют 1 мл раствора треххлористого железа.

Ход исследования

Нагревают 1 мл мочи до кипения с 5 мл реактива Биаля.

При положительной пробе появляется яркая желто-зеленая окраска. В норме проба отрицательная.

Обнаружение глюкозы, фруктозы, пентозы, лактозы и мальтозы в моче может быть результатом врожденных ферментопатий, а лактоза и мальтоза могут быть обнаружены при нарушении их гидролиза в тонкой кишке.

Обнаружение гликозоаминогликанов (проба с метилтриметил-аммония бромидом)

Принцип метода

Метилтриметиламмония бромид (ЦТАБ) с гликозамино-гликанами образует в кислой среде белый осадок.

Необходимые реактивы

1. Лимонная кислота.

2. Едкий натр.

3. Цитратный буфер, 1 ммоль/л, рН 5,7: в небольшом количестве воды растворяют 210 г лимонной кислоты, добавляют 120 г едкого натра, растворяют, охлаждают и доливают водой до 1 л.

4. Раствор ЦТАБ, 25 г в 1 л цитратного буфера.

Ход исследования

К 5 мл мочи приливают 1 мл раствора ЦТАБ и в течение 30 мин наблюдают образование осадка. Пробу проводят при комнатной температуре, для исследования берут свежевыделенную мочу.

Проба считается положительной при образовании осадка. В норме проба отрицательная. Следует учитывать, что проба дает 40 % ложноположительных результатов.

Определение кальция (проба Сулковича)

Высокое содержание кальция в моче может быть при гипервитаминозе D и гиперпаратиреозе.

Принцип метода

Ионы кальция со щавелевой кислотой образуют нерастворимую щавелевокислую соль.

Необходимые реактивы

1. Щавелевая кислота.

2. Аммония оксалат.

3. Уксусная кислота ледяная.

4. Реактив Сулковича: в 50 мл дистиллированной воды растворяют по 2,5 г щавелевой кислоты и оксалата аммония, добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора до 150 мл.

Ход исследования

Смешивают по 0,5 мл мочи и реактива Сулковича. Через 1–2 мин оценивают степень помутнения.

Степень помутнения оценивают визуально:

– 0 – отсутствие помутнения;

– 1 – слабое помутнение;

– 2 – умеренное помутнение;

– 3 – значительное помутнение;

– 4 – резко выраженное помутнение.

О повышенном содержании кальция в моче свидетельствуют 3 и 4-я степени помутнения.

После выявления положительных результатов описанных тестов больной нуждается в тщательном обследовании с помощью точных количественных методов в специализированных учреждениях.

Бактериологическое и бактериоскопическое исследования мочи

Микробиологическое исследование мочи производят при воспалительных заболеваниях мочеиспускательных путей.

Наиболее частыми возбудителями воспалительных процессов мочевого тракта являются грамотрицательные бактерии: Е. coli, Proteus, Providencia, Enterobacter, Klebsiella, Psaeruginosa, Serratia, Streptococcus группы Д. Возбудителями могут быть также Staph. aureus, Staph. epidermidis, Candida albicans, Mycoplasma и другие микроорганизмы.

Взятие мочи для исследования

Микробиологическое исследование мочи нужно проводить до начала антибактериальной терапии.

После тщательного туалета наружных половых органов в стерильную посуду собирают среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 3–5 мл. Взятие мочи с помощью катетера связано с риском инфицирования мочевых путей, поэтому его желательно избегать. Катетеризацию производят только в случаях необходимости – если больной неспособен мочиться или для разграничения воспалительного процесса в почках и мочевом пузыре. С этой целью мочевой пузырь опорожняют и вводят в него 50 мл раствора, содержащего 40 мг неомицина и 20 мг полимиксина. Через 10 мин берут пробы мочи для исследования. При локализации процесса в мочевом пузыре моча остается стерильной, при инфекции в почках отмечается бактериурия.

Мочу можно получить от больного путем надлобковой пункции мочевого пузыря. Этот метод взятия мочи дает наиболее достоверные результаты исследования, однако имеется опасность инфицирования больного.

Микробиологическое исследование мочи надо проводить как можно быстрее после ее получения от больного, с тем чтобы избежать размножения находящихся в ней микроорганизмов. Размножение микробов в моче до начала анализа приводит к ложным результатам при количественном определении бактериурии и может дезориентировать в отношении возбудителя заболевания. Если немедленное исследование мочи невозможно, то ее следует хранить в холодильнике при температуре 4 °C не более суток.

Проведение исследования

Определяют степень бактериурии – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл мочи методом секторных посевов мочи. Платиновой петлей диаметром 2 мм (вместимостью 0,005 мл) производят посев мочи – 3–4 штриха на сектор чашки Петри с простым агаром. Чашку инкубируют при температуре 37 °C в течение 18–24 ч, после чего подсчитывают число колоний, выросших в разных секторах.

Колонии, выросшие на плотной питательной среде, отсевают в пробирки со скошенным агаром, выделенную чистую культуру идентифицируют и определяют ее чувствительность к антибактериальным препаратам.

Ускоренные методы определения степени бактериурии основаны на определении продуктов метаболизма, образующихся при размножении микроорганизмов в моче. Они дают менее точные результаты, чем метод секторных посевов, и используются преимущественно при массовых профилактических обследованиях больших контингентов людей или для экспресс-диагностики. При положительном результате, полученном ускоренными методами, необходимо дальнейшее исследование с помощью более точного бактериологического метода.

Нитритный тест

Нитриты, являющиеся продуктами метаболизма представителей семейства энтеробактерий, могут быть обнаружены в моче с помощью реактива Грисса. Готовят два раствора: I – 1,25 г сульфаниловой кислоты растворяют в 500 мл 30 %– ной уксусной кислоты; II – 2,5 г α-нафтиламина растворяют в 500 мл 30 %-ной уксусной кислоты. Оба раствора хранят в защищенном от света месте.

Непосредственно перед исследованием оба раствора смешивают в равных количествах, 1 мл смеси добавляют к 1 мл мочи. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии в 1 мл мочи не менее 105 микробных клеток.

ТТХ-тест

Трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) под действием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов переходит из бесцветного в красный не растворяющийся в воде трифенилформазан. Интенсивность окраски находится в прямой зависимости от степени бактериурии.

Готовят три раствора: I – насыщенный раствор двузамещенного фосфата натрия; II – 750 мл ТТХ растворяют в 100 мл раствора I; III – рабочий раствор: 4 мл раствора I смешивают со 100 мл раствора II. Хранят растворы в прохладном, защищенном от света месте. Срок хранения растворов I и II – до 2 месяцев, рабочего раствора – не более 2 недель.

При постановке реакции пользуются стерильной посудой.

К 2 мл мочи прибавляют 0,5 мл рабочего раствора и помещают после перемешивания в термостат при температуре 37 °C. После 4-часовой инкубации учитывают результаты. Появление на дне пробирки красного осадка свидетельствует о наличии в 1 мл мочи не менее 105 микробных клеток.

Ускоренные методы позволяют дать немедленный ответ. При использовании бактериологических методов лаборатория дает предварительный ответ через день после получения результатов определения степени бактериурии и окончательный – через 3–4 дня после выделения микроорганизмов, их идентификации и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. В окончательном ответе указывают степень бактериурии, вид выделенных культур, их чувствительность к лекарственным веществам.

Оценка результатов

Основная задача при интерпретации полученных данных заключается в доказательстве этиологической роли микроорганизмов, выделенных из мочи. Учитывают комплекс тестов: степень бактериурии, вид выделенных культур, повторность их выделения в процессе заболевания, присутствие в моче монокультуры или ассоциации микроорганизмов.

Степень бактериурии позволяет дифференцировать инфекционный процесс в мочевых путях с контаминацией мочи с нормальной микрофлорой.

Оценку производят на основании следующих критериев:

1) степень бактериурии, не превышающая 10^3 КОЕ/мл мочи, свидетельствует об отсутствии воспалительного процесса и обычно является результатом контаминации мочи;

2) степень бактериурии, равная 10^4 КОЕ/мл, расценивается как сомнительный результат. Исследование следует повторить;

3) степень бактериурии, равная и выше 10^5 КОЕ/мл мочи, указывает на наличие воспалительного процесса.

Изменение степени бактериурии в процессе заболевания может быть использовано для контроля над течением процесса и эффективностью терапии: уменьшение степени бактериурии свидетельствует о благоприятном течении заболевания и эффективности использованных лекарственных препаратов.

В некоторых случаях у больных, получающих антибактериальную терапию, при плохом оттоке мочи, при ее низкой относительной плотности и рН ниже 5,0 может наблюдаться низкая степень бактериурии при имеющемся заболевании. Поэтому, помимо степени бактериурии, следует учитывать вид выделенных из мочи микроорганизмов.

Эшерихии, протей, синегнойная палочка, клебсиеллы чаще выделяются из мочи больных уроинфекцией. Дифтероиды, лактобациллы и другие грамположительные палочки обычно выделяются из мочи здоровых людей. Повторное выделение из мочи культуры одного вида, типа, варианта свидетельствует об инфекционном процессе.

Монокультура чаще выделяется при острых воспалительных процессах и коррелирует с высокой степенью бактериурии. Ассоциации микроорганизмов чаще встречаются при хронических процессах.

При окончательной оценке результатов микробиологического исследования мочи необходимо учитывать данные клиники и другие лабораторные анализы.

Бактериоскопическое исследование мочи с целью обнаружения туберкулезных микобактерий

Утреннюю порцию мочи собирают в стерильную посуду, отстаивают в течение 1–2 ч. Образовавшийся осадок собирают пипеткой в центрифужную пробирку, центрифугируют. Из осадка приготовляют препараты, хорошо высушивают (плохо высушенные препараты сползают при окраске), фиксируют и красят по Цилю – Нильсену.

Окраска по Цилю – Нильсену

Необходимые реактивы

1. Карболовый фуксин (1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 5%-ного раствора карболовой кислоты).

2. 3 %-ный спиртовой раствор соляной кислоты (3 мл соляной кислоты и 97 мл этилового спирта).

3. Водный 0,5 %-ный раствор метиленового синего.

Ход окраски

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). Дают остыть, сбрасывают фильтровальную бумагу. Опускают препарат в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного отхождения краски. Промывают водой. Докрашивают препарат метиленовым синим в течение 20–30 с. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мочи и бактерии – в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины, с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.

Анализаторы мочи

Анализаторы мочи лабораторные. Полуавтоматические, автоматические и применяемые у постели больного. Применяются для качественного или количественного определения химических и клеточных компонентов в клиническом образце мочи. Спектр данных включает в себя билирубин, гемоглобин, глюкозу, кетоны, нитраты, белок, pH, удельную плотность, уробилиноген, кровь, эритроциты, лейкоциты, соли, цилиндры, сперматозоиды, микроорганизмы (в частности, бактерии). Принцип работы основан на технологии, в которую могут быть включены электрический импеданс, электропроводность, ферментная спектрофотометрия, нефелометрия, фотометрия.

Глава 8

Исследование кала

Макроскопические и микроскопические исследования фекальных масс заслуживают большого внимания главным образом у больных с заболеваниями пищеварительного тракта. Перед тем как говорить об этих исследованиях как таковых, следует прежде всего обратить внимание на некоторые меры, которые в целях правильно проводимых исследований должны обязательно соблюдаться. Результаты исследования зависят от правильной подготовки больного и от правильного сбора, хранения и доставки материала исследования.

Подготовка больного к исследованию

Перед исследованием надо отменить больному медикаменты, прием которых мешает микроскопическому исследованию и которые влияют на внешний вид каловых масс, а также усиливают перистальтику кишечника. К этим лекарствам относятся все слабительные, ваго- и симпатикотропные средства, каолин, бария сульфат, препараты висмута, железа и препараты, вводимые в ректальных свечах, приготовленных на жидкой основе. В течение соответствующего периода следует избегать различных физиотерапевтических процедур в области живота, так как при этом может произойти изменение состава стула. Если целью исследований является обнаружение скрытых кровотечений, то в предшествующие анализу 3 дня следует избегать пищи, содержащей пищевые продукты, которые наравне с кровью могут быть катализаторами в реакциях, направленных на ее обнаружение. К этим продуктам относятся мясо, рыба, все виды зеленых овощей. При исследовании, основной целью которого является изучение степени усвоения пиши, целесообразно применять диеты, содержащие точно дозированные определенные продукты. Наибольшее распространение получили диеты Шмидта и Певзнера.

Диета Шмидта является щадящей:

1) утром 0,5 л молока, чая или какао, белый хлеб с маслом и яйцо всмятку;

2) завтрак (10 ч утра) – 0,5 л жидкой овсяной каши, сваренной на молоке;

3) обед – 125 г хорошо изрубленного постного мяса, слегка обжаренного в масле (внутри сырого), и 200–250 г картофельного пюре (приготовленного с 100 г молока, 10 г масла, соль по вкусу);

4) полдник – то же, что и утром, за исключением яйца;

5) ужин – 0,5 л молока или тарелка жидкой овсяной каши, белый хлеб с маслом и яйцо всмятку (или яичница).

Общая калорийность данной диеты составляет 2250 ккал.

При нормальной функции всех отделов пищеварительного тракта при микроскопическом исследовании пищевые остатки не обнаруживаются.

Диета Певзнера основана на принципе максимальной для здорового человека пищевой нагрузки. В пищевой рацион входят 400 г хлеба (половина черного), 250 г мяса, жаренного куском, 100 г масла, 40 г сахара, гречневая и рисовая каши, жареный картофель, салаты, квашеная капуста, компот из сухофруктов, свежие яблоки.

Калорийность – 3250 ккал. Эта диета рассчитана на максимальную пищевую нагрузку на пищеварительную систему здорового человека. При этом при микроскопическом исследовании в кале обнаруживается непереваренная клетчатка и незначительное количество мышечных волокон. Диета выявляет даже незначительную степень недостаточности процессов пищеварения.

Диету выбирают с учетом состояния органов пищеварения.

При пробной диете Шмидта в условиях нормального пищеварения пищевые остатки в кале не обнаруживаются. В кале здорового человека, получавшего диету Певзнера, содержится большое количество непереваренной клетчатки и немного мышечных волокон.

Пробную диету дают в течение 4–5 дней, фекальные массы исследуют на 3-й день при условии самостоятельного ежедневного опорожнения кишечника. Исследование производят при 3, 4 и желательно 5-й дефекации. Трехкратное исследование фекалий дает наиболее точное представление о функциональном состоянии пищеварительного тракта. Следует также рекомендовать больному, чтобы для спонтанно выделенного стула была использована чистая, сухая посуда, желательно стеклянная. У женщин и девочек рекомендуется производить взятие проб фекальных масс после опорожнения мочевого пузыря и предварительного закрытия влагалища ватным тампоном. Особенное внимание следует обращать на правильное взятие проб фекальных масс у грудных и маленьких детей, у которых наиболее часто встречается смешивание стула с мочой. Наличие мочи в стуле можно узнать на основании аммиачного запаха и сильно выраженной щелочной реакции.

Так как проба фекальных масс подвергается в дальнейшем действию различных процессов ферментации или гниения, а это влечет различные ее изменения, то анализ должен производиться не позднее 8–12 ч после выделения кала, а до этого его следует хранить при температуре от 3 до 5 °C.

Для исследования соответствующих проб некоторые авторы рекомендуют прежде всего разводить их водой, а затем готовить их для исследования; другие же авторы, наоборот, утверждают, что если плотность фекальных масс не является слишком высокой, то подготовка препаратов может осуществляться непосредственно из общей массы испражнений. Мы полагаем, что обе эти возможности могут быть использованы, и поэтому из одной части препаратов мы предпочитаем отбирать разведенные фекальные испражнения, а из другой части пробы исследуются неразведенными.

Физические свойства

Количество выделяемых ежедневно испражнений и при нормальных условиях колеблется в значительных пределах, что зависит от количества и состава пищи. При растительном питании количество кала гораздо больше, чем при пище животного происхождения. По Шмидту, после пробной диеты в течение суток при нормальных условиях выделяется до 200–250 г экскрементов. Увеличение суточного количества кала (полифекалия) может быть обусловлено нарушением всасывания, желчеотделения, заболеваниями желудка, поджелудочной железы и кишечника. Уменьшение количества кала определяется при хронических запорах.

Консистенция и форма. По консистенции различают плотный, или оформленный, густо- или жидкокашицеобразный и водянистый кал. При пище преимущественно животного происхождения фекальные массы имеют цилиндрическую форму, при растительной пище в большинстве случаев выделяется густокашицеобразный кал. Мазевидный кал обнаруживается при нарушениях секреции поджелудочной железы и отсутствии поступления желчи. Жидкий возникает при недостаточном переваривании в тонкой и толстой кишке (при гнилостной диспепсии, колите с изъязвлениями). Кашицеобразный стул возможен при бродильной диспепсии, колите с диареей, ускорении эвакуации из толстого кишечника. Пенистый кал возникает при бродильной диспепсии, овечий – при колите с запором.

Цвет. У здоровых людей (взрослых) пигментом каловых масс является стеркобилен, который придает им коричневатую окраску. Однако цвет фекальных масс обусловлен не только пигментами, но и целым рядом факторов, важнейшим из которых является характер питания. На окраску испражнений влияют лекарства и патологические примеси. Изменение окраски экскрементов в зависимости от различных условий представлено в таблице 38.

Таблица 38

Изменение окраски экскрементов в зависимости от различных условий

Запах. Запах кала зависит преимущественно от скатола, индола и в меньшей степени – от фенола, орто- и паракрезолов. Эти органические соединения ароматического ряда образуются при распаде белков. При усилении гниения белков в кишечнике запах усиливается. Меконий и стул при голодании практически запаха не имеют, кал грудных детей, находящихся на молочном вскармливании, имеет слабокислый запах. В анализе запах кала отмечается лишь в том случае, если он очень резко отличается от обычного.

Гнилостный запах определяется при недостаточности желудочного пищеварения, возникающей при гнилостной диспепсии, колите с запором, двигательных расстройствах кишечника. Зловонный запах определяется при нарушении секреции поджелудочной железы, отсутствии поступления желчи, а также повышенной секреторной функции толстой кишки. Слабый запах характерен для недостаточного переваривания в толстой кишке, запоров. Нерезкий запах появляется при колите с изъязвлениями, кислый – при бродильной диспепсии. Запах масляной кислоты появляется в случае ускоренной эвакуации из толстой кишки.

Макроскопическое исследование

Диагностическое значение имеют остатки тех пищевых продуктов, которые хорошо перевариваются, остатки соединительной и мышечной ткани, жира, т. е. все то, что с большей очевидностью выявляет микроскопическое исследование. В кале можно увидеть также гной, кровь, слизь, конкременты и паразитов.

Гной. Легко распознаваемый в фекальных массах гной может встречаться при ректитах или аноректитах (различной этиологии), при туберкулезной дизентерии, а также при новообразованиях прямой и сигмовидной кишки. В редких случаях больные выделяют большее или меньшее количество гноя без фекальных масс, что отмечается при открытии паракишечных абсцессов в прямую кишку.

Кровь. Наличие крови в стуле, как и гноя, распознается легко; она может появляться в испражнениях вместе со слизью, как это отмечается в кровянисто-слизистых испражнениях при дизентерии. Главным образом случаи рака прямой кишки, а также геморрой сравнительно часто проявляются в форме ректальных кровотечений. Отношение между кровью и фекальными массами может варьироваться, например свежая блестящая кровь может появляться перед отхождением фекальных масс, иногда вместе со стулом, более или менее смешанная с ним или с некоторым запозданием – после дефекации, черного цвета, покрывая фекальные массы. Вообще считают, что красная свежая кровь в кале появляется вследствие нижнего пищеварительного кровотечения, а черная кровь объясняется кровотечением в верхних пищеварительных путях.

По существу в условиях ускоренного транзита и при верхнем пищеварительном кровотечении кровь может появиться в стуле в неизменном виде. С другой стороны, кровь при кровотечениях из нижнего дистального кишечного сегмента пищеварительного тракта после продолжительного пребывания в ободочной кишке может появляться в стуле в форме черно-бурой массы. Мелкие кровотечения, которые не отображаются копрологически, могут обнаруживаться иногда только на основании химического анализа (реакции Адлера).

Слизь. Толстый кишечник вырабатывает большое количество слизи. Слизь может обнаруживаться в различных формах: в большинстве случаев она имеет форму вязких, иногда скользких, неправильной формы и размеров хлопьев. Иногда слизь обнаруживается в форме более или менее мелких скоплений, а реже под влиянием фермента муциназы слизь располагается в форме ложных пластинок или больших лоскутов, длина которых может доходить до 0,5 м. Эти хлопья слизи, иногда в форме лент или нитей, принимаются больными за кишечных паразитов.

Слизь часто также смешивают с остатками соединительной ткани в стуле. Их распознают на основании действия, оказываемого каплей уксусной кислоты. В то время как слизь при свертывании мутнеет, соединительнотканные волокна проясняются.

На практике слизь можно распознать на основании особой ее эластичности, а также на основании того, что при ее сдавливании между предметным и покровным стеклами она весьма легко теряет всякую форму.

Меньшее количество слизи выделяет и тонкий кишечник, но эта слизь обычно расщепляется и переходит в стул только в условиях ускоренного кишечного транзита. В фекальных массах при поносе тончайшая слизь пропитывается билирубином. Наличие слизи в стуле показывает возможность существования кишечного раздражения. Слизь сравнительно часто отмечается в стуле больных со спастическими запорами и колитами.

Иногда слизь оказывается смешанной с гноем и кровью, как это встречается при язвенно-геморрагических ректоколитах, дизентерии, некоторых злокачественных новообразованиях или же при туберкулезных поражениях ободочной кишки и т. д. Вот почему необходимо контролировать и отмечать наличие слизи при копрологических исследованиях.

Желчные камни (различной формы и размеров) в редких случаях могут обнаружиться при макроскопическом исследовании в стуле, где с трудом распознаются; поэтому для установления происхождения их следует подвергать химическому исследованию и исследовать под микроскопом. Другие плотные образования представлены копролитами (каловыми камнями) или же кишечным песком, в состав которых входят различные вещества.

Паразиты. Макроскопическое исследование зачастую позволяет поставить и паразитологический диагноз при обнаружении невооруженным глазом паразитов или фрагментов паразитов, которые появляются в стуле.

Микроскопическое исследование

Перед засевами проб не лишено интереса также и любое микроскопическое исследование, которое можно осуществлять как в отношении свежих неокрашенных, так и на препаратах, предварительно подвергшихся окраске.

При неокрашенных препаратах исследование с бактериологической точки зрения представляет в наше распоряжение данные относительно изобилия бактериальной флоры и возможной подвижности существующих в пробе бактерий. Во время этого исследования следует отмечать наличие эритроцитов, лейкоцитов, кишечных клеток, различных кристаллов (кристаллы Шарко – Лейдена), а также слизи.

При помощи этого микроскопического исследования, осуществляемого непосредственно на неокрашенном препарате, могут быть обнаружены некоторые микологические (дрожжи, ложные мицелии) или же паразитарные элементы (кисты или вегетативные формы протозоа, яйца или личинки некоторых паразитов).

Другие ценные сведения могут быть получены при микроскопическом исследовании окрашенных препаратов фекальных масс, произведенном в копрологической лаборатории. Например, после окраски по Май – Грюнвальду – Гимсу можно определить место, которое занимают на мазке элементы крови: лейкоциты, эозинофилы, эритроциты и т. д. На основании окраски по Граму можно получить сведения о пропорциях и отношениях между грамположительной (Гр+) и грамотрицательной (Гр—) флорой, а после окраски по Люголю можно обнаружить содержащуюся в соответствующих пробах йодофильную флору.

При использовании иммерсионного объектива окрашенная в фиолетовый цвет йодофильная флора выявляет наличие хлоридий или Ceptothrix, расположенные изолированно или цепочкой палочки.

Приготовление препаратов

Для полного микроскопического исследования кала приготавливают ряд препаратов. В большинстве случаев используют влажные препараты, но иногда для изучения клеточных элементов и дифференцирования простейших прибегают к изучению фиксированных окрашенных препаратов.

Влажные препараты готовят в 4 вариантах.

1. Так называемый нативный препарат представляет собой суспензию кала. Для его изготовления на предметное стекло наносят 1–2 капли воды или изотонического раствора хлорида натрия и растирают в ней с помощью стеклянной палочки небольшой комочек кала до получения равномерной суспензии. Этот препарат, покрытый покровным стеклом, рассматривают сначала под малым, а затем под большим увеличением (8 × 10 и 40 × 10). В нативном препарате дифференцируется большинство элементов кала: мышечные волокна, растительная клетчатка, нейтральный жир, жирные кислоты, мыла, лейкоциты, эритроциты, кишечный эпителий, слизь, яйца гельминтов, простейшие, кристаллы.

2. Кал аналогично растирают на предметном стекле, но не с водой, а с раствором Люголя двойной крепости. В таких препаратах можно обнаружить крахмал, йодофильную флору, а также дифференцировать цисты простейших.

3. Третий препарат изготовляют в виде густой водяной эмульсии, к которой прибавляют 1 каплю раствора Судана 3. Эти препараты применяются для обнаружения жира и продуктов его расщепления.

4. Кал растирают с каплей глицерина; последний служит для осветления яиц гельминтов и помогает их обнаружить. Однако для обнаружения яиц гельминтов таких препаратов обычно недостаточно. С этой целью прибегают либо к методам концентрации обследуемого материала, либо к просмотру ряда нативных препаратов.

Применяются следующие реактивы:

1) раствор Люголя двойной крепости: йода – 1 г, йодида калия – 2 г, воды – 50 мл. Растворяют йод и йодид калия в небольшом количестве воды, а потом прибавляют остальную воду;

2) раствор Судана 3 (реактив Састгоффа): спирта – 10 мл, ледяной уксусной кислоты – 90 мл, Судана 3 – до получения ярко-красной окраски;

3) реактив Гехта: смешивают перед употреблением равные объемы 1 %-ной нейтральной красной и 0,2 %-ного бриллиантового зеленого;

4) 0,5 %-ный раствор метиленового синего.

Детрит составляет основной фон при микроскопии нормального кала. Он представляет собой массу мелких частичек различной величины и формы, состоящую из продуктов распада клеток, остатков пищевых веществ и бактерий. Эти частички не поддаются распознаванию. Чем полнее происходит переваривание пищи, тем больше в кале детрита и тем меньше в нем дифференцируемых элементов.

Мышечные и соединительные волокна – единственные остатки белковой пищи, распознаваемые при микроскопии. Мышечные волокна, вернее их обрывки, имеют различный вид в зависимости от степени воздействия на них протеолитических ферментов. Не подвергшиеся перевариванию мышечные волокна имеют цилиндрическую форму и различную длину; края их как бы обрублены под прямым углом. Они довольно ярко окрашены в золотисто-желтый или коричневый цвет; только в ахоличном кале они лишены окраски желтым пигментом и выглядят светлыми. Наиболее характерной отличительной особенностью непереваренных остатков мышечных волокон является поперечная исчерченность.

Идентификация патогенной кишечной флоры, представленной главным образом возбудителями из семейства энтеробактерий (сальмонеллами, шигеллами, коли, протеем и т. д.), а также некоторыми видами стафилококка, стрептококка (энтерококка), клостридиума, энтероколитика и т. д., требует продолжения бактериологического исследования с последующим выделением возбудителей. В этих целях из пробы осуществляются засевы (копрокультура) на обогащенные питательные среды (среду Мюллера – Кауфмана, среду, содержащую селенит натрия, жидкую питательную среду Шапмана и т. д.) или на некоторые селективные среды (среду Вильсона – Блера, среду Истрата – Майтерта, среду, содержащую теллурит натрия, и т. д.).

Химическое исследование кала

Определение реакции кала (рН)

Лакмусовая бумага после контакта с фекальными массами изменяет свой цвет в зависимости от концентрации в них Н+-ионов. Для проведения реакции необходимы следующие материалы: универсальная лакмусовая бумага для измерения рН от 1,0 до 10, 0 или два вида лакмусовой бумаги (синяя и красная).

Лакмусовую бумагу, предварительно смоченную дистиллированной водой, прикладывают к нескольким местам поверхности испражнений; результат определяют спустя 2–3 мин, сравнивая изменение окраски на поверхности лакмусовой бумаги с различными оттенками контрольной шкалы.

Если пользуются красной и синей лакмусовой бумагой, то результаты учитывают следующим образом: при кислой реакции кала синяя бумага краснеет, а красная не изменяет своего цвета; при щелочной реакции красная лакмусовая бумага синеет, а синяя остается без изменения; при нейтральной реакции оба вида бумаги не меняют своего цвета.

В нормальных условиях кал имеет нейтральную или слабощелочную реакцию. Реакция кала преимущественно зависит от жизнедеятельности микробной флоры кишечника; в результате угнетенной жизнедеятельности бактерий, расщепляющих белки, образуется много аммиака, придающего среде щелочную реакцию. Продуктами жизнедеятельности бродильной флоры являются СО_2 и органические кислоты, создающие кислую реакцию среды. Активация бродильной флоры связана с усилением перистальтики толстой кишки, а процессы гниения усиливаются чаще при разложении белков, выделяемых ее стенкой (клетки, воспалительный экссудат). Таким образом, основа бродильной диспепсии – чаще энтериты, а гнилостной – колиты.

Определение крови в кале

Обычно у здорового человека скрытая кровь в кале отсутствует. Анализ производится с применением различных скрининговых тестов. Для этого используется бензидиновая или гваяковая пробы. Обычно назначается подготовка больного перед взятием крови для иключения ложноположительных результатов. За трое суток до обследования из рациона питания исключаются мясные продукты, фрукты и овощи, содержащие каталазу и пероксидазу (хрен, огурцы, цветная капуста), отменяют аскорбиновую кислоту, препараты железа, ацетилсалициловую кислоту, нестероидные противовоспалительные средства.

Рекомендуется исследовать кал после трех последовательных дефекаций, пробы берут каждый раз из двух разных мест каловых масс. Диагностически значимым является даже один положительный результат.

Бензидиновая проба. Применяются следующие реактивы: 1 %-ный раствор бензидина в 50 %-ной уксусной кислоте (при хранении в посуде из темного стекла годен в течение нескольких дней с условием ежедневного контроля), 3 %-ный раствор Н_2О_2.

Неразведенный кал тонким слоем наносят на предметное стекло. Мазок кладут в чашку Петри, лежащую на белом фоне, и наносят на него 2–3 капли раствора бензидина и столько же перекиси водорода. При положительной реакции появляется зеленое или синее окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна количеству крови в испражнениях. Если окраска не развивается или появляется позже 2 мин, то проба считается отрицательной. Бензидиновая проба является наиболее чувствительной и дает положительный результат в разведении крови 1: 100 тыс. – 1: 250 тыс. В настоящее время этот тест практически не используется, так как дает много ложноположительных результатов и выявляет кровопотери, превышающие 15 мл в сутки.

В клинической практике часто применяется гваяковая проба.

Гваяковая проба. Применяются следующие реактивы: 2 %-ная спиртовая настойка гваяковой смолы, ледяная уксусная кислота, 3 %-ный раствор Н_2О_2.

На предметное стекло, помещенное в чашку Петри, кладут кусок фильтровальной бумаги, на которую наносят небольшое количество кала в виде мазка. На кал капают 2–3 капли ледяной уксусной кислоты, настойки гваяковой смолы и перекиси водорода. В присутствии крови появляется сине-зеленое или фиолетовое окрашивание. Проба с гваяковой смолой дает положительный результат с разведениями крови 1: 50 тыс. В настоящее время разработаны тесты, в которых гваяковый реагент нанесен на пластмассовую полоску. Это привело к возможности стадартизировать проведение исследований и диагностировать мелкие кровотечения. Тест становится положительным при концентрации Нb в кале более 2 мг в 1 грамме. Гваяковый тест выявляет скрытую кровь при раке толстой кишки, колоноректальном раке, полипах толстой кишки.

Пирамидоновая проба. Применяются следующие реактивы: 5 %-ный спиртовой раствор амидопирина (пирамидона), 3 %– ный раствор уксусной кислоты, 3 %-ный раствор Н_2О_2.

Небольшой кусочек кала растирают с 4–5 мл воды и фильтруют. К фильтрату добавляют равный объем раствора амидопирина и по 10–12 капель уксусной кислоты и перекиси водорода. В присутствии крови появляется сине-фиолетовое окрашивание. Если через 2 мин окраска не появилась, то проба считается отрицательной. Проба с амидопирином по чувствительности стоит между описанными выше.

Экспресс-тесты. Фирмы «Germed» (ФРГ), «Roham Pharma» (Чехия), «Smith Klein» (США) выпускают бумажные тесты для определения скрытой крови в испражнениях, которые основаны на пробе с гваяковой смолой.

Испражнения наносят на пропитанную гваяковой смолой фильтровальную бумагу, укрепленную на дне небольшого окошка, прорезанного в картонной пластине, и закрывают створкой. С противоположной стороны также имеется створка, которую открывают непосредственно при исследовании, и на фильтровальную бумагу, которая уже пропитана испражнениями, наносят 2–3 капли реактива, в который входят кислота и перекись водорода. При наличии крови на фильтровальной бумаге развивается сине-зеленое окрашивание. Определение крови подобным тестом не ускоряет исследования, но позволяет проводить его у постели больного и значительно упрощает транспортировку испражнений при необходимости исследования только крови.

В последние годы для ранней диагностики рака толстой кишки применяются иммунохимические тесты с использованием специфических антител к гемоглобину человека (наборы типа «Гемоселект» и др.). Они положительные в 97 % случаев рака толстой кишки и 60 % при аденоматозе (при полипах размером более 1 см).

Определение желчных пигментов (стеркобилина, билирубина)

У здорового человека выводится с калом от 250 до 320 мг стеркобилина в сутки. Он придает калу определенную окраску, при его отсутствии кал обецвечен.

Унифицированный метод с двухлористой ртутью (проба Шмидта)

В результате реакции стеркобилина с двухлористой ртутью образуется соединение, имеющее розовое окрашивание. Применяются следующие реактивы: раствор двухлористой ртути (HgCl_2 – хлорид ртути, сумма), 70 г/л раствора.

Растворяют при кипячении, после охлаждения фильтруют.

Комочек кала величиной с лесной орех растирают в фарфоровой чашечке или пробирке с 3–4 мл раствора двухлористой ртути, закрывают крышкой или пробкой и оставляют при комнатной температуре в вытяжном шкафу на сутки. Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но вместо двухлористой ртути берут воду. В присутствии стеркобилина в опытной пробе появляется розовое окрашивание. Оценку результатов можно провести немедленно, если подогревать пробирки с опытной и контрольными пробами на пламени горелки. При наличии билирубина образуется зеленое окрашивание. В норме реакция положительная.

Метод с применением треххлористого железа

Необходимые реактивы

1. Реактив Фуше – раствор треххлористого железа (FeCl_3) 1: 5 мл воды.

2. Концентрированная соляная кислота.

В стеклянный сосуд помещают 1 г фекальных масс, хорошо смешанных с 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мл из этой эмульсии фекальных масс смешивают с 5 мл концентрированной соляной кислоты и нагревают в течение 5 мин до 50 °C. После охлаждения в проточной воде к этой смеси добавляют 2–3 капли треххлористого железа. Реакция может регистрироваться немедленно – в присутствии стеркобилина появляется красная окраска.

Метод с применением ацетата цинка

Необходимый реактив

Насыщенный раствор ацетата цинка (10 г ацетата цинка в 100 мл этилового спирта).

В пробирке смешивают до полной однородности 2–3 г фекальных масс и 100 мл насыщенного спиртового раствора ацетата цинка. В эту смесь добавляют 2–4 капли спиртового раствора йода и затем смесь фильтруют. Спустя 24 ч реакция регистрируется: в присутствии желчных пигментов фильтрат приобретает зеленую окраску.

У взрослых людей неизмененный билирубин в кале может появиться при ускоренной перистальтике (билирубин не успевает восстановиться) и при подавлении жизнедеятельности бактерий кишечника приемом больших доз антибиотиков и сульфаниламидов. Нарушение поступления билирубина в кишечник при заболеваниях печени или механическом препятствии оттоку желчи в результате закупорки или сдавления общего желчного протока приводит к снижению или полному отсутствию стеркобилина в кале, что отражается на окраске испражнений. Полное отсутствие стеркобилина можно установить только при химическом исследовании. Усиленное желчеотделение, повышенный распад эритроцитов приводят к увеличению стеркобилина в кале. Установить это можно, исследуя количество стеркобилина, выделенное с каловыми массами за сутки.

Определение аммиака и аминокислот

Формалин с солями аммония образует гексаметилентетрамин; освобождаемые кислые радикалы солей аммония оттитровывают 0,1 %-ным раствором щелочи в присутствии фенолфталеина.

Необходимые реактивы

1. 30 %-ный раствор хлорида железа (FeCl_3).

2. 1–2 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина.

3. Гидроксид кальция [Са(ОН)2] в порошке.

4. 0,1 %-ная HCl.

5. Формалин, разведенный 1: 2 и нейтрализованный 0,1 %-ным раствором гидроксида натрия (щелочи).

Растирают 10 г кала, постепенно добавляя 90 мл дистиллированной воды. Затем переливают в колбу и при встряхивании добавляют 2 мл 30 %-ного хлорида железа. Спустя 10 мин вносят 25 капель раствора фенолфталеина. В эту смесь добавляют 10 мл дистиллированной воды, в которой растворены 2 г гидроксида кальция, до появления красного окрашивания смеси. Через 10 мин смесь фильтруют и доводят до 100 мл дистиллированной водой. Смесь должна быть прозрачной; мутность появляется при излишке гидроксида кальция. 25 мл фильтрата выливают в колбу и нейтрализуют 0,1 %-ной HCl до бледно-розовой окраски. Затем добавляют 5 мл формалина, после чего фильтрат обесцвечивается. Далее проводят тестирование 0,1 %-ным раствором гидроксида Na до появления бледно-розовой окраски. Количество щелочи, прошедшей тестирование, умножают на 4, получая количество аммиака на 10 г кала.

В нормальных условиях количество аммиака в кале (в 10 г) соответствует приблизительно 4 мл 0,1 %-ного раствора гидрата натрия. Количество аммиака в кале отражает интенсивность гниения в толстом кишечнике. Практически пищевой белок расщепляется и всасывается в тонкой кишке, а гнилостному распаду подвергается чаще белок, выделяемый стенкой толстого кишечника. Следовательно, увеличение аммиака в кале говорит о гиперсекреции и воспалительной экссудации в толстых кишках, но так как распад белка до аммиака требует длительного времени, то при учащенной дефекации его количество в испражнениях даже при колитах может быть нормальным.

Определение растворимой слизи

Муцин слизи осаждается уксусной кислотой. Применяются следующие реактивы: 5 %-ный водный раствор ледяной уксусной кислоты. В пробирку к 2,5 мл 10 %-ной водной суспензии каловых масс приливают 7,2 мл 5%-ной уксусной кислоты. Появление через 20 мин хлопьев и просветления жидкости говорит о присутствии нерастворимой слизи.

Нерастворимая слизь в кале свидетельствует о раздражении или воспалении верхних отделов толстого кишечника.

Бактериологические исследования

О бактериальной флоре ободочной кишки может быть получено достаточно сведений при помощи бактериального исследования фекальных масс. Если речь идет о больном, то в соответствующих фекальных массах могут быть обнаружены в избытке и возбудители, локализованные также и в более высоко расположенных сегментах кишечника.

Бактериальная флора стула является очень разнообразной и богатой. Согласно наблюдениям различных авторов первое место в составе флоры фекальных масс занимают B. bifidus, B. Lactus, а также и различные грамотрицательные анаэробные палочки из группы Bacteroides. Из бактериальной флоры фекальных масс в значительно меньшей пропорции обнаруживаются энтерококки (S. Faecalis), принадлежащие к роду Streptococcus, B. coli или Escherichia coli и некоторые виды из рода Clostridium (семейство Bacillaceae). Среди них особое значение имеет Escherichia coli (кишечная палочка), которая, хотя и входит в нормальную кишечную флору, может в определенных условиях превращаться в патогенный возбудитель. Наряду с этиологической ролью, которая принадлежит некоторым серологическим типам Escherichia coli в появлении эпидемических поносов у новорожденных, следует упомянуть, что этот возбудитель нередко является причиной некоторых кишечных заболеваний у взрослых лиц. Сходную в некоторой степени роль могут играть и другие возбудители, которые встречаются во флоре фекальных масс. Например, в род Proteus включаются виды P. Mirabilis и P. Rettgeri, которые могут путем чрезмерного размножения обусловливать различные первичные или вторичные (после антибиотиков) энтеропатии.

Пищеварительные расстройства, более или менее тяжелые, могут обусловливаться также и некоторыми видами Klebsiella Pseudomonas, Enterobacter и т. д.

Бактериологические исследования, осуществляемые с применением повторных копрокультур, производятся для выделения специфических возбудителей, а также и возбудителей, которые могут превращаться в патогенные (потенциально патогенные) возбудители.

Бактериологическое исследование требует большого внимания и совершенной техники работы в лаборатории.

Взятие проб

Это манипуляция, от которой весьма часто зависит правильный результат. Отбор проб должен осуществляться в тщательно очищенные среды, подвергшиеся стерилизации и герметически закрывающиеся. Обычно из спонтанно выделившегося стула следует отбирать пробы по 3–5 г фекальных масс, не смешанных с мочой.

В рамках общей подготовки больного к взятию пробы следует избегать назначения антибиотиков, по крайней мере за несколько дней до взятия проб. Засевы всегда следует производить после взятия пробы немедленно: существует возможность размножения присоединившейся микробной флоры в ущерб флоре и микробам, которые подлежат выявлению.

Если все же засевы нельзя произвести немедленно, отобранные пробы помещают в реципиент, содержащий стерильную консервирующую жидкость, состоящую из 250 мл глицерина, 750 мл дистиллированной воды и 5 г хлористого натрия.

Каждая проба должна иметь специальный ярлык, на котором отмечают вероятный диагноз и указывают, принимал ли больной антибиотики или подвергался ли специфическим прививкам. Данные относительно макроскопического аспекта стула являются последними. Вполне понятно, что следует особо отмечать, содержит ли выделенный больным стул кровь, слизисто-кровянистые глеры, гной, ложные пленки или же слизь.

Отсылать пробы в лабораторию следует как можно быстрее и при низкой температуре для защиты возбудителей от различных вредных внешних факторов.

Особенности кала детей грудного возраста

В первые 1–2 дня жизни у новорожденных выделяется меконий, который представляет собой густую вязкую массу темно-оливкового цвета без запаха. Термином «меконий» обозначают все содержимое кишечника ребенка, накопившееся перед родами и до первого прикладывания к груди.

Состав мекония представлен клетками кишечного эпителия, остатками проглоченных околоплодных вод со слущенными клетками кожи и lanugo, желчью, секретами кишечника и поджелудочной железы.

Объем мекония составляет 60–200 г, и чаще всего он отходит в первые 12 ч. Иногда этот срок увеличивается до 48 ч и редко – до 72 ч.

При исследовании химического состава мекония обнаруживается небольшое количество жира и почти не выявляется белок. Исключение составляют только дети с наследственным тяжелым заболеванием – кистофиброзом поджелудочной железы, при котором резко возрастает содержание альбумина в меконии.

Отсутствие эпителиальных клеток в составе мекония может быть признаком кишечной непроходимости у новорожденного. Содержание мекония в околоплодных водах в начале родов указывает на внутриутробную асфиксию.

После 3-го дня наблюдается переходный стул, а с 5-го дня устанавливаются обычные испражнения. При естественном (грудном) вскармливании кал золотисто-желтого цвета с кисловатым запахом в виде жидкой сметаны. Число испражнений в течение первого полугодия жизни может достигать 5 раз в день, а после 6 месяцев бывает обычно 2–3 раза в день.

При искусственном вскармливании каловые массы обычно более густые (замазкообразной консистенции), светло-желтого цвета, часто неприятного, гнилостного запаха. Число испражнений в течение первого полугодия обычно 3–4 раза в день, а во втором полугодии – 1–2 раза в день.

Суточное количество кала у грудных детей, вскармливаемых женским молоком, небольшое, в среднем около 20–25 г, что составляет по весу 2,5–3 % принятой пищи. При смешанном и искусственном вскармливании количество каловых масс значительно повышается (при смешанном вскармливании – в среднем до 60–65 г, а при искусственном – до 100 г).

Количество экскрементов у детей 1-го года жизни относительно больше, чем у более старших детей и у взрослых.

Копрограмма у здоровых детей несколько различна в зависимости от получаемой ребенком пищи. При вскармливании грудным молоком попадаются лишь единичные кристаллы жирных кислот; с переходом на докорм смесями со слизистыми отварами встречаются единичные зерна крахмала, а у детей, получающих мясо, – единичные мышечные волокна.

Надо помнить, что даже у совершенно здоровых детей первого года жизни, особенно в первые месяцы жизни, микроскопическое исследование кала обнаруживает небольшое количество лейкоцитов, что не дает никаких оснований говорить о воспалительном процессе у них в толстом кишечнике.

В кале почти всех новорожденных имеется большое количество слизи (гиперсекреция слизи свидетельствует о выраженной катаральной реакции слизистой кишечника), а у 1/3 детей – небольшое количество тканевого белка.

Исследование кала на простейшие

Как известно, патогенные простейшие являются эукариотическими одноклеточными микроорганизмами, которые по структуре своих клеток весьма близки к клеткам животных, вследствие чего они принципиально отличаются от патогенных прокариот.

Паразитирование простейших в организме человека и животных стимулирует функционирование гуморальных и клеточных механизмов иммунитета. Однако их протективная роль при различных протозойных инфекциях неодинакова. Она в значительной степени обусловлена физиологическими особенностями самих паразитов, их жизненным циклом, а также взаимоотношениями между паразитом и хозяином.

Простейшие относятся к Protozoa подклассу Animalia, которое включает 7 типов. Представители трех из них – Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliphora – вызывают заболевания у человека. К патогенным простейшим – возбудителям заболеваний человека – относятся дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, плазмодии малярии, токсоплазма, балантидии.

В кишечнике человека могут паразитировать следующие простейшие: дизентерийная амеба (Entamoeba histolytica), кишечная амеба (Entamoeba coli), кишечная лямблия (Lamblia intestinalis), крупная инфузория (Balantidium сoli), кишечная трихоманада (Trichomonas hominis) и т. д (табл. 39).

Таблица 39

Основные виды паразитов и оптимальные методы их обнаружения в крови, пунктатах, кале

Методы исследования

Необходимым условием исследования кала на простейшие является изучение свежего материала, взятого не позже 15–20 мин после дефекации, так как вегетативные формы быстро погибают во внешней среде. Обычно вегетативные формы отыскивают в жидких и полужидких испражнениях.

Цисты могут обнаруживаться в оформленном кале. Поскольку цисты более стойки во внешней среде по сравнению с вегетативными формами, при необходимости такой кал можно сохранять в прохладном месте в течение суток.

Окончательно отрицательный ответ можно дать только после 4–5-кратного исследования с интервалами в 2–3 дня. Иногда при этом прибегают к даче слабительного с последующим тщательным исследованием.

При исследовании кала на простейшие используют 2 метода:

1) метод нативного мазка и мазка с раствором Люголя;

2) метод фиксированных окрашенных препаратов.

Первый метод является основным и применяется в большинстве клинико-диагностических лабораторий. Второй (окраска железным гематоксилином по Гейденгайну) – сложен, трудоемок, применяется в редких случаях, когда невозможно обойтись исследованием только нативных препаратов.

В кишечнике человека находится большое количество микроорганизмов. Кал на 40–50 % состоит из погибших бактерий. При усилении процессов брожения, особенно при бродильной диспепсии, в кале можно обнаружить йодофильную флору. Она располагается кучками и скоплениями. Морфология ее различна: палочки, кокки, дрожжевые клетки и др. Все они обладают свойством окрашиваться раствором Люголя в черный или темно-синий цвет. В норме йодофильная флора в кале отсутствует.

Приготовление препаратов

Для приготовления препаратов предварительно растирают комочек кала в небольшом количестве дистиллированной воды до консистенции жидкой кашицы. Затем по капле эмульсию наносят на 4–5 предметных стекол. На 1-м стекле готовят нативный препарат. Содержимое препарата накрывают покровным стеклом. На втором стекле готовят препарат с раствором Люголя. Каловую эмульсию хорошо перемешивают с раствором Люголя (1 г йода, 2 г йодида калия, 50 мл дистиллированной воды). На 3-м стекле готовят препарат с метиленовым синим для обнаружения жирных кислот, мыл и нейтрального жира. На 4-м стекле готовят препарат с глицерином. 5-й препарат готовят с краской Судана 3.

Нативные препараты, окрашенные и неокрашенные, рассматривают под малым увеличением микроскопа. Для более детального изучения используют большое увеличение. Существуют методы накопления цист. Из них наиболее распространен метод флотации с помощью 33 %-ного раствора сульфата цинка.

Эфирно-формалиновый метод обогащения фекалий на цисты

Центрифугируют водную суспензию кала (1: 10). К осадку добавляют 10 мл 10 %-ного раствора формалина. Через 5 мин после перемешивания приливают 3 мл эфира. Пробирку закрывают пробкой, интенсивно встряхивают. Центрифугируют в течение 2 мин при 1500 об./мин. Из осадка делают препараты (нативный и с раствором Люголя).

Морфология простейших

Клетки простейших покрыты плотной эластической мембраной – пелликулой, образуемой периферическим слоем цитоплазмы. Некоторые из них снабжены опорными фибриллами и минеральным скелетом, отсутствующими у бактерий. Цитоплазма простейших содержит компактное ядро или несколько ядер, окруженных мембраной, ядерный сок (кариолимфу), хромосомы и ядрышки, а также структуры, свойственные клеткам многоклеточных животных организмов: эндоплазматический ретикулум, рибосомы, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы, различные типы вакуолей и др.

Многие простейшие способны активно перемещаться в пространстве посредством временных псевдоподий или постоянно существующих органелл.

Большинство из них обладают гетеротрофным типом метаболизма. У просто организованных форм захват пищи происходит посредством фагоцитоза.

Простейшие с более сложной морфологией имеют специальные структуры, позволяющие поглощать пищу. Дыхание осуществляется всей поверхностью клетки.

Дизентерийная амеба Entamoeba histolitica

Была открыта Ф. А. Лешем в 1875 г. Тип Sarcomastigophora, подтип Sarcodina, класс Lobosea, отряд Amoebida.

Микробиология

Она является обитателем толстой кишки человека и в своем развитии (жизненный цикл) проходит 2 стадии – вегетативную и стадию покоя. К 1-й относятся 3 морфологически различающиеся формы: большая вегетативная (форма magna, или тканевая), просветная, или кишечная (форма minuta, или комменсальная), и предцистная формы. Отдельные стадии переходят одна в другую в зависимости от условий существования в организме хозяина.

Большая вегетативная форма имеет относительно крупные размеры (20–50 мкм) и обнаруживается с патологическими примесями (кровь, слизь) в нативных препаратах из свежих фекалий больного острым амебиазом. Внутренний слой цитоплазмы (эндоплазма) зернистый, наружный слой (эктоплазма) более гомогенный, стекловидный, хорошо заметен при образовании пседоподий. Этой форме свойственно активное и быстрое перемещение посредством эндоплазматических псевдоподий. Для амебы характерны толчкообразное образование псевдоподий и активное поступательное движение. Ядро у живой амебы плохо различимо. В ее эндоплазме могут наблюдаться фагоцитированные эритроциты хозяина, что является отличительным признаком тканевой формы (табл. 40).

Просветная форма амебы живет и размножается в просвете слепой и восходящей части толстой кишки и в основном имеет строение тканевой формы, но меньших размеров (15–20 мкм); выявляется в фекалиях выздоравливающих больных, а также больных с хроническим течением болезни, у носителей. Они передвигаются медленнее, чем тканевая и вегетативная формы. В цитоплазме выявляются фагоцитированные детрит и бактерии. Эритроцитов эта форма не фагоцитирует.

Предцистная форма дизентерийной амебы встречается в испражнениях реконвалесцентов, а также у бессимптомных носителей. Она отличается от других вегетативных форм наиболее медленными движениями.

Циста имеет округлую форму. Она окружена двухконтурной оболочкой и содержит 1 или несколько ядер. В них различают 4, 2 или 1 ядро, большую гликогеновую вакуоль, а у части цист – так называемые хроматоидные тела, представляющие собой включения в виде 1–3 коротких толстых палочек или брусочков с тупыми концами. Присутствие хроматоидных тел такой формы служит одним из основных диагностических признаков цист дизентерийной амебы.

Гликогеновую вакуоль содержат, как правило, цисты, имеющие 1–2, редко – 3 ядра; выявляют ее при окраске раствором Люголя. Хроматоидные тела видны в нативном препарате.

Цисты хорошо сохраняются во внешней среде.

Дизентерийная амеба хорошо культивируется на искусственных питательных средах (таких как среда Павловой, Даймонда и др.).

Различные штаммы амеб неодинаковы для человека по своей вирулентности, от которой зависит патогенез заболевания.

Жизненный цикл

При попадании в тонкую кишку человека оболочка цисты разрушается, и из нее выходит четырехъядерная материнская клетка амебы. После деления образуются 8 одноядерных паразитов, которые превращаются в вегетативные формы, заселяющие толстую кишку хозяина.

Механизм проникновения амеб в стенку кишки связан с выделением ими протеолитических ферментов. Паразиты разрушают эпителий кишки, что сопровождается некрозом и образованием язв. В основном процесс локализуется в слепой и восходящей кишках, но часто поражаются прямая и сигмовидная кишки. В тяжелых случаях углубление язв до мышечной и серозной оболочек кишки вызывает перфорацию кишечной стенки и развитие перитонита. Возможен длительный, хронически протекающий амебиаз, при котором возникают амебомы – опухолевидные образования в стенке толстой кишки.

При проникновении паразитов в кровяное русло происходит гематогенная диссеминация амеб. Чаще всего при этом поражается печень, но иногда патологические процессы развиваются в легких, коже, головном мозге и других органах. Внедрение паразитов в ткани кишечника и размножение тканевых форм происходят при иммунодефицитных состояниях, а также при дисбактериозе кишечника, когда амебы испытывают недостаток в обычном для них объекте питания – бактериях толстой кишки.

Клиническая картина

Амебная дизентерия – типичный антропоноз, при котором человек является источником инфекции, заражающим цистами амеб окружающую среду. Особое значение при этом имеет бессимптомное носительство паразитов, а также наличие хронических больных, длительно выделяющих цисты амеб в окружающую среду.

Таблица 40

Сравнительные признаки строения амеб в нативных препаратах

Лямблии

Тип Sarcomastigophora, подтип Mastigophora класс Zooma-stigophorea, отряд Diplomomadida.

Возбудитель лямблиоза Lamblia intestinalis был открыт Д. Лямблем в 1859 г. Он относится к роду Lamblia, включающему более 100 видов, паразитирует в организме многих позвоночных. Специфическим паразитом человека является L. intestinalis, обитающий в двенадцатиперстной кишке и верхних отделах тонкого кишечника.

Микробиология

Длина паразита составляет приблизительно 15 мкм, ширина в его передней части 7–8 мкм. Форма клетки грушевидная, заостренная к заднему концу. В ее передней части имеется присасывательный диск, при помощи которого лямблии плотно прикрепляются к эпителиальным клеткам тонкой кишки. По продольной оси проходят 2 опорные нити – аксостили, разделяющие тело паразита на симметричные половины, имеющие ядро с крупной кариосомой в середине. От каждой половины отходят 4 жгута (всего 8).

Брюшко имеет вогнутость – присасывательный диск создает отрицательное давление между паразитом и микроворсинками кишечника, что нарушает всасывание в тонкой кишке аминокислот, которыми и питаются сами лямблии.

Движение поступательное, иногда вращательное. Питание лямблий осуществляется осмотически, размножение – путем продольного деления.

Цисты овальной формы (8–14 мкм), окружены плотной прозрачной оболочкой. Внутри цист имеется сложный рисунок (ядра, аксостили, жгуты).

Клиническая картина

Умеренная инвазия тонкого кишечника обычно не вызывает болезненных симптомов. Однако более выраженное заражение этими паразитами приводит к тяжелым кишечным расстройствам. Проникая через желчный проток из двенадцатиперстной кишки в желчный пузырь, лямблии могут явиться причиной хронического холецистита.

Связь лямблий с позвоночным хозяином является видоспецифической.

В частности, лямблии кроликов или мышей не могут существовать в кишечнике человека.

Источниками инфекции являются не только больные люди, но и здоровые носители.

Цисты лямблий сохраняют свою жизнеспособность во внешней среде довольно длительное время.

Трихомонады

Тип Sarcomastigophora, подтип Mastigophora, класс Zoomastigophorea, отряд Trichomonadida.

Трихомонады относятся к роду Trichomonas Davaine, который включает большое количество видов, паразитирующих в организме различных позвоночных.

Паразитами человека являются представители трех видов: Trichomonas hominis, обитающий в кишечном тракте, T. tenax (T. clongata) – паразит полости рта и T. vaginalis (Donne) – паразит урогенитального тракта.

Микробиология

Trichomonas hominis паразитирует в толстом кишечнике. Клетки паразитов имеют грушевидную форму, длина составляет 7–20 мкм. На переднем конце расположены 4 жгутика, отходящих от базальных зерен. Через всю цитоплазму, от области базальных зерен до конца клетки, проходит опорная эластическая нить (аксостиль). Кроме того, с одной стороны тела паразита имеется ундулирующая мембрана, по волнообразному движению которой его распознают. Ядро сферической формы расположено в передней части клетки. У основания имеется щелевидное углубление («жгутиковый карман»), через который происходит захват пищи (бактерий) посредством фагоцитоза, возможно астматическое питание. В цитоплазме иногда видны пищевые вакуоли, содержащие бактерии.

Отдельные виды трихомонад отличаются также друг от друга строением ундулирующей мембраны. Размножаются трихомонады агамно, продольным делением.

Трихомонады – подвижные организмы, быстро перемещаются при помощи жгутиков и ундулирующей мембраны. Стадия цисты отсутствует.

Трихомонады хорошо растут на питательных средах в присутствии бактерий, которыми питаются.

Клиническая картина

T. hominis обитает в толстой кишке человека, где иногда интенсивно размножается. Полагают, что при массивном заражении этим паразитом у ослабленных больных и детей ухудшается течение предшествующих заболеваний толстой кишки.

Балантидии

Тип Ciliophora, класс Kinttofragminophores, подкласс Vestibuliteria, отряд Trichostomatida, род Balantidium.

Паразиты толстой кишки человека – Balantidium coli (Malmsten) относятся к инфузориям, вызывают изъязвление и перфорацию стенок кишечника, что может явиться причиной перитонита.

Микробиология

Клетки балантидий представляют собой крупную инфузорию яйцевидной формы, достигающую 200 мкм. Они густо покрыты короткими ресничками, расположенными продольными рядами. Благодаря ресничкам осуществляются передвижение и заталкивание питательных веществ вместе с током жидкости в цитостом. На переднем конце клетки имеется щелевидное углубление (перистом), на дне которого помещается ротовое отверстие (цитостом). Ядерный аппарат, типичный для инфузорий, состоит из бобовидного макронуклеуса, расположенного примерно в центре клетки, и находящегося по соседству с ним микронуклеуса. В цитоплазме имеются пищеварительные и сократительные вакуоли, на заднем конце тела – анальная пора.

Циста правильной шарообразной формы (50–60 мкм) с отчетливо выраженной бесцветной двухконтурной оболочкой и хорошо заметным макронуклеусом.

Жизненный цикл

В. coli состоит из двух фаз: бесполой и половой (конъюгация). После конъюгации паразит инцистируется. Цисты выводятся наружу с фекальными массами и довольно стойко сохраняются во внешней среде. Они имеют круглую или овальную форму, покрыты двухслойной оболочкой. Заражение человека цистами происходит через рот.

В. Сoli растет на тех же питательных средах, что и дизентерийная амеба.

Клиническая картина

Балантидий может жить в просвете толстой кишки человека, питаясь кишечным содержимым и не оказывая патогенного действия на организм своего хозяина. При внедрении в слизистую оболочку кишечника и проникновении в толщу его стенки паразит начинает питаться клетками хозяина, заглатывая в большом количестве эритроциты. Это приводит к изъязвлению внутренней стенки кишки, что сопровождается тяжелой формой кровавого поноса.

Исследование кала на гельминты

Инвазии людей паразитическими червями распространены довольно широко.

Важнейшим звеном всей работы служит гельминтологическая диагностика. Для постановки диагноза гельминтозов исследуют испражнения, дуоденальное содержимое, мокроту, мочу, содержимое кист, кровь, перианальную и ректальную слизь, содержимое подногтевых пространств.

В клинической лаборатории чаще всего подвергают исследованию кал. Для анализа достаточно иметь небольшое количество материала. В кале можно обнаружить сами гельминты, их фрагменты или яйца.

В кале встречаются яйца следующих гельминтов:

– из нематод (круглых червей) – аскарид, власоглава, томикса, кривоголовки двенадцатиперстной, некатора, трихостронгилиды;

– из трематод – двуустки печеночной, двуустки кошачьей, двуустки ланцетовидной, шистосомы;

– из ленточных червей – цепня невооруженного, цепня вооруженного, лентеца широкого, лентеца малого.

В лабораторию должны доставляться свежие (менее суточной давности) испражнения (разовая порция) в чистой стеклянной посуде. Для контроля лечения направляют все порции фекалий, выделенные в дни приема антигельминтного средства.

Кал прежде всего должен быть подвергнут макроскопическому осмотру. При этом могут быть выявлены целые экземпляры паразитов и их фрагменты (части, стробилы, членики).

Для яиц гельминтов характерна четкая морфологическая структура. Все они имеют оболочку определенного строения, что отличает их от других образований, попадающих в кал.

Яйца каждого вида гельминтов имеют свои постоянные размеры и могут содержать яйцеклетку, развитые личинки или желточные клетки.

Макрогельминтологические исследования

Макроскопическое исследование служит для обнаружения в кале целых гельминтов и их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы.

Приготовление препарата

Для исследования испражнения смешивают с водой до жидкой консистенции и переносят небольшими порциями в чашку Петри, тщательно осматривая на черном фоне. Пинцетом или препаровальными иглами извлекают все похожие на фрагменты гельминтов белые частицы.

Крупные образования помещают между двумя предметными стеклами и рассматривают под лупой. Более удобен для этой цели способ отстаивания (отмучивания). Собранные фекалии помещают в высокие стеклянные цилиндры, банки (можно в ведро), смешивают с 5–10-кратным количеством воды и дают отстояться. Мутный слой над осадком сливают, снова заливают водой, перемешивают, отстаивают и воду снова сливают. Эту процедуру повторяют, пока вода над осадком не станет прозрачной, затем воду сливают и просматривают осадок в черной или прозрачной кювете на черном фоне.

Дифференцировать отдельные виды гельминтов можно с учетом их анатомоморфологических признаков. Так, определить вид нематод можно только по целым экземплярам, реже по крупным фрагментам.

Распознавание нематод не представляет затруднений; их рассматривают невооруженным глазом или под лупой.

Цестоды можно диагностировать по зрелым членикам, сколексам. Определение вида ленточных червей по членику производят следующим образом. Обнаруженный в испражнениях членик отмывают в воде, помещают на предметное стекло, покрывают другим предметным стеклом и при легком надавливании на край препарата рассматривают на свет. Отмечают форму членика (узкий, длинный характерен для тениид, плоский, короткий – для лентеца широкого), строение матки.

Распознавание крупных цестод по их сколексам производят после дегельминтизации. Отмытого паразита осматривают, отыскивают его тонкий конец. Обнаружив головку, рассматривают ее строение с помощью лупы или под малым увеличением микроскопа. Определение трематод осуществляют только после дегельминтизации на основании особенностей формы, размера, внутреннего строения (расположения семенников и т. д.).

Микрогельминтологические исследования

Изучению подвергают нативные препараты и препараты после специальной обработки.

Самый простой и удобный метод исследования испражнений – метод мазка. Нативный мазок готовят с 50 %-ным раствором глицерина. Для этого деревянной палочкой из разных мест доставленного кала берут частицу величиной со спичечную головку и готовят несколько препаратов.

Кал тщательно растирают на предметном стекле с несколькими каплями 50 %-ного раствора глицерина до получения достаточно равномерного и прозрачного мазка, который занимает почти всю поверхность стекла. Микроскопируют мазок, не применяя покровных стекол. Раствор глицерина хорошо осветляет препарат и предохраняет его от высыхания. При отсутствии глицерина препарат можно готовить с изотоническим раствором хлорида натрия или водой. Вероятность обнаружения яиц гельминтов увеличивается при применении метода толстого мазка.

Метод «толстого мазка с целлофаном» (по Като) применяется для диагностики аскаридоза, трихоцефалеза, анкилостомидоза (для последнего он особенно ценен). Яйца гельминтов обнаруживают в толстом мазке фекалий, осветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью. Для этого используют 3 %-ный водный раствор малахитовой зелени, глицерин, 6 %-ный водный раствор фенола.

Из этих компонентов готовят смесь Като: 6 мл раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл раствора фенола смешивают и хранят в закрытой посуде при комнатной температуре. Раствор стабилен, его используют при приготовлении пластинок по Като. Для приготовления их из целлофана нарезают прямоугольные пластинки размером 20 × 40 мм и погружают их в смесь Като на 24 ч, после чего они готовы к употреблению. Хранят готовые пластинки в смеси Като, в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре.

Кусочек фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают пластинкой по Като и придавливают резиновой пробкой так, чтобы фекалии размазались по стеклу в пределах пластинки. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 30–40 мин. Затем рассматривают под микроскопом.

Достоинствами метода являются его простота, гигиеничность, возможность просмотреть большое количество фекалий, что повышает вероятность выявления яиц. Описанным методом можно выявить яйца нематод и цестод.

Фасциола (Fasciola hepatica). Яйцо правильной овальной удлиненной формы. Оболочка гладкая, тонкая, желтого цвета с крышечкой на одном полюсе и плоским бугорком на другом. Оно заполнено множеством желточных клеток. Размеры 130 × 145 × 70–90 мкм.

Ниже представлена сравнительная характеристика гельминтов (табл. 41, 42, 43).

Описторхис (Opisthorchis felineus). Яйцо овальное, вытянутой формы, слегка асимметрично. Оболочка гладкая, тонкая, светло-желтого цвета. На одном полюсе имеется слабо различимая крышечка, на противоположном – бугорок. Внутри яйца содержится развитая личинка (микроцидий). Размеры 26–32 × 11–14 мкм.

Лентец широкий (Dyphyllobothrium latum). Яйцо овальное желтоватого цвета. Оболочка гладкая, прозрачная, толстая. На верхнем полюсе хорошо просматривается крышечка, на противоположном – бугорок. Внутри яйца многочисленные желточные клетки. Размер 68–71 × 45 мкм.

Вооруженный цепень (Taenia solium) и невооруженный цепень (Taeniarhynchus saginatus). Яйца округлые или слегка овальные с толстой коричневой радиально исчерченной оболочкой. Внутри яйца видна онкосфера (зародыш) с тремя парами крючьев. Яйца обоих видов неразличимы. Размер 31 × 40 мкм.

Карликовый цепень (Hymenolepis nana). Яйцо эллипсовидной формы. Оболочка бесцветная с онкосферой внутри. Онкосфера имеет 3 слоя оболочки темно-коричневого цвета. Хорошо заметны 3 пары эмбриональных крючьев. Размер 40 × 50 мкм.

Власоглав (Trichocephalus trichiurus). Яйцо имеет форму лимона. Оболочка толстая, многослойная, золотисто-желтого или коричневого цвета. На полюсах имеются бесцветные пробковидные образования. Размер 50–54 × 22–23 мкм.

Анкилостома (Ancylostoma duodenale). Яйцо овальной формы с закругленными полюсами. Оболочка тонкая, прозрачная, бесцветная. В свежеотложенном яйце хорошо различимы 4 бластомера. Размер 54–70 × 36–40 мкм.

Аскарида (Ascaris lumbricoides). Оплодотворенное яйцо овальной формы, имеет толстую, многослойную оболочку. Наружная оболочка белковая, крупнобугристая, желто-коричневого цвета. Некоторые яйца бывают лишены белковой оболочки.

Яйцо бесцветное или с серо-зеленым оттенком. Размер 50–106 × 40–50 мкм.

Острица (Enterobius vermicularis). Яйцо овальное, асимметричной формы, одна сторона выпуклая, другая утолщена. Оболочка гладкая, бесцветная, многослойная. Внутри яйца зародыш на разных стадиях развития. Размер 50–60 × 20–30 мкм.

Таблица 41

Сравнительная характеристика яиц трематод

Таблица 42

Сравнительные данные о ленточных червях

Таблица 43

Сравнительная характеристика яиц нематод

Методы обогащения

Кроме метода мазков, применяют более сложные, но и более эффективные методы – методы обогащения, основанные на концентрации яиц в препаратах. Эти методы условно можно разделить на 2 большие группы:

1) концентрация яиц на поверхности жидкости (методы флотации, всплывания);

2) концентрация яиц в осадке (методы осаждения, седиментации).

Метод Калантарян (с флотационным раствором). Основан на том, что в жидкости с высокой относительной плотностью яйца гельминтов как более легкие всплывают на поверхность, где и концентрируются.

Для этого используется раствор Калантарян (1 кг нитрата натрия растворяют в 1 л воды; смесь кипятят до образования пленки, остужают; относительная плотность раствора 1,38).

В химическом стакане тщательно размешивают стеклянной палочкой 5–10 г фекалий со 100–200 мл флотационного раствора. Сразу после размешивания удаляют всплывшие на поверхность крупные частицы. Стаканчик покрывают предметным стеклом так, чтобы оно соприкасалось с поверхностью жидкости.

Если жидкости мало, ее следует долить до полного соприкосновения смеси с предметным стеклом. Оставляют для всплытия яиц на 20–30 мин, после чего предметное стекло снимают, кладут под микроскоп и просматривают без покровного стекла.

Хорошо всплывают все яйца, в том числе трематод, крупных цестод, а также неоплодотворенные яйца аскарид, яйца власоглава.

Метод Фюллеборна позволяет исследовать большое количество материала и широко используется.

В небольшую баночку (обычно мазевую) помещают 5 г фекалий и тщательно размешивают с 20-кратным количеством насыщенного раствора хлорида натрия, добавляя его при помешивании небольшими порциями. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют кусочком бумаги или картона, баночку до краев наполняют раствором хлорида натрия и покрывают предметным стеклом так, чтобы нижняя поверхность соприкасалась с жидкостью. Баночку оставляют стоять на 45–90 мин (в течение этого срока яйца всплывают и держатся на поверхности смеси), затем предметное стекло осторожно поднимают, быстро переворачивают и приставшую пленку микроскопируют под малым увеличением без покровного стекла.

Методом Фюллеборна хорошо выявляются яйца цепня карликового и всех нематод, за исключением неоплодотворенных яиц аскарид. Так как яйца трематод, большинства цестод всплывают, нужно исследовать и осадок со дна баночки. Препараты из осадка малопрозрачны, поэтому для просветления можно добавить каплю глицерина.

Метод Красильникова (с применением детергентов). Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав детергентов (стиральных порошков), яйца гельминтов освобождаются от фекальных масс и концентрируются в осадке.

Для этого используют 1 %-ный раствор стирального порошка «Лотос» (порошок высушивают в сушильном шкафу при 100 °C в течение 1–2 ч; 10 г сухого порошка растворяют в 1 л водопроводной воды).

В центрифужную пробирку помещают комочек кала и приливают раствор детергента. Соотношение кала к жидкости 1: 10. Хорошо перемешивают их до образования суспензии. Через 30 мин содержимое пробирки встряхивают 1–2 мин и центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин. Из осадка готовят 2 препарата на одном стекле.

В практике работы лаборатории пользуются и другим способом. В этом случае жидкость не подвергается центрифугированию, а отстаивается в течение 24 ч для образования осадка, из которого также готовят мазки для микроскопирования.

Метод закручивания (по Шульману) очень прост, более эффективен, чем метод нативного мазка, однако ограничиваться им при исследовании на гельминты нельзя. Он служит дополнением к методам концентрации яиц и личинок.

В небольшой баночке высотой 6–7 см тщательно размешивают 2–3 г испражнений с 3–5-кратным количеством воды или изотонического раствора хлорида натрия. После этого стеклянной палочкой делают быстрые круговые движения (закручивание) в течение 1–2 мин. При круговом движении яйца и личинки собираются у конца стеклянной палочки. По окончании закручивания палочку с каплей взвеси быстро вынимают, каплю помещают на предметное стекло, а затем микроскопируют.

Метод Бермана применяется для выявления личинок гельминтов (угрицы). Полученный от больного кал (лучше свежевыделенный) в количестве 5 г помещают на мелкую металлическую сетку (удобна цедилка для молока) в стеклянную воронку, закрепленную в штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом (аппарат Бермана). Сетку (цедилку) приподнимают и в воронку наливают нагретую до 50 °C воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду. Личинки из кала в связи с термотропностью активно выползают в теплую воду и скапливаются в нижней части воронки. Через 2–4 ч зажим открывают, жидкость выпускают в одну или две центрифужные пробирки. Цетрифугируют в течение 2–3 мин, после чего быстро сливают поверхностный слой, а осадок помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом.

Методы исследования других материалов на гельминты

Для диагностики энтеробиоза применяются специальные методы взятия материала: соскоб шпателем и снятие яиц липкой полиэтиленовой лентой. Применение этих методов основано на биологической особенности самок остриц откладывать яйца на перианальные складки кожи при выползании ночью из кишечника. В кале яйца, как правило, не обнаруживаются. Материал для исследования получают утром до дефекации или вечером, после 1,5 ч пребывания в постели.

Метод снятия яиц липкой лентой. Для этого берут кусок липкой ленты шириной около 2 см и длиной около 10 см. Прикладывают липким слоем середину ленты к перианальным складкам кожи, затем приклеивают ее на предметное стекло. В лаборатории ленту отклеивают, вносят под нее на большом протяжении 1–2 капли вазелинового масла и просматривают под микроскопом.

Метод соскоба шпателем. Широко применяется метод перианального соскоба деревянным шпателем. Шпатель (или плоско заточенную спичку) смачивают 50 %-ным раствором глицерина.

Осторожно производят соскабливание с поверхности складок в окружности ануса и нижнего отдела прямой кишки. Затем материал тщательно соскабливают со спички краем покровного стекла, помещают его на предметное стекло в каплю 50 %-ного раствора глицерина. Накрывают тем же покровным стеклом и микроскопируют. Шпатель после однократного пользования сжигают. Соскоб с перианальных складок производят троекратно.

Количественные методы исследования

Количественные методы используют для суждения об интенсивности инвазии путем определения числа яиц в 1 мл фекалий; применяют при оценке эффективности противоглистных препаратов и других методов лечения, а также результатов массовых противоглистных мероприятий. Число яиц подсчитывают до и после проведения соответствующих мероприятий.

Количественные методы применяются при тех гельминтозах, возбудители которых откладывают яйца в кишечнике более или менее равномерно (аскаридозе, трихоцефалезе, анкилостомидозе, трематодозе).

При цестодозах эти методы не используются, так как яйца не откладываются, а выделяются лишь при распаде или разрыве зрелых члеников. Количественные методы не применяются при энтеробиозе, так как острицы откладывают яйца в перианальной области.

Наиболее распространенным из количественных методов является метод Стола. В мерный цилиндр или специальную колбочку наливают децинормальный раствор едкого натра до метки 56 мл, затем прибавляют испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет отметки 60 мл (приблизительно 4 г фекалий). Смесь тщательно взбалтывают со стеклянными бусами, закрыв сосуд пробкой. Тотчас после взбалтывания набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси, которая содержит 0,005 мл кала. Содержимое пипетки переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (сосчитывают яйца во всем препарате).

Чтобы подсчитать количество яиц в 1 мл (1 г) фекалий, нужно число яиц умножить на 200. Например, если в 0,075 мл смеси, т. е. в 0,005 мл испражнений, обнаружено 5 яиц, то в 1 мл фекалий будет 1000 яиц.

Консервирование

Консервирование кала при исследовании на яйца гельминтов проводят с применением жидкости Шеляпиной (водный раствор формалина и глицерина), жидкости Красильникова (1 %-ный раствор стирального порошка «Лотос»), 3 %-ного раствора хлористоводородистой кислоты.

Анализаторы кала

Анализаторы скрытой крови в кале иммунохимические. Полуавтоматические, автоматические. Применяются для качественного или количественного определения скрытой крови в кале. Принцип работы основан на применении иммунологического метода определения или измерения гемоглобина в клиническом образце кала.

Глава 9

Исследование выделений половых органов

Исследование выделений половых органов – распространенный анализ, без которого редко обходятся женщины, посещающие гинеколога, а мужчины – урологический кабинет. Материалами для исследований служат выделения из уретры, влагалища, шейки матки, простатический сок, эякулят. Цель исследований – выявление патологических элементов, вызывающих то или иное заболевание или являющихся его проявлением. Как и при всяком лабораторном исследовании, оцениваются внешний вид выделений, микроскопическая картина, а при необходимости проводится и бактериологический анализ.

Исследование эякулята

Эякулят (сперма, семенная жидкость) имеет вязкую консистенцию, белесоватый цвет, запах цветов каштана. Нормальный объем – 2–6 мл, реакция – слабощелочная. В семенной жидкости присутствуют сперматозоиды, единичные лейкоциты и эритроциты. Сперматозоиды, образующиеся в яичках, составляют около 5 % объема; примерно 60 % объема спермы продуцируется семенными пузырьками, около 20 % – простатой, 10–15 % – придатками.

Нормальное количество сперматозоидов – 100–150 млн/мл, активные сперматозоиды – более 60 %, малоподвижные – 10–20 %, неподвижные – до 10 %, живые сперматозоиды – 90–95 %.

Отсутствие сперматозоидов как нормальное явление отмечается только в старости, у молодых – это признак патологии.

Главная цель исследования эякулята – выявление причин бесплодия у мужчин. Наличие неподвижных сперматозоидов или их отсутствие в сперме наблюдаются при воспалении яичек, двустороннем крипторхизме, водянке яичка, расширении вен семенного канатика. Нарушения сперматогенеза (образования сперматозоидов) могут возникать в результате перенесенной гонореи, туберкулеза. Наиболее же частая причина отсутствия сперматозоидов (аспермия) – перенесенный двусторонний эпидидимит (воспаление придатков яичка).

Полное отсутствие самого эякулята может быть следствием врожденных или приобретенных изменений проходимости семявыбрасывающих протоков.

Присутствие в сперме крови или кровяных пигментов указывает на воспалительный процесс в простате или семенных пузырьках. Наличие гноя также является показателем воспаления в мочеполовых путях.

Бактериологическое исследование эякулята проводится в случаях подозрения на туберкулезное или гонорейное поражение яичка, его придатков, семенных пузырьков и простаты.

В семенной жидкости исследуют в основном свойства сперматозоидов, обращая внимание на их количество, подвижность и форму головки.

Количество в норме до 100–150 млн в 1 мл. Как правило, их бывает очень много в каждом поле зрения. Для более точной оценки можно считать в камере. Подвижность в нормальной семенной жидкости очень активная и сохраняется до 24 ч при комнатной температуре. В патологических случаях могут быть малоподвижные и неподвижные (мертвые) сперматозоиды, иногда одновременно подвижные и неподвижные. В этих случаях имеет значение подсчет процента тех и других форм. Подвижность может быть плохо заметна в вязкой жидкости, поэтому надо смотреть в разных полях зрения, в более разжиженной части препарата. Форма головки в норме грушевидная. В патологических случаях может быть прямоугольной, овальной, круглой, раздвоенной, иногда раздвоение средней части и хвоста. Изменение морфологии головки сперматозоида иногда лучше выявляется в окрашенном препарате.

Необходимые реактивы

1. 1 %-ный раствор хлорамина.

2. Спирт.

3. Краска – карболового фуксина Циля – 2 части, насыщенного спиртового раствора эозина – 1 часть, спирта – 1 часть.

4. 1 %-ный водный раствор метиленового синего.

Ход окраски

Препарат высушивают, фиксируют над пламенем.

На несколько секунд наливают 1 %-ный раствор хлорамина (для удаления слизи) и промывают водой, затем спиртом. Красят 2–3 мин краской (фуксин-эозин). Промывают водой, докрашивают метиленовым синим несколько секунд и снова промывают водой.

Анализатор спермы/спермограммы. Полуавтоматический или автоматический. Применяется для качественного или количественного анализа образца спермы, позволяет определить объем, концентрацию сперматозоидов, подвижность, морфологические характеристики.

Исследование секрета предстательной железы

Предстательная железа является непарным органом мужской половой системы. Она участвует в зарождении и развитии мужских половых клеток, обеспечивает их транспорт по семявыводящим путям; ее секрет обеспечивает подвижность сперматозоидов. Простатический секрет для исследований получают путем массажа предстательной железы. В норме он имеет белесоватый цвет, мутный. Под микроскопом в нем находят лецитиновые зерна, сперматозоиды, отдельные амилоидные тельца, изредка – единичные лейкоциты и эритроциты. Надежным показателем секреторной способности предстательной железы является присутствие в сперме цинка и лимонной кислоты, содержание которых коррелирует с активностью кислой фосфатазы. Уровень фруктозы в сперме характеризует функции семенных пузырьков.

Увеличение в простатическом секрете лейкоцитов и уменьшение лецитиновых зерен наблюдаются при простатитах и воспалении семенных пузырьков. При этом исследованию подвергаются не только простатический секрет, но и моча, в которой при остром простатите выявляются гнойные нити, а в крови – лейкоцитоз со сдвигом формулы влево.

Взятие материала

Секрет берут после энергичного массажа предстательной железы. В зависимости от количества его собирают на обезжиренное предметное стекло или в пробирку. Независимо от того, получен материал или нет, необходимо исследовать первую порцию мочи, выделенную после массажа, так как основная масса секрета затекает в мочевой пузырь и моча может содержать большое количество элементов простатического сока. Производят общий анализ сока и исследование на гонококки.

Нормальный секрет простаты густой, вязкой консистенции, беловатого цвета, слабощелочной реакции (рН 7,7–8,5), с характерным запахом. Нормальное количество жидкости колеблется в пределах от 1–2 капель до 3–4 мл.

Приготовление препарата

Каплю жидкости помещают на предметное стекло и покрывают покровным. Мочу с целью исследования на элементы простаты центрифугируют, препараты готовят из осадка. Исследуют нативный препарат, в некоторых случаях – препарат, окрашенный по Романовскому. Исследование препарата производят с малым и большим увеличением.

Микроскопическое исследование

Лейкоциты в нормальном секрете единичные 0–10 или 2000 при подсчете в камере. Количество их увеличивается при воспалительных процессах.

Эритроциты в нормальном секрете единичные (при энергичном массаже предстательной железы). Увеличенное количество наблюдается при воспалительных процессах.

Эпителиальные клетки. Выводные протоки предстательной железы выстланы цилиндрическим и переходным эпителием. Цилиндрический эпителий в большом количестве (часто в состоянии белкового и жирового перерождения) встречается вначале воспалительных процессов и при опухолях.

Макрофаги встречаются при хронических воспалительных процессах и при застое секрета.

Гигантские клетки типа «инородных тел» могут быть в тех же случаях, что и макрофаги.

Амилоидные конкременты (тельца) представляют собой сгущенный секрет железы, имеют овальную форму и слоистое строение. В норме не встречаются. Наличие их указывает на застой секрета в железе, что может быть при воспалительных процессах, аденомах, а также у лиц пожилого возраста, при гипертрофии железы.

Лецитиновые зерна – мелкие, блестящие, сильно преломляющие свет образования. Они являются продуктами секреции эпителия предстательной железы, придают секрету молочный вид, относятся к фосфатам. Нормальный секрет богат ими. Уменьшение их количества наблюдается при злокачественных опухолях простаты.

Тельца Труссо – Лалемана – разнообразной формы образования желтоватого цвета, несколько напоминающие восковидные цилиндры (происхождение и значение их не выяснены).

Кристаллы Беттхера. Напоминают по форме кристаллы Шарко – Лейдена. Окрашиваются в синий цвет при добавлении раствора Люголя. Природа их не ясна. Они появляются при простатитах.

Клетки злокачественных опухолей. Морфологически клетки рака простаты не отличаются от клеток рака другой локализации. Те же признаки атипизма, которыми пользуются для распознавания опухолевых клеток в других секретах, полностью применимы и при этом исследовании. Клетки чаще встречаются в виде комплексов с фестончатыми краями, со стертыми границами между клетками. Для обнаружения их просматривают нативные препараты, сочетая это исследование с окраской препаратов по Романовскому или Папенгейму.

Ретенционный синдром наблюдается при аденоме железы и выражается в обилии макрофагов, многоядерных клеток типа «инородных тел» и амилоидных телец.

Исследование выделений из влагалища и шейки матки

Общеклиническое обследование отделяемого из влагалища производится для оценки микрофлоры, выявления воспалительного процесса, атипичных клеток, а также оценки выработки женских половых гормонов.

Количество влагалищной жидкости в норме составляет 0,76–4,5 мл в сутки. Продукция ее возрастает при половом возбуждении, в результате аллергических реакций и дисгормональных расстройств.

Влагалищная жидкость содержит ионы калия, натрия, магния, хлориды, белок, иммуноглобулины, ферменты (АлАТ, АсАТ, ЛДГ, ЩФ и др.), микроэлементы и другие биологически активные вещества (табл. 44).

Влагалищное содержимое включает самые различные микроорганизмы, из которых наиболее часто встречаются лактобактерии и стафилококки.

Важнейшим фактором стабильности микроэкосистемы влагалища является физиологическое значение рН – 3,8–4,2. Увеличение рН выше 4,5 создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности нормальной микрофлоры, сказывается на течении беременности и т. д. У здоровых женщин влагалищный секрет содержит влагалищные палочки (палочки Деферлейна) и плоский эпителий.

Таблица 44

Видовой состав нормальной микрофлоры влагалища

В зависимости от характера влагалищного секрета различают 4 степени чистоты влагалища.

I степень характеризует здоровое состояние половых органов. В секрете – влагалищные палочки и единичные клетки плоского эпителия; реакция секрета кислая (рН – 4–4,5).

II степень отмечается при отсутствии каких-либо общих и местных заболеваний; секрет содержит влагалищную палочку, но имеются и другие микробы (молочнокислая, кишечная палочки), единичные лейкоциты, много эпителиальных клеток; реакция – кислая (рН – 5–5,5).

III степень отмечается при патологическом состоянии полового аппарата; влагалищных палочек мало, много лейкоцитов и разнообразной флоры (стрептококки, стафилококки, грибы и др.), реакция слабокислая или основная (рН – 6–7,2).

IV степень наблюдается при заболеваниях самой влагалищной стенки; в секрете влагалищных палочек нет, очень много патогенных микробов, встречаются трихомонады, много лейкоцитов, эпителиальных клеток мало, реакция основная (рН выше 7,2).

Патологические выделения из половых органов женщин называются белями. Причинами их появления могут быть инфекции, паразитарные и глистные инвазии, микозы, новообразования, механические и термические воздействия и др.

Воспаление влагалища (вагинит, кольпит) может возникнуть в результате трихомонадной инвазии, септической инфекции, заражения гонореей, кандидомикозом (грибковый кольпит) и по другим причинам. Характер выделений – гнойные, слизистые, белые бели, их микроскопическое и бактериологическое исследования помогают установить причину заболевания и назначить соответствующее лечение. С этой же целью исследуется соскоб с поверхности влагалища или шейки матки.

Возможной находкой при исследовании выделений из влагалища может быть примесь крови или скопление больших атипичных клеток, встречающихся при распаде злокачественной опухоли влагалища.

К числу инфекционных заболеваний женских половых органов относятся туберкулезное поражение матки, маточных труб, яичников, влагалища.

Диагностика туберкулеза гениталий достаточно сложна в связи с тем, что это заболевание редко проявляется в форме острого воспаления. Лабораторная диагностика туберкулеза гениталий базируется на исследовании белей, гистологических препаратов (мазков, соскобов); выявлении туберкулезной палочки, бактериологических исследованиях.

При исследовании клеточного состава влагалищных мазков можно определить и характер созревания клеток под влиянием циклически меняющейся секреции половых гормонов. При низкой эстрогенной стимуляции в мазках выявляются парабазальные клетки, по мере возрастания эстрогенной стимуляции в мазке увеличивается содержание промежуточных клеток, а при высокой стимуляции – и поверхностных. Количественная оценка этих изменений производится с помощью индекса созревания, кариопикнотического и эозинофильного индексов.

В норме кариопикнотический индекс равен: в фолликулярную фазу – 1–30 %, в середине цикла —50–80 %, в лютеиновую фазу – более 80 %; эозинофильный индекс равен в фолликулярную фазу – 1–30 %, в середине цикла – 20–70 %, в лютеиновую фазу – более 70 %.

Необходимо подчеркнуть, что воспалительные заболевания половых органов – одна из частых причин женского бесплодия.

Исследование с целью определения функционального состояния яичников

Взятие материала производят из заднебокового свода влагалища. Материалом из заднего свода влагалища пользоваться не следует, так как в нем скапливаются ранее отторгнутые эпителиальные клетки. Содержимое насасывают стеклянной пипеткой с резиновым баллончиком. При необходимости получения большего количества материала содержимое можно брать гинекологической ложечкой. Материал, взятый ватным тампоном, для исследования не годится.

Содержимое равномерно распределяют на предметном стекле. Мазки высушивают на воздухе и окрашивают.

Окраска метиленовым синим

Необходимый реактив

1%-ный водный раствор метиленового синего.

Ход окраски

На высушенный препарат наносят 1–2 капли метиленового синего, покрывают покровным стеклом. Окрашивают в течение 1–2 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой следующим образом: у одного края покровного стекла наносят 1–2 капли дистиллированной воды, к противоположному краю прикладывают полоску фильтровальной бумаги. Таким образом препарат промывают несколько раз до получения бледно-синей окраски, затем высушивают.

Окраска фуксином

Необходимый реактив

3 г кислого фуксина растворяют в 100 мл 95 %-ного спирта. К 12 мл этого раствора прибавляют 100 мл дистиллированной воды.

Ход окраски

На высушенный препарат наливают фуксин на 1 мин, затем смывают водой, высушивают. Таким же способом можно окрашивать мазки и метиленовым синим.

Окраска гематоксилин-эозином

Необходимые реактивы

1. Смесь Никифорова.

2. Водный раствор гематоксилина (гематоксилин – 1 г, калийные квасцы – 50 г, йодистый натрий или калий – 0,2 г, дистиллированная вода – 1000 мл; раствор выдерживают на свету в течение 14 дней, после чего он готов к употреблению).

3. 1 %-ный водный раствор эозина.

Ход окраски

Высушенные мазки фиксируют в смеси Никифорова (10–15 мин). Окрашивают водным раствором гематоксилина в течение 7–10 мин до слабо-фиолетового цвета.

Промывают проточной водой. Окрашивают 1 %-ным водным раствором эозина в течение 30 с. Промывают проточной водой и высушивают.

Окраска по Романовскому

Необходимый реактив

В продаже имеется готовый раствор краски Романовского следующего состава: азур II – 3 г; эозин водорастворимый желтый – 0,8 г; метиловый спирт – 250 мл; глицерин – 250 мл.

В продаже имеется также сухая краска Романовского, из которой готовят раствор краски следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта (последний хуже). Раствор оставляют на 3–5 суток, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3–5 суток, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей, без взбалтывания.

Вновь полученный или приготовленный раствор краски Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков в течение 25–40 мин различно разведенной краской (1–2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают нужное количество капель краски на 1 мл и время окрашивания.

Ход окраски

Фиксированные мазки укладывают на мостик для окраски, представляющий собой стеклянные палочки, уложенные на 2 противоположных края кювета. Затем мазки заливают краской в разведении 1–2 капли на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливают на мазок как можно более высоким слоем, и окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин. Если температура в помещении низкая или требуется быстрее окрасить мазки, то разведенную краску можно подогревать до 60–70 °C (до кипения доводить нельзя).

После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания. Разведенной краской можно пользоваться только в течение одного дня.

Окраска по Папаниколау

Необходимые реактивы

1. Смесь Никифорова.

2. Спирты 95, 90, 80, 70 и 50°.

3. Гематоксилин Гарриса.

4. 0,25 %-ный раствор соляной кислоты.

5. Краска оранжевая Г.

6. Краска (ЕА-36).

7. Абсолютный спирт.

8. Ксилол.

9. Канадский бальзам.

Приготовление гематоксилина Гарриса

1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.

Приготовление раствора краски оранжевая Г

К 100 мл 0,5 %-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовление составной краски (ЕА-36)

45 мл 0,5 %-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5 %-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5 %-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо- и спирторастворимого), 0,2 г фосфорно-вольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.

Ход окраски

Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80 %-, 70 %– и 50 %-ные спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25 %-ный раствор соляной кислоты.

Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95 %-ные спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95 %-ного спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95 %-ного спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и наконец через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.

Из приведенных выше окрасок самые простые – окраска фуксином и метиленовым синим, но эти окраски не дают полного представления обо всей цитологической картине. Метод Папаниколау сложен, требует много дефицитных и дорогостоящих реактивов, поэтому реже используется в практической работе лабораторий. Окраска по Романовскому вполне пригодна для цитологического исследования влагалищных мазков и выгодно отличается тем, что может применяться в любой лаборатории.

Клеточный состав влагалищного мазка

В мазках из влагалища различают 4 вида клеток плоского эпителия.

1. Клетки поверхностные большие (35–55 мк), полигональной формы, ядро маленькое (6 мк), пикнотичное. Клетки чаще располагаются раздельно. Цитоплазма клеток очень слабо окрашивается, ядро темное. В большом количестве встречаются главным образом с 9 по 14-й день менструального цикла.

2. Промежуточные клетки большие (25–30 мк), форма неправильная, ядро более крупное, круглое или овальное. Клетки часто располагаются пластами. Цитоплазма окрашивается интенсивнее, чем у поверхностных клеток, ядро более светлое. Встречаются во всех фазах менструально-овариального цикла.

3. Парабазальные клетки – меньших размеров, круглой или овальной формы, с большим круглым ядром. Диаметр ядра немного меньше, чем ширина ободка цитоплазмы. Окрашиваются чаще в базофильные тона. Иногда морфологические черты парабазальных клеток неясно отличимы от клеток базальных.

4. Клетки базальные (или атрофические) – округлой формы, несколько меньших размеров, чем парабазальные, ядро круглое, большое, занимает большую часть клетки. Цитоплазма окрашивается в интенсивные базофильные тона (некоторые авторы называют клетки с такой морфологией парабазально-базальными). Клетки встречаются во время менопаузы и единичные во время менструаций и после родов.

Слизистая оболочка влагалища в норме выстлана многослойным плоским эпителием. В зависимости от соотношения клеток разных слоев эпителия в мазках различают 4 типа клеточных реакций, которые позволяют судить о функциональном состоянии яичников.

1. Много базальных клеток и большое количество лейкоцитов. Этот тип мазка указывает на резкую недостаточность гормонов яичников (эстрогенов).

2. В мазке значительное количество базальных клеток, довольно много промежуточных, значительное количество лейкоцитов. Соответствует умеренно выраженной недостаточности гормонов.

3. В мазке преобладают промежуточные клетки, иногда нечетко контурированные, могут лежать пластами. Базальных клеток немного. Такая картина мазка указывает на легкую степень недостаточности эстрогенов.

4. Мазок состоит из поверхностных клеток. Такой тип мазка соответствует достаточной секреции эстрогенов.

Исследование влагалищного мазка нельзя производить при наличии воспалительных процессов (выделений), после влагалищных манипуляций, при внутривлагалищном применении медикаментов. После полового сношения мазки берут не раньше чем через 24 ч.

Тест влагалищного мазка применяется для установления показаний и контроля над результатами гормонотерапии. У женщин с нормальным овариально-менструальным циклом картина влагалищных мазков в зависимости от фазы цикла может быть третьей или четвертой (фаза пролиферации – третий тип реакции, в период овуляции и в ближайшие дни после нее – третий или четвертый).

Для решения вопроса о функциональном состоянии яичников применяют ряд цитохимических (определение гликогена и ферментов в клетках) и биохимических методов (определение ферментов во влагалищном содержимом, кислотности, молочной кислоты и др.).

Для исследования влагалищных мазков также используется люминесцентная и фазовоконтрастная микроскопия, данные которой дополняют трактовку функционального состояния яичников. Для более правильной оценки влагалищного мазка, кроме вида клеток и их количества, учитывают так называемые индексы; наибольшее значение они имеют для суждения о нарушении функции яичников. К таким индексам относятся:

1) кариопикнотический индекс – отношение числа поверхностных клеток с пикнотическими ядрами к общему числу клеток мазка;

2) атрофический индекс (индекс глубоких клеток) – отношение числа базальных и парабазальных клеток к общему числу клеток мазка;

3) индекс промежуточных клеток – отношение числа промежуточных клеток к общему числу клеток мазка;

4) эозинофильный индекс – отношение числа ацидофильных поверхностных клеток к общему числу базофильных поверхностных клеток.

При изучении цитологической картины влагалищного мазка можно использовать упрощенную схему Видаля (табл. 45).

Таблица 45

Оценка кольпоцитограммы

В настоящее время цитологический метод оценки функции яичников заменяется определением концентрации половых гормонов в крови.

Наибольшее значение имеет кариопикнотический индекс, показатели которого наиболее точно совпадают с уровнем выделения с мочой половых гормонов (табл. 46).

Таблица 46

Показатели кариопикнотического индекса в течение овуляторного менструального цикла

Исследование на клетки новообразований

Материал, взятый из влагалища путем отсоса пипеткой с пораженного участка (эрозии, язвы), тампоном или путем отпечатка, может служить для обнаружения клеток злокачественных опухолей. Из полученного отделяемого приготавливают тонкие препараты и красят по Романовскому или другими методами, принятыми в цитологии. Если количество полученного материала достаточное, просматривают предварительно нативные препараты.

Исследование влагалищного содержимого на степень чистоты

Мазки для исследования на влагалищную палочку (палочку Деферлейна) готовят так же, как для цитологического исследования. Окрашивают по Граму.

Окраска по Граму

Необходимые реактивы

1. Карболовый раствор генцианвиолета (1 г генцианвиолета растворяют в 10 мл 96 %-ного спирта, раствор выливают в 100 мл 1–2 %-ной карболовой кислоты, взбалтывают).

2. Раствор Люголя (1 г йода, 2 г йодистого калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодистый калий растворяют сначала в 5–8 мл воды, а затем приливают остальную воду).

3. 96 %-ный спирт или сырец.

4. 40 %-ный раствор карболового фуксина (10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды).

Ход окраски

На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианвиолета. Окрашивают в течение 1,5–2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10 %-ным раствором карболового фуксина в течение 10–15 с. Снова промывают водой, высушивают препарат на воздухе.

По своей морфологии палочка Деферлейна грубая, толстая, грамположительная. Различают 4 степени чистоты влагалища (см. выше).

Основным условием для существования влагалищной палочки является высокая степень кислотности (рН 4,0–4,7). Во влагалищном содержимом и в эпителии содержится в большом количестве гликоген.

Существует тесная связь между рН влагалища и количеством гликогена. Кокковая флора соответствует низкому содержанию гликогена и низкой степени кислотности влагалищного содержимого. Степень чистоты может служить относительным тестом функционального состояния влагалища, особенно при аномалиях менструального цикла.

Исследование на трихомонады

Приготовление нативного препарата

Каплю отделяемого из влагалища, взятого пипеткой или петлей, наносят на предметное стекло, покрывают покровным и тотчас микроскопируют. В нативном препарате обнаруживают подвижные формы, которые распознаются по характерному движению ундулирующей мембраны. После потери движения микроорганизм в нативном препарате распознать нельзя.

Окрашенные препараты

Каплю отделяемого распределяют на стекле тонким слоем. Мазки высушивают. Для окрашивания предложено много различных методов: метиленовый синий, окраска по Граму, метод Романовского и др.

Из перечисленных методов наиболее удобным является метод Романовского. При этой окраске трихомонады распознаются легко (ядро фиолетовое, протоплазма вакуолизированная голубая, содержащая бактерии). При этом хорошо виден окружающий их клеточный фон (нейтрофилы, эозинофилы и эпителиальные клетки). В мазках, окрашенных метиленовым синим, трихомонады легко спутать с измененными клетками.

Бактериоскопическое исследование

Отделяемое влагалища исследуют в основном для обнаружения гонококков. В некоторых случаях можно обнаружить и другие патогенные микроорганизмы:

1) палочка дифтерии при дифтерии половых органов. Истинную природу обнаруженной палочки устанавливают только путем бактериологического исследования и проверкой на вирулентность. Дифтерия половых органов – очень редкое заболевание;

2) Bacillus crassus – возбудитель острой язвы вульвы Чапина – Люпшютца. В этом случае при бактериологическом исследовании мазков гнойного отделяемого, окрашенных по Граму, обнаруживают грамположительные палочки длиной от 7–8 до 40 мк, с обрезанными концами, располагающиеся иногда короткими цепочками, а иногда лежащие внутриклеточно. Поражение вульвы и влагалища может быть также грибковой природы (например, грибок молочницы).

Исследование околоплодных вод

Изливающиеся воды при разрыве плодного пузыря принимают иногда за подтекающую мочу. Правильность трактовки в таких случаях устанавливается микроскопическим исследованием.

Необходимые реактивы

1. Раствор Судана 3.

2. 1 %-ный водный раствор эозина.

Ход исследования

Собранную жидкость помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, из осадка готовят препараты и микроскопируют.

Элементы околоплодных вод: «чешуйки» плода, пушковые волосы (lanugo), капли жира.

Определение «чешуек»

Каплю осадка наносят на стекло и покрывают покровным стеклом. Тонким концом пипетки с баллоном впускают под покровное стекло каплю 1 %-ного водного раствора эозина, который равномерно прокрашивает препарат. Избыток краски отсасывают фильтровальной бумагой с противоположного края покровного стекла. Затем точно таким же путем препарат промывают водой. При микроскопии на розовом фоне обнаруживают неокрашенные, хорошо контурированные безъядерные клетки кожи плода («чешуйки»), которые часто лежат скоплениями. «Чешуйки» не воспринимают окраску эозином, так как они покрыты первородной смазкой (жиром). Клетки влагалищного эпителия красятся в ярко-розовый цвет; ядра хорошо выражены.

Определение жира

К капле осадка прибавляют каплю раствора Судана 3, покрывают покровным стеклом. При микроскопии видны капли жира, окрашенные в оранжевый цвет. При определении жира в околоплодных водах требуется тщательно обработанная посуда (обезжиренная).

Обнаружение пушковых волос (lanugo) производят в нативном препарате. Определение «чешуек» дает 99 % положительных находок при исследовании раннего отхождения околоплодных вод, обнаружение капель жира – в 100 %, lanugo выявляются редко.

Исследование на гонококки

Взятие материала

У женщин отделяемое берут одновременно из уретры, влагалища и шейки матки. Выделения из бартолиниевых желез исследуют только по клиническим показаниям. Иногда берут выделения из прямой кишки: спустя 3–4 ч после опорожнения кишечника делают смыв физиологическим раствором, который центрифугируют, после чего исследуют осадок.

У мужчин берут отделяемое из уретры (утром до первого мочеиспускания), секрет простаты, полученный после массажа железы, или мочу, выделенную после массажа. Кроме того, исследуют мочу, собранную утром после длительного воздержания от мочеиспускания. У девочек отделяемое берут из уретры, влагалища и прямой кишки (промывные воды).

Из полученного материала готовят тонкие мазки. Если материалом для исследования служит моча, то препараты готовят из осадка после центрифугирования.

Окраска препаратов

Высушенные и фиксированные над пламенем препараты (делают, как правило, не меньше двух препаратов) окрашивают по Граму и метиленовым синим.

Окраска метиленовым синим

Фиксированные препараты заливают 0,5–1 %-ным водным раствором метиленового синего на 1 мин; промывают водой и высушивают.

Окраска по Граму

Окраска по Граму требует особой тщательности, так как при недостаточном обесцвечивании гонококки могут сохранить окраску Грама, при слишком длительном обесцвечивании окраску могут терять другие грамположительные кокки (стафилококки, стрептококки). Это может привести к ошибочным результатам. Для цитологического исследования препараты окрашивают по Романовскому (при этом нередко обнаруживают эозинофилы, особенно в период выздоровления).

При исследовании под микроскопом гонококки имеют форму кокков, парно расположенных. Поверхности, обращенные друг к другу, несколько уплощены. Гонококки часто располагаются кучками, в острых случаях заболевания находятся главным образом в лейкоцитах. При окраске по Граму обесцвечиваются и окрашиваются в розовый цвет (грамотрицательно).

Бактериоскопический метод, хотя и является основным для выявления гонококков, имеет ряд недостатков: сравнительно редкое обнаружение гонококков и трудность их дифференцирования от другой кокковой флоры, особенно в случаях, когда проводилось лечение. Однократный отрицательный результат не доказателен, поэтому требуются повторные исследования.

При исследовании мазков от больных гонореей в основном наблюдается бактериоскопическая картина 3 видов.

1. Лейкоциты покрывают все поле зрения; часто гонококки расположены внутриклеточно. Имеются также гонококки, лежащие свободно. Другие микроорганизмы при этом не обнаруживаются.

2. Клеточная картина та же самая, но гонококков нет. Посторонняя флора отсутствует. Такая картина часто наблюдается при хронической гонорее.

3. Небольшое количество дегенерированных лейкоцитов и обильная посторонняя флора, появление которой говорит об улучшении течения процесса.

Исследование отделяемого молочных желез

Исследование грудного молока

Отличие женского молока от коровьего (проба Умикова)

Принцип метода

При нагревании женского молока до 60 °C аммиаком получается фиолетовое окрашивание.

Необходимый реактив

10 %-ный раствор аммиака.

Ход исследования

Молоко из молочной железы получают путем сцеживания руками или аппаратом в любое время между кормлениями ребенка, однако лучше сцедить небольшое количество молока до кормления и после него, а затем обе порции смешать. Лучшее время для взятия молока – 9–10 ч.

В пробирку наливают 2 мл молока, добавляют 2 мл раствора аммиака. Затем пробирку встряхивают. Через несколько минут исследуемое молоко окрашивается в фиолетовый цвет.

Окраска исследуемого молока в фиолетовый цвет указывает на принадлежность его женщине. Реакция особенно хорошо выражена в позднем лактационном периоде.

Определение удельного веса

Исследуемое молоко наливают в стеклянный цилиндр и погружают в него ареометр. Цилиндр в строго вертикальном положении держат против света. Мениск молока указывает на шкале ареометра цифру удельного веса. Он колеблется между 1,026–1,036 при температуре 15 °C. Если температура воздуха выше или ниже, на каждый градус добавляют (если она выше 15 °C) или убавляют (если она ниже 15 °C) к указанию ареометра 0,001. Молоко для исследования удельного веса лучше всего получать в течение второго часа после кормления ребенка.

Количественное определение жиров молока (метод Бабкова)

Принцип метода

Концентрированная серная кислота приводит к осаждению жира.

Необходимые реактивы

1. Серная кислота удельного веса 1,83–1,84.

2. Кислотно-алкогольная смесь (равные части амилового спирта и концентрированной соляной кислоты).

Оборудование: бутирометр.

Ход исследования

Исследуемое молоко узкой пипеткой вливают в бутирометр до метки «5». Прибавляют серную кислоту до горлышка бутирометра. Затем вращательными движениями содержимое бутирометра доводят до гомогенной смеси. После этого горлышко бутирометра наполняют кислотно-алкогольной смесью и центрифугируют в течение 1–2 мин. Отделившийся жир отсчитывают по шкале бутирометра (в процентах). Если уровень жира не доходит до метки «0», прибавляют к смеси горячую воду и вновь центрифугируют. Если процент жира выше 5, содержимое бутирометра разводят равным объемом воды и вновь центрифугируют, а полученный при этом процент жира умножают на 2.

Среднее содержание жира в женском молоке составляет 3,7 %.

Микроскопическое исследование молока

На очищенное и обезжиренное предметное стекло наносят пипеткой одну каплю исследуемого молока и покрывают покровным стеклом. Препарат рассматривают в микроскопе при опущенном конденсоре при среднем увеличении. Видны капельки жира, большее или меньшее число лейкоцитов, бактерии.

У здоровой женщины в молоке видны множество жировых капель, единичные лейкоциты, иногда бактерии. При воспалительных процессах (мастит) в препарате молока имеется большое число лейкоцитов (нейтрофилы) и микроорганизмов, главным образом стафилококков, в меньшей степени стрептококков; изредка встречаются и другие микробные ассоциации.

Исследование выделений из соска вне лактационного периода

Выделения из соска могут быть при заболеваниях молочной железы различной этиологии (воспалительные процессы, туберкулез, актиномикоз, мастопатии, новообразования и др.). Из полученного материала готовят нативные препараты (каплю отделяемого помещают на предметное стекло и покрывают покровным) и тонкие мазки для цитологического, а при необходимости и бактериоскопического исследования.

Цитологическое исследование для решения вопроса о новообразовании требует большого опыта и навыка исследователя.

При бактериоскопическом исследовании мазков можно обнаружить кокковую и палочковую флору. При подозрении на туберкулез препараты красят по Цилю – Нильсену.

Глава 10

Исследование мокроты

Сбор и обезвреживание материала

Мокротой называется патологический секрет, выделяемый с кашлем из легких и дыхательных путей. Больным при организации сбора мокроты необходимо разъяснять, что для исследования нужно собирать мокроту, выделенную при откашливании, а не слюну и слизь из носоглотки.

Для сбора мокроты используют чистую, сухую, широкогорлую склянку. Существуют индивидуальные плевательницы из темного стекла, с завинчивающимися крышками и градуировкой на боковой поверхности.

Сбор мокроты для общего клинического анализа осуществляется утром до приема пищи, примесь которой мешает исследованию. Собирают мокроту после тщательного полоскания рта и горла, чистки зубов.

Перед забором полость рта можно тщательно прополоскать раствором пищевой соды, фурацилина (1: 5000), 0,01 %-ным раствором калия перманганата. После этого больной, откашливаясь, собирает в посуду 3–5 мл мокроты. Анализ мокроты производят в день ее выделения.

Мокроту необходимо направить в лабораторию в течение 2 ч с момента забора, так как длительное стояние ведет к размножению флоры и аутолизу клеточных элементов. При необходимости мокроту сохраняют в холодильнике.

Сбор мокроты для выявления микобактерий туберкулеза осуществляется в течение суток, так как в лабораторию необходимо представить достаточное ее количество – не менее 12–15 мл.

Для сбора мокроты на чувствительность к антибиотикам используют стерильные чашки Петри.

В ряде случаев больной не может собрать мокроту на исследование в связи с ее малым количеством или трудностью отделения. Тогда накануне сбора мокроты больному дают отхаркивающие или муколитические средства (термопсис, йодистый калий).

Мокрота чаще всего инфицирована, поэтому по окончании работы исследуемый материал, посуду, в которой он находился, предметные стекла следует обеззараживать. Обеззараживание производят физическими и химическими методами. К физическим методам относится кипячение в воде с добавлением соды в течение 1 ч, а также автоклавирование при температуре 120 °C в течение 30 мин.

Препаровальные иглы после употребления немедленно прокаливают на огне.

Для обеззараживания химическим методом используют активированные аммонийными соединениями растворы хлорамина и хлорной извести (50 г хлорамина и 50 г сульфата или хлорида аммония на 1 л дистиллированной воды). Заливают инфицированный материал двойным количеством дезинфицирующего раствора и оставляют на 4 ч. Можно использовать ДТСГК (двутретьосновную соль гипохлорида кальция), обладающую большой бактерицидной активностью. После обеззараживания посуду моют обычными средствами.

Мокроту с микобактериями туберкулеза дезинфицируют кипячением вместе с плевательницами или раздельно в 2 %-ном растворе гидрокарбоната натрия в течение 15–20 мин с момента закипания.

Для химической дезинфекции мокроту обрабатывают 5 %-ным раствором хлорамина в течение 6 ч (так как лекарственно-устойчивые микобактерии туберкулеза могут обладать повышенной устойчивостью к дезинфицирующим препаратам, целесообразно увеличить экспозицию в этих случаях до 12 ч), 2,5 %-ным активированным хлорамином в течение 2 ч.

Оба эти препарата применяют в соотношении: 1 часть мокроты – 2 части дезинфицирующего раствора. Для дезинфекции мокроты используют также хлорную известь в соотношении: 100 мл мокроты – 20 г сухой хлорной извести; после перемешивания дезинфекция продолжается 1 ч.

Физические свойства мокроты

Консистенция тесно связана с характером мокроты и может быть вязкой, густой, жидкой.

Вязкость зависит от содержания слизи и от количества форменных элементов (лейкоцитов, эпителия). Количественное измерение вязкости проводится с помощью специального капиллярного вискозиметра. Вязкая мокрота обнаруживается при муковисцидозе, бронхиальной астме. При хронических неспецифических заболеваниях легких выявлена зависимость между величиной вязкости мокроты и содержанием в ней мукополисахаридов, ДНК, нейтрофилов и других продуктов воспалительной реакции. Так, вязкость слизисто-гнойной и гнойной мокроты существенно выше, чем слизистой. Величина вязкости отражает степень обсемененности мокроты патогенными бактериями. Установлено, что повышение в мокроте уровня патогенных микробов, протеолитические ферменты которых активно расщепляют мукополисахариды, ведет к снижению вязкости. Величина вязкости расценивается как один из показателей активности легочного воспалительного процесса: при усилении бактериального воспаления наблюдается разжижение мокроты, в процессе успешной антибактериальной терапии вязкость мокроты повышается, а ее суточный объем уменьшается.

Количество мокроты может меняться в широких пределах от 10 до 100 мл. Суточное количество, как и величина отдельных порций, зависит, с одной стороны, от характера заболевания, с другой – от способности больного к отхаркиванию. Скудное количество мокроты выделяется при воспалении дыхательных путей (ларингите, трахеите, остром бронхите в начальной стадии, бронхиальной астме, бронхопневмонии). Обильное количество мокроты (от 0,5 до 2 л) выделяется обычно из полостей легочной ткани, бронхов (бронхоэктатическая болезнь, абсцесс легкого, прорыв эмпиемы) при кровенаполнении легких и пропотевании в бронхи большого количества плазмы крови (отек легких).

При отставании значительного количества гнойной мокроты можно обнаружить 2 слоя (гной и плазма) или 3 (гной, плазма и комочки слизи на поверхности). Двухслойная мокрота характерна для абсцесса легкого, трехслойная – для бронхоэктатической болезни, туберкулеза легких (при наличии каверн).

Цвет и прозрачность зависят от характера мокроты, так как преобладание одного из субстратов (слизи, гноя) придает мокроте соответствующий оттенок, а также от состава вдыхаемых частиц. Чаще мокрота бесцветная, изменение цвета мокроты возникает при различных заболеваниях. Слизистая мокрота стекловидная, прозрачная, слизисто-гнойная – стекловидная с желтым оттенком, гнойно-слизистая – желто-зеленоватая, гнойная – желто-зеленая, слизисто-кровянистая – стекловидная с розоватым или ржавым оттенком, слизисто-гнойно-кровянистая – стекловидная с желтыми комочками, прожилками красного цвета или ржавым оттенком; отделяемое при легочном кровотечении жидкое, прозрачно-желтое, с опалесценцией, пенистое и клейкое из-за присутствия белков плазмы. Отделяемое при легочном кровотечении жидкое, красного цвета, пенистое (за счет содержания пузырьков воздуха). При злокачественных новообразованиях (распаде опухоли) изредка может наблюдаться мокрота в виде «малинового желе».

Мокрота с инородными примесями имеет цвет этих примесей: белая у мукомолов, черная у шахтеров, синяя при вдыхании метиленового синего, ультрамариновой краски и т. д.

Некоторые лекарственные средства могут менять окраску мокроты, например, рифампицин окрашивает мокроту в красный цвет.

Запах. Обычно мокрота не имеет запаха. Он появляется при длительном стоянии, а также при задержке мокроты в бронхах или полостях в легких (обусловливается деятельностью анаэробов, вызывающих гнилостный распад белков до индола, скатола и сероводорода). Неприятный запах мокрота может иметь при хронических бронхитах с плохим дренированием бронхов, резкий неприятный запах – при бронхоэктатической болезни, абсцессе легкого, иногда туберкулезе, злокачественных новообразованиях с некрозом, зловонный (гнилостный) запах отмечается при гангрене легкого. Для вскрывшейся эхинококковой кисты характерен своеобразный фруктовый запах.

Реакция. Обычно мокрота имеет нейтральную или щелочную реакцию. Кислую реакцию приобретает разложившаяся мокрота.

Макроскопическое исследование мокроты

От выбора материала, из которого готовят препараты, во многом зависит успех исследования. Мокроту выливают на чашку Петри и, раздвигая препаровальными иглами, рассматривают на белом и черном фоне. При макроскопическом изучении обращают внимание на характер мокроты, ее количество, цвет, запах, консистенцию, слизистость, наличие различных включений.

Характер мокроты определяется ее составом.

Слизистая состоит из слизи – продукта слизистых желез дыхательных путей. Выделяется при острых бронхитах, катарах верхних дыхательных путей, разрешении приступа бронхиальной астмы.

Слизисто-гнойная представляет смесь слизи и гноя, причем слизь преобладает, а гной включен в виде комочков или прожилок. Наблюдается при хронических бронхитах, бронхопневмониях.

Гнойно-слизистая содержит гной и слизь с преобладанием гноя; слизь имеет вид тяжей. Появляется при хронических бронхитах, бронхоэктазах, абсцедирующей пневмонии и т. д.

Гнойная не имеет примеси слизи и появляется в случае открытого в бронх абсцесса легкого, при прорыве экземы плевры в полость бронха.

Слизисто-кровянистая состоит в основном из слизи с прожилками крови или кровяного пигмента. Отмечается при катарах верхних дыхательных путей, пневмониях, бронхогенном раке.

Слизисто-гнойно-кровянистая содержит слизь, кровь, гной, чаще равномерно перемешанные между собой. Появляется при бронхоэктазах, туберкулезе, актиномикозе легких, бронхогенном раке.

Кровавое отделяемое (кровохарканье) наблюдается при легочных кровотечениях (туберкулезе, ранении легкого, опухоли легкого и бронхов, актиномикозе).

Серозное отделяемое характерно для отека легких (левожелудочковая недостаточность, митральный стеноз, отравление боевыми отравляющими веществами), представляет собой пропотевшую в полость бронхов плазму крови.

Спирали Куршмана имеют вид беловатых закрученных нитей, резко отграниченных от остальных частей мокроты, имеют диагностическое значение при бронхиальной астме.

Фибринозные свертки представляют собой беловато-красноватые клубочки, которые при отмывании обнаруживают ветвистое строение. Длина свертков от нескольких миллиметров до 10–12 см. Определяются при фибринозном бронхите.

Пробки Дитриха (гнойные пробки) – это маленькие творожистые комочки белого или желтовато-серого цвета со зловонным запахом, состоящие из детрита, бактерий, кристаллов жирных кислот; встречаются при бронхоэктазах, гангрене легкого.

Рисовидные тельца (линзы Коха) – желтовато-зеленоватые плотные образования творожистой консистенции величиной с булавочную головку, состоящие из детрита, туберкулезных палочек и эластических волокон; обнаруживаются при кавернозном туберкулезе легких.

Дифтерические пленки из зева и носоглотки – сероватые обрывки, местами окрашенные кровью, состоящие из фибрина и некротизированных клеток.

Обрывки легочной ткани представляют собой некротизированные кусочки легкого различной величины, темно-серого цвета, содержащие эластические волокна и зернистый черный пигмент, иногда пронизанные соединительной тканью, кровеносными сосудами, лейкоцитами и эритроцитами; встречаются при абсцессе и гангрене легкого.

Друзы актиномицета имеют вид мелких желтоватых или сероватых зерен, покрыты гнойной массой, содержатся в скудном количестве.

Пузыри эхинококка встречаются в мокроте редко. Чаще при разрыве эхинококковой кисты обнаруживают обрывки хитиновой оболочки пузыря в виде серовато-белых пленчатых образований. Эти элементы употребляют для приготовления нативных и окрашенных препаратов.

Микроскопическое исследование

Микроскопическое исследование мокроты проводят в свежих неокрашенных и фиксированных окрашенных препаратах. При приготовлении препаратов необходим тщательный отбор материала. Прокаленной и остуженной лопаточкой или металлической петлей из мокроты выбирают поочередно все подозрительные зернышки, кровяные прожилки, комочки и приготавливают из них препараты, помещая на предметное стекло.

Нативный препарат

Нативный препарат готовят из выбранных элементов мокроты. Препаровальными иглами помещают комочек мокроты на середину предметного стекла и накрывают покровным стеклом.

Чистым концом препаровальной иглы слегка надавливают на покровное стекло, делая препарат более плоским, полупрозрачным. При этом следят, чтобы мокрота не выходила за края покровного стекла. Готовят не менее четырех нативных препаратов из различных участков мокроты.

Микроскопируют вначале под малым увеличением (обзорная микроскопия), а затем под большим увеличением.

Элементы мокроты, которые обнаруживаются в нативном препарате, можно разделить на 3 основные группы: клеточные, волокнистые и кристаллические образования.

Клеточные элементы

Плоский эпителий – это слущенный эпителий слизистой оболочки ротовой полости, носоглотки, надгортанника и голосовых связок, имеющий вид тонких клеток с небольшим пиктоническим пузырчатым ядром и гомогенной цитоплазмой. Одиночные клетки плоского эпителия встречаются всегда, в большом количестве – при примеси слюны или воспалительных явлениях в ротовой полости.

Цилиндрический эпителий – эпителий слизистой оболочки бронхов и трахеи. Имеет вид удлиненных клеток, один конец которых, обращенный в просвет бронха, расширен, другой заострен и сужен, содержит овальное ядро. Клетки снабжены венчиком из ресничек (обычно реснички видны только в очень свежей мокроте). Цилиндрический эпителий иногда видоизменяется, приобретает веретенообразную форму, при этом один из концов вытягивается в длинную нить. Встречается в больших количествах при остром приступе бронхиальной астмы, остром бронхите, острых катаральных поражениях верхних дыхательных путей.

Макрофаги – клетки костномозгового происхождения, имеют овальную или круглую форму, размер от 15 до 20–25 мкм, обычно одно (иногда больше) эксцентрично расположенное ядро, вакуолизированную цитоплазму, содержащую различные включения темно-бурого цвета. Встречаются при различных воспалительных процессах в бронхах и легочной ткани (пневмонии, бронхитах). Макрофаги с явлениями жировой дистрофии – липофаги («жировые шары»), окрашиваемые Суданом 3 в оранжевый цвет, встречаются при раке легкого, туберкулезе, эхинококкозе, актиномикозе. Макрофаги, содержащие гемосидерин, сидерофаги (старое название «клетки сердечных пороков»), имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. С достоверностью их определяют реакцией на берлинскую лазурь.

Определение сидерофагов. Кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 1–2 капли 2–5 %-ного раствора хлористо-водородной кислоты и 1–2 капли 5 %-ного раствора желтой кровяной соли (железисто-синеродистого калия). Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой и сине-зеленый цвета.

Сидерофаги встречаются в мокроте у больных с застойными явлениями в малом круге кровообращения, при инфаркте легкого, синдроме Гудпасчера, идиопатическом легочном гемосидерозе.

Пылевые макрофаги (кониофаги) распознаются по содержанию в цитоплазме частиц угля или пыли иного происхождения. Эти клетки располагаются в виде тяжей и скоплений в слизистой части мокроты. Их обнаружение имеет значение в диагностике пневмокониозов и пылевого бронхита.

Опухолевые клетки чаще представлены в виде клеток плоскоклеточного (с ороговением или без него) железистого рака или аденокарциномы. Нередко возникают трудности в разграничении опухолевых клеток с метаплазированными клетками плоского или цилиндрического эпителия. Опухолевые клетки характеризуются полиморфизмом (могут быть гигантских размеров), увеличением и гиперхромией ядра с нуклеолами и митозами, базофилией цитоплазмы, способностью к фагоцитозу. При этом достоверно лишь обнаружение конгломератов, комплексов опухолевых клеток, расположенных на волокнистой основе. Подозрения на опухолевые клетки при изучении нативного препарата подтверждаются тщательным цитологическим исследованием окрашенных препаратов. При этом более информативно исследование бронхиальных смывов и плеврального экссудата.

Лейкоциты – круглые клетки диаметром от 10–12 до 15 мкм с плохо различимым ядром, равномерной обильной зернистостью. Встречаются почти в каждой разновидности мокроты: в слизистой – единичные, а в гнойной сплошь покрывают все поле зрения (иногда среди лейкоцитов можно выделить эозинофилы – крупные лейкоциты с отчетливой и темной зернистостью).

Эритроциты – круглой или слегка овальной формы клетки, желтоватого цвета (свежие) или бесцветные (измененные и потерявшие пигмент), диаметром меньше лейкоцитов, никогда не имеют зернистости в протоплазме, двухконтурные (клетка-мишень), несколько преломляющие свет. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте; в большом количестве обнаруживаются в мокроте, окрашенной кровью (легочное кровотечение, инфаркт легкого, застойные явления в легких и др.).

Волокнистые образования

Эластические волокна имеют вид извитых, блестящих, преломляющих свет тонких нитей, собранных в пучки, иногда повторяющих строение альвеолярной ткани. Как правило, эти волокна располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Указывают на распад легочной ткани и обнаруживаются при туберкулезе, абсцессе, новообразованиях легких. Иногда при этих заболеваниях в мокроте встречаются коралловые волокна – грубые, ветвящиеся образования с бугристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл, а также обызвествленные эластические волокна – грубые, пропитанные слоями извести палочковидные образования.

Для обнаружения эластических волокон к мокроте добавляют 2–3 объема 10 %-ного раствора едкой щелочи и кипятят до растворения (эластические волокна при этом не растворяются). После охлаждения в жидкость добавляют 5–7 капель 1 %-ного спиртового раствора эозина и центрифугируют. Осадок исследуют под микроскопом. При нахождении волокон нужно быть осторожным, чтобы не спутать их с эластическими волокнами из пищи.

Придавать диагностическое значение можно лишь тем волокнам, которые встречаются группами (пучками) и обнаруживают альвеолярное расположение.

Эластические волокна обнаруживаются в мокроте на поздней стадии деструктивного процесса и только в том случае, если каверна дренируется бронхом. Их обнаруживают при туберкулезе, абсцессе, эхинококкозе, опухолях легких.

Фибринозные волокна – тонкие волоконца, которые заметно осветляются в препарате при добавлении 30 %-ного раствора уксусной кислоты, растворяются при добавлении хлороформа. Встречаются при фибринозном бронхите, туберкулезе, актиномикозе, крупозной пневмонии.

Спирали Куршмана – уплотненные, закрученные в спираль образования из слизи. Наружняя рыхлая часть называется мантией, внутренняя, плотно закрученная часть – центральной осевой нитью. Изредка обнаруживаются отдельно только тонкие центральные нити без мантии и спирально извитые волоконца без центральной нити. Спирали Куршмана рассматриваются под малым увеличением микроскопа. При исследовании под большим увеличением по периферии спиралей можно видеть лейкоциты, кристаллы Шарко – Лейдена. Спирали Куршмана наблюдаются при легочной патологии, сопровождающейся бронхоспазмом (бронхиальной астме, астматических бронхитах, опухолях бронхов).

Кристаллические образования

Кристаллы Шарко – Лейдена встречаются в мокроте вместе с эозинофилами и имеют вид блестящих, гладких, бесцветных, различной величины ромбов, иногда с тупыми концами. Образование кристаллов Шарко – Лейдена связывают с распадом эозинофилов, считают их продуктом кристаллизации белков.

Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко – Лейдена, они образуются в ней в закрытой посуде через 24–28 ч. Характерно присутствие этих кристаллов в мокроте при бронхиальной астме даже не на высоте приступа, а в межприступный период. Кроме этого, они встречаются при глистных поражениях легких, реже – при крупозной пневмонии, различных бронхитах.

Кристаллы гематоидина имеют форму ромбов и иголок (иногда пучков и звезд) золотисто-желтого цвета. Эти кристаллы являются продуктом распада гемоглобина, образуются в глубине гематом и обширных кровоизлияний, в некротизированной ткани. В препаратах кристаллы гематоидина располагаются на фоне детрита, эластических волокон. Их следует отличать от зерен гемосидерина – золотисто-желтых включений в цитоплазме макрофагов, дающих положительную реакцию на берлинскую лазурь. Они диагностируются при абсцессе и гангрене легкого.

Кристаллы холестерина – бесцветные, четырехугольной формы, с обломанным ступенеобразным углом; образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях и располагаются на фоне детрита (туберкулез, новообразования, эхинококкоз, абсцесс и т. д.).

Кристаллы жирных кислот в виде длинных тонких игл и капелек жира содержатся часто в гнойной мокроте (пробка Дитриха); образуются при застое мокроты в полостях (абсцесс, бронхоэктазы).

Окрашенные препараты

Собранные из 4–6 разных мест гнойные частицы мокроты помещают на стекло, тщательно растирают другим предметным стеклом до гомогенной массы, высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

Препараты окрашивают тем или иным способом и микроскопируют с иммерсионной системой. Окраска по Граму – самый распространенный метод окраски всех видов материала, полученного от больного для быстрого установления инфекционного агента.

Мокроту считают пригодной для культивирования и идентификации возбудителя, если в мазке при малом увеличении микроскопа обнаруживается более 25 лейкоцитов и менее эпителиальных клеток в поле зрения.

Окраску препаратов для изучения клеток крови в мокроте, окраску по Романовскому – Гимзе, используют главным образом для выявления эозинофилов. Для этого используют 0,5 %-ный спиртовой раствор эозина, 1 %-ный водный раствор метиленового синего. На теплое стекло (после фиксации над пламенем) наливают раствор эозина и окрашивают в течение 3 мин. Затем мазок промывают водой и докрашивают в течение нескольких секунд метиленовым синим. Краску смывают водой, препарат высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. На синем фоне четко выделяется красная зернистость эозинофилов.

Эозинофилы в мокроте в отличие от эозинофилов крови нередко имеют круглое ядро, вид тяжей, скоплений с рассыпанными вокруг эозинофильными зернами. Их обнаружение рассматривается как один из важных диагностических признаков бронхиальной астмы, астматического бронхита. Однако эозинофилия мокроты свойственна также лекарственным и эозинофильным пневмониям, синдрому Леффлера.

При этой окраске удается дифференцировать нейтрофилы, лимфоциты, базофилы, эритроциты, однако необходимость их изучения возникает редко.

Для выявления клеток злокачественных новообразований мокроту окрашивают одним из способов, применяемых для окраски мазков крови.

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Для бактериоскопического исследования мазки мокроты приготавливают, растирая тщательно выбранный кусочек между двумя предметными стеклами таким образом, чтобы мазок занял не более 2/3 поверхности стекла. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окраску мазков мокроты по Цилю – Нильсену используют для выявления кислотоустойчивых бактерий.

Метод обнаружения микобактерий туберкулеза

Микобактерии туберкулеза обнаруживают в мазке, окрашенном по Цилю – Нильсену. Окрашивают карболовым фуксином- Циля (1 г основного фуксина растирают в ступке с 10 мл 96 %– ного этилового спирта; приготовленный раствор вливают в 90 мл 7%– ного раствора фенола, тщательно перемешивают; хранят в посуде из темного стекла). Кроме того, здесь необходим 3 %-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты (3 мл концентрированной хлористо-водородной кислоты добавляют к 97 мл 96 %-ного этилового спирта) и 1 %-ный водный раствор метиленового синего. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, которая должна быть ýже предметного стекла. Наливают 2–3 мл карболового фуксина Циля. Держа препарат пинцетом, подогревают над пламенем горелки до трехкратного отхождения паров. При этом растворяется жировосковая капсула микобактерий, и они воспринимают красную краску.

Остужают, бумажку сбрасывают, препарат промывают водой и полностью обесцвечивают, погружая стекло в 3 %-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты. Обесцвечиваются все части мокроты, кроме кислото- и спиртоустойчивых микобактерий.

Промывают водой и докрашивают в течение 30 с метиленовым синим. При этом все части мокроты окрашиваются в синий цвет, кроме микобактерий туберкулеза.

Вновь промывают препарат водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. На синем фоне хорошо различимы микобактерии туберкулеза красного цвета. Они полиморфны, имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины, могут быть колбовидной, пунктирной формы, располагаться поодиночке или группами.

Метод флотации Потенджера

Микобактерии туберкулеза неравномерно распределяются в мокроте, при количестве менее 100 тыс. в 1 мл обнаружить их в препарате не всегда удается. Методы накопления позволяют сконцентрировать микобактерии. Для их концентрации чаще всего пользуются методом флотации. В основе метода лежит адсорбирование микобактерий туберкулеза бензином, толуолом или ксилолом, которые всплывают на поверхности более плотной жидкости. Для этого используют 0,5 %-ный раствор едкого натра (или калия); бензин (ксилол, толуол), дистиллированную воду.

Свежеприготовленную мокроту помещают в стерильную узкогорлую бутылку вместимостью 200–250 мл с хорошо пригнанной пробкой. Для флотации достаточно 10–15 мл мокроты. Ее заливают двойным объемом щелочи и энергично встряхивают в течение 10–15 мин в аппарате для встряхивания. При этом мокрота гомогенизируется, растворяются слизь и гной, освобождаются микобактерии. Затем в эту же бутылку приливают 1 мл бензина и 100 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты. Снова встряхивают в течение 10–15 мин для эмульгирования бензина. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки. Смесь оставляют при комнатной температуре на 40–50 мин. За это время капельки бензина с адсорбированными на них микобактериями всплывают, образуя в горлышке бутылки сливкообразное флотационное кольцо.

Препараты готовят на новых обезжиренных предметных стеклах, которые предварительно подогревают до 60 °C на воздушной бане. На подогретые стекла пастеровской пипеткой наносят капли из флотационного кольца, высушивают и снова наносят капли на то же место. Каждую последующую каплю наносят на высохшую предыдущую каплю. Таким образом все флотационное кольцо переносят на предметные стекла. Готовят 3–4 препарата, фиксируют и окрашивают по Цилю – Нильсену.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на том, что туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).

Для диагностики туберкулеза легких, кроме бактериоскопии мокроты, необходимо исследовать бронхиальные смывы, промывные воды желудка, плевральный экссудат, используя методы бактериоскопии, а также посев материала на специальные питательные среды, метод ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Окраска препаратов по Граму

В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, клебсиеллы, стрептококки, стафилококки, друзы актиномицета и другие микроорганизмы.

Для этого используют:

1) карболовый раствор генцианового фиолетового (1 г генцианового фиолетового растирают в ступке с 10 мл 96 %-ного этилового спирта; раствор вливают в 90 мл 2%-ного раствора фенола, хорошо перемешивают; хранят в бутылке из темного стекла);

2) раствор Люголя (1 г йода и 2 г йодата калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды; после растворения навески доливают 295 мл дистиллированной воды);

3) 96 %-ный этиловый спирт;

4) фуксин Пфейффера (10 мл карболового фуксина Циля смешивают с 90 мл дистиллированной воды).

Мазок фиксируют над пламенем горелки. На зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового на 1,5–2 мин. Все части препарата окрашиваются в фиолетовый цвет. Снимают бумажку и заливают мазок раствором Люголя на 2 мин. При этом фиолетовая окраска закрепляется на грамположительной флоре. Сливают раствор Люголя. Препарат обесцвечивают 96 %-ным этиловым спиртом до сероватого цвета. Грамположительная флора фиолетовую окраску сохраняет. Промывают водой и докрашивают фуксином Пфейффера в течение 10–15 с. Все части препарата, кроме грамположительной флоры, окрашиваются в красный цвет. Снова промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопируют с иммерсионной системой. На красном фоне четко видны фиолетовые грамположительные микроорганизмы. Грамотрицательная флора окрашивается в красный цвет.

Пневмококки представляют собой попарно расположенные грамположительные округлые или вытянутые диплококки, окруженные капсулой. Клебсиеллы имеют вид толстых грам-отрицательных палочек различной величины с закругленными концами, расположенных попарно и окруженных капсулой. Стрептококки представляют собой круглые, мелкие, расположенные цепочками разной длины грамположительные кокки. Находятся внутри лейкоцитов и среди них. Стафилококки – круглые грамположительные кокки различной величины, располагаются единично или группами. Часто встречаются одновременно со стрептококками.

Друзы актиномицета имеют вид сплетений темно-фиолетового цвета. Каждая нить сплетения заканчивается колбовидным утолщением, окрашенным в красный цвет.

Методы ускоренной диагностики. Путем применения молекулярно-генетических методов возможно получение анализов в течение трех суток с момента поступления образца. Тест-системы основаны на амплификации генов возбудителя туберкулеза. Их применение позволяет подтвердить принадлежность возбудителя к виду M. Tuberculosis, а также наличие/отсутствие мутации у выделенного штамма, которая можен привести к устойчивости к изониазиду и рифампицину.

Изучение грибковой флоры в мокроте

Иногда в окрашенном или неокрашенном препарате можно встретить различные виды грибов.

Дрожжевые грибы рода Candida – почкующиеся клетки и короткие почкующиеся нити псевдомицелия (клетки круглой или овальной формы, псевдомицелий – членистый, ветвистый, споры на нем располагаются мутовками). Наличие этих грибов в мокроте свидетельствует об их активизации, но еще не дает основания для диагноза кандидомикоза, который ставится при учете клинических данных и повторных обнаружениях грибов.

Дрожжевой гриб Criptococcus – возбудитель бластомикоза, имеет вид круглых, частью почкующихся клеток с довольно толстыми двухконтурными стенками.

Плесневый гриб из рода Aspergillus имеет вид обрывков широких нитей мицелия и круглых темно-зеленых спор.

Лучистый гриб Actinomyces встречается в мокроте при поражении легких актиномикозом. Для его обнаружения из мокроты выделяют очень мелкие желтоватые и серовато-белые с зеленым оттенком зернышки, представляющие друзы лучистого гриба, и исследуют под микроскопом. При большом увеличении центральная часть друзы состоит из густого компактного сплетения тонких ветвящихся нитей мицелия с пигментированными зернами, по периферии клубок мицелия окружен зоной из булавовидных образований со вздутиями на концах, сильно преломляющих свет. Эти образования расположены частоколом и сообщают друзе лучистое строение. При окраске по Граму нити мицелия окрашиваются в синий цвет, а колбы – в розовый; при окраске по Цилю – Нильсену колбы приобретают красный цвет. Решающую роль в диагностике поражения легких при глубоких микозах играют посев мокроты (и бронхиального содержимого) на специальные питательные среды и серологические методы диагностики.

Химическое исследование

При хронических неспецифических заболеваниях легких отмечается корреляция между содержанием общего белка и сиаловой кислоты в мокроте и активностью воспалительного процесса. Широкое распространение имеет метод альвеолярного лаважа, позволяющий изучать секрет непосредственно из альвеол и бронхов.

В лаважной жидкости определяются число и состав форменных элементов, бактерий, белков. Метод особенно важен для диагностики генетически обусловленных заболеваний легких, на долю которых в структуре причин хронических неспецифических заболеваний легких приходится 10 %. У здоровых лиц в бронхиальном секрете содержатся альбумин, IgG, секреторный IgA, трипсин, α-1-антитрипсин, лизоцим, интерферон, лактоферрин. Появление IgE в бронхиальном секрете характерно для аллергического поражения бронхов (при бронхиальной астме, астматическом бронхите).

Отсутствие в лаважной жидкости IgA свидетельствует об иммунодефицитном состоянии – генетическом или приобретенном (например, при атрофическом бронхите). Для генетического дефицитосекреторного IgA характерно генерализованное поражение легких, а также слизистых кишечника и мочевой системы. При дефиците α-1-антитрипсина – мощного эндогенного ингибитора протеолитических ферментов – слизистые бронхов и альвеол легкого повреждаются протеазами нейтрофилов, альвеолярных макрофагов и бактерий.

Таблица 47

Характеристика мокроты при различной легочной патологии

Этот генетически детерминированный дефицит играет важную роль в патогенезе хронических неспецифических заболеваний легких и первичной эмфиземы легких. При другом наследственном заболевании – муковисцидозе – за счет потери с потом натрия и хлоридов эпителий бронхов и пищеварительных желез продуцирует крайне вязкую слизь, обтурирующую бронхи и протоки поджелудочной железы. Муковисцидоз проявляется хроническими неспецифическими заболеваниями легких с бронхоэктазами, эмфиземой легких, а также синдромом нарушения всасывания.

В лаважной жидкости определяются также сурфактант и его метаболиты. Сурфактант – фосфолипопротеин, называемый антиателектатическим фактором, – обладает поверхностно-активными свойствами; он предотвращает «слипание», облитерацию альвеол. Нарушение синтеза сурфактанта в альвеолярном эпителии (генетически обусловленное или приобретенное) и потеря сурфактанта при тяжелых воспалительных процессах в легких индуцируют ателектаз и являются одной из причин хронических неспецифических заболеваний легких. Мокрота при раздичных заболеваниях органов дыхания отличается (табл. 47).

По изучению клеточного состава бронхиального секрета судят о фагоцитарной способности легочной ткани (альвеолярных макрофагов).

Выделяют варианты хронических неспецифических заболеваний легких, связанные с генетическим дефектом альвеолярных макрофагов: снижением фагоцитоза, потерей способности продуцировать эндогенный интерферон.

Глава 11

Исследование спинномозговой жидкости

Спинномозговая жидкость образуется в сосудистых сплетениях желудочков головного мозга путем пропотевания плазмы крови через стенки сосудов, а также секретируется клетками сосудистых сплетений. Из желудочков она поступает в субарахноидальное пространство и цистерны мозга. У взрослого человека одновременно в субарахноидальном пространстве в желудочках мозга циркулирует 110–160 мл ликвора, в спинномозговом канале – 50–70 мл. Ликвор образуется непрерывно со скоростью 0,2–0,8 мл/мин, что зависит от внутричерепного давления. В сутки у здорового человека образуется 350–1150 мл спинномозговой жидкости. Исследование спинномозговой жидкости имеет важное диагностическое значение при заболеваниях центральной нервной системы и мозговых оболочек.

Правила получения ликвора

Для получения ликвора чаще всего используют люмбальную, субокципитальную и вентрикулярную пункции. Во время люмбальной пункции необходимо первые 5 капель удалить, затем собрать 3 порции асептической жидкости в стерильные пробирки, плотно их закрыть и оформить направление в клиническую лабораторию. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термос или другую тару, где поддерживается температура около 37 °C. Доставляется немедленно. Ликворное давление измеряют при пункции в каплях в минуту или миллиметрах ртутного cтолба. Ликвор исследуют клинически, биохимически и бактериологически. Основные показатели церебральной жидкости:

1) общий белок – 0,15–0,45 г/л;

2) альбумин – 0,1–0,2 г/л;

3) глюкоза – 3,6–5,2 ммоль/л;

4) лактат – 1,1–1,6 ммоль/л;

5) магний – 1,0–1,5 ммоль/л;

6) хлориды – 115–130 ммоль/л;

7) лимфоциты – менее 3;

8) лейкоциты – менее 8.

Макроскопическое исследование

Цвет. Нормальная спинномозговая жидкость бесцветна. По виду она не отличается от воды, поэтому ее цвет определяют путем сравнивания с дистиллированной водой, налитой в пробирку такого же диаметра. Зеленовато-желтый цвет ликвора отмечается при гнойном менингите либо при прорыве абсцесса. Темно-вишневый цвет спинномозговая жидкость приобретает при гематоме или кисте.

Мутность спинномозговой жидкости может быть обусловлена присутствием в ней эритроцитов, лейкоцитов и микроорганизмов. Иногда спинномозговая жидкость окрашена в красноватый цвет от крови. Примесь крови может быть случайной, вызванной травмой при проколе, и в связи с патологическим процессом. При центрифугировании полученной жидкости образуется кровянистый осадок, а жидкость над осадком остается бесцветной.

Микроскопическое исследование

Определение количества лейкоцитов

При помощи микроскопа и счетной камеры подсчитывают число лейкоцитов в ликворе после разрушения эритроцитов.

Необходимый реактив

10 %-ная уксусная кислота, подкрашенная метиловым фиолетовым, ледяной уксусной кислоты, – 5 мл, воды – до 50 мл, метилового фиолетового – 0,1 мл.

Специальное оборудование

Микроскоп, камера Фукса – Розенталя, смесители для подсчета лейкоцитов.

В меланжер для подсчета лейкоцитов набирают до метки «I» 10 %-ной соляной кислоты, подкрашенной метиловым фиолетовым, до метки «II» набирают спинномозговую жидкость. Раствор уксусной кислоты гемолизирует эритроциты и подкрашивает в синий цвет лейкоциты, что облегчает их подсчет. После встряхивания запоминают содержание меланжера, предварительно выпустив первую каплю в камеру Фукса – Розенталя, которая состоит из 16 больших квадратов. Глубина камеры 0,2 мм, общий объем 3,1 мкл. При отсутствии смесителя допустимо смешивание ликвора с реактивом: на 10 капель ликвора 1 капля реактива. Лейкоциты считают во всех 256 квадратах и полученное число делят на 3,2 (объем камеры). Результат соответствует количеству форменных элементов в 1 мкл ликвора. Кроме этого, полученный результат необходимо разделить на 10 (степень разведения ликвора).

Нормальное содержание лейкоцитов в 3 мл спинномозговой жидкости следующее:

1) из желудочков мозга – 0–3 клетки;

2) субокципитальной пункции – 0–2 клетки;

3) люмбальной пункции – 7–10 клеток.

У детей цитоз выше, чем у взрослых, и с возрастом постепенно падает. У ребенка до 3 месяцев в 1 мл содержится 20–23 летки, к 1 году – 14–15 клеток, к 10 годам – 4–5 клеток.

Повышенный цитоз наблюдают при воспалительных поражениях мозговых оболочек и органических поражениях вещества мозга.

Подсчет эритроцитов

Производится в камере Горяева или Фукса – Розенталя. Эритроциты могут быть обнаружены в прозрачной, бесцветной жидкости. При наличии 900–1000 эритроцитов в 1 мкл наблюдается помутнение жидкости, при наличии 2000 эритроцитов появляется розовое окрашивание, при наличии 4–5 тыс. эритроцитов жидкость приобретает геморрагический характер.

Для диагностики внутричерепной геморрагии значение имеет не только абсолютное количество эритроцитов, но и нарастание их числа при повторном исследовании.

Дифференциация клеточных элементов в счетной камере

В счетной камере с сухой системой (окуляр 15° или 10°, объектив – 40°) можно дифференцировать почти все элементы. Реактив окрашивает все ядра клеток в красновато-фиолетовый цвет, цитоплазма остается бесцветной. При этом обращают внимание на величину клеток, форму и расположение ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение, наличие включений в цитоплазме. Этот метод используется наиболее часто.

Дифференциация клеточных элементов в окрашенных препаратах

Окраска по Розиной. Жидкость центрифугируют в течение 7–10 мин. Надосадок сливают легким покачиванием его по поверхности стекла, через 1–2 мин жидкость сливают. При небольшом лейкоцитозе (менее 50 мкл) осадок распределяют на участке 1 см^2; при лейкоцитозе, превышающем 100 в 3 мкл, – на участке 1,5–2 см^2; при лейкоцитозе 500 в 3 мкл – на участке 2–3 см^2. При очень большом лейкоцитозе осадок распределяют по всему предметному стеклу. Мазок высушивают в сушильном шкафу. Затем фиксируют метанолом в течение 1–2 мин и окрашивают по Романовскому: тонкий препарат с небольшим цитозом – 6–7 мин, с большим цитозом – 10–12 мин. Затем краску сливают, мазок промывают дистиллированной водой и высушивают. Если ядра имеют бледно-голубой цвет, мазок докрашивают еще в течение 1–2 мин.

Окраска по Везновой. Осадок выливают на стекло, слегка покачивая его, жидкость равномерно распределяют по поверхности. Мазок высушивают при комнатной температуре в течение суток, фиксируют метиловым спиртом в течение 5 мин, покрывают специальными красителями, окрашивают в течение 1 ч. Если клетки бледны, докрашивают неразведенной краской под контролем микроскопии в течение 2–10 мин. Чем больше форменных элементов в ликворе, особенно при наличии крови, тем больше надо дополнительно окрашивать.

Окраска по Алексееву. На высохший, но не фиксированный препарат наносят 8–10 капель красителя по Романовскому. Той же пипеткой осторожно распределяют краску на весь препарат и оставляют на 30 с. Затем добавляют на препарат 12–20 капель дистиллированной воды, нагретой до 40–60 °C. Соотношение капель краски и воды должно быть 1: 2. Помешивают краску с водой и оставляют на 3 мин. Смывают краску струей дистиллированной воды, сушат препарат фильтровальной бумагой и микроскопируют. Метод применяется при срочном цитологическом исследовании.

Морфология клеточных элементов в спинномозговой жидкости

Лимфоциты по величине сходны с эритроцитами. При дифференцировании клеток в камере лимфоциты, окрашенные фуксином, имеют крупное ядро и узкий неокрашенный ободок цитоплазмы. В нормальной жидкости содержится 8–10 клеток. Количество их увеличивается при опухолях центральной нервной системы. Лимфоциты встречаются при хронических воспалительных процессах в оболочках (туберкулезном менингите, цистицеркозном арахноидите).

Плазматические клетки. Клетки крупнее лимфоцитов, ядро крупное, эксцентрично расположенное, большое количество цитоплазмы при сравнительно небольшом размере ядра (размер клеток – 6–12 мкм). Плазматические клетки обнаруживаются только в патологических случаях при длительно текущих воспалительных процессах в мозге и оболочках, при энцефалитах, туберкулезном менингите, цистицеркозном арахноидите и других заболеваниях, в послеоперационном периоде, при вялотекущем заживании раны.

Тканевые моноциты. Размер клеток – от 7 до 10 мкм. В нормальной жидкости иногда могут встречаться в виде единичных экземпляров. Обнаруживаются после оперативного вмешательства на центральной нервной системе, при длительно текущих воспалительных процессах в оболочках. Наличие тканевых моноцитов говорит об активной тканевой реакции и нормальном заживлении раны.

Макрофаги. Могут иметь ядра различной формы, чаще ядро расположено на периферии клетки, цитоплазма содержит включения и вакуоли.

Величина – от 7 до 17 мкм, иногда – 20–30 мкм. В нормальном ликворе макрофаги не встречаются. Наличие макрофагов при нормальном цитозе наблюдают после кровотечения или при воспалительном процессе. Как правило, они встречаются в послеоперационном периоде, что имеет прогностическое значение и говорит об активной санации ликвора.

Зернистые шары. Клетки с жировой инфильтрацией – макрофаги с наличием в цитоплазме капель жира. В счетной камере они имеют различную величину, форму, окрашены в темно-коричневый цвет, ядра клеток не видны.

В окрашенных препаратах клетки имеют небольшое периферически расположенное ядро и крупноячеистую цитоплазму. Величина ячеек различна и зависит от включенных капель жира. Зернистые шары обнаруживаются в патологической жидкости, полученной из мозговых кист в очагах распада мозговой ткани, при опухолях.

Нейтрофилы. В камере идентичны по виду нейтрофилам периферической крови. Наличие в ликворе нейтрофилов даже в минимальных количествах указывает или на бывшую, или на имеющуюся воспалительную реакцию.

Присутствие измененных нейтрофилов указывает на затухание воспалительного процесса.

Эозинофилы. Определяют по имеющейся равномерной, блестящей зернистости. Эозинофилы встречаются при субарахноидальных кровоизлияниях, менингитах, туберкулезных и сифилитических опухолях мозга.

Эпителиальные клетки. Эпителиальные клетки, ограничивающие подпаутинное пространство, встречаются редко. Это довольно крупные круглые клетки с небольшими круглыми или овальными ядрами. Обнаруживаются при новообразованиях, иногда при воспалительных процессах.

Опухолевидные клетки и комплексы. Их находят в камере и окрашенном препарате. Злокачественные клетки могут относиться к следующим видам опухолей:

1) медулобластома;

2) спонгиобластома;

3) астроцитома;

4) рак.

Кристаллы. Встречаются в спинномозговой жидкости редко, в случае распада опухоли. Элементы эхинококка – крючья, сколексы, обрывки хитиновой оболочки – находят редко.

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Для бактериоскопического исследования готовят тонкие мазки, высушивают их в термостате, обрабатывают смесью Никифорова (спирт и эфир поровну) в течение 10 мин, высушивают и окрашивают.

Если осадок незначительный, то из него сначала готовят препарат для исследования, а затем снимают покровное стекло и делают мазок для бактериоскопического исследования. Обнаруженные фибринозные свертки сначала исследуют микроскопически, а затем извлекают из-под покровного стекла на сухое предметное стекло, растягивают препаровальными иглами, высушивают, фиксируют на огне и смесью Никифорова и окрашивают по Цилю – Нильсену для исследования на наличие туберкулезных бацилл.

При окрашивании осторожно смывают водой краску и оставляют препарат для высыхания в вертикальном положении, но не высушивают фильтровальной бумагой. Туберкулезные бациллы обнаруживаются почти исключительно в фибринозных свертках.

Для бактериоскопического исследования, помимо окраски по Циль – Нильсену, мазок окрашивают по Граму и по Гале – Якобсону. Краску Гале – Якобсона готовят следующим образом: 1 часть карболового фуксина, 4 части насыщенного раствора метиленовой синьки и 35 частей дистиллированной воды. На фиксированные и обработанные смесью Никифорова мазки наливают краску, окрашивают в течение 10–15 с, смывают водой и высушивают. При этой окраске бактерии интенсивно окрашиваются и их нетрудно обнаружить.

Если материала мало, то следует приготовить для бактериоскопического исследования один мазок, сначала окрасить по Гале – Якобсону, а затем перекрасить его по Граму.

При окраске по Гале – Якобсону обнаруживаются менингококки, они находятся группами внутри нейтрофилов. При других формах гнойных менингитов микроорганизмы легко обнаружить при бактериоскопическом исследовании.

При туберкулезном менингите имеет место трудность обнаружения туберкулезных палочек, и нередко приходится потратить значительное время.

Химическое исследование

Определение белка

Осуществляется унифицированным методом с сульфациловой кислотой и на биохимическом анализаторе. Нормальное содержание белка в спинномозговой жидкости варьирует в пределах:

1) при поясничной пункции – 0,22–0,33 г/л;

2) при цистериальной пункции – 0,1–0,22 г/л;

3) при вентрикулярной пункции – 0,12–0,2 г/л.

Унифицированный метод определения белка с сульфациловой кислотой и сульфатом натрия

Интенсивность получения при коагуляции белка сульфациловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы

1. 6 %-ный раствор сульфациловой кислоты.

2. 14 %-ный раствор безводного сульфата натрия.

3. Стандартный раствор альбумина – 1 %-ный раствор: 1,0 мл альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9 %-ного раствора хлорида натрия в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствором хлорида натрия до метки. Реактив нестойкий. Для стабилизации к стандартному раствору прибавляют 1 мл 5%-ного раствора азидида натрия. В этом случае при хранении в холодильнике реактив годен к употреблению в течение 2 месяцев.

4. 1 мл раствора альбумина.

5. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход исследования

Для анализа применяют свежеприготовленную смесь равных объемов 6 %-ного раствора сульфациловой кислоты и 14 %-ного раствора безводного сульфата натрия (рабочий раствор). В пробирку наливают 5 мл свежеприготовленного рабочего раствора и 0,5 мл ликвора. Тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность помутнения измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля, длина волны 410–480 нм (сине-фиолетовый светофильтр). В контроль вместо реактива берут 0,9 %-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из стандартного раствора готовят разведения и обрабатывают их так, как опытные. В 5 пробирок наливают 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1 мл стандартного раствора альбумина и в каждую из них доливают до объема 10 мл 0,9 %-ного раствора хлорида натрия. Концентрация белка в этих растворах соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 г/л.

Примечания

1. Если муть начинает оседать, перед измерением пробирку необходимо встряхнуть.

2. Перед определением целесообразно поставить реакцию Панди, и если результат реакции оценивают – 3+ или 4+, то перед началом количественного исследования ликвор надо развести изотоническим раствором хлорида натрия и при Расчете учесть степень разведения.

3. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л, поэтому при более высоких концентрациях белка ликвор следует разводить.

Повышенное содержание белка отмечают при нарушении гемодинамики, воспалительных процессах, органических поражениях центральной нервной системы и оболочек мозга, при экстрамедуллярных опухолях спинного мозга. Пониженное содержание белка отмечается при гидроцефалии и повышенном образовании ликвора.

Большое практическое значение придается определению белкового индекса, отношению глобулинов к альбуминам. Белковые фракции определяются методом электрофореза.

Глобулиновые реакции

Унифицированный метод определения глобулинов осаждением карболовой кислотой (реакция Панди)

Реакция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты.

Необходимый реактив

Насыщенный раствор карболовой кислоты – 100 г карболовой кислоты – растворяют в 1 л воды, встряхивают и оставляют в термостате при 37 °C на 6–8 ч. После пребывания при комнатной температуре в течение 7 дней надосадочную жидкость сливают и используют в качестве реактива.

Специальное оборудование: не требуется.

Ход исследования

На часовое стекло, положенное на черную бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю наносят 1–2 капли ликвора.

Оценка результатов

В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с используемой спинномозговой жидкостью образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть. Для обозначения результатов реакции Панди пользуются системой 4 плюсов:

1) слабая – 1+;

2) заметная опалесценция – 2+;

3) умеренное помутнение – 3+;

4) значительное помутнение – 4+.

Унифицированный метод определения глобулинов высаживанием (реакция Апельда)

Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации осаждать избирательно глобулины.

Необходимый реактив

Насыщенный раствор сульфата аммония – 85 г соли – растворяют в 100 мл воды. Полученный раствор выдерживают 48 ч при комнатной температуре и после фильтрования употребляют для постановки реакции. Реакция раствора нейтральная.

Ход исследования

В пробирку вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реактива и перемешивают. В контрольную пробирку наливают 1 мл воды.

Оценка результатов

Оценку проводят в течение 3 мин после смешивания ликвора с реактивом. Сравнение опыта с контролем производят на темном фоне. Для выражения результатов пользуются системой 4 плюсов:

1) значительное помутнение – + + + +;

2) умеренное – + + +;

3) заметная опалесценция – + +;

4) слабая опалесценция – +.

Клиническое значение

Реакция дает относительное представление о нормальном и патологическом содержании глобулинов. Слабая опалесценция (+) свойственна и нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении общего белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное представление о содержании глобулинов можно получить при электрофоретическом обследовании ликвора, которое целесообразно проводить при положительной реакции Апельда.

Унифицированная реакция с хлорным золотом (реакция Ломге)

Коллоидные растворы, не изменяющиеся под влиянием различных разведений нормальной спинномозговой жидкости, в патологически измененной жидкости меняют степень дисперсности в зависимости от разведения жидкости, при этом изменяются цвет, растворимость и может выпадать осадок.

Необходимые реактивы

1. 1 %-ный водный раствор чистого хлорного золота.

2. Хлорид натрия, 4,5 г на 1 л воды.

3. Цитрат натрия, 1 %-ный раствор в воде.

4. Рабочий раствор хлорного золота.

Готовят следующим образом: к 95 мл воды приливают 1 мл 1%-ного хлорного золота, нагревают до 90–95 °C.

К рабочему раствору прибавляют 5 мл до появления вишнево-красного окрашивания. В процессе кипячения окраска раствора меняется, переходя из синей в фиолетовую, затем красную и вишневую. Раствор может храниться в темном месте до 2 месяцев.

Ход исследования

Готовят разведения спинномозговой жидкости. Берут 11 пробирок, в первую наливают 0,9 мл, а в остальные – по 0,5 мл 0,45 %-ного раствора хлорида натрия. В первую наливают 0,1 мм спинномозговой жидкости и после перемешивания переносят 0,5 мл во 2-ю пробирку, из последней 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом исключают серию разведений от 1: 10 до 1: 5120. В 11-ю пробирку спинномозговую жидкость не добавляют, она является контрольной. Во все пробирки добавляют до 2,5 мл рабочего раствора хлорида натрия. После энергичного встряхивания пробирок их оставляют на 16–18 ч при комнатной температуре.

Оценка полученных результатов. Если спинномозговая жидкость нормальная, смесь всех 11 пробирок остается пурпурно-красной или в одной из первых пробирок фиолетово-пурпурной. При патологическом ликворе на дне пробирок появляется осадок, а цвет жидкости меняется. Изменение цвета принято регистрировать цифрами:

0 – отсутствие окраски;

1 – красно-фиолетовый цвет;

2 – фиолетовый;

3 – красно-синий;

4 – синий;

5 – светло-синий и голубой;

6 – бесцветный.

Цифровое выражение по пробиркам: отрицательная реакция – 00 000 000 000; дегенеративная кривая – 666 654 320; воспалительная – 00 124 566 530.

Клиническое значение

При изменении альбумино-глобулинового коэффициента происходит изменение коллоидной реакции. Воспалительный тип реакции Ломге наблюдается при повышенном содержании α- и β-глобулинов, дегенеративный тип реакции бывает за счет увеличения мелкодисперсной фракции белка – альбуминов и снижения содержания глобулинов.

Большое значение имеют глобулиновые реакции при дифференциальной диагностике органических и функциональных нарушений, при неврастении, прогрессивном параличе и латентном сифилисе.

Определение крови в спинномозговой жидкости

Количественное определение крови

Метод основан на сравнении уровня гемоглобина в периферической крови и спинномозговой жидкости. М. М. Гунеф использовал для определения гемоглобина в ликворе 0,04 %-ный раствор аммиака.

Ход определения

5 мл геморрагической спинномозговой жидкости центрифугируют в течение 10 мин, осадок растворяют в 5 мл 0,4 %-ного раствора аммиака, можно брать и меньше, важно, чтобы количество жидкости и раствора аммиака было одинаковым. Кровь из пальца в количестве 20 мл смешивают с 5 мл 0,4 %-ного раствора аммиака.

Концентрацию гемоглобина определяют на аппарате при длине волны 542.

Биохимические методы исследования

Определение глюкозы

Определение глюкозы в спинномозговой жидкости осуществляется с помощью цветной реакции или на биохимическом анализаторе так же, как и в крови. В норме в ликворе содержится глюкоза в пределах 2,8–3,9 ммоль/л. При остром и подостром серозном менингите содержание глюкозы увеличивается. Увеличение ее содержания в ликворе при нормальном содержании в крови наблюдается при явлениях раздражения оболочек мозга.

Определение содержания глюкозы в спинномозговой жидкости должно проводиться с исследованием сахара крови.

Унифицированный газооксидазный метод по окислению ортотолуидина

Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием синего хромогена. Обе реакции протекают одновременно при рН 4,8.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид – 9 г/л (изотонический раствор). Готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл жидкости.

2. Цинка сульфат – 50 г/л, 5 г сульфата цинка (ZnSO_4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя в воде, доводят до 100 мл.

4. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием.

5. Ортотолуидина 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл 96 %-ного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой в течение нескольких месяцев.

6. Ацетатный буферный раствор pH 4,8: смешивают 4 части 0,25 г уксусной кислоты и 6 частей 0,25 %-ного ацетата натрия.

7. Глюкозооксидаза. Сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.

8. Пероксидаза из крови – 1 мл растворяют в 5 мл ацетатного буфера.

9. Рабочий реактив: в 80 мм ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивная или спустя несколько часов после хранения начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.

10. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мл вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора 0,3 %-ной бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л. Для этого берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщение раствором до 10 мл.

Ход определения

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 %-ного раствора NaOH, перемешивают. При этом образуется тонкий гель гидрата окиси цинка, в него впускают 0,1 мл спинномозговой жидкости, снова перемешивают и в течение 10 мин центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно развивается окрашивание, которое возникает максимум через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см, длина волны 625 нм холостого опыта. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора. Расчет можно проводить по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (моль/л), а на другой – величины экстинкции.

Определение хлоридов

Определение хлоридов может осуществляться методом титрования или на электролитном анализаторе.

Пониженное содержание хлоридов в ликворе характерно для менингита, особенно туберкулезного, при бруцеллезе, повышенное – при опухолях мозга, абсцессах мозга, эхинококкозе.

Определение мочевины, билирубина, холестерина

Имеет небольшое диагностическое значение.

Определение гликопротеинов и липопротеинов спинномозговой жидкости производят с помощью электрофореза на бумаге с предварительным сгущением жидкости.

Диагностика заболеваний

Для диагностики туберкулеза используются триптофановая реакция с 2 %-ным формалином, 0,06 %-ным раствором цитрата натрия и концентрированная соляная кислота.

Необходимые реактивы

1. 2 %-ный водный раствор формалина (1 часть формалина и 19 частей дистиллированной воды).

2. 20,6 %-ный раствор азотистого натрия (NaNO_2), готовится ex tempera из 0,6 %-ного раствора (1 часть его и 9 частей дистиллированной воды).

3. Концентрированная соляная кислота.

Ход определения

В широкую пробирку отмеривают 3 мл спинномозговой жидкости, прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты и 2–3 капли раствора формалина, слегка встряхивают и дают постоять в течение 5 мин, а затем доливают 2 мл раствора азотистокислого натрия. При положительной реакции на границе жидкостей образуется нежное фиолетовое кольцо, которое при стоянии исчезает. При отрицательной реакции кольцо совсем не образуется или имеет коричневый цвет.

При туберкулезном менингите в отличие от менингита другой этиологии реакция часто бывает положительной.

Реакция Фридмана и Ференца

Метод основан на окислительно-восстановительной реакции раствора перманганата калия и осаждении белка трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы

1. 1 %-ный водный раствор перманганата калия, приготовленный на бидистиллированной воде и постоявший не менее 2–3 недель.

2. 20 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

Ход исследования

К 1 мл ликвора прибавляют 0,05 мл (1 каплю) реактива 1, смесь хорошо взбалтывают. В нормальной спинномозговой жидкости наблюдается яркое фиолетовое окрашивание, которое долго сохраняется. Цвет не меняется от прибавления 2–3 капель реактива 2.

Реакция используется для ранней диагностики менингита. В ранней стадии менингита при смешивании ликвора с раствором перманганата калия фиолетовая окраска переходит в красно-желтый и коричнево-желтый цвета.

При добавлении трихлоруксусной кислоты (реактив 1) в случаях гнойного менингита цвет доходит до светло-желтого или наступает полное обесцвечивание с одновременным помутнением и осаждением белка.

Изменение цвета по типу менингеальной реакции не наступает при других органических поражениях мозга: травме, опухоли, сифилисе мозга, рассеянном склерозе и других, протекающих без менингеальных симптомов.

Микробиологическое исследование

Микробиологическое исследование цереброспинальной жидкости проводится в случаях, сходных с менингитом, а также при коматозных состояниях и неврологических симптомах неясного генеза.

Спинномозговая жидкость стерильна, поэтому положительный результат исследования – это всегда расшифровка диагноза.

Этиология менингитов очень разнообразна.

Наиболее часто выделяют следующие микроорганизмы:

1) при гнойных менингитах: менингококк, пневмококк, стафилококк золотистый, стрептококки групп А, В, D, Н, бактерии коли, протеус, псевдомонос и др.;

2) при асептических менингитах: туберкулезная палочка, возбудитель лептоспироза, токсоплазмоза, вирусы.

Пробы должны проводиться асептично.

Забор материала собирают в 2 стерильные пробирки.

Одна направляется на цитологическое исследование, вторая – на бактериологическое исследование в объеме до 10 мл, у взрослых – 15 мл.

Учитывая, что часть возбудителей чувствительна к охлаждению, материал должен быть доставлен в лабораторию как можно скорее, и при доставке должна поддерживаться температура 37 °C.

Доставленную пробу центрифугируют. Надосадочную жидкость стерильной пипеткой помещают в пробирку и используют для биохимического и серологического исследований.

Оставшийся осадок и около 0,5 мл жидкости используют для изготовления мазков для посева.

Из осадка делают 2 тонких мазка на стекле, окрашивают по Граму метиленовым синим и немедленно микроскопируют.

Иногда на типичной морфологии могут быть выявлены только возбудители – как менингококк, пневмококк.

Результаты первичной микроскопии служат основанием предварительной диагностики. Для посева берут 10 мл жидкости в стеклянной пробирке.

Посев спинномозговой жидкости производят на следующие питательные среды:

1) двойную среду;

2) среду для контроля стерильности;

3) жидкую среду Сабуро;

4) среду Рапопорт.

К осадку, оставшемуся в пробирке, добавляют 5 мл сывороточного полужидкого кляра – среду обогащения.

Проверку роста проводят после ночной инкубации, а в дальнейшем ежедневно в течение 7 дней до появления роста.

При отсутствии роста дается отрицательный результат на 9– 10-й день.

Выделение микроорганизмов из спинномозговой жидкости свидетельствует об их этиологической роли.

Должна быть проведена количественная оценка бактериального роста.

Таблица 48

Сводный справочник показателей спинномозговой жидкости

В случае положительного результата проводят дальнейшую идентификацию с определением их свойств, типизируя их, определяя чувствительность к антибактериальным препаратам.

Применение международной системы единиц СИ вызывает определенные затруднения в оценке результатов исследования спинномозговой жидкости. В таблице 48 приведены показатели нормы в единицах СИ в сравнении с традиционными, для чего приводятся соответствующие коэффициенты перевода показателей в традиционную систему, которая встречается в старых изданиях.

Глава 12

Исследование экссудатов и транссудатов

Виды пунктатов

Транссудат (от «транс» и лат. sudo – «просачиваюсь») – жидкость, скапливающаяся при общих и местных нарушениях кровообращения; невоспалительный выпот, результат пропотевания сыворотки крови. От воспалительного выпота (экссудата) отличается главным образом низким содержанием белка (табл. 49).

Транссудаты (невоспалительные жидкости) появляются вследствие разнообразных причин:

1) при повышении венозного давления (правожелудочковая недостаточность сердца, портальная гипертония на почве тромбоза воротной вены, цирроза печени, адгезивный перикардит);

2) при снижении онкотического давления в сосудах (заболевания, протекающие с гипопротеинемией: нефротический синдром различной этиологии, тяжелые поражения печени, кахексия);

3) при нарушениях обмена электролитов, главным образом повышении концентрации натрия (гемодинамическая сердечная недостаточность, нефротический синдром, цирроз печени);

4) при увеличении продукции альдостерона и некоторых других состояниях.

Таблица 49

Дифференциально-диагностические признаки транссудатов и экссудатов

Экссудат (exsudatio; от лат. exsudare – «потеть») – выпотевание белоксодержащей жидкой части крови через сосудистую стенку в воспаленную ткань. Соответственно жидкость, выходящая при воспалении из сосудов в ткань, называется экссудатом. Термины «экссудат» и «экссудация» употребляются только по отношению к воспалению. Они призваны подчеркнуть отличие воспалительной жидкости (и механизма ее образования) от межклеточной жидкости и транссудата (например, при экссудативном плеврите).

Механизм экссудации включает 3 основных фактора:

1) повышение проницаемости сосудов (венул и капилляров) в результате воздействия медиаторов воспаления и в ряде случаев самого воспалительного агента;

2) увеличение кровяного (фильтрационного) давления в сосудах очага воспаления вследствие гиперемии;

3) возрастание осмотического и онкотического давления в воспаленной ткани в результате альтерации и начавшейся экссудации и, возможно, снижение онкотического давления крови из-за потери белков при обильной экссудации.

Сохраняющееся динамическое равновесие между данными механизмами обеспечивается тем, что всасывающая способность плевры у здорового человека почти в 3 раза превышает ее секретирующую способность, поэтому в плевральной полости содержится лишь незначительное количество жидкости.

Ведущим фактором экссудации является повышение проницаемости сосудов. Оно, как правило, является двухфазным и включает немедленную и замедленную фазы. Первая возникает вслед за действием воспалительного агента, достигает максимума на протяжении нескольких минут и завершается в среднем в течение 15–30 мин. Вторая фаза развивается постепенно, достигает максимума через 4–6 ч и длится иногда до 100 ч в зависимости от вида и интенсивности воспаления. Следовательно, экссудативная фаза воспаления начинается немедленно и продолжается более 4 суток.

Преходящее повышение проницаемости сосудов в немедленной фазе обусловлено главным образом контрактильными явлениями со стороны эндотелиальных клеток. При этом в реакцию вовлекаются преимущественно венулы. В результате взаимодействия медиаторов со специфическими рецепторами на мембранах эндотелиальных клеток происходит сокращение актиновых и миозиновых микрофиламентов цитоплазмы клеток, округляются эндотелиоциты; две соседние клетки отодвигаются друг от друга, и между ними появляется межэндотелиальная щель, через которую и осуществляется экссудация. Стойкое увеличение проницаемости сосудов в замедленной фазе связано с повреждением сосудистой стенки лейкоцитарными факторами – лизосомальными ферментами и активными метаболитами кислорода. При этом в процесс вовлекаются не только венулы, но и капилляры.

По отношению к сосудистой проницаемости медиаторы воспаления могут быть разделены на 2 группы:

1) прямодействующие, влияющие непосредственно на эндотелиальные клетки, вызывая их контракцию, – гистамин, серотонин, брадикинин, С5а, С3а, лейкотриены С4 и D4;

2) нейтрофилзависимые, эффект которых опосредуется лейкоцитарными факторами. Такие медиаторы неспособны повышать проницаемость сосудов у лейкопенических животных. Это компонент комплемента С5а des Arg, лейкотриен В4, цитокины, в частности интерлейкин-1, отчасти фактор, активирующий тромбоциты.

Повышенная проницаемость сосудов в сочетании с увеличенным фильтрационным давлением крови, осмотическим и онкотическим давлением ткани обеспечивает выход жидкой части крови из сосуда и задержку ее в ткани. По некоторым данным, экссудация осуществляется также путем фильтрации и диффузии через микропоры в самих эндотелиальных клетках (трансцеллюлярные каналы), а также не столько пассивным путем, сколько активным – с помощью так называемой микровезикуляции, состоящей в микропиноцитозе эндотелиальными клетками плазмы крови, транспорте ее в виде микропузырьков (микровезикул) по направлению к базальной мембране и выбросе ее в ткань.

Поскольку повышение проницаемости сосудов при воспалении наблюдается в значительно большей степени, чем при любом из невоспалительных отеков, даже при которых этот фактор является ведущим, количество белка в экссудате превышает таковое в транссудате. В свою очередь, отличие в степени повышения проницаемости сосудов при воспалительных и невоспалительных отеках обусловлено разницей в количествах и наборе высвобождаемых биологически активных веществ. Например, лейкоцитарные факторы, повреждающие сосудистую стенку, играют важную роль в патогенезе экссудации и мало участвуют при невоспалительных отеках.

Степенью повышения проницаемости сосудов определяется и белковый состав экссудата. При сравнительно небольшом увеличении проницаемости могут выйти только мелкодисперсные альбумины, по мере дальнейшего повышения – глобулины и, наконец, фибриноген.

Экссудаты образуются в результате воспалительных процессов, вызываемых разнообразными причинами. Различают экссудаты:

1) серозные и серозно-фибринозные (при экссудативных плевритах и перитонитах туберкулезной этиологии, ревматических плевритах);

2) геморрагические (чаще всего при злокачественных новообразованиях и травматических поражениях плевры, брюшины, перикарда, реже – при инфаркте легкого, остром панкреатите, геморрагических диатезах, туберкулезе);

3) хилезные (при затруднении лимфооттока через грудной проток вследствие сдавления опухолью, увеличенными лимфатическими узлами, а также при разрыве, обусловленном травмой или опухолью);

4) хилусоподобные (при хронических воспалениях серозных оболочек вследствие обильного клеточного распада с жировым перерождением);

5) псевдохилезные (молочный вид этих экссудатов обусловлен не увеличенным содержанием жира, как в хилезных, а своеобразным изменением белка, наблюдается иногда при липоидной дистрофии почек);

6) холестериновые (при застарелых осумкованных выпотах в плевральную, брюшную или перикардиальную полость);

7) гнилостные (при огнестрельных ранениях и присоединении гнилостной флоры);

8) гнойный.

Рассмотрим несколько подробнее характеристику отдельных видов экссудатов.

Серозный экссудат характеризуется умеренным содержанием белка (3–5 %), в основном мелкодисперсного (альбумин), и небольшим количеством полиморфно-ядерных лейкоцитов, вследствие чего имеет невысокий удельный вес (1015–1020) и является достаточно прозрачным. По составу наиболее близок к транссудату.

Характерен для воспаления серозных оболочек, реже встречается при воспалении в паренхиматозных органах. Экссудат при серозном воспалении слизистых оболочек характеризуется большой примесью слизи. Такое воспаление называется катаральным. Чаще всего серозный экссудат наблюдается при ожоговом, вирусном, аллергическом воспалениях.

Фибринозный экссудат отличается высоким содержанием фибриногена, что является результатом значительного повышения проницаемости сосудов. При контакте с поврежденными тканями фибриноген превращается в фибрин и выпадает в виде ворсинчатых масс (на серозных оболочках) или пленки (на слизистых), вследствие чего экссудат уплотняется. Если фибринозная пленка рыхлая, поверхностная, легко отделяется без нарушения целостности слизистой, такое воспаление называется крупозным. Оно наблюдается в желудке, кишечнике, трахее, бронхах. В том случае, когда пленка плотно спаяна с подлежащей тканью и при ее удалении обнажается язвенная поверхность, речь идет о дифтеритическом воспалении. Оно характерно для миндалин, полости рта, пищевода. Такое различие обусловлено характером эпителия слизистой оболочки и глубиной повреждения. Фибринозные пленки могут самопроизвольно отторгаться благодаря аутолизу, развертывающемуся вокруг очага, и выходить наружу, подвергаться ферментативному расплавлению, прорастанию соединительной тканью с образованием соединительнотканных сращений, или спаек. Фибринозный экссудат может наблюдаться при дифтерии, дизентерии, туберкулезе.

Гнойный экссудат характеризуется наличием большого количества полиморфно-ядерных лейкоцитов, главным образом погибших и разрушенных (гнойные тельца), ферментов, продуктов аутолиза тканей, альбуминов, глобулинов, иногда – нитей фибрина, особенно нуклеиновых кислот, обусловливающих высокую вязкость гноя. Вследствие этого гнойный экссудат является достаточно мутным, с зеленоватым оттенком. Он характерен для воспалительных процессов, вызванных кокковой инфекцией, патогенными грибками или химическими флогогенами, такими как скипидар, отравляющие вещества. Нередко гнойный экссудат бывает окрашен в красно-бурый или бурый цвет от примеси крови или кровяного пигмента. Под микроскопом видно огромное количество гнойных клеток: одни из них хорошо сохранившиеся, другие сморщены, зернисты, нередко в стадии полного распада.

При оформившейся эмпиеме – сплошная масса детрита и отмерших гнойных клеток, жировые капли, иногда кристаллы гематоидина и холестерина и почти всегда обильная микрофлора. Своеобразная и нечасто встречающаяся картина наблюдается при так называемой плевральной эозинофилии. В этих случаях до 75 % клеток плеврального выпота являются эозинофильными полинуклеарами, тогда как обычно их встречается 1–5 %. В крови обычно в этих случаях эозинофилия отсутствует. Массивная эозинофилия (до 75–80 %) может наблюдаться и при повторных пункциях в стадии резорбции гемоторакса.

Гнилостный экссудат отличается наличием продуктов гнилостного разложения тканей, вследствие чего имеет грязно-зеленую окраску и крайне неприятный запах индола и скатола. Образуется в случае присоединения патогенных анаэробов. Под микроскопом обнаруживаются гнойные шарики, сильно дегенерированные, много кристаллов холестерина и жирных кислот, иногда кристаллы гематоидина, масса различных микроорганизмов.

Геморрагический экссудат характеризуется большим содержанием эритроцитов, что придает ему розовый или красный цвет. Характерен для туберкулезных поражений (туберкулезного плеврита), чумы, сибирской язвы, черной оспы, токсического гриппа, аллергического воспаления, т. е. при воздействии высоковирулентных агентов, бурно протекающем воспалении, сопровождающемся значительным повышением проницаемости и даже разрушением сосудов. Геморрагический характер может принять любой вид воспаления – серозный, фибринозный, гнойный. Геморрагические экссудаты наблюдаются при злокачественных новообразованиях плевры, цинге, геморрагических диатезах, а также при огнестрельных ранениях грудной клетки. При огнестрельных ранениях по числу эритроцитов можно судить, продолжается ли кровотечение или оно прекратилось. Если кровотечение продолжается, то число свежих эритроцитов не меняется; если оно прекратилось, то число таких эритроцитов уменьшается. В стадии резорбции после ранений много эозинофилов и макрофагов с заглоченными эритроцитами и их обломками и значительное количество клеток мезотелия.

Молочновидные экссудаты объединяют хилезные, хилусоподобные и псевдохилезные экссудаты, так как они имеют вид разбавленного молока с зеленоватым отблеском.

Хилезные экссудаты происходят от разрыва лимфатических сосудов и истечения хилуса. Такие экссудаты главным образом наблюдаются в полости брюшины, но бывают и в плевральной полости вследствие разрыва грудного протока, межреберных и легочных лимфатических сосудов. Молочный вид их обусловливается присутствием большого количества жира, который легко отстаивается и образует верхний сливкообразный слой.

Под микроскопом в них определяют капельки жира, окрашивающиеся в черный цвет от осмиевой кислоты и в красный – от Судана 3; кроме того, в них находят очень много красных кровяных клеток, лимфоцитов и немного полинуклеаров. Прибавление к хилезному экссудату одного эфира или эфира с предварительным подщелачиванием несколькими каплями раствора едкого калия быстро осветляет экссудат. Хилезные экссудаты произвольно свертываются, но не вполне за один раз – свертки фибрина появляются в них повторно.

Хилусоподобные экссудаты встречаются чаще, чем хилезные; они происходят вследствие хронического воспаления серозных оболочек и обыкновенно наблюдаются: в брюшной полости – при атрофическом циррозе печени, в полостях плевры – при туберкулезе, сифилисе и злокачественных новообразованиях плевры. Молочный вид этих экссудатов зависит от распавшихся перерожденных клеток. Вообще жира в них бывает значительно меньше, чем в хилезных экссудатах, но под микроскопом он выглядят обычно в форме более крупных жировых шариков; наряду с последними встречается также масса перерожденных клеток.

Псевдохилезные экссудаты имеют также вид разбавленного молока, но вовсе не содержат жира; если же они содержат жир, то в очень небольших количествах – меньше того количества, которое необходимо, чтобы жир служил причиной белого цвета жидкости (менее 0,15 %). От чего зависит цвет таких жидкостей, определенно сказать нельзя. Одни авторы объясняют его белковыми телами, другие – мукоидным веществом, третьи – особым агрегатным состоянием частиц глобулина, четвертые – нуклеинами и мукоидами и, наконец, некоторые – лецитином. Псевдохилезные экссудаты при стоянии не образуют сливкообразного слоя и не осветляются от прибавления эфира: от осмиевой кислоты они приобретают лишь коричневый оттенок или даже вовсе не изменяют своего цвета. Обычно не свертываются или дают ничтожное количество фибрина. Псевдохилезные экссудаты встречаются при липоидной дегенерации почек.

Смешанные экссудаты наблюдаются при воспалении, протекающем на фоне ослабления защитных сил организма и при присоединении вследствие этого вторичной инфекции. Различают серозно-фибринозный, серозно-гнойный, серозно-геморрагический, гнойно-фибринозный экссудаты.

Биологическое значение экссудации состоит в том, что, являясь одним из основных компонентов воспаления как патологического процесса, она выполняет вместе с тем важную защитную роль, которая заключается в следующем. Экссудация обеспечивает поставку в ткань плазменных медиаторов – активных компонентов комплемента, кининов, факторов свертывающей системы, ферментов плазмы, биологически активных веществ, высвобождаемых активированными клетками крови. Совместно с тканевыми медиаторами они участвуют в умерщвлении и лизисе микроорганизмов, привлечении лейкоцитов крови, опсонизации патогенного агента, стимуляции фагоцитоза, раневом очищении, репаративных явлениях. С экссудатом из тока крови в очаг выходят продукты обмена, токсины, т. е. очаг воспаления выполняет дренажную элиминативную функцию. С другой стороны, вследствие свертывания лимфы в очаге, выпадения фибрина значение экссудата в усугублении венозного застоя и тромбирования венозных и лимфатических сосудов повышается, так как он участвует в задержке в очаге микробов, токсинов, продуктов обмена.

Вместе с тем при определенных условиях экссудация может приводить к осложнениям воспалительного процесса – поступлению экссудата в полости тела с развитием, например, плеврита, перикардита, перитонита; сдавлению близлежащих органов; гноеобразованию с развитием абсцесса, эмпиемы, флегмоны, пиемии. Образование спаек может вызвать смещение и нарушение функций органов. Большое значение имеет локализация воспалительного процесса. Так, например, образование на слизистой оболочке гортани при дифтерии фибринозного экссудата может привести к асфиксии.

Пункция плевральной полости

Для уточнения диагноза и исследования экссудата больным проводят пункцию плевральной полости. Это самый распространенный и эффективный способ лечения поражений плевры при туберкулезе. Плевральную пункцию проводят с диагностической целью для подтверждения наличия патологического содержимого в плевральной полости и направления его на бактериологическое, цитологическое и биохимическое исследования. С лечебной целью проводят эвакуацию содержимого плевральной полости и введение лекарственных препаратов.

Для проведения плевральной пункции используют длинные иглы (8–10 см) среднего калибра (более 1 мм) с острым срезом и канюли к ним. Игла соединяется со шприцем посредством крана, пластмассовой или резиновой трубки. При больших свободных выпотах пункцию осуществляют в VII–VIII межреберье по задней подмышечной линии, а при осумкованных место пункции определяют рентгенологически.

Пункцию проводят в процедурном кабинете или перевязочной. Возможна премедикация. Врач работает в маске, предварительно обрабатывает руки и надевает перчатки.

В месте вкола проводят местную анестезию межреберья.

Место вкола обрабатывают спиртовым раствором йода.

Указательным пальцем левой руки нащупывают верхний край нижнего (в заданном межреберье) ребра и по нему, точно над ребром, по его краю (чтобы не поранить межреберные сосуды и нервы) иглой с надетой на нее трубкой, зажатой зажимом, или иглой, насаженной на шприц (чтобы не произошло вхождения воздуха в плевральную полость), коротким движением прокалывают кожу, клетчатку, межреберные мышцы и париетальный листок плевры. Попадание в плевральную полость ощущается как провал иглы.

К наружному концу трубки присоединяют шприц, первые порции содержимого отправляют на анализ, а затем, присоединив трубку к отсасывающему аппарату и сняв зажим, начинают эвакуировать экссудат. Большое количество жидкости следует удалять медленно во избежание быстрого смещения органов средостения.

Важно на всех этапах процедуры максимально соблюдать герметичность. Затем иглу быстро извлекают, обрабатывают место пункции спиртовым раствором йода и заклеивают стерильной наклейкой.

Дренаж. После диагностической плевральной пункции при необходимости постоянного удаления содержимого устанавливают дренажную силиконовую трубку с внутренним диаметром не менее 4 мм. Для установки дренажа используют троакар – стальной остроконечный стилет с просветом внутри. Он предназначен для прокола грудной клетки и проведения через него дренажной трубки. Обычно трубку герметично закрепляют в грудной стенке, чем обеспечивают закрытое дренирование, которое может быть пассивным и активным.

Физико-химические свойства полостных жидкостей

Цвет и прозрачность полостных жидкостей зависят от их характера. Транссудаты и серозные экссудаты имеют светло-желтый цвет, прозрачные. Остальные виды экссудатов в большинстве случаев мутные, различного цвета. Характер экссудата устанавливается обычно при осмотре жидкости: серозный – жидкость прозрачная, соломенно-желтого цвета; гнойный – жидкость вязкая, сливкообразная; геморрагический – жидкость кровянистая или красновато-бурого цвета; хилезный – в виде молока.

Если уровень гематокрита экссудата превышает 50 % верхней нормы гематокрита крови – экссудат геморрагический. Хилезным экссудат может считаться при содержании триглицеридов в нем более 100 мг%.

Относительную плотность полостных жидкостей определяют с помощью урометра. Транссудаты имеют меньшую относительную плотность, чем экссудаты. Относительная плотность транссудатов колеблется от 1005 до 1015; относительная плотность экссудатов обычно выше 1018.

Содержание белка и его определение проводят теми же методами, что и в моче, или аналогично определению белка в сыворотке крови с помощью рефрактометра; выражают результаты в граммах на литр. В транссудатах содержится 5–25 г/л белка, а в экссудатах – более 30 г/л. Имеет значение и качественный состав белков. Так, соотношение альбуминов и глобулинов в транссудатах и экссудатах различно: в транссудатах альбуминово-глобулиновый индекс равен 2,5–4,0; в экссудатах он составляет 0,5–2,0.

Для более детального исследования белковых фракций пользуются методом электрофореза.

Унифицированный метод количественного определения белка

Принцип метода основан на том, что салициловая кислота вызывает денатурацию белка (помутнение). Интенсивность помутнения пропорциональна концентрации белка.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход исследования

В связи с высоким содержанием белка в транссудатах и экссудатах их перед исследованием разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида. Степень разведения ориентировочно устанавливают по реакции с сульфосалициловой кислотой. После этого готовят основное разведение выпотных жидкостей 1: 100, для чего к 0,1 мл экссудата или транссудата добавляют 9,9 мл 0,9 %– ного раствора натрия хлорида. При необходимости (большое содержание белка) степень разведения можно увеличить. В пробирку вносят 1,25 мл разведенной жидкости и 3,75 мл 3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты, содержимое перемешивают. Через 5 мин фотометрируют при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против контрольной пробы, в которую вместо сульфосалициловой кислоты вносится 3,75 мл 0,9 %-ного раствора натрия хлорида.

Расчет производят по калибровочному графику с учетом разведения пробы (табл. 50). Для построения графика из стандартного раствора альбумина готовят разведения и обрабатывают их как опытные пробы.

Таблица 50

Построение калибровочного графика

Примечание

Прямолинейная зависимость калибровочного графика сохраняется до концентрации белка 1000 мг/мл. В экссудатах содержится от 30 до 80 г/л белка, тогда как в транссудатах – 5–25 г/л.

Проба Ривальта была предложена также для дифференцирования транссудатов и экссудатов.

Принцип метода

Транссудаты содержат серомуцин (соединение глобулиновой природы), дающий положительную пробу (денатурацию) со слабым раствором уксусной кислоты.

Ход определения

В цилиндр наливают 100–150 мл дистиллированной воды, подкисляют 2–3 каплями ледяной уксусной кислоты и добавляют по каплям исследуемую жидкость. Падающая капля экссудата образует помутнение в виде белого облачка, опускающегося до дна сосуда. Капля транссудата не образует помутнения, или оно бывает незначительным и быстро растворяется. Несмотря на указанные различия экссудатов и транссудатов, разграничить их на практике не всегда легко, так как иногда приходится иметь дело с рядом переходных жидкостей, а также экссудатами, которые по содержанию белка и относительной плотности стоят близко к транссудатам. Предложенная таблица 51 поможет разобраться в отличиях выпотных жидкостей.

Таблица 51

Отличие транссудата от экссудата

Большое значение для различения транссудатов и экссудатов имеет микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование

Микроскопическое исследование позволяет детально изучить клеточный состав пунктата. Цитологическому исследованию подвергаются препараты, полученные из осадка после центрифугирования жидкости.

Экссудаты, доставленные в лабораторию в свернувшемся виде, подвергаются дефибринированию путем взбалтывания стеклянными бусами. До окраски препараты рекомендуется изучить в нативном виде под покровным стеклом.

Нативные препараты

Исследование нативных препаратов дает возможность ориентировочно оценить количество клеточных элементов, качественный состав осадка, наличие подозрительных на атипичные клетки конгломератов и др. Техника приготовления препаратов обычная: каплю осадка наносят на предметное стекло и накрывают покровным. Препараты рассматриваются сначала под малым, а затем под большим увеличением. При исследовании на клетки злокачественного новообразования жидкость центрифугируют повторно не менее 5–6 раз, сливая надосадочный слой после каждого центрифугирования и вновь наливая исследуемую жидкость. В нативном препарате можно обнаружить определенные элементы.

Эритроциты в том или ином количестве присутствуют в любой жидкости. В транссудатах и серозных экссудатах их выявляют в небольшом количестве; в геморрагических экссудатах они обычно покрывают все поле зрения. Это значительно затрудняет исследование нативных препаратов.

В этих случаях надо готовить тонкие препараты или добавлять каплю слабого раствора уксусной кислоты (для гемолиза эритроцитов), но такой препарат в дальнейшем окрашивать нельзя.

При раневых гемотораксах представляет практический интерес изучение эритрограммы. Увеличение числа старых дегенеративных эритроцитов (микроформы, «тени» эритроцитов, пойкилоциты и др.) указывает на прекращение кровотечения: появление на их фоне свежих эритроцитов свидетельствует о повторном его возникновении.

Лейкоциты в небольшом количестве (до 15 в поле зрения) обнаруживаются в транссудатах и в большом количестве в жидкостях воспалительного происхождения (особенно много в гнойном экссудате). Качественный состав лейкоцитов (соотношение отдельных видов) изучают в окрашенных препаратах.

Клетки мезотелия распознают по большим размерам (25–40 мкм), округлой или полигональной форме. В транссудате большой давности эти клетки встречаются в виде скоплений, претерпевают дегенеративные изменения – вакуолизацию цитоплазмы и оттеснение ядра к периферии по типу перстневидных клеток. Они обнаруживаются в начальных стадиях воспалительного процесса, при реактивном воспалении плевры, а также при опухолях.

Опухолевые клетки можно заподозрить по расположению конгломератов, отсутствию четких клеточных структур, полиморфизму величины и формы. Они появляются при карциноме плевры.

Слизь обнаруживается крайне редко и является указанием на наличие бронхопульмонального свища.

Жировые капли в виде резко преломляющих свет круглых образований, окрашивающихся Суданом 3 в оранжевый цвет, встречаются в гнойных экссудатах с клеточным распадом и в больших количествах в хилезных экссудатах.

Кристаллы холестерина – это тонкие прозрачные пластинки с обрезанными углами. Обнаруживаются в старых осумкованных выпотах, чаще туберкулезной этиологии.

Друзы актиномицетов можно найти в плевральном экссудате при актиномикозе.

Окрашенные препараты

Техника приготовления препаратов проста. Небольшую каплю осадка распределяют по предметному стеклу и высушивают на воздухе. Окраску производят после фиксации мазков обычными гематологическими методами, однако время окрашивания сокращается до 10 мин и меньше. Окрашенный препарат рассматривают сначала с сухой, а затем с иммерсионной системой, изучают морфологию клеточных элементов, подсчитывают соотношение отдельных видов. В окрашенных препаратах дифференцируются следующие клеточные элементы.

Нейтрофилы присутствуют в экссудатах любой этиологии. В серозных экссудатах туберкулезной этиологии они обнаруживаются в небольшом количестве в начальной стадии развития экссудата (примерно в течение первых 10 дней), а затем количество их постепенно уменьшается за счет лимфоцитов. Если нейтрофилез держится длительное время, это является признаком тяжелого течения заболевания; появление преобладающего количества нейтрофилов указывает на переход серозного экссудата в гнойный. В гнойных экссудатах нейтрофилы являются преобладающими клетками.

В более доброкачественных случаях (при серозно-гнойном характере жидкости) многие нейтрофилы сохранены, функционально активны, хорошо выполняют функцию фагоцитоза, в более тяжелых случаях (при отчетливо гнойном характере экссудата) обнаруживают признаки дегенерации: токсическую зернистость цитоплазмы, резкий пикноз ядра, кариолизис вплоть до полного клеточного распада. При благоприятном течении заболевания по мере просветления экссудата количество дегенеративных форм уменьшается, увеличивается число активных нейтрофилов, появляются различные тканевые клетки (макрофаги, мезотелиальные клетки и др.).

Лимфоциты являются обязательными элементами всякого экссудата. В серозных экссудатах в разгар клинических проявлений они превалируют в цитологической картине, составляя 80–90 % всех лейкоцитов. Морфология лейкоцитов различна, наряду с малыми формами встречаются и более крупные клетки.

Эозинофилы содержатся иногда в серозных геморрагических экссудатах, при плевритах различной этиологии, в частности ревматических, иногда туберкулезных, опухолевых, а также в период рассасывания раневого плеврита, составляя 20–80 % всех клеточных элементов.

Плазматические клетки могут встречаться в значительном количестве при затяжном характере воспаления серозных оболочек.

Полибласты – это тканевые клетки разнообразной величины и размера с базофильной цитоплазмой и нежным ядром овальной или бобовидной формы, иногда с наличием нуклеолы.

Макрофаги морфологически напоминают моноциты, имеют ядро неправильной причудливой формы с наличием нуклеолы и ячеистую, содержащую вакуоли и азурофильную зернистость цитоплазму. Появляются при кровоизлияниях в плевральную полость, опухолях.

Мезотелиальные клетки (покровный эпителий) имеют большой размер (25–30, нередко до 50 мкм), круглое, иногда содержащее нуклеолу ядро, расположенное центрально или эксцентрично, широкую нежно-голубую цитоплазму. Клетки мезотелия постоянно присутствуют в транссудатах, в начальных стадиях и в период репарации экссудатов, в значительном количестве при канцероматозе серозных оболочек. В жидкостях большой давности они подвергаются различной степени дегенерации, крупновакуолизированные клетки с оттесненным к периферии ядром напоминают раковые перстневидные клетки, что иногда приводит к ошибкам.

Клетки злокачественных опухолей обнаруживаются в полостных жидкостях при канцероматозе плевры, брюшины, вследствие первичного (мезотелиома) или вторичного (прорастание опухоли из соседних и метастазирование из удаленных органов, лимфогранулематоз) поражения. Клетки злокачественных опухолей в экссудате отличаются полиморфизмом, увеличением и гиперхромией ядра с множеством мелких нуклеол, базофилией вакуолизированной цитоплазмы, наличием митозов, фагоцитарной активностью.

Встречаются перстневидные клетки, в центре которых имеется огромная вакуоль. Цитологическая диагностика рака надежна только в случае, если обнаружены конгломераты подобных атипичных клеток. При люминесцентной микроскопии (акридин оранжевый, родамин) свечение опухолевых отличается от люминесценции мезотелиальных клеток.

Бактериоскопическое исследование

Сухие фиксированные мазки окрашивают по Цилю – Нильсену, Граму и т. д. Для исследования на туберкулезные микобактерии экссудат подвергают длительному центрифугированию или обработке способом флотации. При необходимости производят бактериологическое исследование.

Дифференциальная диагностика полостных жидкостей

Далее мы остановимся немного подробнее на основных заболеваниях, которые сопровождаются скоплением жидкостей в различных полостях человеческого организма.

Плевриты

Cиндром плеврального выпота диагностируется примерно у 10 % больных пульмонологического профиля. Природа заболеваний, проявляющихся плевральным выпотом, весьма разнообразна. Это большая гетерогенная группа:

1) воспалительные, застойные, опухолевые, диспротеинемические выпоты;

2) плевральные выпоты вследствие нарушения целостности плевры;

3) выпоты при длительном контакте с асбестом, при уремии и пр.

Возникновение плеврального выпота всегда является признаком неблагоприятного (осложненного) течения основного заболевания и предполагает интенсификацию, а в ряде случаев и изменение стратегии лечения. Гетерогенность заболеваний, сопровождающихся (проявляющихся) плевральным выпотом, определяет важность дифференциальной диагностики плевральных выпотов. Целью дифференциальной диагностики плевральных выпотов является установление главной причины образования выпота в плевральной полости для подбора адекватной терапии.

При общеклиническом обследовании важно различать признаки основного заболевания и собственно поражения плевры. Основными клиническими признаками плеврального выпота являются боли в грудной клетке, непродуктивный кашель и одышка. Важный признак плеврального выпота – смещение средостения. При парапневмоническом плеврите средостение обычно смещается в здоровую сторону. При выпоте, сочетающемся с ателектазом или пневмоциррозом, средостение смещается в пораженную сторону. Дифференциально-диагностическое значение имеют не столько наличие или выраженность того или иного симптома плеврального выпота, сколько скорость нарастания симптоматики. Так, для воспалительных поражений плевры более характерно острое начало, а для опухолевых или застойных – медленное, постепенное нарастание симптоматики. Весьма существенным является сочетание признаков плеврального выпота с симптомами основного заболевания. На этапе клинического исследования врач определяет направленность, ширину и глубину диагностического поиска.

Плевральная пункция, входящая в обязательный диагностический минимум, дает много информации, позволяющей верифицировать диагноз. Первым и весьма важным элементом дифференциальной диагностики плеврального выпота является определение характера жидкости: экссудат или транссудат. При этом дифференциально-диагностическое значение имеет не только определение абсолютного содержания того или иного вещества в плевральном выпоте, но и соотношение содержания исследуемого компонента в выпоте и сыворотке крови. При обнаружении транссудата в плевральной полости дальнейший поиск причин поражения плевры прекращают и проводят соответствующие лечебные мероприятия (эвакуацию выпота, назначение мочегонных и прочих средств, уменьшающих транссудацию в плевральную полость).

При воспалительном характере плеврального выпота – экссудате – диагностический поиск продолжается. Определенное значение для диагностики имеет внешний вид плеврального содержимого. Так, геморрагический экссудат наблюдается при тромбоэмболии легочной артерии, травмах, опухолях, коричневый – при амебиазе, молочный – при хилотораксе. Повышенная вязкость характерна для мезотелиомы, гнилостный запах – для эмпиемы.

Анализ клеточного содержимого характеризует фазу и характер воспаления. Так, нейтрофилез экссудата свидетельствует об острой фазе воспаления или суперинфицировании. Лимфоцитоз характерен для хронического воспаления. Эозинофилия более 10 % нередко встречается в экссудатах. Это может быть и признаком основного заболевания, и результатом аутосенсибилизации при повторных плевральных пункциях. Отсутствие мезотелия в экссудате наблюдается в тех случаях, когда плевральные листки покрыты фибрином (при туберкулезном и парапневмоническом плевритах). При застойных выпотах обычно наблюдается высокое содержание клеток мезотелия. Обнаружение опухолевых клеток, микроорганизмов, паразитов при микроскопии осадка плеврального выпота является абсолютным диагностическим признаком и означает окончательную верификацию диагноза.

Все воспалительные плевриты можно условно разделить на следующие группы:

1) гнойно-воспалительные;

2) инфекционные:

– бактериальные;

– грибковые;

– вирусные и др.;

3) паразитарные:

– амебиаз;

– эхинококкоз;

– парагонизм и др.;

4) ферментогенные: панкреатогенный;

5) аллергические и аутоиммунные:

– экзогенный аллергический альвеолит;

– лекарственная аллергия;

– синдром Дресслера и др.;

6) при ревматических заболеваниях:

– системная красная волчанка;

– ревматоидный артрит;

– ревматизм и др.;

7) травматические:

– лучевая терапия;

– ожоги и др.

Весьма полезным в дифференциальной диагностике плевритов является исследование глюкозы плеврального содержимого. Низкое содержание (менее 3,33 ммоль/л) характерно для туберкулеза, опухолевого поражения, ревматического и парапневмонического плеврита. При других вариантах плевритов содержание глюкозы в экссудате обычно равно таковому в сыворотке крови. При уровне глюкозы менее 2,22 ммоль/л у больных с парапневмоническим плевритом весьма высока вероятность формирования эмпиемы, а при эмпиеме глюкоза в плевральном содержимом обычно отсутствует. Интенсивность воспаления в плевральной полости обычно коррелирует с повышением лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Наряду с ЛДГ по специальным показаниям в экссудате можно определять и другие маркеры воспаления: металлопротеазы, интерлейкины. Иммунологическое исследование плеврального содержимого направлено на обнаружение либо этиологически значимых агентов (антигенов), либо следов их пребывания (антител). Для этой цели используются иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция. Бактериологическое исследование плеврального содержимого дает максимальную информацию при инфекционной природе плевритов.

На первом этапе дифференциальной диагностики необходимо различать воспалительный, опухолевый и застойный характер выпота (табл. 52). На этом этапе наиболее сложным и ответственным является исключение (или подтверждение) опухолевой природы плеврального выпота. В большинстве случаев при опухолях наблюдаются постепенное развитие выпота и наличие известных факторов риска опухоли. Лучевые методы позволяют обнаружить дополнительные тени и определить показания к бронхологическому исследованию. Плевральное содержимое довольно часто носит геморрагический характер, в нем определяются опухолевые маркеры. Обнаружение опухолевых клеток является абсолютным диагностическим признаком и означает успешное окончание диагностического поиска. При отсутствии клеток опухоли в плевральном содержимом и сохраняющемся подозрении на опухолевый процесс показана торакоскопия с биопсией, позволяющая в большинстве случаев получить диагностически значимый материал.

Таблица 52

Основные отличительные черты воспалительных, опухолевых и застойных выпотов

Примечание

ТЭЛА – тромбоэмболия легочной артерии.

Среди инфекционных плевритов наиболее часто приходится проводить дифференциальную диагностику между туберкулезным, пневмоническим и грибковым поражениями плевры.

Туберкулезный плеврит редко встречается как единственное проявление туберкулеза. Чаще он сочетается с диссеминированным, очаговым, инфильтративным туберкулезом легких, бронхоаденитом или первичным комплексом. Туберкулезный плеврит может быть первым проявлением первичного туберкулеза. В 3 % случаев туберкулезный плеврит является случайной находкой. Выделяют 3 основных варианта туберкулезного плеврита: аллергический, перифокальный и туберкулез плевры.

Для аллергического плеврита характерно острое начало с болями и лихорадкой, с быстрой (в течение месяца) положительной динамикой процесса. Аллергический плеврит возникает у больных первичным туберкулезом при свежем заражении или хроническом течении первичной туберкулезной инфекции. Для этих больных характерна пышная туберкулиновая реакция, часто наблюдается эозинофилия. Экссудат чаще лимфоцитарный, иногда с примесью эозинофилов. Микобактерии в экссудате обычно не обнаруживаются. Нередко экссудативному плевриту у этих больных сопутствуют и другие проявления первичного туберкулеза: фликтены, узловатая эритема, полиартрит.

Перифокальный плеврит – это следствие вовлечения в воспалительный процесс плевральных листков у больных легочными формами туберкулеза. Течение такого плеврита длительное, может носить рецидивирующий характер. Рентгенологическое исследование грудной клетки у этих больных выявляет одну из форм туберкулезного поражения легких (очаговое, инфильтративное или кавернозное). Экссудат в большинстве случаев серозный, лимфоцитарный, микобактерии, как правило, не выявляются.

Туберкулез плевры может быть единственным проявлением заболевания, но возможно его сочетание с другими локализациями туберкулезного поражения. Морфологический субстрат туберкулеза плевры представлен более или менее крупными туберкулезными очагами с элементами казеозного некроза. Наряду с этим в плевре выражена экссудативная реакция, обусловливающая накопление выпота. В зависимости от размеров очагов и распространенности поражения экссудат может быть и серозным, и гнойным с преобладанием нейтрофилов. В экссудате нередко обнаруживаются микобактерии туберкулеза. Особое место среди плевритов туберкулезной природы занимает эмпиема плевры, развивающаяся при блокаде естественных механизмов резорбции экссудата. При всех вариантах туберкулезного плеврита большое значение имеют обнаружение микобактерий, их антигенов или антител к ним в экссудате, обнаружение внеплевральных форм туберкулеза, получение специфических результатов биопсии плевры.

Известно, что около 40 % пневмоний протекают с более или менее выраженным плевритом. При этом в зависимости от этиологии пневмонии частота возникновения плеврита варьирует от 10 % (Klebsiella pneumoniae) до 70–95 % (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus). При нижнедолевых пневмониях плевральный выпот обычно не диагностируется. Диагностическое значение имеет обнаружение пневмонического фокуса в паренхиме легкого. В плевральном содержимом возможно бактериологическое обнаружение возбудителя. При этом чаще положительные результаты культуральных исследований получаются при анаэробной флоре (до 70 %) и реже – при пневмококковой инфекции (4 %). Существенный вклад в диагностику этиологии плеврита вносят определение антигенов микроорганизмов и антител к ним в экссудате, а также быстрый ответ на адекватную антибактериальную терапию.

Плевриты грибковой природы возникают преимущественно у лиц с признаками недостаточности иммунитета. К группе риска относятся лица, длительно получающие иммунодепрессанты, кортикостероиды, после трансплантации внутренних органов, а также с хроническими заболеваниями, ведущими к снижению противогрибкового иммунитета (сахарным диабетом, ВИЧ-инфицированные и др.). Течение заболевания имеет много общего с туберкулезом. Обычно микотический плеврит сочетается с грибковым поражением паренхимы легких. Решающее значение в диагностике имеет обнаружение грибов в повторных культуральных исследованиях плеврального содержимого. При наличии свищей (актиномикозе) культуральное исследование отделяемого позволяет верифицировать диагноз. Серодиагностика имеет вспомогательное значение.

Этиологическая структура паразитарных поражений плевры определяется эпидемиологическими особенностями паразитарных болезней. В России наиболее часто наблюдаются плевриты при амебиазе, эхинококкозе, парагонимозе. Основные дифференциально-диагностические признаки этих болезней следующие.

Амебный плеврит возникает обычно при прорыве через диафрагму амебного абсцесса печени. Это сопровождается резкой болью в правом подреберье, одышкой. Плевральный выпот имеет вид шоколадного сиропа, содержит частицы паренхимы печени, нейтрофилы. Амебы определяются лишь в 10 % случаев. Серодиагностика обычно помогает уточнить этиологический диагноз.

Эхинококковые поражения плевры возникают при прорыве эхинококковой кисты легкого, печени или селезенки в плевральную полость. Реже киста развивается первично в плевральной полости. При прорыве кисты в плевральную полость возникают острая боль, одышка. Нередко прорыв нагноившейся кисты ведет к формированию эмпиемы. Наличие субплеврально расположенной эхинококковой кисты часто ведет к образованию бронхоплеврального свища. Диагностическое значение имеют обнаружение в экссудате, биоптате плевры сколексов с крючьями паразита, оболочек эхинококковой кисты, а также положительные результаты серодиагностики.

Экссудативный плеврит – типичное проявление парагонимоза. В России эндемичные очаги этой инфекции расположены на Дальнем Востоке. У 40 % больных парагонимозом диагностируется сухой мигрирующий рецидивирующий плеврит. У трети больных парагонимозом экссудативный плеврит сочетается с очаговыми и инфильтративными поражениями легких. Для этих плевритов характерно длительное течение с образованием мощных плевральных сращений. Экссудат преимущественно эозинофильный. Диагностика основана на обнаружении в плевральной жидкости и мокроте яиц паразита и на повышении титров антител к антигенам паразита.

Экссудативные плевриты – нередкое проявление системных заболеваний соединительной ткани. Системная красная волчанка (СКВ) до 50 % случаев протекает с поражением плевры. Плевральный выпот у таких больных чаще двусторонний, экссудат серозный, лимфоцитарный. Обнаружение клинико-лабораторных признаков СКВ, особенно противоядерных антител и LE-клеток, позволяет установить природу плеврита. Особенностью волчаночного плеврита является высокая эффективность кортикостероидной терапии.

Экссудативный плеврит при ревматоидном полиартрите имеет склонность к хроническому рецидивирующему течению. Экссудат серозный, лимфоцитарный, с низким содержанием глюкозы и высокими титрами ревматоидного фактора. Эффективность применения кортикостероидов непостоянная. В диагностике важен учет других проявлений ревматоидного полиартрита. Экссудативный плеврит при ревматизме имеет минимальное количество специфических признаков. Диагностика основана на учете клиники ревматизма и исключении других возможных причин плеврита. При гистологическом исследовании биоптатов плевры специфические гранулемы обнаруживаются очень редко.

Таким образом, дифференциальная диагностика плевральных выпотов должна осуществляться последовательно, с учетом клинических, лабораторных и инструментальных данных до получения абсолютных диагностических признаков заболевания. Важными элементами диагностики являются выявление и идентификация внеплевральных признаков заболевания, приведшего к появлению плеврального выпота.

Несмотря на большую дополнительную информацию, получаемую при исследовании плеврального содержимого и биоптатов плевры, не всегда удается получить абсолютные диагностические признаки. При отсутствии абсолютных диагностических признаков нозологической принадлежности плеврита (микрофлора, специфические гранулемы или опухолевые клетки) диагноз устанавливается по сумме косвенных признаков, в том числе и по эффективности пробной терапии.

Перитонит

Скопление жидкости возможно и в полости брюшины.

Перитонит – это воспаление брюшины.

Классификация перитонитов.

1. По происхождению:

– вторичный перитонит: как следствие острого хирургического заболевания; как следствие перфорации полого органа;

– послеоперационный перитонит вследствие несостоятельности швов полых органов; вследствие прогрессирования воспалительного процесса;

– криптогенный перитонит, когда источник перитонита не выявлен.

2. По характеру экссудата:

– серозный перитонит;

– геморрагический перитонит;

– фибринозный перитонит;

– гнойный перитонит;

– гнилостный перитонит;

– каловый перитонит;

– желчный перитонит;

– мочевой перитонит.

3. По распространенности процесса:

– местный перитонит: занимает 1–2 смежные анатомические области (неотграниченный); отграниченный (инфильтрат или абсцесс брюшной полости);

– диффузный перитонит: занимает 2–3 смежные анатомические области;

– разлитой перитонит: занимает не менее трех анатомических областей до 2/3 брюшины, или один из этажей брюшной полости;

– общий перитонит (воспаление всей брюшины).

4. По стадиям развития:

– реактивная фаза;

– токсическая фаза;

– терминальная фаза.

Клиническая картина перитонита наслаивается на проявления основного заболевания (острый аппендицит, острый холецистит и т. д.). Характеризуется нарастающими болями в животе, симптомами интоксикации, тошнотой и рвотой, вздутием живота, гипертермией. При обследовании больного выявляются сухой язык, тахикардия, живот при пальпации напряжен (доскообразный живот) и болезнен, определяются симптомы раздражения брюшины (симптом Щеткина – Блюмберга, симптом Раздольского). В поздние стадии присоединяются парез и паралич желудочно-кишечного тракта, в анализах крови отмечаются лейкоцитоз, сдвиг лейкоцитарной формулы влево, токсическая зернистость нейтрофилов, увеличивается лейкоцитарный индекс интоксикации, повышается СОЭ.

Лечение

Лечение перитонита только оперативное, которое состоит из трех основных этапов:

1) ликвидации источника перитонита: аппендэктомия, холецистэктомия, ушивание перфоративного отверстия и т. д.;

2) санации брюшной полости, которая состоит в эвакуации экссудата, при разлитом и общем перитонитах необходимо промывание брюшной полости растворами антисептиков;

3) адекватного дренирования отлогих участков брюшной полости: подпеченочного и поддиафрагмального пространств, боковых каналов, полости малого таза.

После операции проводят инфузионную дезинтоксикационную терапию, антибактериальную терапию, стимуляцию моторики желудочно-кишечного тракта, стимуляцию защитных сил организма, парентеральное питание.

Перикардит

Перикардит – это воспаление сердечной сумки, сопровождаемое выпотом (серозным, фибринозным, гнойным, геморрагическим); наблюдается как сопутствующее явление при остром суставном ревматизме, скарлатине, кори, септицемии, цинге, левостороннем плеврите, пневмонии, страданиях клапанов, бугорчатке. Симптомы: боль в области сердца, лихорадка, цианотический вид, одышка, учащенный пульс, шум. Часто перикардит заканчивается смертью.

Возбудители инфекционных перикардитов у человека – кокки, вирусы, микобактерии туберкулеза и др. В их развитии играет роль сенсибилизация перикарда продуктами белкового распада тканей и бактериальными токсинами; такой аллергический механизм может играть и самостоятельную патогенетическую роль. Чаще других встречается ревматический перикардит. К неинфекционным относят перикардит при уремии, инфаркте миокарда, травматический, послеоперационный и др. Кроме того, выделяют идиопатический доброкачественный перикардит, причины которого еще не ясны. Фибринозный перикардит связан с отложением на листках перикарда сухого налета (фибрина). Такое явление наблюдается при туберкулезе, уремии, инфаркте миокарда и других заболеваниях. Экссудативный перикардит, при котором щель между листками перикарда заполняется выпотом (экссудатом), может быть серозным или серозно-фибринозным (туберкулезный, ревматический, идиопатический и др.), геморрагическим (туберкулезный, при опухолях и др.), гнойным и гнилостным (при абсцессе легкого и др.). При экссудативном перикардите исходом заболевания могут быть полное рассасывание выпота или образование спаек и сращений листков перикарда. Лечение зависит от причины перикардита: противоревматическое, противотуберкулезное и др.; применяют антибиотики, противоаллергические, противовоспалительные, симптоматические средства, при необходимости удаляют экссудат с помощью пункции или хирургическим путем.

Классификация перикардитов

По характеру экссудата:

1) серозный;

2) геморрагический;

3) слипчивый;

4) гнойный;

5) фибринозный перикардит (панцирное сердце).

Клиническая картина

Ведущим проявлением перикардита является нарушение деятельности сердца, или сердечная недостаточность, проявляющаяся одышкой, синюшностью кожных покровов, сердцебиением, слабостью, утомляемостью, отеками на нижних конечностях.

При обследовании выявляется тахикардия, при аускультации – ослабление сердечных тонов, шум трения перикарда, при перкуссии – расширение границ сердца. При рентгенографии органов грудной клетки в двух проекциях отмечается шарообразная форма сердца.

Лечение

В начальных стадиях проводят консервативное лечение. При скоплении экссудата производят пункцию полости перикарда, при фибринозно-гнойном перикардите выполняют торакотомию, перикардотомию с эвакуацией экссудата. После пункции или операции проводят антибактериальную, дезинтоксикационную, кардиогенную терапию.

Необходимо помнить о целесообразности определения в плевральной жидкости активности амилазы, так как плевральный выпот нередко связан с острым панкреатитом. В этом случае активность амилазы в плевральной жидкости выше в два и более раза, чем в сыворотке крови. Повышение содержания амилазы в плевральной жидкости может быть при перфорации пищевода, в этих случаях фермент поступает из слюнной железы с проглоченной слюной и попадает в плевральную полость уже через 2 ч после наступления перфорации. Поэтому при подозрении на перфорацию пищевода необходимо определить активность амилазы в плевральной жидкости. Установить источник происхождения амилазы в выпоте можно при определении активности общей и панкреатической амилазы.

Характеристика ферментативного экссудата при остром панкреатите

Наличие ферментативного экссудата подтверждает острый панкреатит.

Общие признаки ферментативного экссудата:

1) высокая активность амилазы (в 2–3 раза выше амилазы крови);

2) слабощелочной характер (рН > 7,0);

3) высокая концентрация белка (более 20 г/л);

4) отсутствие фибрина;

5) стерильность.

При нетяжелом панкреатите ферментативный экссудат или отсутствует, или если имеется, то в небольшом количестве, как правило серозный.

Количество ферментативного экссудата и интенсивность его окраски (от слабо-розовой до черной) прямо пропорциональны тяжести острого панкреатита.

У больных тяжелым панкреатитом ферментативный экссудат (несколько капель в пробирку с кровью) вызывает гемолиз крови.

Гнойные экссудаты

Одним из самых распространенных инфекционных процессов, наблюдающихся в настоящее время, является продукция гнойного (иногда серозно-гнойного) экссудата как результат бактериального инфицирования полости, ткани или органа тела. Такие инфекции могут проявляться в виде достаточно простых и безобидных папул или множества гнойных карманов в абсцессах в одном или нескольких анатомических участках.

Экссудат состоит из белых кровяных телец, преимущественно полиморфно-ядерных лейкоцитов, инородных организмов (микробов) и смеси транссудата с фибрином. В одних случаях экссудат может накапливаться в межклеточном пространстве в пределах ткани, например фурункул или подкожный нарыв, в то время как в других случаях экссудат образуется в связи с открытыми ранами, из которых вытекают мутная жидкость или гной.

Как анатомические участки, вовлеченные в экссудативные процессы, так и микроорганизмы, вызывающие эти процессы, могут быть весьма разнообразными.

Согласно рекомендациям ВОЗ, все наиболее часто встречающиеся бактериальные патогены разделены по уровням приоритетности.

1. Патогены высокого уровня приоритетности:

– пиогенный стрептококк;

– золотистый стафилококк.

2. Патогены среднего уровня приоритетности:

– энтеробактерии;

– псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии;

– клостридии;

– бактероиды и другие анаэробы;

– стрептококки (других видов).

3. Патогены низкого уровня приоритетности:

– Bacillus anthracis;

– Mycobacterium tuberculosis, Mulcerans и др.;

– Pasteurella multocida.

Возбудители вирусных инфекций в отличие от грибов и бактерий очень редко являются продуцентами гнойного экссудата.

Взаимосвязь лечащего врача и врача-лаборанта особенно важна при постановке диагноза и выборе тактики лечения больного при наличии заболевания, сопровождающегося гнойной инфекцией. Врач-лаборант должен сотрудничать с клиницистом, чтобы обеспечить взятие материала по всем правилам и его незамедлительную доставку в лабораторию для безотлагательного проведения необходимых исследований.

Современный протокол микробиологического исследования клинического материала, полученного от пациентов с раневой инфекцией

Хирургический материал может быть получен при пункции местных абсцессов или во время других хирургических процедур. Хирургу следует посоветовать отбирать несколько маленьких кусочков различных тканей и имеющиеся образцы гнойного экссудата. Если возможно, то не следует пользоваться ватным тампоном. Экссудат необходимо отбирать стерильным шприцем с иглой. Если использован ватный тампон, следует отбирать как можно больше экссудата и поместить тампон в соответствующую емкость для отправки в лабораторию. Некоторые примеры клинических состояний и обнаруживаемые при этом микроорганизмы в различных образцах хирургического материала приведены ниже.

Перитонеальная полость наиболее часто содержит грамотрицательные кишечные бактерии, грамотрицательные анаэробные палочки (Bacteroides fragilis) и клостридии.

Межклеточный абсцесс может содержать любые микроорганизмы как одного вида, так и смешанные: наиболее часто выделяются грамположительные кокки и грамотрицательные бактерии. Необходимо учитывать возможность присутствия анаэробных бактерий и амеб в зависимости от места расположения абсцессов.

Лимфатические узлы наиболее часто вовлекаются при системных инфекциях. Они увеличиваются в размерах и часто имеют тенденцию к аккумулированию гнойного экссудата. Если лимфатический узел флюктуирует, содержащаяся в нем жидкость может быть пунктирована лечащим врачом. Биоптат или пунктат лимфатического узла ребенка следует исследовать на наличие Mycobacterium tuberculosis или других микобактерий. Дополнительно материал исследуют на наличие стафилококков, стрептококков и грамотрицательных кишечных бактерий.

Кожные покровы и подкожная клетчатка являются локусами как для абсцессов, так и для раневых инфекций. Подкожные абсцессы, как правило, вызываются стафилококками. Открытые, поврежденные, мокнущие кожные покровы часто поражены β-гемолитическим стрептококком и (или) стафилококком, как при импетиго. Другие разновидности кожных поражений, требующие хирургического вмешательства, часто рассматриваемые как результат внутрибольничных инфекций, – это пролежни. Бактерии, являющиеся комменсалами кожи или представителями нормальной микрофлоры кишечника, обладают способностью к пролиферации на поверхности язвы, что вызывает ее неприятный запах и вид.

Ожоги склонны к инфицированию различными видами бактерий. Наиболее часто обнаруживаемыми бактериальными агентами являются стафилококки и синегнойная палочка.

Выпоты. Иногда серозная или гнойная жидкость собирается в полостях, в которых в норме содержится очень малый объем стерильной жидкости, например в перикардиальной сумке, плевральной полости, суставах или синовиальных сочленениях. Пунктирование полости иглой в асептических условиях позволяет взять для исследования материал, из которого может быть выделен и идентифицирован возбудитель. Обычно причиной появления выпотов являются бактерии, однако грибы и вирусы также могут быть ответственными за этот процесс. Такие инфекции, как правило, моноспецифичны, но могут встречаться и смешанные (аэробы и анаэробы) случаи. Пункция плевральной полости, например, может выявить пневмококки, зеленящие стрептококки, гемофильные палочки, анаэробные стрептококки и бактероиды.

Взятие и транспортировка материала

Взятие материала требует тесного сотрудничества лаборатории и клинического отделения. Во множестве случаев это единственная возможность получить материал для исследования, поскольку во многих ситуациях «повторного» материала для исследования просто не будет. В связи с этим выполненное по всем правилам взятие материала, его транспортировка и хранение чрезвычайно важны, и каких-либо отступлений от принятой процедуры следует избегать.

Абсцессы. В случае обнаружения абсцесса хирургу или лечащему врачу следует проконсультироваться с бактериологом, чтобы определить дальнейшие действия. Техника забора гноя и кусочков ткани из абсцесса аналогична той, что применяется при хирургической операции. Максимально возможное количество гнойного материала следует забирать шприцем, взятый материал переносят в стерильную емкость в асептических условиях. В том случае, если стерильной емкости не оказалось, взятый материал может быть оставлен в шприце с закрытой иглой. В этом случае сам шприц доставляют в лабораторию.

Следует принять меры к недопущению забора малого количества материала с помощью тампона, когда в действительности имеется большой объем экссудата. Тампон в виде исключения может быть использован только для сбора гноя, когда имеется скудное его количество или когда гной отбирают из анатомической области, требующей обращения с особой осторожностью, например из глаза. Когда кусочки ткани из области абсцесса получены, их необходимо измельчить в маленьком объеме стерильного бульона, используя для этого стерильные ножницы.

Инфицированные рваные, проникающие ранения, послеоперационные раны, ожоги, пролежни. После тщательной обработки операционного поля хирург определяет места, где скапливается гной, расположены некротические ткани, выделяется газ (крепитация) или наблюдаются другие признаки инфекции. Частицы пораженных тканей, предназначенные для лабораторного исследования, помещают в стерильную марлю и затем в стерильную емкость. Гной или другой экссудат должны быть аккуратно собраны и помещены в стерильную пробирку. При необходимости могут быть использованы тампоны.

Свищи или отделяемое лимфатических узлов. В тех случаях, когда свищи или воспаленные лимфатические узлы самопроизвольно дренируются, этот материал должен быть тщательно собран с помощью стерильной пастеровской пипетки с резиновой грушей и помещен в стерильную пробирку. Если самопроизвольного дренирования не произошло, хирургу следует получить материал, используя стерильный шприц с иглой или зонд. Использования тампона по возможности следует избегать.

Выпоты. Большой объем скопившейся жидкости в полостях тела, таких как плевральная полость, брюшная полость, коленный сустав, требует вмешательства хирурга, который в асептических условиях производит прокол, собирает жидкость в стерильную емкость и организует ее быструю доставку в лабораторию для микробиологического и цитологического исследований. В тех случаях, когда продукция экссудата постоянно продолжается и поставлен открытый дренаж, необходимо собрать дренажную жидкость в асептических условиях в стерильную пробирку и отправить ее в лабораторию.

Макроскопическое исследование

Провести оценку образцов гноя или отделяемого ран, отобранных с помощью тампона, очень трудно, особенно когда тампоны были помещены в транспортную среду. Если же образцы гноя получены в стерильной емкости или шприце, бактериологу следует внимательно исследовать их для выявления особенностей цвета, консистенции и запаха.

Цвет. Цветовая гамма гноя может варьировать от желто-зеленого до красно-коричневого. Красный цвет обычно является следствием наличия в нем крови или гемоглобина. Пунктат из первичного амебиазного печеночного абсцесса имеет светло-коричневый или темно-коричневый цвет и желатинообразную консистенцию. Гной из послеоперационных или травматических ран (ожогов) может быть окрашен в зелено-голубой цвет за счет пигмента пиоцианина, вырабатываемого синегнойной палочкой.

Консистенция. Консистенция гноя может варьировать от очень жидкой до очень густой и клейкой. Экссудаты, полученные из суставов, плевральной полости, перикардиального мешка или брюшины, обычно жидкие с возможной градацией от серозных до гнойных.

Гной, полученный из дренажа свищей шейной области, необходимо исследовать на наличие маленьких желтых гранул «серы», которые являются колониями Actinomyces israelii. Наличие серых гранул позволяет поставить предположительный диагноз шейно-лицевого актиномикоза. Мелкие гранулы различного цвета (белого, черного, красного или коричневого) типичны для мицетомы – гранулематозной опухоли, которая обычно поражает нижние конечности (так называемая мадурская стопа) и характеризуется множественными абсцессами и самодренирующимися свищами. Цвет гранул определяется наличием в них «волокнистых» бактерий или мицелиальных грибов. Гной из туберкулезного «холодного абсцесса» (с наличием нескольких характерных признаков воспаления) иногда сравнивают с мягким сыром и называют «казеиновым гноем».

Запах. Отвратительный фекальный запах – один из главных характерных признаков анаэробной или смешанной инфекции. О характерном запахе вместе с результатами микроскопии мазка, окрашенного по Граму, бактериолог должен сразу же сообщить лечащему врачу, поскольку это может повлиять на выбор схемы эмпирической антибактериальной терапии.

Микроскопическое исследование

Каждый образец следует окрашивать по Граму и подвергать микроскопии.

Прямая микроскопия. По требованию лечащего врача или когда имеются основания предполагать наличие грибковой или паразитарной инфекции, следует проводить микроскопию нативного материала. Когда исследуют гной на наличие грибов, его смешивают с каплей 10 %-ной гидроокиси калия.

Сверху материал покрывают покровным стеклом и, используя объектив 10° и 40°, внимательно исследуют на наличие:

1) активно движущихся амеб в пунктате из печеночного абсцесса;

2) дрожжевых клеток Histoplasma capsulatum, var. Duboisii, Blastomyces dermatidis, Candida spp.;

3) грибковых гифов и бактериальных нитей в раздавленных гранулах мицетомы;

4) паразитов, таких как микрофилярии, крючья Echinococcus, яйца Schistosoma, Fasciola и Paragonimus.

Окраска по Граму. Приготовленный мазок микроскопируют в иммерсионном масле, используя объектив 100°. Внимательно просматривают мазок, отмечая наличие и количество (+) следующих клеток:

1) полиморфно-ядерные гранулоциты (клетки гноя);

2) грамположительные кокки, расположенные в виде виноградной грозди (предположительно стафилококки);

3) грамположительные кокки, расположенные в виде цепочек (предположительно стрептококки);

4) грамотрицательные палочки, сходные с колиформами или облигатными анаэробами (бактероиды);

5) крупные прямые грамположительные палочки с «обрубленными» концами – предположительно клостридии или бациллы;

6) разнообразные бактериальные клетки, включая веретенообразные формы палочек. Такая картина свидетельствует о смешанной анаэробной флоре.

Candida или другие дрожжевые клетки, которые выглядят как овальные грамположительные почкующиеся сферы, часто формируют дочерний псевдомицелий.

Серные гранулы актиномицетов или гранулы мицетомы должны быть раздавлены на стекле, окрашены по Граму и исследованы на наличие тонких фрагментарных грамположительных волокон.

Бактериологическое исследование

Посев. В том случае, когда при микроскопическом исследовании обнаружены бактерии или грибы, материал следует засеять на соответствующие питательные среды. Независимо от результатов микроскопического исследования все пробы гноя или экссудата следует посеять как минимум на 3 питательные среды:

1) кровяной агар для выделения стрептококков и стафилококков;

2) агар Мак-Конки для выделения грамотрицательных палочек;

3) бульон, который может служить средой обогащения как для аэробов, так и для анаэробов, например тиогликолевый бульон.

Другие питательные среды следует использовать исходя из результатов микроскопического исследования и нозологической формы инфекции, например в случаях, перечисленных ниже.

При подозрении на наличие стафилококков целесообразно использовать желточно-солевой (магнитно-солевой) агар для получения роста чистой культуры и для предварительной дифференциации между золотистым и другими стафилококками.

При подозрении на наличие стрептококков их идентификацию можно ускорить, положив дифференцирующий диск с бацитрацином на чашку с первичным посевом (кровяная среда).

При подозрении на грибы материал следует засеять в 2 пробирки с агаром Сабуро. Одну из них инкубируют при +35–37 °C, другую – при комнатной температуре.

Гной у больных с артритами, плевритами, остеомиелитами, воспалением подкожной клетчатки, особенно полученный от детей в возрасте до 5 лет, следует высевать на шоколадный агар для выявления гемофильной палочки.

Культивирование в строго анаэробных условиях необходимо осуществлять, если в окрашенном по Граму материале обнаружена «смешанная анаэробная флора», а также когда этот материал имеет типичный неприятный запах. Анаэробный кровяной агар также необходим для роста Actimomyces spp. Анаэробное культивирование потребуется, если лечащий врач подозревает газовую гангрену (клостридии).

Оценка результатов. Выделенные микроорганизмы являются этиологическим агентом воспалительного процесса. При выделении ассоциации микроорганизмов из раневого отделяемого и выпотной жидкости ведущее значение в течении гнойно-воспалительного процесса следует отдавать видам, количественно преобладающим в данной ассоциации.

В лаборатории должен быть произведен подсчет степени обсемененности исследуемого материала. Имеются следующие критерии количественной оценки микробного роста при прямом штриховом посеве раневого отделяемого на 1/2 чашки Петри с плотной питательной средой:

1) степень 1 – очень скудный рост (на плотных питательных средах роста нет, рост только в бульоне);

2) степень 2 – небольшое количество – 10 колоний;

3) степень 3 – умеренное количество – от 11 до 100 колоний;

4) степень 4 – большое количество – более 100 колоний.

Показано, что уровень обсемененности тканей в ране, равный 105 и выше колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм содержимого, является критическим. Превышение этого уровня указывает на возможность генерализации инфекционного процесса. Аналогичного критерия для выпотов пока не найдено.

Определение чувствительности к антибиотикам. Колонии, выросшие на плотной питательной среде, идентифицируют и определяют чувствительность чистой культуры микроорганизма к антибиотикам. Используют или стандартный диско-диффузионный метод, предложенный Керби и Бауэром (метод Керби – Бауэра), или метод серийных разведений – коммерческие тест-системы («стрипы»), представляющие собой набор тех или иных антибиотиков, представленных в двух концентрациях. Этот метод (breakpoint) позволяет избежать трудоемкости стандартного метода серийных разведений, но не теряет при этом его главного достоинства – количественного определения минимальной подавляющей концентрации препарата, соответствующей терапевтической концентрации антибиотика в организме.

Глава 13

Исследование костного мозга

Развитие, cтроение, кровоснабжение и иннервация костного мозга

Красный костный мозг является центральным органом гемопоэза и иммуногенеза. В нем находится основная часть стволовых кроветворных клеток, происходит развитие клеток лимфоидного и миелоидного рядов. В красном костном мозге осуществляется универсальное кроветворение, т. е. все виды миелоидного кроветворения, начальные этапы лимфоидного кроветворения и, возможно, антигеннезависимая дифференцировка В-лимфоцитов. На этом основании красный костный мозг можно отнести к органам иммунологической защиты.

Развитие. Красный костный мозг развивается из мезенхимы, причем ретикулярная строма красного костного мозга развивается из мезенхимы тела зародыша, а стволовые кроветворные клетки развиваются из внезародышевой мезенхимы желточного мешка и уже затем заселяют ретикулярную строму. В эмбриогенезе красный костный мозг появляется на 2-м месяце в плоских костях и позвонках, на 4-м месяце – в трубчатых костях. У взрослых он находится в эпифизах трубчатых костей, губчатом веществе плоских костей. Несмотря на территориальную разобщенность, функционально костный мозг связан в единый орган благодаря миграции клеток и регуляторным механизмам. Масса красного костного мозга составляет 1,3–3,7 кг (3–6 % массы тела).

Строение. Строма красного костного мозга представлена костными балками и ретикулярной тканью. В ретикулярной ткани содержится множество кровеносных сосудов, в основном синусоидных капилляров, не имеющих базальной мембраны, но содержащих поры в эндотелии.

В петлях ретикулярной ткани находятся гемопоэтические клетки на разных стадиях дифференцировки – от стволовой до зрелых (паренхима органа). Количество стволовых клеток в красном костном мозге наибольшее (5 × 106). Развивающиеся клетки лежат островками, которые представлены дифферонами различных клеток крови.

Кроветворная ткань красного костного мозга пронизана синусоидами перфорированного типа. Между синусоидами в виде тяжей располагается ретикулярная строма, в петлях которой находятся гемопоэтические клетки. Отмечается определенная локализация разных видов кроветворения в пределах тяжей: мегакариобласты и мегакариоциты (тромбоцитопоэз) располагаются по периферии тяжей вблизи синусоид, гранулоцитопоэз осуществляется в центре тяжей. Наиболее интенсивно кроветворение протекает вблизи эндоста. По мере созревания зрелые форменные элементы крови проникают в синусоиды через поры базальной мембраны и щели между эндотелиальными клетками.

Эритробластические островки обычно формируются вокруг макрофага, который называется клеткой-кормилкой (кормилицей). Клетка-кормилка захватывает железо, попадающее в кровь из погибших в селезенке старых эритроцитов, и отдает его образующимся эритроцитам для синтеза гемоглобина.

Созревающие гранулоциты формируют гранулобластические островки. Клетки тромбоцитарного ряда (мегакариобласты, про- и мегакариоциты) лежат рядом с синусоидными капиллярами. Как отмечалось выше, отростки мегакариоцитов проникают в капилляр, от них постоянно отделяются тромбоциты. Вокруг кровеносных сосудов встречаются небольшие группы лимфоцитов и моноцитов.

Среди клеток костного мозга преобладают зрелые и заканчивающие дифференцировку клетки (депонирующая функция красного костного мозга). Они при необходимости поступают в кровь.

В норме в кровь поступают только зрелые клетки. Предполагают, что при этом в их цитолемме появляются ферменты, разрушающие основное вещество вокруг капилляров, что облегчает выход клеток в кровь. Незрелые клетки таких ферментов не имеют. Второй возможный механизм селекции зрелых клеток – появление у них специфических рецепторов, взаимодействующих с эндотелием капилляров. При отсутствии таких рецепторов взаимодействие с эндотелием и выход клеток в кровоток невозможны.

Наряду с красным существует желтый (жировой) костный мозг. Он обычно находится в диафизах трубчатых костей. Состоит из ретикулярной ткани, которая местами заменена на жировую. Кроветворные клетки отсутствуют. Желтый костный мозг представляет собой своеобразный резерв для красного костного мозга. При кровопотерях в него заселяются гемопоэтические элементы, и он превращается в красный костный мозг. Таким образом, желтый и красный костный мозг можно рассматривать как 2 функциональных состояния одного кроветворного органа.

Кровоснабжение. Красный костный мозг снабжается кровью из двух источников:

1) питающими артериями, которые проходят через компактное вещество кости и распадаются на капилляры в самом костном мозге;

2) прободающими артериями, которые отходят от надкостницы, распадаются на артериолы и капилляры, проходящие в каналах остеонов, а затем впадают в синусы красного костного мозга.

Следовательно, красный костный мозг частично снабжается кровью, контактировавшей с костной тканью и обогащенной факторами, стимулирующими гемопоэз.

Артерии проникают в костномозговую полость и делятся на 2 ветви: дистальную и проксимальную. Эти ветви спирально закручены вокруг центральной вены костного мозга. Артерии разделяются на артериолы, отличающиеся небольшим диаметром (до 10 мкм). Для них характерно отсутствие прекапиллярных сфинктеров. Капилляры костного мозга делятся на истинные капилляры, возникающие в результате дихотомического деления артериол, и синусоидные капилляры, продолжающие истинные капилляры. В синусоидные капилляры переходит только часть истинных капилляров, тогда как другая их часть входит в гаверсовы каналы кости и далее, сливаясь, дает последовательно венулы и вены. Истинные капилляры костного мозга мало отличаются от капилляров других органов. Они имеют сплошной эндотелиальный слой, базальную мембрану и перициты. Эти капилляры выполняют трофическую функцию.

Синусоидные капилляры большей частью лежат вблизи эндоста кости и выполняют функцию селекции зрелых клеток крови и выделения их в кровоток, а также участвуют в заключительных этапах созревания клеток крови, осуществляя воздействие на них через молекулы клеточной адгезии. Диаметр синусоидных капилляров составляет от 100 до 500 мкм.

На срезах синусоидные капилляры могут иметь веретеновидную, овальную или гексагональную форму, выстланы эндотелием с выраженной фагоцитарной активностью. В эндотелии имеются фенестры, которые при функциональной нагрузке легко переходят в истинные поры. Базальная мембрана или отсутствует, или прерывиста. С эндотелием тесно связаны многочисленные макрофаги. Синусоиды продолжаются в венулы, а те, в свою очередь, вливаются в центральную вену безмышечного типа. Характерно наличие артериоло-венулярных анастомозов, по которым может сбрасываться кровь из артериол в венулы, минуя синусоидные и истинные капилляры. Анастомозы являются важным фактором регуляции гемопоэза и гомеостаза кроветворной системы.

Иннервация. Афферентная иннервация красного костного мозга осуществляется миелиновыми нервными волокнами, образованными дендритами псевдоуниполярных нейронов спинальных ганглиев соответствующих сегментов, а также черепно-мозговыми нервами, за исключением 1, 2 и 8-й пар.

Эфферентная иннервация обеспечивается симпатической нервной системой. Симпатические постганглионарные нервные волокна входят в костный мозг вместе с кровеносными сосудами, распределяясь в адвентиции артерий, артериол и в меньшей степени вен. Они также тесно связаны с истинными капиллярами и синусоидами. Факт непосредственного проникновения нервных волокон в ретикулярную ткань поддерживается не всеми исследователями, однако в последнее время доказано наличие нервных волокон между гемопоэтическими клетками, с которыми они образуют так называемые открытые синапсы. В таких синапсах нейромедиаторы из нервной терминали свободно изливаются в интерстиций, а затем, мигрируя к клеткам, оказывают на них регуляторное влияние. Большинство постганглионарных нервных волокон адренергические, однако часть из них является холинергическими. Некоторые исследователи допускают возможность холинергической иннервации костного мозга за счет постганглионаров, происходящих из параоссальных нервных ганглиев.

Прямая нервная регуляция кроветворения до сих пор ставится под сомнение, несмотря на обнаружение открытых синапсов. Поэтому считается, что нервная система оказывает трофическое влияние на миелоидную и ретикулярную ткани, регулируя кровоснабжение костного мозга. Десимпатизация и смешанная денервация костного мозга ведут к деструкции сосудистой стенки и к нарушению гемопоэза. Стимуляция симпатического отдела вегетативной нервной системы приводит к усилению выброса из костного мозга в кровоток клеток крови.

Регуляция кроветворения. Молекулярно-генетические механизмы кроветворения в принципе те же, что и любой пролиферирующей системы. Их можно свести к следующим процессам: репликация ДНК, транскрипция, сплайсинг РНК (вырезание из первоначальной молекулы РНК интронных участков и сшивка оставшихся частей), процессинг РНК с образованием специфических информационных РНК, трансляция – синтез специфических белков.

Цитологические механизмы кроветворения заключаются в процессах деления клеток, их детерминации, дифференцировке, росте, запрограммированной гибели (апоптозе), межклеточных и межтканевых взаимодействиях с помощью молекул клеточной адгезии и др.

Существует несколько уровней регуляции кроветворения:

1) геномно-ядерный уровень. В ядре кроветворных клеток, в их геноме заложена программа развития, реализация которой приводит к образованию специфических клеток крови. К этому уровню в конечном итоге приложены все остальные регуляторные механизмы. Показано существование так называемых факторов транскрипции – связывающихся с ДНК белков различных семейств, функционирующих с ранних стадий развития и регулирующих экспрессию генов кроветворных клеток;

2) внутриклеточный уровень сводится к выработке в цитоплазме кроветворных клеток специальных триггерных белков, влияющих на геном этих клеток;

3) межклеточный уровень включает действие кейлонов, гемопоэтинов, интерлейкинов, вырабатываемых дифференцированными клетками крови или стромы и влияющих на дифференцировку стволовой кроветворной клетки;

4) организменный уровень заключается в регуляции кроветворения интегрирующими системами организма: нервной, эндокринной, иммунной, циркуляторной.

Следует подчеркнуть, что эти системы работают в тесном взаимодействии. Эндокринная регуляция проявляется в стимулирующем влиянии на гемопоэз анаболических гормонов (соматотропина, андрогенов, инсулина, других ростовых факторов). С другой стороны, глюкокортикоиды в больших дозах могут подавлять кроветворение, что используется в лечении злокачественных поражений кроветворной системы. Иммунная регуляция осуществляется на межклеточном уровне, проявляясь выработкой клеток иммунной системы (макрофагами, моноцитами, гранулоцитами, лимфоцитами и др.) медиаторов, гормонов иммунной системы, интерлейкинов, которые контролируют процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза кроветворных клеток.

Наряду с регуляторными факторами, вырабатывающимися в самом организме, на гемопоэз оказывает стимулирующее влияние целый ряд экзогенных факторов, поступающих с пищей. Это прежде всего витамины (В_12, фолиевая кислота, оротат калия), которые участвуют в биосинтезе белка, в том числе и в кроветворных клетках.

Методы исследования костного мозга

Пункция костного мозга

Наиболее полное представление о состоянии кроветворной системы дают изучение пунктата костного мозга (из грудины) и трепанобиопсия, которыми широко пользуются в гематологической клинике.

Пункцию грудины по методу Аринкина производят при помощи иглы Кассирского, которая удобна и безопасна, так как имеет предохранительный щиток. Щиток-ограничитель может быть установлен на требуемую глубину проникновения в зависимости от толщины кожи и подкожной клетчатки и предохраняет от прокола задней пластинки грудины. Костный мозг забирают шприцем емкостью 10–20 мл. Для обеспечения требуемого вакуума предварительно удостоверяются, что шприц не пропускает воздуха.

Производят прокол рукоятки или тела грудины на уровне 3–4-го ребра по средней линии. Передняя стенка тела грудины тоньше и имеет ровную или слегка вогнутую поверхность, наиболее удобную для пункции. Кроме того, эта область костного мозга содержит большее количество клеток. Во время пункции грудины больной лежит на спине.

У детей существует опасность прокола грудины ввиду ее меньшей плотности и индивидуальных различий в толщине кости.

Поэтому у детей, особенно у новорожденных и грудных, предпочтительно делать пункцию в верхней трети большеберцовой кости, с внутренней стороны дистального эпифиза бедренной кости или пяточной кости.

Пункцию подвздошной кости производят на 1–2 см кзади от передней верхней ости ее гребешка. Можно пунктировать ребра и остистые отростки позвонков (удобнее – 3–4-й поясничные позвонки).

Пункция остистых отростков. При пункции остистых отростков позвонков пациент занимает сидячее положение, наклонившись вперед. Место пункции дезинфицируют спиртом и йодной настойкой. Затем кожу, подкожную клетчатку и надкостницу при помощи тонкой иглы инфильтрируют 1–2 %-ным раствором новокаина в количестве 2 мл. Для анестезии кожи можно применять хлорэтил. Пункцию производят и без обезболивания.

Шприц и пункционную иглу (игла Кассирского) стерилизуют сухим методом или кипячением и тщательно высушивают спиртом, а затем эфиром. Перед тем как сделать укол, при помощи винтовой нарезки предохранитель-ограничитель устанавливают на необходимую глубину прокола. Иглу направляют перпендикулярно к грудине по ее средней линии, быстрым движением прокалывают кожу и подкожно-жировой слой и проходят наружную пластинку грудины. В этот момент уменьшается сопротивление, и игла, как бы проваливаясь, входит в полость костного мозга. При этом она устанавливается вертикально и неподвижно.

Если игла не находится в неподвижном состоянии, то, не вынимая ее, отодвигают предохранитель несколько выше и вновь продвигают иглу в полость костного мозга.

Следует помнить, что при наличии рака, миеломной болезни, остеомиелита и других остеолитических процессов игла, попадая в очаг поражения, встречает меньшее сопротивление и плохо фиксируется в кости.

После того как игла войдет в полость костного мозга, вынимают мандрен и плотно насаживают шприц. Далее оттягивают поршень шприца и насасывают не более 0,5–1 мл костного мозга (при большем количестве пунктата в нем может содержаться больше периферической крови). Если не удается получить костный мозг, то, не вынимая иглы, снимают шприц, вставляют вновь мандрен и, не вынимая иглы, переводят ее в другое положение – выше, ниже или в стороны. Затем снова с помощью шприца насасывают немного пунктата. После взятия костного мозга иглу, не разъединяя со шприцем, извлекают из грудины, а место прокола закрывают стерильной наклейкой. Полученный материал переносят на часовое стекло, затем выбирают кусочки костного мозга и готовят из них тонкие мазки. Если пунктат содержит примесь крови, то последнюю удаляют с помощью фильтровальной бумаги или отсасывают пастеровской пипеткой. Если же получено большое количество жидкого костного мозга, то методом лейкоконцентрации отделяют клетки от плазмы и уже из осадка делают мазки. Очень большое практическое значение имеет правильное приготовление мазка из ткани костного мозга, иначе примесь периферической крови не даст точного представления о клеточном составе костного мозга. В хорошо приготовленном препарате клетки расположены густо, но отдельно, и их структура хорошо видна.

Рекомендуется делать как можно больше мазков, использовав для этого весь полученный материал костного мозга. Мазки необходимо готовить быстро, так как свертывание костного мозга наступает быстрее, чем периферической крови. При этом клетки повреждаются настолько, что их невозможно дифференцировать.

При гипопластических и апластических состояниях костного мозга мазки содержат небольшое количество клеток, а иногда они полностью отсутствуют. Вопрос о том, является ли это следствием патологических процессов или результатом неправильно проведенной пункции, можно решить при повторной пункции. Мазки пунктата фиксируют и окрашивают так же, как и мазки периферической крови.

Для замедления свертывания пунктата костного мозга, которое создает известные трудности при его исследовании, В. И. Каро рекомендует следующий простой прием: на часовое стекло, покрытое парафином, перед пункцией насыпают очень тонким слоем (припудривают) порошкообразный цитрат натрия. Полученный при пункции костный мозг сразу же помещают на часовое стекло поверх цитрата натрия, который, растворяясь в жидкой части пунктата, тормозит его свертывание. Мельчайшие кристаллики цитрата натрия не мешают приготовлению мазков, не деформируют клеток.

Трепанобиопсия подвздошной кости. Прижизненное изучение гистологических препаратов, полученных методом трепанобиопсии, становится необходимым в тех случаях, когда при пункции не удается получить достаточное количество костного мозга, подтверждающее тот или иной патологический процесс. Гистологический метод приобретает особо важное значение при таких заболеваниях, как лейкозы, эритремия, остеомиелосклероз, гипо- и апластические процессы и др.

Для прокола и извлечения кусочка костной ткани М. Г. Абрамов предложил пользоваться иглой-троакаром. Игла сконструирована по принципу стернальной иглы Кассирского. Толщина иглы-троакара – 3 мм, внутренний диаметр – 2 мм, длина – 6 см. Периферический конец иглы имеет подобие фрезы и спиралевидное очертание, благодаря чему игла приобретает способность при ее вращении срезать костную ткань. Составными частями иглы являются мандрен (стилет с заостренным концом) и рукоятка. В. А. Ершов, Н. А. Климков модернизировали иглу-троакар Абрамова, сделав ее более удобной в работе. Игла отличается от описанной выше тем, что мандрен ее ввинчивается в нижний конец рукоятки и при проколе кортикального слоя быстро извлекается из иглы без предварительной разборки, что ускоряет процесс трепанобиопсии.

Прокол производят в гребешок подвздошной кости, отступив 2–3 см кзади от ее передней верхней ости. Технически удобнее прокалывать левую подвздошную кость. Место прокола дезинфицируют спиртом и йодной настойкой. Предварительно иглу стерилизуют сухим методом или кипячением и высушивают спиртом и эфиром. На сухой игле при помощи винтовой нарезки устанавливают щиток-ограничитель на необходимую глубину прокола с учетом толщины подкожного жира. Перед введением иглы-троакара производят анестезию кожи, подкожной клетчатки и надкостницы 2 %-ным раствором новокаина. Проникнув иглой-троакаром в мягкие ткани, нащупывают концом заостренного мандрена место кости, где должен быть произведен прокол. Иглу вводят в костную ткань под некоторым давлением вращательными движениями. При появлении ощущения прочной фиксации иглы мандрен извлекают. Разъединив мандрен и ручку, последнюю вновь навинчивают на иглу, зафиксированную в кости.

Производя вращательное движение по часовой стрелке, иглу без большого труда удается ввести в спонгиозное вещество костной ткани. После этого вращательным движением иглу извлекают. Цилиндрический столбик костной ткани, находящейся в игле, выталкивают мандреном из просвета иглы на предметное стекло, а оттуда переносят в банку с формалином и отправляют на гистологическое исследование. Из оставшегося на стекле, в игле и на мандрене костного мозга делают мазки. Чаще всего удается вырезать и извлечь кусочек костной ткани длиной от 6 до 10 мм, иногда больше.

Трепанат (спонгиозная костная ткань) у здоровых людей и у больных с гиперпластическими процессами богат костным мозгом. При тяжелых апластических процессах трепанат имеет желтый цвет, что обусловливается почти полным исчезновением костномозговых элементов и заменой их жировой тканью.

При всех формах остеомиелосклероза и миелофиброза извлеченный кусочек костной ткани выглядит нередко «сухим», и из него удается извлечь лишь очень небольшое количество костного мозга для приготовления мазков.

Исследование клеток

Определение количества клеток в пунктате

Пунктат костного мозга на часовом стекле осторожно растирают стеклянной палочкой и быстро насасывают в смеситель для эритроцитов, набирают 3–5 %-ный раствор уксусной кислоты (разведение костного мозга можно также производить пробирочным методом по Николаеву). После этого поступают так же, как при подсчете лейкоцитов крови.

Общее количество ядерных элементов колеблется в больших пределах, по-видимому, вследствие неодинакового состава костномозговой ткани в различных участках и различной примеси периферической крови в пунктате. У здоровых людей количество костномозговых клеток составляет от 45 тыс. до 250 тыс. в 1 мкл.

Миелограмма представляет собой процентное отношение клеточных элементов в мазках, приготовленных из пунктатов костного мозга. Мазки пунктата костного мозга просматривают сначала с малым увеличением и отбирают те, которые содержат наибольшее количество клеток. При малом увеличении нужно тщательно просмотреть по возможности все мазки для выявления комплексов атипических клеток, клеток Березовского – Штернберга, клеток Пирогова – Лангханса и др. При этом же увеличении нужно обратить внимание на количество мегакариоцитов: есть ли они в мазках, много их или мало.

В тех случаях, когда в мазке не обнаруживают или находят единичные мегакариоциты, необходимо тщательно просмотреть конец мазка в «метелочке», где они иногда собираются в большом количестве. После тщательного просмотра мазков приступают к дифференциальному подсчету клеток костного мозга. Подсчитывают не менее 500 клеток и вычисляют процент каждого вида клеток.

Подсчет можно производить двумя способами:

1) метод Коста. Считают отдельно клетки лейкопоэза и эритропоэза. Сосчитывают 500 (или 1000) клеток лейкопоэза, а количество клеток красной крови вычисляют на 100 клеток лейкопоэза;

2) метод Аринкина. Считают подряд все клетки костного мозга и вычисляют процент каждого вида клеток.

При оценке пунктата костного мозга, кроме количества подсчитанных клеток, необходимо учитывать и соотношение между молодыми и более зрелыми формами нейтрофилов – так называемый костномозговой индекс созревания нейтрофилов. В норме этот индекс меньше 1 и равен 0,6–0,8.

При оценке миелограммы необходимо знать динамику периферической крови и состояние больного. Помимо количественных сдвигов клеток лейкопоэза и эритропоэза, надо учитывать степень их созревания. При увеличении эритробластических и лейкобластических элементов с задержкой их созревания в периферической крови может наблюдаться уменьшение количества лейкоцитов и эритроцитов. В других же случаях (например, при эритремии) в костном мозге отмечаются увеличенное количество нормобластов без нарушения их созревания и увеличение числа эритроцитов в крови.

При оценке пунктата костного мозга очень важно отношение количества элементов лейкопоэза к числу ядерных элементов эритробластического ряда. У здоровых людей это соотношение составляет 4: 1 или 3: 1.

Если количество костномозговых клеток увеличивается в основном за счет клеток эритропоэза, это указывает на гиперплазию последнего, и соотношение лейко / эритро уменьшается, достигая величины 1: 1 и меньше. Такая картина наблюдается при различных формах малокровия (постгеморрагической, гемолитической и В_12-дефицитной анемиях).

При нелеченной анемии Аддисона – Бирмера количество клеток увеличивается преимущественно за счет мегалобластов, а в начале ремиссии – за счет эритронормобластов. При этом соотношение лейко / эритро достигает 1: 8. При полной ремиссии оно приближается к норме.

При уменьшении количества клеток в костном мозге уменьшение соотношения лейко / эритро может быть и не связано с гиперплазией эритропоэза, а является следствием уменьшения образования клеток гранулопоэза. Такая картина встречается при агранулоцитозе.

При одновременном уменьшении числа клеток лейкопоэза и эритропоэза может сохраниться нормальное соотношение между ними, и в то же время оба указанных выше ростка будут подавлены.

Подобное состояние встречается при гипо- и апластических процессах.

Резкое увеличение количества костномозговых элементов с увеличением соотношения лейко / эритро свидетельствует о гиперплазии миелоидных элементов, встречается при лейкозах, инфекциях, интоксикациях и других состояниях.

Для количественной оценки мегакариоцитов используют следующие методы:

1) подсчет в камере;

2) подсчет в мазках: по полям зрения, по отношению к количеству всех ядерных клеток костного мозга.

Все эти методы не являются достаточно точными. Наиболее точное количественное представление дает подсчет их в срезах костного мозга, полученного при трепанобиопсии.

Подсчет в счетной камере. При разведении пунктата костного мозга уксусной кислотой (1: 20) происходит гемолиз эритроцитов, позволяющий производить подсчет мегакариоцитов в счетной камере. Разведение пунктата костного мозга и методика подсчета аналогичны подсчету лейкоцитов в крови.

Подсчет производят на всей поверхности сетки, затем число сосчитанных мегакариоцитов умножают на разведение (20) и делят на объем камеры (3,2).

Мегакариоциты в камере видны в виде крупных клеток с полиморфным гиперсегментированным ядром и широкой зоной цитоплазмы. Недостаточная точность метода обусловлена тем, что в камере не распознаются мелкие формы (мегакариобласты, голые ядра и др.), которые не попадают в счет. Преимущество метода – равномерное распределение клеток в счетной камере. У здорового человека в 1 мкл пунктата костного мозга при подсчете в счетной камере обнаружено (по данным разных авторов) 63 ± 10 и 83 ± 13,86 мегакариоцитов. У здоровых детей в возрасте от 5 месяцев до 3 лет общее количество мегакариоцитов составляет около 116 ± 10,8 в 1 мкл пунктата.

Подсчет в мазках по полям зрения. В мазках пунктата костного мозга подсчитывают мегакариоциты при малом увеличении микроскопа с выведением средних цифр.

Неточность метода обусловлена тем, что в мазках мегакариоциты располагаются неравномерно, сосредоточиваясь больше по краям препарата и в конце мазка. У здорового человека в мазках пунктата костного мозга в 250 полях зрения содержится 5–12 мегакариоцитов.

Подсчет в мазках по отношению к числу всех ядерных клеток. В мазках пунктата костного мозга при выведении миелограммы (подсчет не менее 500 клеток) отмечается процент мегакариоцитов. Недостаток метода тот же, что и при подсчете в мазках по полям зрения.

В среднем у здорового человека в пунктате костного мозга количество мегакариоцитов составляет 0,1–0,2 %. Данные разных авторов свидетельствуют о широких колебаниях процента мегакариоцитов в мазках пунктата костного мозга – от 0 до 1,2 %, в среднем он составляет 0,4 × 0,18 %.

Резкое увеличение количества мегакариоцитов в костном мозге наблюдается при миелопролиферативном синдроме, особенно при полицитемии, а также при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (болезни Верльгофа), при циррозе печени с явлениями гиперспленизма.

Увеличение числа мегакариоцитов выявляется при злокачественных новообразованиях, симптоме геморрагической тромбоцитемии, после острой кровопотери. Уменьшение количества мегакариоцитов характерно для большинства системных гиперпластических процессов.

Морфология клеток костного мозга

Кроветворные клетки первых трех классов морфологически неразличимы. Они имеют круглую или неправильную форму, ядро фиолетовое, округлое или почкообразное, с одним или двумя ядрышками. Светло-голубой узкий ободок цитоплазмы не содержит зернистости. Эти клетки существуют в бластной и лимфоцитоподобной формах.

Бластные клетки имеют ядро нежной структуры, с одним или несколькими ядрышками. Ядра лимфоцитоподобных форм плотные. Возможен переход одной формы в другую. Принадлежность клеток к тому или иному классу из первых трех определяется цитохимическими или культуральными методами.

Начиная с четвертого класса клетки обладают характерными особенностями, которые различимы при микроскопии.

Морфология ретикулярных клеток

В кроветворных органах наряду с дифференцированной тканью (паренхима), состоящей в костном мозге из клеток миелоидного ряда, а в селезенке и лимфатических узлах – из клеток лимфатического ряда, имеются клетки ретикулярной ткани (строма). Среди ретикулярных элементов различают следующие формы.

Малые лимфоидные ретикулярные клетки имеют сходство с лимфоцитами, и эти два типа клеток не всегда можно дифференцировать. У малых лимфоидных ретикулярных клеток ядро круглое или овальное с четко очерченными границами. Изредка в ядрах можно обнаружить ядрышки, окрашенные в синий цвет. Цитоплазма окружает ядро узким ободком и окрашивается в синий цвет.

Встречаются малые лимфоидные ретикулярные клетки с биполярно вытянутой цитоплазмой с бахромчатыми краями и несколько удлиненными ядрами. В цитоплазме иногда содержится немного азурофильных зерен.

В норме малые лимфоидные ретикулярные клетки обнаруживаются в пунктате костного мозга и лимфатических узлов только как редкие экземпляры (0,1–0,3 %), а в селезенке – от 1 до 10 %.

Большие лимфоидные ретикулярные клетки – гемогистобласты величиной от 15 до 30 мкм. Благодаря синцитиальному расположению клетки не имеют правильной формы. Ядро клеток круглое или овальное с нежно-сетчатой ажурной структурой, светлое, содержит 1–2 ядрышка. Цитоплазма обильная и окрашивается в светло-голубой или серовато-голубой цвет, иногда с нежной, пылевидной или палочковидной азурофильной зернистостью. В норме в кроветворных органах большие лимфоидные ретикулярные клетки обнаруживаются в виде единичных экземпляров.

Клетки Феррата представляют собой ретикулярные клетки, неспособные в нормальных условиях к дальнейшему развитию и приобретающие способность к кроветворению лишь при определенных патологических условиях. Существует также мнение, что клетки Феррата – это промиелоциты, раздавленные и распластанные при приготовлении мазков. Клетки Феррата имеют крупные размеры, достигающие 35–40 мкм, неправильную, чаще всего полигональную, форму. Ядро круглое, бледное, занимает около половины клетки и, как правило, располагается эксцентрично. Нити базихроматина грубоватые, расположены широкими, переплетающимися полосами с просветами бесцветного оксихроматина. В ядре имеются хорошо очерченные 1–3 ядрышка. Цитоплазма широкая, часто с расплывчатыми очертаниями, окрашивается в светло-голубой цвет. В ней имеется большое количество мелкой, пылевидной азурофильной зернистости. Клетки Феррата в кроветворных органах встречаются в норме в единичных экземплярах. Их количество резко возрастает при заболеваниях, сопровождающихся гиперплазией ретикулогистиоцитарной системы.

Макрофаги представляют собой фагоцитирующие ретикулярные клетки. В периферической крови они известны как гистиоциты, однако правильнее их называть макрофагами. Клетки различной величины, в основном больших размеров. Молодые клетки имеют круглое или овальное ядро нежной структуры, содержащее иногда 1–2 ядрышка. Цитоплазма голубого цвета, нерезко очерчена. У более зрелых клеток ядро грубее, цитоплазма широкая, голубого цвета и нерезко очерчена, содержит различные включения: азурофильные зерна, обломки клеток, эритроциты, глыбки пигмента, жировые капли, иногда бактерии и т. п. Встречаются макрофаги недеятельные, не имеющие в цитоплазме включений (макрофаги в покое).

Липофаги – это макрофаги, фагоцитирующие жиры и липоиды. Они могут быть различной величины, достигая 40 мкм и более. В цитоплазме имеется обильная мелкая вакуолизация за счет содержания капель жира, растворившихся во время фиксации препарата в спирте. В некоторых случаях мелкие капли могут сливаться, образуя одну большую, которая заполняет всю цитоплазму и оттесняет ядро к периферии. При добавлении Судана 3 капли жира окрашиваются в оранжевый цвет. В норме в пунктате костного мозга, лимфатического узла, селезенки встречаются единичные липофаги. Большое количество их обнаруживается при апластических процессах в кроветворной ткани.

Атипичные ретикулярные клетки встречаются при ретикулезах – лейкозах. Среди них различают следующие виды:

1) клетки небольших размеров, ядра неправильной формы, занимают большую часть клетки, богаты хроматином, некоторые имеют ядрышки. Цитоплазма в виде небольшого ободка бледно-синего цвета, вакуолизирована, иногда содержит темно-фиолетовую зернистость. Клетки могут встречаться в синцитиальной связи;

2) клетки, схожие с большими лимфоидными ретикулярными клетками (гемогистобласты), больших размеров, неправильной полигональной формы. Ядра их чаще круглые или овальные, нежной структуры, окрашиваются в светло-фиолетовый цвет. Имеют 1–2 ядрышка. Цитоплазма широкая, без четких контуров, окрашивается в светло-синий цвет. Эти клетки чаще всего встречаются в синцитии;

3) клетки, схожие с моноцитами, имеющие нежные ядра с многочисленными извилинами в них, а иногда разделенные на части, окаймленные как бы воздушной, легкой цитоплазмой. В некоторых ядрах также обнаруживаются ядрышки;

4) гигантские многоядерные клетки и клетки с резко выраженной плазматизацией, приобретающие благодаря этому сходство с миеломными клетками.

Ретикулярные клетки, встречающиеся при инфекционном мононуклеозе:

1) клетки больших размеров (до 20 мкм и более) с молодой нежно-губчатой структурой ядра (в котором иногда обнаруживаются ядрышки) и широкой цитоплазмой, окрашивающиеся то в более темный, то в более светлый синий цвет;

2) клетки меньших размеров (до 10–12 мкм) с ядром круглой или бобовидной формы, нередко расположенным эксцентрично, имеющим грубопетлистое строение. Цитоплазма резко базофильна, более интенсивно окрашена по периферии. Встречаются клетки, особенно в разгаре болезни, и со светлой, еле заметной цитоплазмой, в которой иногда имеются азурофильные зерна;

3) клетки размерами крупнее, чем зрелые лимфоциты, с моноцитоидным ядром и довольно интенсивно окрашенной в синий цвет цитоплазмой, в которой также иногда обнаруживают азурофильные зерна. При этом заболевании ретикулярные клетки называют атипичными мононуклеарами.

Клетки Гоше относятся к ретикулярным элементам, макрофагам, содержащим вещество керазин (из группы цереброзидов). Клетки больших размеров (около 30–40, некоторые до 80 мкм) имеют круглую, овальную или полигональную форму. Ядро занимает меньшую часть клетки и обычно оттеснено к периферии. Оно грубое, комковатое, местами пикнотичное. Иногда наблюдаются многоядерные клетки. Цитоплазма светлая, широкая, занимает большую часть клетки. Наличие керазина создает впечатление слоистости цитоплазмы. Реакция на жир всегда отрицательна. Описанные клетки обнаруживают в пунктатах костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и других органов, при керазиновом ретикулезе, болезни Гоше. Клетки, подобные клеткам Гоше, встречаются при болезни Пика – Нимана (фосфатидный липоидоз) и болезни Шюллера – Крисчена (холестериновый липоидоз). Различить их более точно можно только посредством химического исследования содержащихся в них веществ.

Тучные (тканевые) клетки (базофилы соединительной ткани) образуются из ретикулярных клеток. Размер клеток колеблется от 10 до 14 мкм. Ядро круглое или овальное, неопределенной структуры, окрашено в красновато-фиолетовый цвет. Цитоплазма широкая с обильной зернистостью темно-фиолетового цвета. В норме они встречаются в пунктате лимфатического узла и селезенки до 0,1 %. В большом количестве обнаруживаются в костном мозге при базофильных лейкозах.

Остеобласты – клетки больших размеров (20–35 мкм). Форма их удлиненная, неправильная или цилиндрическая. Ядро клеток круглое или овальное, занимает меньшую часть клетки. Расположенное большей частью эксцентрично, оно как бы выталкивается из клетки. Иногда можно видеть, что ядро только одним краем примыкает к цитоплазме клетки, остальной же частью лежит вне ее. Ядро состоит из большого количества базихроматина в виде небольших комочков и небольшого количества оксихроматина. Окрашивается ядро в темный фиолетово-красный цвет; в нем имеются небольшие бледно-голубые ядрышки, иногда различной величины. Цитоплазма больших размеров и по периферии имеет пенистое строение, окрашивается в цвета от синего с фиолетовым оттенком до серо-голубого. Нередко участки цитоплазмы одной и той же клетки приобретают разные оттенки. Остеобласты имеют некоторое сходство с миеломными клетками и проплазмоцитами. Остеобласты принимают участие в образовании костной ткани. В норме в пунктате костного мозга они почти не встречаются.

Остеокласты – клетки, которые в эмбриональном периоде участвуют в развитии костной ткани. Во взрослом организме появление их связано с процессом рассасывания костной ткани. Величина и форма их очень разнообразны. Наиболее часто встречаются крупные экземпляры, достигающие 60–80 мкм и больше. Форма клеток овальная, полигональная, чаще неправильная, с большим количеством (чаще 6–15, а иногда до 100) ядер. Ядра группируются или располагаются в цитоплазме разбросанно. Размер ядер достигает 12 мкм. Форма их круглая или овальная. Они окрашиваются в светло-фиолетовый цвет. В ядрах обнаруживаются одиночные маленькие ядрышки.

Цитоплазма при окраске становится светло-синей, фиолетовой или розоватой. Иногда можно наблюдать в одной и той же клетке различную окраску. Цитоплазма по периферии клетки слабо контурируется, иногда образует широкие отростки, постепенно сливающиеся с общим фоном препарата. Вокруг ядра отмечается узкая зона просветления. В некоторых клетках в цитоплазме имеются включения в виде зерен или небольших глыбок неправильной формы (гемосидерин). Остеокласты имеют некоторое сходство с клетками Лангханса, зрелыми мегакариоцитами и гигантскими клетками инородных тел.

Остеокласты обнаруживаются в пунктате костного мозга в местах переломов костей, при болезни Педжета, саркомах, метастазах рака в кости и некоторых других заболеваниях, связанных с рассасыванием костной ткани.

Морфология клеток гранулоцитарного ростка

К этим клеткам относят миелобласт (4-й класс), промиелоцит, миелоцит, метамиелоцит и палочкоядерный гранулоцит (5-й класс), сегментоядерный гранулоцит (6-й класс).

Миелобласт имеет диаметр 15–20 мкм. Ядро округлой формы, занимает большую часть клетки, окрашено в красно-фиолетовый цвет, имеет нежно-сетчатую структуру хроматина, содержит от 2 до 5 ядрышек сине-голубого цвета. Ядро окружено узким пояском ярко-синей (базофильной) цитоплазмы, в которой содержится в небольшом количестве красная (азурофильная) зернистость. В норме в костном мозге миелобластов содержится 0,2–1,7 %. При острых лейкозах и тяжелых обострениях хронических миелозов встречаются патологические миелобласты в виде микрогенераций с утраченной нежно-сетчатой структурой ядра и выраженным его полиморфизмом.

Промиелоцит – крупная клетка диаметром 25 мкм. Ядро овальной формы, занимает большую часть клетки, окрашено в светло-фиолетовый цвет, имеет тонкую сетчатую структуру, в которой различимы ядрышки. Цитоплазма широкая, голубого цвета, содержит обильную красную, фиолетовую или коричневую зернистость. По особенностям зернистости можно определить видовую направленность промиелоцита: нейтрофильную, эозинофильную или базофильную. В норме в пунктате костного мозга количество промиелоцитов колеблется в пределах 1–4,1 %.

Миелоцит является более зрелой клеткой гранулоцитарного ряда диаметром 12–16 мкм. Ядро овальной формы, расположено эксцентрично, светло-фиолетового цвета. Его структура более грубая, чем у промиелоцита, ядрышки не выявляются. Цитоплазма окружает ядро широким поясом, окрашена в светло-голубой цвет, содержит зернистость. В зависимости от характера зернистости различают миелоциты нейтрофильные, эозинофильные и базофильные. Нейтрофильная зернистость мелкая, сине-фиолетового цвета, эозинофильная – крупная, желтовато-красного цвета, базофильная – темно-синего цвета.

При патологических процессах, особенно при лейкозах, в миелоцитах отмечается несоответствие в развитии ядра и цитоплазмы, а также зернистости клеток. В норме в костном мозге количество нейтрофильных миелоцитов колеблется от 5,4 до 14,5 %, эозинофильных – от 0,4 до 3 % и базофильных – от 0,1 до 0,5 %.

Метамиелоцит – клетка диаметром 12–13 мкм с бобовидным эксцентрично расположенным ядром бледно-фиолетового цвета, структура его компактна. Ядро окружено по периферии широкой цитоплазмой розового цвета, содержащей нейтрофильную, эозинофильную или базофильную зернистость. В норме в костном мозге содержится: нейтрофильных метамиелоцитов – от 6,5 до 15 %, эозинофильных – от 0,2 до 2 %, базофильных – от 0 до 0,1 %.

Палочкоядерный гранулоцит имеет диаметр 10–12 мкм. Ядро изогнуто в виде палочки или подковы, фиолетового цвета, с грубой структурой. Цитоплазма имеет розовую окраску, занимает большую часть клетки, содержит фиолетовую зернистость. У эозинофильного палочкоядерного гранулоцита цитоплазма практически не видна из-за обильной крупной желтовато-красного цвета зернистости. Палочко-ядерная стадия базофильного гранулоцита обычно не встречается.

Сегментоядерный гранулоцит такого же размера, как и палочкоядерный. Ядро разделено на отдельные сегменты, соединенные тонкими перемычками. Количество сегментов колеблется от 2 до 5. Ядро фиолетовое, расположено в центре клетки. Сегментоядерный нейтрофил имеет розовую (оксифильную) цитоплазму, в которой содержится мелкая фиолетовая зернистость. Ядро эозинофила состоит обычно из двух сегментов, занимая меньшую часть клетки. Большая часть клетки заполнена крупной, густо расположенной желтовато-красной зернистостью. Ядро базофила состоит, как правило, из трех сегментов. Светло-фиолетовая цитоплазма содержит крупную синего или темно-фиолетового цвета зернистость, которая местами наложена на ядро, в связи с чем его контуры нечеткие.

Морфология клеток лимфатического ростка

К клеткам лимфатического ряда относят лимфобласт и плазмобласт (4-й класс), пролимфоцит и проплазмоцит (5-й класс), лимфоцит и плазмоцит (6-й класс).

Лимфобласт имеет диаметр 15–20 мкм. Ядро округлое, с нежно-сетчатой структурой хроматина, бледно-фиолетового цвета, расположено в центре. В ядре четко виды 1–2 ядрышка. Цитоплазма светло-синяя, окружает ядро узким ободком, не содержит зернистости. Участок цитоплазмы вблизи ядра имеет более светлую окраску (перинуклеарная зона).

В периферической крови и костном мозге у здорового человека лимфобластов не бывает. Их обнаруживают при лимфолейкозе в небольшом количестве. В норме в пунктате лимфатического узла содержится лимфобластов от 0,1 до 0,5 %, а в пунктате селезенки – до 0,2 %.

Пролимфоцит является небольшой клеткой диаметром 11–12 мкм. Ядро округлое, бледно-фиолетового цвета, с нежной сетью хроматина. В некоторых случаях может содержать остатки ядрышек. Цитоплазма голубая, окружает ядро в виде неравномерного ободка, иногда содержит азурофильную (красновато-фиолетовую) зернистость.

В норме в периферической крови и в костном мозге пролимфоциты могут встречаться в виде единичных экземпляров. В пунктате нормального лимфатического узла их содержится 65–80 %, а в селезенке – до 60 %.

Лимфоцит – зрелая клетка диаметром от 7–9 до 12–13 мкм в зависимости от величины цитоплазмы. Ядро округлое, темно-фиолетового цвета, компактное, иногда имеет вдавление. Ядрышек не содержит. Выявляются малые лимфоциты с узким ободком голубой цитоплазмы, которая практически незаметна, средние и большие лимфоциты, цитоплазма которых занимает большую часть клетки, менее интенсивно окрашена и содержит азурофильную зернистость. Вокруг ядра всегда определяется перинуклеарная зона. Содержатся в костном мозге в количестве 4,4–13,7 %.

Плазмобласт – крупная клетка диаметром 16–20 мкм с округлым, центрально или эксцентрично расположенным большим ядром, имеющим нежную структуру и несколько ядрышек. Цитоплазма ярко-синего цвета, окружает ядро широким поясом. Вокруг ядра выражена перинуклеарная зона. В норме эти клетки могут содержаться в пунктате лимфатического узла и селезенки в виде единичных экземпляров.

Проплазмоцит – клетка диаметром 10–20 мкм. Ядро округлое, компактное, расположено эксцентрично. В ядре чередуются темно- и светло-фиолетовые участки, которые расположены радиально от центра к периферии, что напоминает расположение спиц в колесе, – колесовидная структура ядра. Ядрышки отсутствуют. Цитоплазма интенсивного синего цвета, широкая, вакуолизированная. Хорошо видна перинуклеарная зона.

Плазмоцит – зрелые плазматические клетки (клетки Унна), разнообразные как по форме, так и по размерам (от 8 до 20 мкм). Ядро имеет почти постоянную величину, а меняется большей частью величина цитоплазмы. Ядро круглое или чаще овальное и расположено эксцентрично, имеет характерную грубую колесовидную структуру. Цитоплазма окрашивается в интенсивный синий цвет с ясным просветлением вокруг ядра, однако встречаются клетки с более светлой цитоплазмой и менее выраженной перинуклеарной зоной. В цитоплазме могут быть различной величины вакуоли, расположенные, как правило, в ее периферической части и придающие ей ячеистое строение. Нередко встречаются многоядерные плазматические клетки, содержащие 2–3 ядра и более одинаковой или различной величины. Плазматические клетки больших размеров могут иметь цитоплазму, окрашенную в серо-голубой цвет, с менее отчетливой перинуклеарной зоной или с ее отсутствием.

В норме в пунктате костного мозга находят зрелые плазматические клетки в количестве до 1,8 %, а в пунктате лимфатического узла и селезенки – плазмобласты, проплазмоциты и зрелые плазматические клетки в количестве 0,1–0,8 %.

В периферической крови в норме плазматических клеток не находят. Они появляются в крови при ряде инфекций (кори, краснухе, ветряной оспе), сывороточной болезни, некоторых болезнях кожи, инфекционном мононуклеозе, агранулоцитозе, туберкулезе, лимфогранулематозе, тяжелом сепсисе, крупозной пневмонии, актиномикозе, циррозе печени, миеломной болезни. При некоторых формах миеломной болезни молодые плазматические клетки могут поступать в периферическую кровь в большом количестве. Морфология плазматических клеток при миеломной болезни имеет характерные черты – миеломные клетки.

Миеломные клетки имеют большие размеры, достигающие иногда 40 мкм и более в диаметре. Ядро нежное, содержит 1–2 больших или несколько мелких ядрышек, окрашенных в голубой цвет. Нередко встречаются клетки с 3–5 ядрами. Цитоплазма больших размеров, окрашивается в различные цвета: светло-голубой, светло-фиолетовый, интенсивно-фиолетовый, а иногда красноватый, обусловленный присутствием гликопротеидов. Околоядерное просветление выражено нечетко или отсутствует. В редких случаях находят 1–2 гиалиновых включения – тельца Русселя величиной 2–4 мкм. При окраске азур-эозином они приобретают красный цвет.

Морфология клеток моноцитарного ростка

К клеткам моноцитарного ряда относят монобласт (4-й класс), промоноцит (5-й класс), моноцит (6-й класс).

Монобласт имеет диаметр 12–20 мкм. Ядро округлое, иногда дольчатое, имеет нежную структуру, светло-фиолетовую окраску. Содержит 2–5 ядрышек. Цитоплазма нежно-голубая, занимает меньшую часть клетки.

Промоноцит имеет диаметр 12–20 мкм. Ядро крупное, рыхлое, бледно-фиолетовое, может содержать остатки ядрышек. Цитоплазма широкая, серовато-фиолетового цвета.

Моноцит является зрелой клеткой диаметром 12–20 мкм. Ядро рыхлое, светло-фиолетовое. Форма ядра может быть различной: бобовидной, дольчатой, подковообразной. Цитоплазма серовато-фиолетового цвета, широкая, светлая, может содержать обильную мелкую азурофильную зернистость.

В норме в периферической крови и в костном мозге монобластов и промоноцитов, как правило, не бывает. Встречаются они как временное явление при острых инфекциях (например, при инфекционном мононуклеозе) и при других заболеваниях, сопровождающихся высоким моноцитозом.

Морфология клеток эритроцитарного ростка

К клеткам эритроцитарного ростка относят эритробласт (4-й класс), пронормоцит, нормоцит, ретикулоцит (5-й класс), эритроцит (6-й класс).

Эритробласт имеет диаметр 20–25 мкм. Ядро нежной структуры, округлое, занимает большую часть клетки, красновато-фиолетового цвета, содержит 1–5 ядрышек. Цитоплазма насыщенного синего цвета, не содержит зернистости. Вокруг ядра определяется зона просветления.

Эритробласты встречаются в нормальном костном мозге в количестве 11,4–29,4 %, а в периферической крови – только при патологических состояниях.

Патологические формы эритробластов наблюдаются при некоторых патологических состояниях (остром сепсисе, апластических анемиях, остром лейкозе, тяжелых инфекционных заболеваниях, после облучения и др.). Изменяется морфология ядра и цитоплазмы клеток различных стадий созревания. Ядро теряет нормальную структуру, хроматин становится однородным. Встречаются эритробласты с плотным, пикнотичным базихроматином, как у зрелых нормобластов. Цитоплазма может быть вакуолизированной. Цвет ее не соответствует степени созревания ядра.

Мегалобласты – большие эмбриональные эритробласты. В костном мозге и периферической крови появляются в постэмбриональной жизни только при патологических состояниях, связанных с дефицитом гемопоэтического фактора – витамина В_12, фолиевой кислоты. Мегалобласты в зависимости от степени созревания делятся на промегалобласты и базофильные, полихроматофильные, оксифильные мегалобласты.

Пронормоцит – клетка диаметром 12–18 мкм. Ядро имеет более грубую структуру, чем у эритробласта, но еще сохраняет нежную сетчатую структуру. Ядрышки отсутствуют. Цитоплазма барофильная, не содержит зернистости.

Нормоцит имеет диаметр 8–12 мкм. В зависимости от степени насыщенности их цитоплазмы гемоглобином различают базофильный, полихроматофильный и оксифильный нормоциты. Самые крупные – базофильные нормоциты, наименьший размер имеют оксифильные нормоциты. Ядра этих клеток имеют грубую структуру, окрашены в темно-фиолетовый цвет. Цитоплазма базофильного нормоцита – синяя, полихроматофильного – серовато-фиолетовая, оксифильного – розовая.

Нормоцит вызревает в эритроцит через стадию ретикулоцита – молодого предшественника эритроцита, сохранившего остатки базофильной субстанции (РНК) цитоплазмы, которая выявляется при помощи специальной окраски.

Ретикулоцит – клетка диаметром 9–11 мкм. В зависимости от способа окраски может быть голубого или зеленого цвета. Содержит нитчато-сетчатую субстанцию, которая окрашена в синий цвет.

Эритроцит – зрелая клетка периферической крови диаметром 7–8 мкм, розово-красного цвета. Имеет форму двояковогнутого диска, что ведет к неравномерности в окраске – клетка более светлая в центре и более интенсивно окрашена по периферии.

Морфология клеток мегакариоцитарного ростка

К клеткам мегакариоцитарного ростка относят мегакариобласт (4-й класс), промегакариоцит и мегакариоцит (5-й класс), тромбоцит (6-й класс).

Мегакариобласт имеет диаметр 20–25 мкм. Ядро округлое, с нежной структурой, красновато-фиолетового цвета, имеет ядрышки. Цитоплазма небольшая, интенсивно барофильная, не содержит зернистости. Вокруг ядра заметна зона просветления.

Промегакариоцит – значительно более крупная клетка, чем мегакариобласт. Ядро грубой структуры, не содержит ядрышек. Цитоплазма базофильная, занимает большую часть клетки, зернистость в ней отсутствует.

Мегакариоциты – гигантские клетки костного мозга. Мегакариоцит представляет собой гигантскую клетку костного мозга диаметром 60–120 мкм. Ядро имеет грубую структуру, различной, в некоторых случаях причудливой, формы. Цитоплазма отличается очень большими размерами, содержит зернистость розовато-фиолетового цвета. От цитоплазмы мегакариоцита отшнуровываются тромбоциты.

Тромбоциты (кровяные пластинки) – зрелые элементы периферической крови, имеющие небольшие размеры (1,5–3 мкм), округлую или овальную форму. Периферическая часть – гиаломер – светлого цвета, центральная часть – грануломер – розовато-фиолетового цвета, содержит мелкие гранулы.

При исследовании красного костного мозга подсчитывают процентное содержание костномозговых элементов (табл. 53).

Таблица 53

Показатели миелограммы

Глава 14

Исследование лимфатических узлов

Развитие, строение, кровоснабжение и иннервация лимфатических узлов

Лимфатические узлы располагаются по ходу лимфатических сосудов и задерживают антигены, попавшие в лимфу, очищая ее.

Развитие

Закладка и дифференцировка лимфоузлов в эмбриогенезе происходят асинхронно. Зачатки первых лимфоузлов появляются в конце 2-го, в начале 3-го месяца эмбриогенеза в виде скопления мезенхимы по ходу лимфососудов. Мезенхима превращается в ретикулярную ткань. К концу 4-го месяца в закладку лимфоузла вселяются лимфоциты и формируются лимфоидные узелки (фолликулы). Примерно в это же время начинают формироваться синусы лимфоузла в виде эндотелиальных трубок. Лимфоузел разделяется на корковое и мозговое вещества. Однако большая часть лимфоузлов начинает формироваться во второй половине беременности.

Строение

Общее число лимфоузлов примерно 1000, что составляет около 1 % массы тела. Их размеры в среднем 0,5–1 см. Лимфоузлы имеют округлую почковидную форму. Лежат регионарно по отношению к органам, группами. С выпуклой поверхности лимфоузла в него входят приносящие лимфососуды, а с противоположной стороны, которая называется воротами, выходят выносящие лимфососуды. Кроме того, в ворота лимфоузла входят артерия и нервы, а выходят вены.

Лимфоузлы являются паренхиматозными зональными органами и имеют следующее строение:

1) капсула, содержащая рыхлую волокнистую неоформленную соединительную ткань с большим количеством коллагеновых волокон. В капсуле встречаются гладкие миоциты, способствующие активному продвижению лимфы, а также нервные стволики и окончания, в том числе и пластинчатые тельца Фатера – Пачини. Болезненность лимфоузлов при воспалительных процессах обусловлена сдавлением телец Фатера – Пачини. В капсуле содержатся также артерии, вены и гемокапилляры;

2) трабекулы, отходящие от капсулы, также состоят из рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани. Анастомозируя друг с другом, они образуют каркас лимфоузла. Содержат единичные гладкие миоциты;

3) ретикулярная ткань, заполняющая все пространство между капсулой и трабекулами.

Капсула, трабекулы и лежащая между ними ретикулярная ткань составляют строму лимфатического узла. Его паренхимой является совокупность клеток лимфоидного ряда. В лимфоузле различают 2 зоны: периферическую – корковое вещество и центральную – мозговое вещество. Между корковым и мозговым веществами находится паракортикальная зона, которую часто не выделяют как самостоятельную зону и определяют как глубокую кору.

Синусы – совокупность лимфососудов, по которым движется лимфа. Последовательность прохождения лимфы через лимфоузел и расположения синусов такова:

1) приносящие лимфососуды – краевой или субкапсулярный синус;

2) промежуточные корковые синусы – промежуточные мозговые синусы;

3) воротный синус – выносящий лимфососуд в области ворот.

Поскольку приносящих сосудов больше, чем выносящих, то лимфатические синусы сходятся к воротам, формируя подобие воронки, через которую лимфа течет под давлением. Это облегчает фильтрацию лимфы и фагоцитоз из нее антигенов макрофагами.

В корковом веществе выделяют скопление лимфоидной ткани, представленной лимфоидными фолликулами, или узелками, и интерфолликулярное плато. Лимфоидные узелки – округлые образования величиной до 1 мм.

Различают первичные (без реактивного центра) и вторичные лимфоидные фолликулы, имеющие реактивный центр (центр размножения, светлый центр). Первичные фолликулы состоят в основном из малых В-лимфоцитов, связанных с ретикулярными и фолликулярными дендритными клетками. Здесь могут также находиться в небольшом количестве Т-лимфоциты и макрофаги. Первичные лимфоидные узелки в наибольшем количестве встречаются во внутриутробном периоде, после рождения в связи с постоянно имеющей место антигенной стимуляцией происходит их превращение во вторичные узелки.

При попадании антигена протекает бласттрансформация В-лимфоцитов. Вторичные фолликулы состоят из центра размножения и короны (мантии) на периферии. Корона образована малыми В-лимфоцитами памяти, а также малыми лимфоцитами костномозгового происхождения («наивными»). Здесь же встречаются макрофаги, лимфобласты и ретикулярные клетки. Корона асимметрична. На полюсе, обращенном в сторону мозгового вещества, она истончена, а на периферическом полюсе утолщена и формирует подобие шапочки.

Часть короны, граничащая со светлой зоной центра размножения, служит местом выхода из фолликулов незрелых плазмоцитов. Реактивный центр на высоте иммунной реакции подразделяется на темную и светлую зоны. Темная зона обращена к паракортикальной зоне. Здесь клетки митотически делятся, перемещаясь в светлую, более периферическую зону, где находятся уже более зрелые, мигрирующие клетки. Предшественники плазмоцитов выходят из фолликула через боковые зоны короны в интерфолликулярное плато, а затем перемещаются через паракортикальную зону в мозговое вещество (мякотные тяжи), где созревают в плазмоциты.

Паракортикальная зона, или зона глубокой коры, находится на границе коркового и мозгового веществ. Является тимусзависимой зоной (Т-зоной) лимфоузла. Содержит преимущественно Т-лимфоциты, однако здесь обнаруживаются также мигрирующие в мякотные тяжи мозгового вещества плазмоциты на разных стадиях развития.

Всю паракортикальную зону можно разделить на отдельные единицы. Каждая единица состоит из центральной и периферической частей. В центре происходят бласттрансформация и размножение Т-лимфоцитов. На периферии находятся посткапиллярные вены с высоким эндотелием. Через них происходит миграция лимфоцитов из крови в лимфоузел и, возможно, обратно. Высота эндотелиоцитов может меняться, что влияет на интенсивность миграции: при высоком эндотелии между эндотелиоцитами появляются широкие щели, и миграция клеток максимальна, при низком эндотелии межклеточные пространства исчезают, и миграционные процессы минимальны. Мигрировать через посткапиллярные венулы могут только зрелые Т- и В-лимфоциты, имеющие на своей поверхности так называемые хоминг-рецепторы, комплементарные к рецепторам эндотелия венул. Незрелые лимфоциты таких рецепторов не имеют и не обладают способностью к миграции.

Основной путь миграции лимфоцитов через посткапиллярные вены – интерэндотелиальный, хотя допускается и интраэндотелиальный механизм.

Эндотелий разных лимфоидных органов имеет свои специфические рецепторы, и это определяет специфичность расселения лимфоцитов по лимфоидным органам, что является необходимым условием для нормального функционирования иммунной системы.

Мозговое вещество состоит из двух структурно-функциональных компонентов: мозговых или мякотных тяжей и мозговых промежуточных синусов. Мозговые тяжи являются В-зависимой зоной.

Здесь происходит окончательное созревание мигрировавших из коры предшественников плазмоцитов в плазмоциты. Накапливающиеся при иммунном ответе в мозговых тяжах плазмоциты секретируют в лимфу антитела. Снаружи к мозговым тяжам прилежат мозговые синусы.

Все синусы лимфоузла представляют собой щелевидные пространства, которые выстланы эндотелием («береговые» клетки), способным к фагоцитозу. Кроме эндотелиоцитов, в образовании стенки лимфатических синусов участвуют рететелиальные клетки. Они имеют отростчатую форму.

При этом отростки пересекают все пространство синуса и на противоположной его стороне формируют расширения в виде площадок, которые наряду с «береговыми» клетками формируют прерывистую выстилку синусов (в субкапсулярном синусе со стороны капсулы выстилка непрерывна). Базальная мембрана в выстилке синусов отсутствует. Отростки рететелиальных клеток формируют трехмерную сеть, замедляющую ток лимфы, что способствует ее более полному очищению макрофагами. Сеть формируют также идущие в разных направлениях ретикулярные волокна. В синусах много свободных макрофагов и лимфоцитов, которые могут фиксироваться в сети.

Кровоснабжение

Кровеносные сосуды входят в ворота узла. От артерий отходят капилляры в капсулу и трабекулы, а также к узелкам. В них есть поверхностная и глубокая капиллярные сети. Капиллярные сосуды продолжаются в венулы с высоким эндотелием, а затем в вены, которые выходят через ворота узла. В норме кровь никогда не поступает в синусы. При воспалении, травмах и других патологических состояниях подобное явление возможно.

Иннервация

Афферентная иннервация узла обеспечивается клетками Догеля второго типа и псевдоуниполярными нейронами соответствующих спинальных ганглиев. Эфферентная иннервация включает симпатическое и парасимпатическое звенья. Имеются мелкие интрамуральные ганглии. Нервы входят в лимфоузел вместе с сосудами, в адвентиции которых формируют обильную сеть. От этой сети отходят веточки, направляющиеся в мозговое и корковое вещества. В мозговом веществе они лежат в межузелковом пространстве либо концентрически по периферии узелков. Внутри узелков нервные структуры отсутствуют. Стимуляция симпатического звена вегетативной нервной системы приводит к некоторому угнетению иммунного ответа в результате накопления в иммунокомпетентных клетках циклического АМФ, тормозящего бласттрансформацию и деление. Стимуляция парасимпатического звена вызывает противоположный эффект.

Регенерация

Физиологическая регенерация лимфоузлов протекает на высоком уровне. В ее основе лежат деление и дифференцировка лимфоцитов и ретикулярных клеток. Посттравматическая регенерация может происходить в том случае, если сохраняются приносящие и выносящие лимфатические сосуды с прилежащей к узлу соединительной тканью. В основе такой регенерации лежит пролиферация клеток вначале ретикулярной ткани, а в последующем – лимфоцитов.

Методы исследования лимфатических узлов

Пункция лимфатического узла. Этот метод имеет большое диагностическое значение, так как ряд заболеваний сопровождается увеличением лимфатических узлов и изменениями их клеточного состава. Если пунктат получить не удается, прибегают к биопсии лимфатического узла для гистологического исследования.

Пунктировать увеличенные лимфатические узлы можно в различных участках тела, но наиболее доступны шейные, подмышечные, паховые. Выбор лимфатического узла для пункции имеет большое значение, особенно в тех случаях, когда предполагают наличие туберкулеза или лимфогранулематоза. Желательно пунктировать 2 лимфатических узла средней плотности с давностью увеличения примерно 2–3 месяца. Не рекомендуется пунктировать флуктуирующие узлы, в которых чаще имеется некроз. При наличии только одного увеличенного лимфатического узла нужно брать материал из разных его участков.

При проведении пункции необходимо иметь следующее оборудование и реактивы: шприц 5- или 10-граммовый, иглу, предметные и покровные стекла, вату или марлевые тампоны, реактивы, спирт, эфир, йод.

Пункцию производят 5- или 10-граммовым шприцем с хорошо пригнанным к цилиндру поршнем. Иглы должны быть новыми, достаточно тонкими, от № 16 до № 25, длиной 3–4 см, желательно с удлиненным срезом.

Иглу и шприц стерилизуют сухим жаром или кипячением и затем тщательно высушивают спиртом и эфиром. В зависимости от расположения исследуемых лимфатических узлов больной должен лежать или сидеть. Место прокола дезинфицируют спиртом и йодной настойкой.

Чаще пункцию производят без обезболивания, но можно применять хлорэтил или охлаждение кожи в области укола эфиром. Прокол делают иглой с насаженным на нее шприцем. Лимфатический узел при этом необходимо фиксировать левой рукой. Оттягивая поршень, насасывают небольшое количество содержимого лимфатического узла. Если это не удается, то, не вынимая иглы, переводят ее в другое положение – выше, ниже или в стороны – и снова аспирируют содержимое узла. Затем следует разъединить иглу со шприцем и после этого быстрым движением извлечь, после чего, надев на иглу шприц, быстро выдувают содержимое иглы на предметное стекло и готовят тонкие мазки. При значительной примеси крови в полученном материале рекомендуется выбрать светлые крупинки, если они есть, и размазать их тонким слоем по предметному стеклу или готовить препараты по принципу отпечатков. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют и красят так же, как периферическую кровь.

Окрашенные препараты вначале тщательно просматривают под малым увеличением микроскопа для отыскания комплексов клеток злокачественной опухоли, клеток Березовского – Штернберга, Пирогова – Лангханса и других, а затем изучают морфологию клеток с иммерсионной системой.

Компьютерная томография (КТ). Инструментальный метод диагностики, характеризуется высокой информативностью. Позволяет исследовать состояние лимфатических узлов: размеры, общую структуру, взаимодействие лимфатических узлов с прилегающими тканями. Возможна диагностика гиперплазии, неоднородности, деформации контуров, образования конгломератов и пакетов лимфоузлов, инфильтрации прилегающих тканей.

КТ редко назначается с целью самостоятельного изучения лимфоузлов. Обычно применяется в качестве дополнительного метода диагностики при исследовании предполагаемой локализации воспалительного процесса или злокачественного новообразования.

Таблица 54

Патологии, при которых показана компьютерная томография

Ультразвуковое исследование (УЗИ). Используется при постановке диагноза, в случае необходимости дифференциальной диагностики первичных онкологичных поражений лимфоидной системы, при возможности метастазирования опухолей других органов и систем. Дает возможность определения формы, диаметра, расположения, структурных особенностей отдельных лимфоузлов.

Магнитно-резонансная томография (МРТ). Задействуется при лимфаденопатии, когда крупные структуры могут быть определены пальпаторно. Применяется при дифференциальной диагностике пострадиационного фиброза и рецидива лимфомы, поскольку лимфатические узлы отличаются по релаксационным характеристикам от окружающей жировой ткани.

Изменения лимфатических узлов при патологии

Лейкозы

При остром лейкозе увеличение лимфатических узлов у взрослых встречается редко, у детей – довольно часто. Они плотные и безболезненные, но при быстром росте или при воспалительных реакциях становятся болезненными. В пунктате находят большое количество бластных клеток (метаплазия), единичные нейтрофилы, нормобласты и лимфоциты. Последние могут встречаться в мазке группами среди гемоцитобластов.

При хроническом миелолейкозе лимфатические узлы чаще увеличены у детей. Основная масса клеточных элементов пунктата состоит из молодых клеток миелоидного ряда. Помимо миелоидной метаплазии, связанной с экстрамедуллярным кроветворением при миелозах, развитие миелоидной ткани в лимфатических узлах может быть проявлением реактивных изменений при ряде заболеваний, например при распространенных метастазах рака в костях, при некоторых инфекционных заболеваниях (скарлатине, дифтерии, туберкулезе и др.).

При хроническом лимфолейкозе происходит генерализованное увеличение лимфатических узлов. Они чаще бывают больших размеров и располагаются пакетами, не спаянными между собой и с подлежащими тканями, эластично-тестоватой консистенции, безболезненны.

Цитологическая картина пунктата характеризуется наличием лимфоцитов различной степени зрелости, среди которых преобладают пролимфоциты.

Лимфогранулематоз

Характеризуется увеличением лимфатических узлов отдельных групп или генерализованным (в зависимости от стадии болезни). Основной возможностью правильного распознавания заболевания является морфологическое (цитологическое и гистологическое) исследование лимфатических узлов.

Для цитологической картины лимфогранулематоза характерна пестрота клеточного состава: лимфоциты, пролимфоциты, лимфобласты, ретикулярные и плазматические клетки, эозинофилы, нейтрофилы, тучные клетки и клетки Березовского – Штернберга. Различают 2 вида клеток Березовского – Штернберга. Более зрелые элементы – больших размеров (до 80 мкм в диаметре). Они имеют много круглых и дольчатых ядер, сгруппированных обычно в центральной части клетки, чаще всего беспорядочно. Ядра содержат нити базихроматина, расположенные в виде коротких толстых палочек. В ядре содержится 2–4, реже больше ядрышек разнообразной величины и формы, окрашивающихся в синий цвет. Некоторые ядрышки имеют очень большие размеры, до величины малого лимфоцита. Цитоплазма большей частью значительная, гомогенная или ячеистая с неправильными контурами и окрашивается в светло-голубой или серовато-синий цвет, иногда с единичными азурофильными включениями. Описанные клетки нередко имеют сходство с опухолевыми клетками и мегакариоцитами. Другой вид клеток Березовского – Штернберга – так называемые молодые клетки, меньших размеров, округлой формы, с одним ядром, занимающим почти всю площадь клетки. Структура ядра нежная, местами слегка глыбчатая. В ядре имеются разнообразной величины и формы 2–4 ядрышка, окрашивающиеся в синий цвет. Цитоплазма чаще всего окрашивается в интенсивно-синий цвет.

Гистологическая картина, оцениваемая по классификации Lukes с соавторами, включает 4 гистологических варианта лимфогранулематоза.

1. Лимфогистиоцитарный вариант – с преобладанием лимфоидной ткани. Клеточный состав представлен зрелыми лимфоцитами, единичными эозинофилами, нейтрофилами и плазматическими клетками. Клетки Березовского – Штернберга встречаются при просмотре многочисленных срезов; это не типичные гигантские многоядерные клетки, а более мелкие с широкой светлой цитоплазмой, двухлопастным ядром и небольшим нечетким ядрышком.

2. Узелковый склероз, для которого характерно образование правильных тяжей коллагена, делящих ткань узла на округлые участки. Клеточная пролиферация при узелковом склерозе широко варьирует. Особенностью этого варианта является наличие особенно крупных «лакунообразных» клеток Березовского – Штернберга.

3. Смешаный клеточный вариант с пестротой клеточного состава: эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты, плазматические клетки, атипичные ретикулярные клетки, «диагностические» клетки Березовского – Штернберга. Склероз значительно выражен. Встречаются очаги некроза.

4. Ретикулярный вариант и вариант диффузного фиброза объединены в одну группу благодаря выраженной редукции лимфоцитов. Для первого характерны преобладание атипичных клеток Березовского – Штернберга, ретикулярных клеток и умеренно выраженный фиброз, для второго – массивное разрастание грубых тяжей волокнистой соединительной ткани с выпадением аморфных белковых масс, небольшое количество ретикулярных клеток и клеток Березовского – Штернберга.

Решающим для диагноза лимфогранулематоза во всех случаях является обнаружение клеток Березовского – Штернберга.

Лимфосаркома

Увеличенные лимфатические узлы локализуются вначале большей частью в шейной области. В дальнейшем наблюдается увеличение и других их групп.

При цитологическом исследовании пунктата при мелкоклеточной лимфосаркоме обнаруживают большое количество тесно располагающихся мелких клеток, которые имеют большое сходство с лимфоцитами. Среди мелких клеток встречаются и более крупные, которые трудно дифференцировать с пролимфоцитами и лимфобластами. Диагностика в этих случаях затруднена. Возникает необходимость в производстве биопсии лимфатического узла и пункции костного мозга.

При крупноклеточной лимфосаркоме в пунктате отмечается наличие большого количества (90 % и более) довольно крупных круглых клеток. Большая часть этих клеток занята ядром. Ядро чаще круглое, но встречается и бобовидной формы. Оно состоит из нежных переплетающихся нитей базихроматина и содержит 2–4 ядрышка. Обнаруживается большое количество клеток в состоянии деления. Цитоплазма небольших размеров, окрашена в синий или голубой цвет. Нередко в ней имеются различной величины вакуоли.

Ретикулосаркома

Вначале поражается какая-либо одна группа лимфатических узлов, которые могут быть средней плотности и не соединены между собой. Затем процесс быстро распространяется на другие группы, увеличенные лимфатические узлы становятся более плотной консистенции и соединяются между собой.

В пунктате обнаруживают большое количество разнообразных клеток. Часть из них по морфологическим чертам приближается к клеткам лимфосаркомы, часть же имеет сходство с истинными клетками злокачественных опухолей. Между ними наблюдаются и переходные формы. Клетки достигают 30–40 мкм в диаметре. Они располагаются в препарате одиночно или группами.

Чаще клетки имеют неправильную форму. Встречаются единичные двуядерные и трехъядерные экземпляры гигантских размеров. Ядра этих клеток имеют округлую, овальную, бобовидную, лапчатую и другие формы и расположены большей частью центрально.

Структура ядра нежная. При окраске они приобретают оттенок от светлого до темного красно-фиолетового. В ядре имеются различной величины и формы резко очерченные ядрышки, окрашивающиеся в синий цвет. Часто встречаются фигуры митоза. Цитоплазма у большинства клеток широкая, расплывчатая, окрашивающаяся в светло-синий, а у некоторых клеток в темно-синий цвет. Нередко в ядре и цитоплазме имеются вакуоли.

Кроме описанных клеток, в препарате при ретикулосаркоме могут быть в большом количестве молодые ретикулярные клетки, зрелые лимфоциты, единичные нейтрофилы и эозинофилы.

Метастазы рака

При метастазах рака в регионарные лимфатические узлы раковая опухоль постепенно вытесняет нормальную ткань лимфатического узла. Поэтому в полученном пунктате обнаруживают большое количество клеточных элементов опухоли. В начале метастазирования находят отдельные клетки опухоли или небольшие их группы среди значительного количества клеток лимфаденоидной ткани.

Признаки раковых клеток: большие размеры, достигающие 70–80 мкм. Наряду с клетками гигантских размеров встречаются небольшие по величине клетки разнообразной формы. Ядерно-цитоплазменное соотношение в них нарушено за счет увеличения размера ядра, занимающего большую часть клетки, диаметр его иногда достигает 40–50 мкм. Форма ядра разнообразная, часто неправильная и причудливая. Нередко в одной и той же клетке имеются ядра, разные по величине и форме. Встречаются синцитиальные образования с большим количеством ядер. Цитоплазма окружает ядро большей частью небольшим ободком. Структура ядра то нежная, то более грубая. Базихроматин неравномерный. Количество делящихся клеток увеличено, много фигур митозов. В некоторых клетках ядрышки больших размеров, окрашиваются в темно-синий цвет, в других клетках они очень мелкие, слабо окрашиваются. Форма их чаще круглая или овальная, иногда угловатая.

В цитоплазме и ядре часто имеются дегенеративные изменения: жировое перерождение цитоплазмы и нередко ядра, вакуолизация, лизис и пикноз ядер, появление голоядерных клеток. Иногда обнаруживают фагоцитирующие раковые клетки.

Диагноз метастазов рака в лимфатический узел ставится не на основании изменений в каких-либо отдельных клетках, а по сумме всех цитологических признаков, обнаруженных при детальном изучении препаратов и с учетом клинических и лабораторных данных о больном.

Саркома

Метастазы саркомы в лимфатические узлы встречаются крайне редко. Еще реже наблюдаются в них первичные саркомы. Диагноз саркомы на основании исследования пунктата лимфатических узлов нужно ставить осторожно.

Макрофолликулярная лимфобластома

Чаще увеличиваются лимфатические узлы шеи на любой ее стороне, но заболевание может начинаться и с увеличения подмышечных, паховых и других узлов. Величина их может резко варьировать. В одних случаях лимфатические узлы могут месяцами оставаться тех же размеров, в других происходят быстрое их увеличение и генерализация процесса. Они мягкой консистенции, подвижны и безболезненны. При цитологическом исследовании обнаруживают особые клетки, которые можно разделить на 3 типа.

К первому типу относят клетки больших размеров с круглым крупносетчатым ядром с бледными ядрышками и светлой, почти прозрачной или слабобазофильной цитоплазмой, которая благодаря вакуолям часто кажется пенистой. В цитоплазме отдельных клеток имеются азурофильные зерна. Второй тип – это переходный вид клеток с ядром, более богатым хроматином и более грубой его структурой. Они меньше по размеру, чем первые. К третьему типу относят клетки, схожие с пролимфоцитами.

Установить точный диагноз можно лишь на основании гистологического исследования биопсированного лимфатического узла.

Саркоид Бека, доброкачественный лимфогранулематоз

Видимые лимфатические узлы у большинства больных не увеличены. У некоторых больных могут отмечаться лишь отдельные узлы, увеличенные до размеров зерна фасоли, или небольшие конгломераты. Кроме лимфатического аппарата, поражаются также кожа, легкие, щитовидная железа, миндалины, селезенка, печень и другие органы. При цитологическом исследовании обнаруживают большое количество пролимфоцитов, меньшее количество зрелых лимфоцитов и среди них эпителиоидные клетки и гигантские клетки типа клеток Пирогова – Лангханса. Эпителиоидные и гигантские клетки при этом заболевании имеют некоторые особенности:

1) не столь выражена регулярность палисадовидного расположения ядер у гигантских клеток по сравнению с гигантскими клетками при туберкулезе;

2) имеется азурофильная зернистость в цитоплазме эпителиоидных и гигантских клеток;

3) цитоплазма у эпителиоидных клеток более широкая, чем у эпителиоидных клеток при туберкулезе;

4) в цитоплазме эпителиоидных клеток наблюдается вакуолизация.

При этом заболевании отсутствует казеоз и нет лимфоидного вала вокруг эпителиоидных клеток. При дифференциальной диагностике следует помнить о заболеваниях со сходной морфологией (туберкулезе, сифилисе, туляремии).

Острый лимфаденит

Заболевание возникает в результате проникновения в лимфатические узлы различных вредных веществ инфекционной или неинфекционной природы. В начальной стадии воспаления клеточный состав пунктата лимфатического узла почти нормален: большое количество пролимфоцитов, небольшое количество зрелых лимфоцитов, единичные лимфобласты, эндотелий синусов, ретикулярные клетки и клетки типа моноцитов. Иногда встречаются макрофаги и нейтрофилы. Во второй стадии пунктат состоит из большого количества нейтрофилов, большая или меньшая часть которых находится в дегенеративном состоянии. Кроме нейтрофилов, имеются лимфоциты, лимфоидные и моноцитоидные клетки и макрофаги. Можно обнаружить микробы, которые располагаются как в цитоплазме нейтрофилов и макрофагов, так и внеклеточно. При окраске по Граму они становятся фиолетовыми. В третьей стадии острого лимфаденита образуется гной. Пунктат состоит преимущественно из нейтрофилов в различных стадиях распада, детрита и нитей фибрина. Обнаруживаются также макрофаги, небольшое количество лимфоидных и моноцитоидных клеток. Иногда встречаются так называемые гигантские клетки инородных тел – клетки больших размеров (до 35 мкм и более), возникающие в результате неполного амитотического деления ретикулярных плазматических клеток и поэтому содержащие по 3–5 и более ядер без деления цитоплазмы. Ядра круглые или овальные, реже вытянутой формы, располагаются, как правило, беспорядочно по всей клетке. Структура ядер грубая. Цитоплазма значительных размеров, окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет. Часто в ней содержатся включения в виде мелких зерен темно-розового цвета. В препаратах иногда находят микробы.

Туберкулезный лимфаденит

Лимфатические узлы при туберкулезном лимфадените различной величины, чаще расположены пакетами, могут быть соединены между собой и с окружающей клетчаткой и кожей. Иногда образуются свищи. По данным (Н. А. Шмелев, Е. Д. Тимашева), полученным в результате клинико-цитологических исследований, различают 5 стадий туберкулезного лимфаденита.

1. Гиперпластическая стадия. Характерными морфологическими признаками являются выраженная в различной степени гиперплазия лимфаденоидной ткани, присутствие ретикулярных клеток, ретикулогистиоцитарных и лимфоидно-ретикулярных элементов, синусовых клеток и наличие элементов лимфоидных бугорков.

2. Продуктивная стадия. Характерно образование анатомических элементов туберкулезной гранулемы. На фоне гиперплазии лимфаденоидной и ретикулярной тканей специфично присутствие эпителиоидных и гигантских клеток Пирогова – Лангханса, а иногда и участков кавернозного некроза. Эпителиоидные клетки имеют диаметр 16–18 мкм. Они неправильной, округлой или несколько вытянутой формы. Ядро овальное, хроматин имеет ажурную сетчатую структуру. Часто в ядрах содержится по одному маленькому ядрышку. Цитоплазма окружает ядро относительно широким ободком, без четких границ, а нередко едва заметна. Окрашивается в голубовато-дымчатый цвет.

Клетки Пирогова – Лангханса значительных размеров (80–90 мкм и более), имеют характерное кольцевидное расположение ядер по периферии клетки. Часто в окрашенных препаратах из-за нарушения целостности клетки обнаруживается только беспорядочное групповое расположение ядер. Клетки эндотелия синусов встречаются в небольшом количестве. Форма их круглая или неправильная, структура ядра мелкозернистая, рыхлая, в его петлях могут отмечаться нуклеолы. Цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет. Иногда имеются азурофильные зерна, разбросанные по всей цитоплазме.

3. Творожистая (казеозная) стадия. Пунктат макроскопически имеет вид крупинок. При микроскопическом исследовании он имеет вид аморфной массы, состоящей из мельчайших крупинок, нитей или неправильных глыб, окрашенных в темно-фиолетовый цвет. Нередко среди детрита могут располагаться сохранившиеся и разрушенные лимфоциты. Творожисто-измененный узел может подвергаться обызвествлению. В этих случаях на фоне детрита отмечаются различной величины и формы кристаллы фосфатов. Для подтверждения диагноза необходимо найти эпителиоидные клетки или клетки Пирогова – Лангханса. В небольшом проценте случаев в казеозном пунктате можно встретить туберкулезные микобактерии, поэтому необходимо произвести окраску мазков по Цилю – Нильсену. Для этой цели можно использовать нативные или окрашенные мазки, в которых был обнаружен казеоз, без предварительного их обесцвечивания.

4. Индуративная стадия. В этот период лимфатические узлы на ощупь очень плотные, иногда «хрящевой» консистенции, безболезненны. Прокол лимфатического узла производится с некоторым затруднением. Пунктат очень скудный. Характерными признаками этой стадии являются наличие небольшого количества нейтрофилов и зрелых лимфоцитов, среди которых обнаруживаются элементы рубцовой ткани (фиброциты и фибробласты), отсутствие макрофагальной реакции и наличие больших участков казеозного некроза. Заключение о туберкулезном характере процесса следует давать лишь при наличии в препарате эпителиоидных или гигантских клеток Пирогова – Лангханса.

5. Фиброзная стадия. Эпителиоидные бугорки в процессе обратного развития. Эпителиоидные клетки вытягиваются и превращаются в волокнистую субстанцию. Ядра также резко удлиняются.

Туляремия

При цитологическом исследовании пунктата находят большое количество лимфоцитов, скопление эпителиоидных клеток, а иногда гигантские клетки Пирогова – Лангханса. Могут обнаруживаться ретикулярные клетки. При нагноении в пунктате находят нейтрофилы в различных стадиях распада. Характер клеточных элементов при туляремии может быть сходным с таковым при туберкулезном или остром лимфадените, поэтому одно цитологическое исследование при данном заболевании решающего значения иметь не может.

Актиномикоз

Макроскопически пунктат желтовато-зеленого цвета. Нередко в нем содержатся белесоватые крупинки, состоящие из друз лучистого гриба. Для микроскопического исследования необходимо выбрать эти крупинки и приготовить нативный препарат. При подозрении на наличие друз и мицелия лучистого гриба этот препарат нужно окрасить по Граму. Клеточный состав пунктата лимфатического узла при актиномикозе не имеет специфических признаков. Могут встречаться элементы воспалительной реакции, иногда с наличием ксантомных клеток.

Чумный лимфаденит

Пункция лимфатического узла производится для поисков чумных палочек. Клеточный состав пунктата не имеет характерных признаков.

Лепра (проказа)

Пункция лимфатического узла производится главным образом для поиска лепрозных палочек. В пунктате находят вакуолизированные («пенистые») лепрозные клетки, которые являются производными ретикулярных клеток. Диаметр этих клеток колеблется от 30 до 50 мкм. Цитоплазма значительной величины и у многих клеток почти вся занята вакуолями различной величины, тесно примыкающими друг к другу. Вакуоли содержат липоиды, а поэтому при обычной окраске выглядят как пустоты.

Кроме этих клеток, в пунктате находят гигантские клетки с центрально расположенными ядрами и обрывками вакуолизированной цитоплазмы, напоминающие лепрозные клетки. Встречаются различной степени зрелости плазматические клетки, лимфоциты, гигантские клетки инородных тел, а также клетки, схожие с эпителиоидными.

Системная красная волчанка

В пунктате наблюдается увеличенное количество плазматических клеток различной степени зрелости и много макрофагов. Количество лимфоцитов уменьшено. Подобные изменения могут встречаться и при других заболеваниях. При достаточном количестве пунктата можно при соответствующей обработке произвести исследование на волчаночные клетки.

Сифилитические лимфадениты

Лимфатические узлы при сифилисе могут быть поражены во всех периодах болезни. Однако чаще всего они увеличены в первой и второй стадиях. В большинстве случаев поражаются лимфатические узлы в паховых областях. Поражение лимфатических узлов носит множественный характер. Они довольно плотной консистенции, подвижны и безболезненны, чаще имеют овальную форму и небольшой размер. Пункция лимфатических узлов при сифилисе имеет большое диагностическое значение в начале заболевания, когда серологические реакции могут еще не быть положительными. В этот период болезни в пунктате лимфатических узлов в 80 % случаев обнаруживают спирохеты. При цитологическом исследовании пунктата находят большое количество пролимфоцитов. Много клеток находится в состоянии митоза. В некоторых случаях обнаруживают плазматические клетки и макрофаги. Могут встречаться и эпителиоидные клетки. Диагноз можно поставить с уверенностью только при наличии спирохет.

Инфекционный мононуклеоз

Наиболее типичное расположение увеличенных лимфатических узлов – по заднему краю грудино-ключично-сосцевидной мышцы, но вместе с тем увеличиваются и другие узлы. Их размеры колеблются от величины фасоли до величины лесного ореха. В первые дни болезни они небольшие, затем быстро увеличиваются, достигая к 4–6-му дню наибольших размеров. Лимфатические узлы плотны, подвижны, не спаяны между собой и болезненны.

Клеточный состав пунктата пестрый. Характерной особенностью его является наличие значительного количества разнообразных ретикулярных клеток, среди которых различают атипичные одноядерные клетки часто неправильной формы. В пунктате имеются клетки, схожие с плазмоцитами, плазмобластами, пролимфоцитами и лимфобластами. Кроме перечисленных клеток, в пунктате лимфатического узла обнаруживают большое количество пролимфоцитов и немного зрелых лимфоцитов.

Глава 15

Современные методы лабораторной диагностики

Виды лабораторных исследований

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ входит в группу иммунохимических методов и относится к наиболее популярным методам лабораторной диагностики, применяется при определении инфекционных, воспалительных, эндокринных, онкологических, аллергических и иммунных заболеваний, задействуется в определении уровня онкомаркеров, гормонов, выявлении лекарственных препаратов и прочих соединений в биологических средах человека.

Принцип действия ИФА основан на специфическом взаимодействии между антигеном и антителом. Постановка реакций осуществляется с целью выявления антител или антигенов. Результаты выдаются качественно или количественно. При качественной диагностике выявляется наличие или отсутствие определенных антител или антигенов в биоматериале. При количественной диагностике возможно определить концентрацию вещества в биологической жидкости. Метод ИФА характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью, возможностью определить заболевание и отследить динамику процесса, доступностью.

Сфера применения иммуноферментного анализа:

1) выявление специфических антител к инфекционным заболеваниям;

2) выявление антигенов инфекционных и венерологических заболеваний;

3) исследование гормонального статуса;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование по поводу наличия аутоиммунных заболеваний.

Ультразвуковое исследование (УЗИ)

Ультразвуковое исследование действует на основе отражения ультразвуковых волн от внутренних органов. Данное исследование позволяет создать изображение внутренних органов на мониторе. Различные по плотности среды (жидкость, газ, кость) различным образом отображаются на экране. Посредством УЗИ возможно определить размер и форму внутренних органов и заметить структурные изменения. Эхокардиография (ЭхоКГ) представляет собой вариант УЗИ, применяемый для исследования сердца.

Эндоскопия

Эндоскопическое исследование представляет собой исследование полостей и полых органов с помощью эндоскопа – гибкого волоконно-оптического инструмента с диаметром трубки 0,8–1,5 см и длиной 0,3–1,5 м. С помощью эндоскопа можно получить качественное изображение бронхов, пищеварительного тракта и др. Современные эндоскопы могут быть оборудованы устройством забора образцов тканей для дальнейших лабораторных исследований, а также электрическим зондом для разрушения патологической ткани.

Компьютерная томография (КТ)

Компьютерная томография относится к рентгенологическим методам исследования. Характеризуется высокой точностью и разрешающей способностью. При проведении данного исследования делается серия рентгеновских снимков по требуемым параметрам (плоскость, толщина среза и др.).

Магнитно-резонансная томография (МРТ)

Магнитно-резонансная томография представляет собой метод исследования, основанный на принципе действия мощного магнитного поля для получения точных изображений органов. Данный метод диагностики относится к высокоточным, но сложным и достаточно дорогим.

Радионуклеидное исследование

Радионуклеидное исследование основано на принципе распознавания радиоактивно меченых веществ, специфичных для того или иного органа. Индикатор (меченые вещества) в небольшом количестве вводят в вену пациента. Особенно популярен данный метод при исследовании кровоснабжения органов, в частности, злокачественных опухолей. Излучение индикаторов, распределившихся по организму, регистрируется гамма-камерой. Изображение воспроизводится на экране и фиксируется. Возможно генерирование трехмерного изображения, в частности, «холодных» или «горячих» узлов в щитовидной железе. Обычно исследование данного вида используется при дифференциальной диагностике.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР-диагностика представляет собой высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики. Принцип действия основан на выявлении в исследуемой пробе специфического участка ДНК или РНК возбудителя. Благодаря высокой чувствительности данный метод дает возможность выявить даже единичные клетки возбудителей (вирусов, бактерий). Для сравнения, чувствительность микроскопических и иммунологических тестов составляет 103–105 клеток в исследуемой пробе, чувствительность ПРЦ-теста – 10–1000 клеток. Одна биологическая проба дает возможность обнаружения нескольких возбудителей. Еще одно преимущество данного вида диагностики – возможность доклинической и ретроспективной диагностики. Возможно также исследование архивного материала или биологических остатков, что применяется при идентификации личности или установлении отцовства.

В качестве биологической пробы могут выступать всевозможные биологические среды и жидкости пациента: слюна, моча, кровь, соскобы эпителиальных клеток, ткани плаценты, выделения из половых органов и другие. При выявлении в пробе заданных условий (наличия возбудителя) определенный участок ДНК или РНК патогена подвергается амплификации (многократному удвоению) под действием ферментов в лабораторных условиях. После чего образуется достаточное количество ДНК или РНК для визуального анализа специалиста.

Эффективность ПРЦ-диагностики доказана в случае подозрения на следующие заболевания:

1) боррелиоз, клещевой энцефалит;

2) вирусные гепатиты А, В, С, G (РНК-HAV, ДНК-HBV, РНК-HCV, РНК-HGV);

3) ВИЧ-инфекции (ВИЧ-1);

4) герпетическая инфекция (ДНК вируса простого герпеса ВПГ 1-го и 2-го типа);

5) инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейн-Барр – ВЭБ);

6) ИППП (инфекции, передающиеся половым путем) – уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз);

7) кандидоз (грибы рода Candida);

8) коронавирусная инфекция COVID-19;

9) листериоз;

10) онкогенные вирусы (папилломавирусная инфекция);

11) туберкулез (микобактерия туберкулеза);

12) хеликобактерная инфекция (Helicobacter pylori);

13) цитомегаловирусная инфекция (ДНК-CMV) и пр.

Для получения точных результатов необходима правильная подготовка к сдаче биологического материала. Врачи рекомендуют не вступать в половые отношения за сутки до сдачи материала, кровь для исследования сдавать натощак утром, при сдачи мочи собирать первую утреннюю порцию в стерильный контейнер.

Виды анализаторов ПЦР

Изотермические амплификаторы. Полуавтоматические и автоматические. Применяются для амплификации цели (ДНК или РНК) в образце при постоянной температуре, путем применения реакций транскрипции и обратной транскрипции. Также используется для выявления усиленного продукта реакции путем применения олигонуклеотидных маркеров в режиме реального времени.

Амплификаторы нуклеиновых кислот термоциклические (термоциклеры). Полуавтоматические, автоматические, на ручном управлении. Применяются для амплификации мишеней ДНК или РНК в клиническом образце. Действие основано на применении термостабильного фермента полимеразы и повторяющихся циклов охлаждения и нагревания (термоциклирование) для репликации продукта. При получении амплифицированного продукта его идентифицируют посредством использования олигонуклеотидных маркеров в реальном времени или по конечной точке. Также данный анализатор обладает возможностью изоляции, экстрагирования, подготовки нуклеиновых кислот из клинического образца.

Виды иммунохимических анализаторов

Анализаторы иммунологические жидкофазные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для качественного или количественного выявления химических и биологических маркеров в клиническом образце. Принцип работы основан на иммунологическом методе: при воздействии жидкофазного связывания иммунологические компоненты связываются без твердой фазы и определяются посредством флуоресцентного или хроматографического разделения.

Анализаторы иммунологические многоканальные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для качественного или количественного выявления множественных химических и биологических маркеров в клиническом образце. Принцип работы основан на сочетании двух и более технологий, включая хроматографическое или электрохимическое разделение в сочетании с ферментной, хемилюминесцентной, флуоресцентной, радиометрической, нефелометрической, электрометрической или фотометрической системой определения. Обычно для работы анализатора требуются определенные тестовые наборы для тех или иных аналитов или реагентов.

Анализаторы иммунологические нефелометрические. Полуавтоматические или автоматические. Принцип действия основан на применении иммунологического метода. Для определения скорости и количества агглютинации частиц через образование иммунных комплексов применяется нефелометрическая система детекции. Поддерживается обработка образца, данных и визуальное воспроизведение данных.

Анализаторы иммунологические с магнитными частицами. Полуавтоматические или автоматические. Принцип работы основан на иммунологическом методе. Применяется система детектирования с магнитными частицами. Антигены и антитела, меченные магнитными частицами, иммунологически связываются в твердой фазе (в частности, посредством иммунохроматографической тест-полоски, микропланшета).

Анализаторы иммуноферментные (ИФА). Полуавтоматические или автоматические. Принцип действия основан на применении иммунологического метода с использованием ферментов.

Анализаторы иммунофлуоресцентные. Полуавтоматические или автоматические. Могут быть стационарными или портативными. В результате иммунологической реакции между реагентом и образцом появляются флуоресцентные маркеры, которые и считываются прибором. В состав анализатора обычно входят автоматический отборник проб, дозатор реагентов, источник света, монохроматор или фильтр, флуоресцентная система обнаружения, программное обеспечение.

Анализаторы иммунохемилюминесцентные. Полуавтоматические или автоматические. Принцип работы основан на иммунологическом методе с применением системы хемилюминесцентного определения.

Анализаторы мультиплексные. Полуавтоматические или автоматические. Применяются для качественного или количественного одновременного определения множественных химических и биологических маркеров в клиническом образце. Принцип действия основан на иммунологическом методе: множество антител, расположенных на твердой поверхности или микрочастицах, объединяются. Обычно в состав прибора входит система определения связанного антигена-мишени (флуоресцентный, хемилюминесцентный, фотометрический, магнитный детектор).

Глава 16

Характеристики заболеваний, сопровождающихся нарушением в составе крови

Анемии

Анемия (малокровие) – это синдром, обусловленный снижением эритроцитов и гемоглобина в единице циркулирующей крови. Истинная анемия, которую необходимо отличать от гемоделюции, вызываемой массивным переливанием кровезаменителей, сопровождается или уменьшением циркулирующих эритроцитов, или снижением содержания в них гемоглобина. При железодефицитных состояниях, анемиях, связанных с нарушением синтеза порфиринов, талассемии содержание эритроцитов в крови может оставаться нормальным (при талассемии – нередко повышенным) при низком уровне гемоглобина. При острых кровопотерях (массивном кровотечении или остром гемолизе) в первые часы уровень гемоглобина и эритроцитов в крови остается нормальным, хотя есть очевидные признаки малокровия – бледность кожных покровов, конъюнктив, спавшиеся вены, сердцебиение и одышка при небольшой нагрузке, а в тяжелых случаях – и падение артериального давления. Анемии всегда вторичны, т. е. являются одним из симптомов какого-то общего заболевания. Наряду с часто встречающимися и легко диагностируемыми формами анемии имеются и очень редкие анемические синдромы, требующие для диагностики сложных методических приемов.

Классификация

Единой классификации анемий в зависимости от механизма возникновения и нозологической принадлежности не существует. Приведена классификация, согласно которой анемии делятся в основном на 2 большие категории: анемии, вызванные нарушениями гемоглобинообразования или продукции эритроцитов, и анемии, обусловленные повышенной деструкцией эритроцитов (гемолитические).

1. Анемии вследствие нарушения гемоглобинообразования или продукции эритроцитов:

1) железодефицитные, гипохромные, связанные с дефицитом железа и возникающие вследствие:

а) хронических кровопотерь:

– маточных кровотечений;

– кровотечений из желудочно-кишечного тракта (язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, грыжи пищеводного отверстия диафрагмы, геморрой, злокачественные и доброкачественные опухоли, дивертикулы, глистные инвазии, анкилостомоз);

– кровотечений из легких (парагонимоз, изолированный легочный сидероз);

б) недостаточного поступления железа с пищей (редко);

в) повышенной потребности в железе:

– при беременности;

– в период лактации;

– у подростков;

– у недоношенных детей;

г) дефицита трансферрина:

– наследственного;

– приобретенного;

2) гипохромные, не связанные с дефицитом железа, возникающие вследствие:

а) нарушения синтеза или утилизации железа;

б) наследственных патологий;

в) приобретенных заболеваний;

г) свинцовой интоксикации;

д) приема некоторых противотуберкулезных средств;

е) хронического алкоголизма;

3) мегалобластные В_12-дефицитные, возникающие вследствие:

а) снижения секреции внутреннего фактора:

– анемия Аддиса – Бирмера;

– тотальная гастроэктомия;

– токсическое действие высоких доз алкоголя на слизистую оболочку желудка;

б) нарушения всасывания витамина В_12 в кишечнике:

– наследственное селективное нарушение всасывания;

– приобретенные формы (спру, целиакия, регионарный илеит, обширная резекция тонкой кишки, синдром malabsorbtion, вызванный лекарствами – неомицином, колхицином);

– конкурентное поглощение витамина В_12 в кишечнике;

– дифиллоботриоз;

– синдром «слепой петли»;

– дивертикулез тонкой кишки;

в) недостаточного поступления витамина В_12 с пищей (редко);

4) мегалобластные фолиеводефицитные, возникающие вследствие:

а) нарушения всасывания фолиевой кислоты:

– спру;

– целиакия;

– резекция тонкой кишки;

– синдром «слепой петли»;

б) хронического алкоголизма и алкогольного цирроза печени;

в) приема некоторых противосудорожных (дифенин, фенобарбитал) и противозачаточных средств;

г) повышенной потребности (расход) в фолиевой кислоте:

– при беременности;

– у подростков;

– недоношенных детей;

д) недостаточного поступления фолиевой кислоты с пищей (редко);

5) гипо- и апластические (недостаточность продукции костного мозга), возникающие вследствие:

а) воздействия токсических факторов:

– ионизирующей радиации;

– химических агентов (бензола, мышьяка, солей висмута, жидкого азота);

б) применения лекарственных средств:

– антибиотиков (хлорамфеникол, стрептомицин);

– противоэпилептических (дилантин, мезантоин);

– антиметаболитов (6-меркаптопурин, метотрексат);

в) влияния гормонов и метаболических ингибиторов:

– микседема;

– гипофизарная недостаточность;

– злокачественные опухоли;

– инфекции;

6) идиопатическая форма:

а) наследственная форма:

– тип Фанкони;

– Даймонда – Блекфена;

б) связанные с гемобластозами (метапластические):

– острый лейкоз;

– множественная миелома;

– миелофиброз;

– остеомиелосклероз.

2. Анемии вследствие повышенной деструкции эритроцитов (гемолитические):

1) наследственные гемолитические:

а) дефекты в эритроцитарной мембране:

– наследственный сфероцитоз;

– наследственный эллиптоцитоз;

– наследственный стоматоцитоз;

– наследственный акантоцитоз;

б) дефицит ферментов эритроцитов:

– Г-6-ФДГ;

– пируваткиназы и др.;

в) гемоглобинопатии:

– гемоглобинопатия S, С;

– талассемия;

– смешанные формы;

– нестабильные гемоглобины;

2) приобретенные гемолитические:

а) связанные с антителами (иммунные):

– изоиммунные (посттрансфузионные, гемолитическая болезнь новорожденных);

– гаптеновые (лекарственные, вирусные);

– аутоиммунные (идиопатическая аутоиммунная анемия);

– вторичные аутоиммунные (злокачественные опухоли, системные заболевания соединительной ткани);

– пароксизмальная холодовая гемоглобинурия;

б) вызванные механическим разрушением:

– маршевая гемоглобинурия при протезировании клапанов сердца;

– микроангиопатическая гемолитическая анемия при болезни Мошковича, уремическо-гемолитическом синдроме, гранулематозе Вегенера, ДВС-синдроме;

в) обусловленные инфекционными агентами:

– септицемией;

– вирусными инфекциями;

– малярией;

г) вызванные воздействием химических агентов:

– нитро- и динитробензолом;

– солями свинца;

– анилином;

– фенилгидразином;

– коллоидальным серебром;

– мышьяковистым водородом.

Железодефицитная анемия

Этиология и патогенез определяются недостаточным поступлением в организм железа, что приводит к снижению функции тканевых ферментов, содержащих железо, а в последующем появляется нарушение синтеза гемоглобина. В большинстве случаев решающую роль играют хронические кровопотери, не компенсируемые поступлением железа с пищей, реже (это бывает у детей) анемия обусловлена малым исходным поступлением железа в организм плода из-за дефицита железа у матери. Особую группу составляют больные после резекции или с тяжелым поражением тонкого кишечника (резекция желудка без сопутствующего энтерита не ведет к развитию дефицита железа).

Клиническая картина

Характерны вялость, повышенная утомляемость еще до развития выраженной анемии, запор, головная боль, извращение вкуса (больные едят мел, глину, появляется, склонность к острой, соленой пище и т. п.), ломкость, искривление и поперечная исчерченность ногтей, выпадение волос, императивные позывы на мочеиспускание, недержание мочи. Кроме этих признаков, в крови отмечаются специфические для всех анемий признаки, связанные со степенью малокровия: бледность кожи и слизистых оболочек, сердцебиение, одышка при физической нагрузке. Важное значение в клинической картине имеет характер заболевания, вызвавшего дефицит железа (язва желудка, двенадцатиперстной кишки, геморрой, миома матки, обильные меноррагии и т. п.). При исследовании крови выявляется анемия. Цветовой показатель обычно низкий (иногда ниже 0,5); выраженная гипохромия эритроцитов, анизоцитов, пойкилоцитоз; скорость оседания эритроцитов обычно незначительно увеличена. Важнейший показатель болезни – снижение уровня железа сыворотки (норма – 13–28 ммоль/л для мужчин; 11–26 ммоль/л для женщин). Проверять его можно не менее чем через неделю после отмены препаратов, содержащих железо.

Диагностика

Дигноз железодефицитной анемии предварительно устанавливают при сниженном уровне гемоглобина и низком цветовом показателе на фоне типичных для железодефицитных состояний трофических нарушений. Доказательным он становится при низком уровне сывороточного железа и ферритина, который отражает запас железа в организме, а также повышении уровня общей железосвязывающей способности сыворотки.

Но и в этом случае требуется точно установить причину дефицита железа, после чего формируется диагноз заболевания в целом. С низким цветовым показателем, но без снижения уровня сывороточного железа и без свойственных дефициту железа трофических нарушений протекают талассемии и анемии, вызванные нарушениями синтеза порфиринов, в частности свинцовая интоксикация.

Кровопотеря из желудочно-кишечного тракта – одна из частых причин железодефицитной анемии. Желудочно-кишечные кровопотери могут оставаться скрытыми в течение многих лет, несмотря на многократные рентгенологические, гастро-, дуодено- и колоноскопические исследования, так как миомы и ангиомы тонкого кишечника при этих исследованиях не всегда выявляются. Количественно кровопотерю из желудочно-кишечного тракта можно оценить лишь при помощи метки эритроцитов по 51Сг.

Другой скрытой причиной кровопотери могут быть кровоизлияния в легочную паренхиму при изолированном легочном гемосидерозе. Заболевание характеризуется рецидивирующими эпизодами пневмонии с развитием железодефицитной анемии, сопровождающейся периодическим подъемом уровня ретикулоцитов в крови. При рентгенографии выявляются облаковидные множественные, нередко асимметричные тени, которые могут исчезнуть в течение 1–2 дней. Физикальные данные очень скудны: выслушиваются несколько усиленный выдох, единичные крепитирующие хрипы. Температура тела чаще невысокая. Тенеобразования в легких обусловлены кровоизлияниями (если их объем велик и они повторяются, то развивается железодефицитная анемия), сопровождающимися появлением в мокроте «клеток сердечных пороков» – макрофагов, насыщенных гемосидерином. Повторные легочные кровоизлияния могут привести к развитию легочного гемосидероза. В сомнительных случаях для диагностики приходится проводить биопсию легких.

Описанная картина легочного гемосидероза в сочетании с тяжелым прогрессирующим нефритом – синдром Гудпасчера – также может сопровождаться железодефицитной анемией. Синдром Гудпасчера развивается в результате образования аутоантител к базальной мембране клубочков почек; эти же антитела действуют и на базальную мембрану легочных альвеол.

Сходную клиническую картину, складывающуюся при гломерулонефрите и кровохарканье, дает поражение эндотелия клубочков почек и сосудов легких иммунными комплексами, которые могут появиться в ответ на инфекционный процесс любой природы и определяются методом иммунофлюоресценции в биоптате почек или легочной ткани. Иммунные комплексы нередко представлены криоглобулинами (комплекс иммуноглобулинов, выпадающих в осадок при температуре ниже 37 °C), которые могут циркулировать в крови, откладываться под эндотелием сосудов разных органов и тканей, вызывая развитие генерализованного васкулита, например болезни Шенлейна – Геноха.

Железодефицитная анемия может быть следствием хронического воспалительного процесса в организме (хронического пиелита, сепсиса и т. п.).

Скрытыми источниками кровопотери могут оказаться так называемые шоколадные кисты. Чаще речь идет о кистах яичников, повторные кровоизлияния в которые приводят к дефициту железа в организме, так как образующийся в местах кровоизлияний гемосидерин не всасывается и не утилизируется для нужд кроветворения. Эти кисты распознаются при тщательных гинекологическом и рентгенологическом исследованиях, с помощью компьютерной томографии, ультразвукового исследования.

Недостаточное поступление железа с пищей может стать причиной железодефицитной анемии при беременности и лактации, усиленном росте в период полового созревания у девушек, хотя во всех этих случаях обычно существует скрытый, предшествующий дефицит железа. Железодефицитная анемия может быть у недоношенных детей, у детей от многоплодной беременности. Меноррагии и метроррагии (например, при миомах матки), кровопотери при геморрое, носовых кровотечениях нередко служат причиной анемии. Однако во всех случаях, казалось бы, очевидных причин железодефицитной анемии необходимо самым тщательным образом исключить (прежде всего клинически) другие возможные источники кровопотерь, так как нередко анемия обусловлена не одной, а несколькими причинами. Появление железодефицитной анемии в пожилом возрасте независимо от пола требует исключения возможной опухоли желудочно-кишечного тракта.

Лечение

В первую очередь необходимо устранить причину кровопотерь. Обязательно назначают препараты железа внутрь: железа сульфат, глюконат и фуморат, гемостимулин, феррокаль, ферроплекс, орферон, конферон. При тяжелых формах малокровия рекомендуется принимать по 2 таблетки одного из этих препаратов 3 раза в день до еды. При плохой переносимости (тошнота, боль в животе) таблетки принимают после или во время еды и в таком количестве, чтобы диспепсических нарушений не было. Уменьшение дозы замедляет нормализацию состава крови. Препараты железа обычно принимают в течение нескольких месяцев, при сохраняющемся источнике кровопотерь (например, меноррагии) их назначают с небольшими перерывами почти постоянно, ориентируясь прежде всего на субъективные признаки дефицита железа, такие как повышенная утомляемость, сонливость, появление ломкости и деформации ногтей, сухость кожи, а затем и на показатели крови (табл. 55).

Прием препаратов железа усиливает костномозговую продукцию эритроцитов и сопровождается подъемом уровня ретикулоцитов в крови через 8–12 дней после начала терапии (факт, имеющий дифференциально-диагностическое значение). Несколько усиливает всасывание железа аскорбиновая кислота.

Таблица 55

Содержание железа и его усвоение из коммерческих препаратов

Лечение парентерально вводимыми препаратами железа менее эффективно, чем прием его в виде таблеток внутрь, поэтому проводится только при синдроме нарушенного всасывания после обширных резекций тонкой кишки и при тяжелых заболеваниях кишечника, при плохой переносимости препаратов внутрь.

Для внутримышечного введения применяют «Жектофер», «Фербитол», «Феррум Лек» и др. Последний препарат выпускают и для внутривенного введения. Показанием к парентеральному введению железа при железодефицитной анемии служат тяжелые энтериты, состояния после обширных резекций тонкой кишки (но не резекций желудка). Дозы назначают из Расчета 1,5 мг железа на 1 кг массы тела в сутки. «Жектофер» вводят внутримышечно по 2 мл в день больному с массой тела 60 кг.

При изолированном легочном гемосидерозе наряду с лечением препаратами железа применяют иммунодепрессивную терапию – преднизолон, а при его неэффективности и тяжелом клиническом состоянии – азатиоприн (имуран), циклофосфан или другие цитостатики. При синдроме Гудпасчера с лечебной целью используют те же иммунодепрессивные средства наряду с плазмаферезом, направленным на удаление иммунных комплексов.

Железодефицитная анемия, обусловленная инфекционным процессом, требует в первую очередь активной антибактериальной терапии. Препараты железа при остром процессе назначать не следует, если его дефицит обусловлен только инфекцией.

Лечение препаратами железа обычно проводят амбулаторно. Контрольные исследования крови целесообразны через 1,5 недели от начала лечения для выявления ретикулоцитарного подъема и через месяц, когда уровень гемоглобина обычно приближается к нормальному. В дальнейшем контроль достаточно осуществлять 1 раз в 3 месяца и даже реже, если больной хорошо оценивает субъективные признаки дефицита железа. Эти показатели – важный фактор контроля для систематической профилактики железодефицитных состояний.

Даже при отсутствии явных признаков дефицита железа, но выявлении отдельных его симптомов без развития анемии у беременных и женщин, страдающих обильными меноррагиями, целесообразно назначить 1 таблетку препарата железа в день до ликвидации всех этих явлений (витамин В_12 и другие витамины группы В в подобных ситуациях бесполезны!). Нередко наблюдаемая при беременности псевдоанемия вследствие гидремии (гемоглобин около 85–100 г/л, цветовой показатель, близкий к 1, розовый цвет лица и слизитых оболочек, отсутствие выраженного анизоцитоза эритроцитов) вообще не требует какого-либо специального противоанемического лечения. Псевдоанемия бесследно проходит самостоятельно.

Переливание крови при железодефицитных анемиях не показано, за исключением тяжелых состояний, связанных с массивной кровопотерей и сопровождающихся признаками острой постгеморрагической анемии.

Железодефицитная анемия у пожилых людей нередко требует подключения и кардиотонических средств, так как она осложняется сердечной недостаточностью, задержкой жидкости, гидремией, которая сама по себе ухудшает показатели анализа крови. Доказательством гидремической псевдоанемии является повышение показателей красной крови после лечения диуретиками и кардиотоническими средствами.

Наследственные анемии

Наследственные анемии обусловлены снижением связывания протопорфирина с железом и образованием гема (сидероахрестические анемии). Они характеризуются гипохромией эритроцитов, повышением уровня сывороточного железа, отложением железа с картиной гемосидероза органов.

Этиология и патогенез связаны с нарушением синтеза протопорфирина, что ведет к нарушению связывания железа и накоплению его в организме при резко нарушенном образовании гемоглобина. Наиболее тяжелой формой является наследуемая по рецессивному типу врожденная порфирия. Чаще встречается протопорфирия, наследование которой связано с Х-хромосомой, которая характеризуется отсутствием порфиринурии. Возможно также наследование по рецессивному типу, не сцепленное с полом.

Клиническая картина

При порфирии после рождения моча имеет красный оттенок, отмечается повышенная чувствительность к свету, выражающаяся появлением эритемы, пузырей с гнойным содержимым, из которых формируются рубцовые изменения. Появляются искривление скелета, коричневая окраска зубов, гемолитическая анемия, спленомегалия.

При протопорфирии жалобы почти отсутствуют. Отмечается повышенная утомляемость, чувствительность к солнечному свету. В последующем, в связи с отложением железа, кожа приобретает сероватый оттенок, развивается гемосидероз печени, поражаются поджелудочная железа, миокард.

Накопление железа в сердечной мышце приводит к тяжелой недостаточности кровообращения, гемосидероз яичек сопровождается развитием евнухоидизма. Иногда кожа приобретает серый оттенок.

Картина крови: выраженная гипохромия эритроцитов (цветовой показатель 0,4–0,6), уровень гемоглобина снижен, в меньшей степени изменено число эритроцитов, повышен уровень сывороточного железа. Морфологически отмечаются анизоцитоз, пойкилоцитоз, иногда небольшое количество мишеневидных форм. Содержание ретикулоцитов обычно нормальное. Другие показатели крови нормальные.

Диагностика

Диагноз устанавливают на основании гипохромной анемии без каких-либо признаков железодефицитного синдрома (отсутствуют выраженная астенизация, сухость кожи, выпадение волос, ломкость и деформация ногтей и т. п.), повышенного уровня сывороточного железа. Следует иметь в виду, что железодефицитные анемии чаще встречаются у женщин, а данная форма – почти исключительно у мужчин. При исследовании костного мозга в отличие от железодефицитных анемий отмечается высокий процент кольцевых сидеробластов (практически все эритрокариоциты – кольцевые сидеробласты). Окончательно диагноз может быть установлен при исследовании уровня порфиринов в эритроцитах.

Лечение

Назначают пиридоксин (витамин B_6) 1 мл 5%-ного раствора внутримышечно 2 раза в день. При эффективной терапии через 1,5 недели резко возрастает содержание ретикулоцитов, а затем повышается и уровень гемоглобина. При нарушении активности фермента пиридоксалькиназы эффект дает применение кофермента витамина B_6 (пиридоксальфосфата) по 2 мг 3 раза в день в таблетках. Для лечения гемосидероза как такового, сопровождающегося патологией печени, поджелудочной железы и других органов, а также для лечения форм, устойчивых к витамину B_12 (ими болеют как мужчины, так и женщины; наследование рецессивное, не сцепленное с полом), применяют дефероксамин (десферал) курсами не менее месяца по 500 мг внутримышечно ежедневно. Таких курсов может быть 4–6 в год. Повышенное выведение из организма железа с помощью дефероксамина не только способствует нормализации функций, нарушенных из-за гемосидероза органов, но и уменьшает степень анемии, улучшая деятельность блокированного избытком железа костного мозга.

Анемия при свинцовом отравлении

Этиология и патогенез

Эта анемия обусловлена нарушением синтеза порфиринов и гема, определяется блокадой свинцом ферментов, участвующих в синтезе гема. В результате развивается гипохромная анемия при высоком уровне сывороточного железа. Кроме того, свинец повреждает оболочку эритроцитов, вызывая повышенный гемолиз. В результате нарушения синтеза гема повышается выведение из организма порфиринов и, что патогномонично для свинцового отравления, δ-аминолевуленовой кислоты, уровень которой в моче повышается в десятки раз.

Клиническая картина

Складывается из общих признаков анемического синдрома без явлений дефицита железа, полиневрита, приступообразной боли в животе. При исследовании крови выявляются гипохромная анемия, повышение содержания ретикулоцитов до 10 % вследствие гемолиза, барофильная пунктация в эритроцитах, высокий уровень сывороточного железа. В костном мозге наблюдается высокий процент сидеробластов.

Диагностика

Диагноз подтверждается существенным повышением в моче уровня δ-аминолевуленовой кислоты. Другой важный признак свинцового отравления – повышенное выделение свинца с мочой при введении в организм комплексонов (тетацин-кальция, оксатиола и др.). Определенную помощь в диагностике оказывают анамнестические сведения о контакте со свинцом (например, литье дроби, игрушек, употребление молока или квашеных овощей, хранившихся в глиняной посуде кустарного производства, глазурь которых нередко содержит свинец).

Лечение

Проводится комплексонами под контролем уровня выводимого свинца и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче. При эффективной терапии ее содержание в моче нормализуется.

Мегалобластные анемии

Это группа анемий, общим признаком которых служит обнаружение в костном мозге своеобразных эритрокариоцитов со структурными ядрами, сохраняющими эти черты на поздних стадиях дифференцировки (результат нарушения синтеза ДНК и РНК в клетках, называемых мегалобластами), в большинстве случаев мегалобластная анемия характеризуется цветовым показателем выше 1. Поскольку синтез нуклеиновых кислот касается всех костномозговых клеток, частыми признаками болезни являются уменьшение числа тромбоцитов, лейкоцитов, увеличение числа сегментов в гранулоцитах.

Анемии, связанные с дефицитом витамина B_12

Независимо от причин этого дефицита эти анемии характеризуются появлением в костном мозге мегалобластов, внутрикостномозговым разрушением эритроцитов, гиперхромной макроцитарной анемией, тромбоцитопенией и нейтропенией, атрофическими изменениями слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и изменениями нервной системы в виде фуникулярного миелоза.

Этиология, патогенез

Идиопатическая форма B_12-дефицитной анемии (пернициозная анемия) развивается в результате недостаточного поступления в организм экзогенного цианокобаламина (витамина В_12), встречается преимущественно у лиц пожилого возраста. Патогенез дефицита витамина В_12 чаще связан с нарушением выработки гликопротеина, соединяющегося с пищевым витамином В_12 и обеспечивающего его всасывание (внутренний фактор). Нередко первые признаки заболевания появляются после перенесенного энтерита, гепатита. В первом случае это связано с нарушением всасывания витамина В_12 в тонкой кишке, во втором – с расходованием его запасов в печени, являющейся основным депо витамина B_12. Однако и тот и другой провоцирующие моменты могут играть роль пускового механизма лишь при уже ранее имевшемся скрытом дефиците этого витамина за счет нарушения секреции внутреннего фактора. Развитие В_12-дефицитной анемии после тотальной гастрэктомии (когда полностью ликвидируется секреция внутреннего фактора) происходит через 5–8 лет и более после операции. В течение этого срока больные живут запасами витамина в печени при минимальном пополнении его за счет незначительного всасывания в тонкой кишке не соединенного с внутренним фактором витамина.

Весьма редкой формой В_12-дефицитной анемии является нарушение ассимиляции витамина при инвазии широким лентецом, когда паразит поглощает большое количество витамина В_12. Причинами нарушенного всасывания витамина В_12 при поражении кишечника могут быть тяжелый хронический энтерит, терминальный илеит, дивертикулез тонкого кишечника, возникновение слепой петли тонкой кишки после операции на ней.

В возникновении дефицита витамина в последних случаях важную роль играет его поглощение избыточно развившейся кишечной микробной флорой.

К редкой форме дефицита витамина В_12 относится рецессивно наследуемый синдром Имерслунда – Гресбека с поражением эпителия кишечника, почек, кожи. Болезнь развивается у детей и характеризуется сочетанием мегалобластной анемии с поражением почек. Изредка болезнь бывает у взрослых.

Одной из причин нарушенного выделения внутреннего фактора может быть хроническая алкогольная интоксикация, когда она сопровождается токсическим поражением слизистой оболочки желудка. Причина возникновения наиболее распространенной идиопатической формы болезни не совсем ясна, хотя для многих случаев может быть доказана наследственная природа (рецессивное наследование).

Клиническая картина дефицита витамина В_12 характеризуется поражением кроветворной ткани, пищеварительной и нервной систем. Отмечаются слабость, утомляемость, сердцебиение при физической нагрузке. Один из характерных признаков – фуникулярный миелоз. Желудочная секреция угнетена, возможна стойкая ахлоргидрия.

Нередко наблюдаются признаки глоссита – «полированный» язык, ощущение жжения в нем. Кожа больных иногда слегка желтушна, в сыворотке крови увеличен уровень непрямого билирубина (за счет повышенной гибели гемоглобинсодержащих мегалобластов костного мозга). Определяется небольшое увеличение селезенки, реже – печени.

Диагностика

Картина крови: резко выраженный анизоцитоз эритроцитов наряду с очень крупными (более 12 мкм в диаметре) клетками-мегалоцитами, резчайший пойкилоцитоз, повышенное насыщение эритроцитов гемоглобином – гиперхромия, появление полисегментированных нейтрофилов, гиперхромный, реже нормохромный характер анемии, тромбоцитопения, лейкопения.

Степень цитопении может быть различной, редко отмечается параллелизм в снижении уровня всех трех форменных элементов крови. Решающее значение в диагностике принадлежит исследованию костного мозга, которое обнаруживает резкое увеличение в нем числа элементов эритроидного ряда с преобладанием мегалобластов. Описанная картина относится к далеко зашедшим состояниям.

Часто В_12-дефицитная анемия определяется лишь по картине крови у больных без каких-либо жалоб: отмечаются умеренная, обычно гиперхромная, анемия, лейкопения, тромбоцитопения (иногда либо тромбоцитопения, либо лейкопения). Полисегментация ядер нейтрофилов, резко выраженные изменения формы эритроцитов могут отсутствовать. В костном мозге во всех случаях находят большой процент мегалобластов. Однако если больной за несколько дней до пункции костного мозга получил инъекцию витамина В_12, то мегалобластоз костного мозга может либо оказаться не очень резко выраженным, либо отсутствовать вовсе. Следовательно, во всех случаях нормохромной или гиперхромной анемии, сопровождающейся лейко- и тромбоцитопенией (признак необязательный), необходимо помнить важнейшее правило: проводить пункцию костного мозга до назначения витамина В_12.

Клетки красного мозга, очень напоминающие мегалобласты, могут встречаться при остром эритромиелозе, который, как и В_12-дефицитная анемия, сопровождается небольшой желтушностью, часто сочетается с лейко- и тромбоцитопенией. Однако при этом лейкозе нет столь выраженного анизо- и пойкилоцитоза, как при В_12-дефицитной анемии, а главное – в костном мозге наряду с мегалобластоподобными клетками встречаются в большом количестве миелобласты или недифференцируемые бласты. В сомнительных случаях следует после пункции костного мозга начать терапию витамином В_12, которая при В_12-дефицитной анемии через 8–10 дней приведет к резкому возрастанию в крови процента ретикулоцитов (ретикулоцитарному кризу), подъему уровня гемоглобина, исчезновению в крови выраженного анизоцитоза, а в костном мозге – мегалобластов. При остром эритромиелозе введение витамина В_12 не может изменить ни картины крови, ни состояния больного.

Установление причины дефицита витамина В_12 – следующий этап диагностики. Надо иметь в виду, что иногда дефицит витамина В_12 сочетается с раком желудка, так как рак желудка несколько чаще возникает у лиц, страдающих этой формой анемии. Наряду с проведением всех обязательных исследований (для исключения инвазии широким лентецом, энтерита и т. п.) необходимо убедиться с помощью гастроскопии или рентгенологического исследования в отсутствии рака желудка.

Лечение

Цианокобаламин (витамин В_12) вводят ежедневно подкожно в дозе 200–500 мгк 1 раз в день в течение 4–6 недель. После нормализации кроветворения и состава крови, наступающей через 1,5–2 месяца, витамин вводят 1 раз в неделю в течение 2–3 месяцев, затем в течение полугода 2 раза в месяц (в тех же дозах, что и в начале курса). В дальнейшем больных следует поставить на диспансерный учет; профилактически им вводят витамин В_12 1–2 раза в год короткими курсами по 5–6 инъекций. Эта рекомендация может быть изменена в зависимости от динамики показателей крови, состояния кишечника, функции печени.

Диагностику заболевания, самым сложным элементом которой является костномозговая пункция, и лечение витамином В_12 можно провести в амбулаторных условиях. Длительность нетрудоспособности определяется выраженностью анемии и неврологическими нарушениями. Стойкой утраты трудоспособности при этом заболевании практически не бывает. Опасным, угрожающим жизни осложнением дефицита витамина В_12 является развитие комы. Чаще это состояние наблюдается в глубокой старости у лиц, которым задолго до этого осложнения исследовали периферическую кровь или вообще не проверяли кровь в течение десятков лет. Пожилым людям, госпитализируемым в коматозном состоянии, после установления низкого уровня гемоглобина необходимо немедленно произвести стернальную пункцию, окрасить мазок и, увидев картину В_12-дефицитной мегалобластной анемии, начать введение больших доз витамина; переливание эритроцитной массы начинают только при выявлении низкого уровня гемоглобина.

Фолиеводефицитная анемия

Фолиеводефицитная анемия – мегалобластная анемия, сходная в основных проявлениях с В_12-дефицитной анемией; развивается при дефиците фолиевой кислоты.

Этиология и патогенез

Нарушение всасывания фолиевой кислоты наблюдается у беременных, страдающих гемолитической анемией или злоупотреблявших алкоголем до беременности, у недоношенных детей, особенно при вскармливании их козьим молоком, у лиц, перенесших резекцию тонкой кишки, при тропической спру и целиакии, у страдающих алкоголизмом, а также при длительном приеме противосудорожных препаратов типа фенобарбитала, дифенина. Клиническая картина, картина крови и костного мозга аналогичны таковым при дефиците витамина В_12, но обычно не бывает глоссита и фуникулярного миелоза.

Диагностика

Диагноз фолиеводефицитной анемии можно достоверно установить по снижению уровня фолиевой кислоты в эритроцитах и сыворотке крови. В практической работе это трудноосуществимо.

Лечение

Обнаружение мегалобластного характера анемии при описанных выше состояниях является достаточным основанием для назначения фолиевой кислоты в дозе 5–15 мг/сут внутрь (такая доза обеспечивает лечебный эффект даже после резекции тонкой кишки, при энтеритах и т. п.). Ретикулоцитарный подъем через 1,5–2 недели лечения свидетельствует о правильности диагностики.

Профилактика фолиеводефицитной анемии заключается в назначении фолиевой кислоты лицам, перенесшим ее дефицит однажды и страдающим одним из состояний, описанных выше. Фолиевую кислоту следует назначать беременным, болеющим гемолитической анемией.

Кроме описанных, встречаются рецессивно наследуемые формы мегалобластных анемий, когда анемия наряду с другими признаками встречается у детей и не поддается лечению витамином В_12 и фолиевой кислотой. Эти больные должны обследоваться в специализированных учреждениях.

Наследственные гемолитические анемии, обусловленные дефектами в эритроцитарной мембране

Гемолитические анемии связаны с усиленным разрушением эритроцитов.

Все гемолитические состояния характеризуются увеличением в крови содержания продуктов распада эритроцитов (билирубина или свободного гемоглобина) или появлением гемосидерина в моче. Важный признак – значительное нарастание в крови процента «новорожденных» эритроцитов (ретикулоцитов) за счет повышения продукции клеток красной крови. Костный мозг при гемолитических анемиях характеризуется значительным увеличением числа клеток красного ряда.

Наследственный микросфероцитоз (семейная гемолитическая анемия Минковского – Шоффара)

Этиология, патогенез

Наследственный микросфероцитоз представляет собой группу заболеваний, связанную с врожденными дефектами белков мембраны эритроцитов. Различают:

– тип I – дефект гена β-спектрина;

– тип II – дефект гена анпирина;

– тип III – дефект гена α-спектрина.

Болезнь наследуется по доминантному типу. В основе гемолиза лежит дефект структуры мембраны эритроцитов, что вызывает ее повышенную проницаемость и способствует проникновению внутрь эритроцитов избытка натрия и накоплению воды. Эритроциты приобретают сферическую форму, повреждаясь при прохождении через узкие пространства синусов селезенки. Поврежденные клетки захватываются макрофагами (внутриклеточный гемолиз); превращение в них гемоглобина в билирубин ведет к непрямой гипербилирубинемии, желтухе.

Клиническая картина

Внутриклеточный распад эритроцитов определяет клинические проявления болезни – желтуху, увеличение селезенки, анемию, склонность к образованию камней в желчном пузыре, характерные морфологические изменения эритроцитов, ретикулоцитоз. Первые клинические проявления болезни могут быть в любом возрасте, хотя в действительности она начинается с рождения. Весьма редкий и неспецифический признак болезни – образование трофических язв на голенях. Длительно, с раннего детства, существующий гемолиз сопровождается гиперплазией костного мозга, что, в свою очередь, ведет к нарушению костеобразования. Отмечаются деформация челюстей с неправильным расположением зубов, высокое небо, выступающий лоб, легкая микрофтальмия и т. п. Селезенка пальпируется всегда.

Диагностика

Желтуха, увеличенная селезенка, сфероцитоз эритроцитов, их пониженная осмотическая стойкость, высокий ретикулоцитоз, деформация лицевого черепа и увеличение селезенки делают диагноз наследственного сфероцитоза несомненным. Как правило, аналогичные симптомы удается обнаружить у одного из родителей больного, хотя их выраженность может быть иной. В редких случаях родители совершенно здоровы. Трудности диагностики часто обусловлены желчнокаменной болезнью, обычно сопровождающей наследственный микросфероцитоз (из-за образования в протоках и желчном пузыре билирубиновых камней). Свойственная гемолизу непрямая билирубинемия при холелитиазе сменяется прямой – возникает механическая желтуха. Болезненность в области желчного пузыря, некоторое увеличение печени – обычные признаки при наследственном микросфероцитозе. Нередко в течение многих лет больных ошибочно рассматривают как лиц, страдающих заболеванием желчевыводящих путей или печени. Одним из источников ошибок является отсутствие сведений о ретикулоцитах.

Картина крови: микросфероцитоз эритроцитов, высокий ретикулоцитоз, обычно исчисляемый десятками процентов, нормохромная анемия разной выраженности, иногда число эритроцитов и гемоглобин нормальные. В период гемолитического криза возможен нейтрофильный лейкоцитоз. Очень редко возникают так называемые арегенераторные кризы, когда повышенный гемолиз в течение нескольких дней не сопровождается эритропоэзом; ретикулоциты исчезают из крови, быстро нарастает анемия, уровень билирубина падает. Сфероцитозу эритроцитов соответствует их пониженная осмотическая стойкость. Средний диаметр эритроцитов уменьшается, соответственно увеличивается их толщина, в связи с чем в большинстве клеток не видно центрального просветления, так как эритроцит из двояковогнутого превращается в шаровидный.

Сфероцитоз эритроцитов и другие признаки гемолиза (желтуха, увеличение селезенки, ретикулоцитоз) встречаются и при аутоиммунных гемолитических анемиях. Однако в отличие от наследственного микросфероцитоза при них не бывает изменений лицевого черепа, признаков наследственного микросфероцитоза у кого-либо из родителей; при первых клинических проявлениях аутоиммунного гемолиза еще не отмечается существенного увеличения селезенки, болезненности в области желчного пузыря, но анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов выражены больше, чем при микросфероцитозе. В сомнительных случаях необходимо ставить пробу Кумбса, которая бывает положительной (прямая проба) в большинстве случаев аутоиммунной гемолитической анемии и отрицательной при наследственном микросфероцитозе. Характерные для наследственного микросфероцитоза изменения выявляются в кислотной эритрограмме: обнаруживается резкое увеличение устойчивости эритроцитов к действию хлористоводородной кислоты с типичной кривой их лизиса во времени, уменьшение их стойкости после отмывания.

Лечение

Радикальный метод – спленэктомия, показанная при выраженном гемолизе, анемии, желчнокаменной болезни, трофических язвах голени. У детей спленэктомию желательно проводить в возрасте после 7–8 лет, однако выраженная анемия, тяжелые гемолитические кризы являются прямым показанием к операции в любом возрасте. После операции наступает практическое выздоровление у всех больных, хотя остаются сфероцитоз эритроцитов и весьма небольшие признаки повышенного гемолиза. При калькулезном холецистите одновременно со спленэктомией может быть произведена холецистэктомия. При арегенераторных кризах переливают эритроцитную массу, иногда назначают преднизолон в дозе 40–60 мг в день.

Наследственный овалоцитоз (эллиптоцитоз)

Доминантно наследуемая аномалия эритроцитов, иногда осложняющаяся повышенным гемолизом. У большинства носителей аномалии признаков повышенного гемолиза нет.

Клиническая картина болезни при гемолизе соответствует наследственному микросфероцитозу.

Диагноз устанавливают на основании овалоцитоза большинства эритроцитов и признаков внутриклеточного гемолиза (желтуха, ретикулоцитоз, увеличение селезенки).

Лечение

При выраженном гемолизе – спленэктомия.

Наследственный стоматоцитоз

Доминантно наследуемая аномалия формы эритроцитов, иногда осложняющаяся внутриклеточным гемолизом. Сама по себе аномалия протекает бессимптомно.

Патогенез гемолитического синдрома, по-видимому, аналогичен таковому при наследственном сфероцитозе.

Клиническая картина гемолитического синдрома характеризуется желтухой, ретикулоцитозом, увеличением селезенки. Специфическая особенность эритроцитов при этом заболевании – две своеобразные соединяющиеся по краям клетки линии в области центрального просветления эритроцита. Они придают ему форму рта, отсюда и название аномалии.

Лечение

При выраженном гемолитическом синдроме – спленэктомия.

Гемолитические анемии, обусловленные дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ)

Болезнь широко распространена в ряде стран Азии и Африки. Встречается в Азербайджане, реже – в других государствах Закавказья, спорадически – повсеместно.

Этиология и патогенез

Ген, регулирующий синтез Г-6-ФДГ, располагается в Х-хромосоме. Нарушения в структуре этого гена, ведущие к дефициту фермента, встречаются преимущественно у мужчин. Генетические нарушения в данном структурном гене варьируют довольно широко: активность фермента в одних случаях лишь слегка ниже нормальной, в других – почти отсутствует. Весьма разнообразны патологические процессы, связанные с дефицитом Г-6-ФДГ. Клинически они проявляются гемолитическими кризами в ответ на прием некоторых лекарств, употребление в пищу конских бобов, но возможен и хронический гемолитический процесс, обостряющийся под влиянием тех же провоцирующих воздействий.

Патогенез повышенного гемолиза при дефиците Г-6-ФДГ не совсем ясен. Нарушение восстановительных процессов в эритроците ведет к окислению гемоглобина, выпадению в осадок цепей глобина, повышенному разрушению таких эритроцитов в селезенке.

Клиническая картина

Гемолитический криз при дефиците Г-6-ФДГ характеризуется появлением темной мочи (гемосидерин и свободный гемоглобин в моче), небольшой желтухой на 2–3-й день приема медикамента, спровоцировавшего гемолиз. Дальнейший прием этого лекарства ведет к тяжелому внутрисосудистому гемолизу с повышением температуры тела, болью в костях рук и ног, в тяжелых случаях – падением артериального давления, анемической комой. В крови наблюдаются нейтрофильный лейкоцитоз (иногда очень высокий) со сдвигом до миелоцитов, выраженная анемия, высокий ретикулоцитоз. Моча темно-бурого цвета.

Диагностика

Уровень билирубина умеренно повышен за счет непрямого. Провокаторами гемолиза являются хинин, акрихин, примахин, сульфаниламиды (в том числе и противодиабетические средства), нитрофураны, нитроксолин, налидиксовая кислота (невиграмон), изониазид (тубазид), фтивазид, ПАСК, антипирин, фенацетин, амидопирин, ацетилсалициловая кислота, викасол. Этими препаратами, вероятно, не исчерпывается список провокаторов гемолитического криза при дефиците Г-6-ФДГ. Поскольку тяжесть поражения связана с дозой препарата, его немедленная отмена ведет к стиханию гемолиза. Иногда отмечается временное прекращение гемолиза, несмотря на продолжающийся прием провоцировавшего медикамента (возможно, в связи с выходом в кровь большого числа повышенно стойких молодых форм эритроцитов). Тяжелый гемолитический криз может вызвать острый некронефроз с развитием тяжелой почечной недостаточности.

Особой формой болезни является тяжелый гемолитический криз у новорожденных, клиническая картина которого соответствует резус-конфликту.

Фавизм – развитие острого гемолитического синдрома у некоторых лиц с дефицитом Г-6-ФДГ в ответ на употребление с пищей конских бобов или попадание в легкие пыльцы этого растения. Картина гемолитического криза соответствует описанной при приеме лекарств, но развивается раньше – уже через несколько часов после употребления этих бобов появляется тяжелый гемолиз с развитием почечной недостаточности. Гемолиз, спровоцированный цветочной пыльцой этих бобов, возникает через несколько минут после контакта с ней, протекает легко.

Наряду с гемолитическими кризами при дефиците Г-6-ФДГ возможен постоянный гемолиз с небольшой желтухой, умеренной анемией, повышением в крови процента ретикулоцитов, увеличением размеров селезенки. Воздействие описанных провоцирующих факторов, в том числе инфекции, усиливает гемолиз. Диагноз с достоверностью может быть поставлен лишь при использовании методов, определяющих активность Г-6-ФДГ в эритроцитах. В дифференцировке с иммунным гемолизом определенную помощь оказывает реакция Кумбса, особенно при гемолитической болезни новорожденного, когда нет несовместимости по резус-антигену. Поскольку дефицит Г-6-ФДГ распространен в Закавказье, особенно в Азербайджане, гемолитический криз у этнических представителей этого региона всегда требует исключения данного заболевания. Хронические формы повышенного гемолиза необходимо дифференцировать прежде всего от талассемии, гемоглобинопатий.

Лечение

Следует отменить медикамент, вызвавший гемолитический криз. Назначают рибофлавин по 0,015 г 2–3 раза в день внутрь, эревит по 2 мл 2 раза в день внутримышечно. При тяжелом гемолитическом кризе для предупреждения почечной недостаточности внутривенно медленно вводят 5 %-ный раствор гидрокарбоната натрия (реополиглюкин противопоказан при почечной недостаточности), фуросемид (лазикс) – по 40–60 мг и более внутривенно повторно для усиления диуреза. При развитии анурии используют плазмаферез, при необходимости – гемодиализ. Тяжелый анемический синдром с начальными признаками анемической комы может быть основанием для переливания эритроцитов. В связи с тем что иногда вопрос о гемотрансфузиях приходится решать до установления природы гемолитического криза, следует пользоваться отмытыми эритроцитами (лучше размороженными).

Профилактика

Тщательный сбор анамнеза. Каждый носитель дефекта должен быть снабжен списком противопоказанных ему лекарственных препаратов и осведомлен об опасности употребления в пищу конских бобов. Профилактические прививки носителям данного дефекта следует проводить лишь по строгим эпидемическим показаниям.

Талассемии

Талассемия представляет собой группу заболеваний, связанных с нарушением синтеза нормальных полипептидных цепей гемоглобина. Снижение синтеза α-глобиновых цепей вызывает α-талассемию, β-цепей – β-талассемию.

Группа наследственных гемолитических анемий, характеризующихся выраженной гипохромией эритроцитов при нормальном или повышенном уровне железа в сыворотке крови. Часто повышено содержание билирубина в крови, отмечаются умеренный ретикулоцитоз, увеличение селезенки. В странах СНГ болезнь распространена преимущественно в Азербайджане, реже встречается в Грузии, Армении, Таджикистане, Узбекистане; спорадические случаи могут быть повсеместно. При талассемии нарушается синтез одной из четырех цепей глобина. Наследование патологии от одного (гетерозиготность) или обоих родителей (гомозиготность), тип нарушенной цепи определяют выраженность клинических проявлений.

Этиология и патогенез повышенной гибели эритроцитов связаны с нарушенной структурой клетки из-за неправильного соотношения цепей глобина в ней. Кроме укорочения жизни эритроцитов, при талассемии происходит гибель эритрокариоцитов костного мозга – так называемый неэффективный эритропоэз.

Клиническая картина гомозиготной талассемии характеризуется тяжелой гипохромной анемией, резко выраженным анизоцитозом эритроцитов, наличием мишеневидных форм (вместо нормального просветления в центре определяется пятно гемоглобина, напоминающее мишень). Раннее начало гемопоэза, сопровождающегося резкой гиперплазией костного мозга, ведет к грубым нарушениям лицевого черепа (квадратный, башенный череп, седловидный нос, нарушения прикуса, расположения зубов и т. п.).

Рано начавшаяся анемия обусловливает физическое и умственное недоразвитие ребенка. Отмечается небольшая желтушность (за счет непрямого билирубина). Селезенка увеличена. Рентгенологически определяются утолщение и своеобразное строение губчатого слоя костей свода черепа: «волосатая» структура. Больные подвержены инфекционным заболеваниям.

При тяжелой анемии дети умирают на первом году жизни. Встречаются и менее тяжелые формы гомозиготной талассемии, когда больные доживают до зрелого возраста.

Гетерозиготная талассемия может протекать с умеренной гипохромной анемией, небольшим ретикулоцитозом, легкой желтушностью, незначительным увеличением селезенки. Однако признаки повышенного гемолиза при гетерозиготном носительстве могут отсутствовать.

Морфология эритроцитов аналогична описанной, хотя выраженность изменений при этом меньшая.

Диагностика

Талассемия может быть заподозрена при обнаружении гипохромной анемии с резко выраженным анизоцитозом эритроцитов, их мишеневидностью (признак не абсолютно специфический), увеличением селезенки, нормальным уровнем сывороточного железа. Если при железодефицитной анемии прием препаратов железа сопровождается подъемом уровня ретикулоцитов в крови к середине или концу второй недели лечения, то при талассемии прием железа не меняет уровня ретикулоцитов. Форма талассемии может быть определена лишь при специальном исследовании цепей глобина.

Картина крови при талассемиях характеризуется описанной выше морфологией эритроцитов, низким цветовым показателем. Число эритроцитов нормальное или слегка увеличенное, лейкограмма, число тромбоцитов не меняются. Диагностический признак – нормальные или повышенные цифры сывороточного железа.

Лечение тяжелых гомозиготных форм сводится к коррекции анемии с помощью переливаний эритроцитов в таком количестве, которое позволяет удерживать гемоглобин на уровне 85 г/л (так называемая супертрансфузия), выводя при этом избытки железа десфералом. Одним из рано применяемых методов терапии может быть трансплантация костного мозга. При тяжелом гемолизе и значительном увеличении селезенки показана спленэктомия, однако к ней редко приходится прибегать при талассемии.

Профилактика

Поскольку тяжелая гомозиготная форма болезни чаще встречается в браках кровных родственников, необходимо предупреждать такие браки.

Серповидно-клеточная анемия

Этиология и патогенез

В большой группе заболеваний, обусловленных нарушениями аминокислотного состава глобина, – гемоглобинопатий, – наиболее распространенной является серповидно-клеточная анемия. Болезнь встречается в двух формах: гомозиготной (тяжелой) и гетерозиготной; последняя осложняется анемическим кризом лишь в особых условиях кислородного голодания. Сама по себе аномалия структуры глобина (замена в β-цепи глобина глутаминовой кислоты на валин) наследуется доминантно, однако клинически яркие проявления болезни возникают лишь у гомозигот, т. е. наследуются рецессивно. Серповидно-клеточная анемия распространена в Центральной Африке, спорадические случаи встречаются среди выходцев из Африки повсеместно; в СНГ очаги распространения серповидно-клеточной анемии отмечены в Закавказье.

Клиническая картина гомозиготной формы складывается из ранней тяжелой гемолитической анемии, имеющей нормохромный или гиперхромный характер. Физическая и некоторая умственная отсталость, связанная с рано развившимся и глубоким анемическим синдромом, сопровождается нарушениями скелета; дети худые с удлиненными конечностями, череп своеобразно деформированный, высокий, суженный, имеет часто утолщенный шов лобных частей в виде гребня. Характерны тромботические осложнения. Тромбозы сосудов, питающих кости, сопровождаются сильной болью в длинных трубчатых костях и суставах, их припухлостью. Наблюдаются асептические некрозы головок бедренной и плечевой костей. Нередко возникают тромбозы мезентериальных сосудов, инфаркты легких. Гемолитический криз обычно протекает с высокой температурой, выраженным нейтрофильным лейкоцитозом с омоложением формулы, тромбоцитозом. Массивный внутрисосудистый гемолиз при кризе сопровождается выделением темной мочи, в которой определяется гемосидерин. Нередко встречаются язвы голеней. В начале болезни часто увеличена селезенка, в дальнейшем из-за повторных инфарктов она сморщивается и перестает пальпироваться. Печень также несколько увеличена.

Диагностика

Картина крови: нормохромная анемия, выраженный анизоцитоз эритроцитов, присутствие своеобразных форм, напоминающих полудиск, небольшое число мишеневидных эритроцитов. Настоящие серповидные эритроциты выявляются лишь при специальной пробе с метабисульфитом натрия, который, действуя как восстановитель, вызывает недостаток кислорода в эритроцитах, что ведет к кристаллизации гемоглобина в них и появлению серповидных форм. Снятие покровного стекла с препарата – обеспечивается доступ кислорода – ведет к восстановлению нормальной формы эритроцитов.

Клинические проявления гетерозиготной формы наблюдаются лишь при гемолитических кризах, спровоцированных аноксическими состояниями (полет в самолете без герметизации кабины, тяжелая пневмония, наркоз и т. п.). Криз сопровождается множественными тромботическими осложнениями. В крови наблюдаются анемия, нейтрофильный лейкоцитоз, тромбоцитоз. Эритроциты претерпевают те же изменения, что и при гомозиготной форме, та же проба выявляет серповидность. Электрофорез гемоглобина при гомозиготной форме обнаруживает присутствие лишь S-гемоглобина, а при гетерозиготной – как S-, так и А-фракцию гемоглобина.

Лечение

В период гемолитического криза – госпитализация больного и согревание, так как при низкой температуре признаки серповидности выражены больше. Внутрь назначают ацетилсалициловую кислоту (в качестве дезагреганта и фактора, меняющего сродство гемоглобина к кислороду) в дозе 0,5 г 3 раза в день. При тяжелой анемии переливают эритроцитную массу.

Кроме серповидно-клеточной гемоглобинопатии, встречаются и другие аномалии гемоглобина, обычно дающие гемолитический синдром лишь в гомозиготном состоянии: отмечаются небольшая желтуха, увеличение селезенки, анизоцитоз и иногда мишеневидность эритроцитов, ретикулоцитоз. Электрофорез гемоглобина позволяет уточнить характер гемоглобинопатий. Может встречаться гетерозиготность двух патологических гемоглобинов или их сочетание с талассемией.

Гемолитические анемии при нестабильных гемоглобинах

Этиология и патогенез

Особую группу гемолитических анемий представляет носительство нестабильных гемоглобинов; их неустойчивость к воздействию окислителей, нагреванию возникает в результате замен аминокислот в α- или β-цепи глобина. Болезни наследуются по доминантному типу, встречаются редко, гомозиготные формы отсутствуют.

Клиническая картина характеризуется гемолитическим синдромом (присутствуют желтуха, ретикулоцитоз, анемия, увеличение селезенки). У одних больных гемолиз протекает почти бессимптомно, у других выражен. Анемия обычно нормохромная, отмечаются анизоцитоз, иногда тельца Гейнца, небольшая мишеневидность эритроцитов; встречается их барофильная пунктация. Последние два феномена позволяют предполагать носительство нестабильного гемоглобина.

Диагностика

При воздействии на эритроциты различных окисляющих агентов, например бриллиантового крезилового синего, нестабильный гемоглобин подвергается денатурации и выпадает в осадок в виде мелких круглых включений. В ряде случаев проверяется термостабильность эритроцитов.

Лечение разработано недостаточно; при спленомегалии и выраженном гемолитическом синдроме спленэктомия в большинстве случаев несколько уменьшает интенсивность гемолиза.

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ)

Болезнь Маркиафавы – Микеле, пароксизмальная ночная гемоглобинурия с постоянной гемосидеринурией, болезнь Штрюбинга – Маркиафавы – своеобразная приобретенная гемолитическая анемия, протекающая с постоянным внутрисосудистым гемолизом, гемосидеринурией, угнетением грануло- и тромбоцитопоэза.

Этиология и патогенез болезни связаны с внутрисосудистым разрушением эритроцитов, дефектных в значительной своей части. Наряду с патологической популяцией эритроцитов сохраняется и часть нормальных клеток, имеющих нормальный срок жизни. Обнаружены нарушения в структуре гранулоцитов и тромбоцитов. Болезнь не является наследственной, но какие-либо внешние факторы, провоцирующие образования дефектной популяции клеток, которая является клоном, т. е. потомством одной первоначально измененной клетки, неизвестны. Тромботические осложнения при ПНГ связаны с внутрисосудистым гемолизом, провоцирующим тромбообразование. Происхождение важного, но далеко не обязательного признака болезни – пароксизмов гемоглобинурии ночью или утром – остается неясным. Пароксизм связан не со временем суток, а со сном, который днем также может вызвать криз. Отмечается повышенная комплементчувствительность патологических эритроцитов при ПНГ. Возможно, именно это является основой для провокации гемолитического криза переливанием свежей крови, в которой содержатся факторы, активирующие комплемент. Переливание крови, хранившейся более недели, гемолиза не провоцирует.

Клиническая картина

Заболевание развивается медленно: появляются признаки умеренной анемии, слабость, утомляемость, сердцебиение при нагрузке, боль в животе, нередко связанная с тромбозом мезентериальных сосудов. Кожа и слизистые оболочки бледно-желтушные, сероватые в связи с анемией и отложением гемосидерина. Характерны признаки внутрисосудистого гемолиза. Появление черной мочи – непостоянный признак. Поскольку ПНГ часто сопровождается лейкопенией (преимущественно за счет гранулоцитопении), возможны хронические инфекционные осложнения. Тромбоцитопения может осложниться геморрагическим синдромом. Длительное выделение с мочой гемоглобина и гемосидерина постепенно ведет к развитию железодефицитного состояния – возникает астенический синдром, появляются сухость кожи, ломкость ногтей.

Картина крови характеризуется вначале нормохромной, а затем гипохромной анемией, небольшим ретикулоцитозом (2–4 % и более), лейкопенией и тромбоцитопенией. Морфология эритроцитов не имеет характерных признаков. В костном мозге наблюдается гиперплазия красного ростка, но в трепанате отмечается незначительное увеличение клеточности костного мозга, который по мере развития болезни может стать гипопластичным. В связи с постоянно текущим внутрисосудистым гемолизом в плазме повышено содержание свободного гемоглобина (в норме – менее 0,05 г/л). Уровень сывороточного железа вначале нормален, затем может быть значительно снижен. Наряду с типичным началом болезни, когда преобладает гемолитический синдром, возможно развитие картины апластического синдрома, который через несколько лет может осложниться гемолитическим кризом с типичной ночной гемоглобинурией. Чаще гемолитический криз провоцирует переливание крови.

Диагноз устанавливают на основании признаков внутрисосудистого гемолиза (анемия, небольшой ретикулоцитоз, гемосидерин в моче). Уточняют диагноз специальными исследованиями (положительная сахарозная проба, проба Хема, отрицательная проба Кумбса). Похожая по внешним проявлениям на ПНГ гемолизиновая форма аутоиммунной гемолитической анемии, протекающая с внутрисосудистым гемолизом, характеризуется наличием гемолизинов в сыворотке крови, положительной пробой Кумбса. В отличие от ПНГ при ней нет лейкопении и тромбоцитопении, обычно хороший эффект дает преднизолон. Отличить от апластической анемии ПНГ позволяет картина костного мозга: при аплазии трепанат характеризуется преобладанием жира, при гемолизе – клеточной гиперплазией, однако в редких случаях ПНГ может развиться картина гипоплазии костного мозга, хотя в моче постоянно обнаруживают гемосидерин, а в крови – ретикулоцитоз.

Лечение при отсутствии выраженной анемии не проводится. Тяжелый анемический синдром требует переливания эритроцитов; наилучшие результаты дает переливание отмытых или выдержанных в течение 7–10 дней эритроцитов. При гипоплазии кроветворения показаны анаболитические стероиды: неробол – по 10–20 мг в день или ретаболил – по 50 мг внутримышечно в течение 2–3 недель. Применяют препараты железа, но они могут иногда провоцировать гемолитический криз. Для предупреждения криза железо назначают в малых дозах на фоне лечения анаболическими стероидами. При тромбозах показан гепарин: при первой инъекции внутривенно вводят 10 тыс. ЕД, затем по 5–10 тыс. ЕД 2–3 раза в день под кожу живота (тонкой иглой на глубину 2 см в жировую клетчатку) под контролем свертывания крови. Противопоказания к лечению гепарином – недавнее обострение язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки, а также наличие источников кровотечения.

Аутоиммунные гемолитические анемии

Иммунные гемолитические анемии развиваются под воздействием антител на эритроциты.

Это приобретенные заболевания, обусловленные появлением антител или иммунных лимфоцитов, вызывающих гибель эритроцитов или эритрокариоцитов.

Основные формы иммунных гемолитических анемий:

1) аутоиммунные, обусловленные появлением в организме антител против собственных эритроцитов;

2) гаптеновые, вызванные фиксацией на эритроцитах чуждых для организма антигенов – гаптенов (лекарства, вирусы и т. п.) с антителами, образованными в ответ на соединение гаптена с белком организма;

3) изоиммунные, связанные с попаданием в организм новорожденного антител матери, направленных против эритроцитов ребенка (при несовместимости ребенка и матери по Rh-антигену и гораздо реже по антигенам системы АВО).

Патогенез

В основе патологического процесса лежит срыв иммунолитической нечувствительности к собственному антигену.

Клиническая картина болезни складывается из признаков анемического синдрома; тяжесть состояния больных определяется выраженностью и остротой развития анемии. При хроническом, медленно развивающемся процессе первым признаком болезни может быть небольшая желтуха (за счет непрямого билирубина); одновременно выявляется и анемия. В других случаях начало болезни характеризуется бурным гемолизом с быстро нарастающей анемией и желтухой. Нередко повышается температура тела.

Часто увеличивается селезенка. Возможно увеличение печени за счет холелитиаза, жировой дистрофии. Обычно выслушивается функциональный систолический шум на верхушке и на основании сердца, нередко определяется раздвоение II тона.

Диагностика

Картина крови характеризуется нормохромной анемией (при остром гемолизе уровень гемоглобина может падать до катастрофических цифр, больной может впадать в анемическую кому). Морфология эритроцитов существенно не меняется, но иногда отмечается их микросфероцитоз, что требует дифференцировки от наследственного микросфероцитоза. При остром гемолизе в крови могут определяться единичные эритрокариоциты. Уровень ретикулоцитов высок. Белая кровь существенно не меняется, но гемолитический криз может сопровождаться непродолжительным нейтрофильным лейкоцитозом (назначение стероидных гормонов при гемолизе может сопровождаться очень высоким нейтрофильным лейкозом со сдвигом до промиелоцитов). Число тромбоцитов обычно нормальное. Однако встречается аутоиммунный цитолиз, касающийся двух ростков – тромбоцитарного и эритроцитарного (синдром Ивенса – Фишера). В этом случае клинически определяются признаки гемолитической анемии и тромбоцитопенической пурпуры.

Костный мозг при аутоиммунной гемолитической анемии характеризуется раздражением красного ростка (при сочетании гемолиза с тромбоцитопенией в костном мозге отмечается высокий мегакариоцитоз), но нередко можно встретить высокий процент ретикулярных клеток – своеобразных элементов с грубоструктурным ядром и широкой цитоплазмой, содержащей скудную азурофильную зернистость. Биохимические исследования обнаруживают, помимо гипербилирубинемии, увеличение содержания γ-глобулинов, которые в отдельных случаях могут иметь моноклоновый характер.

Прогнозировать течение гемолитического процесса невозможно, дозу назначаемых стероидных гормонов приходится нередко повышать (первая доза – обычно 60 мг в день), если нет ответа на первую. Заболевание может проявиться единственным эпизодом гемолиза либо принять хроническое течение.

Наряду с этой наиболее частой формой аутоиммунной гемолитической анемии, при которой поврежденные аутоантителами эритроциты поглощаются макрофагальными клетками селезенки (внутриклеточный гемолиз), встречается форма болезни с внутрисосудистым гемолизом. Отличительная особенность при этом – выделение темной мочи за счет гемоглобинурии и гемосидеринурии. При тяжелом гемолизе возможны тромбозы в системе мезентериальных сосудов с появлением сильной приступообразной боли в животе и вздутием его за счет пареза кишечника. Как правило, тромбируются мелкие сосуды, и гангрена кишечника не развивается, в оперативном вмешательстве потребности не возникает. Иногда может отмечаться внутрисосудистый гемолиз в ответ на охлаждение (холодовая гемоглобинурия). Эта форма гемолитической анемии связана с действием гемолизинов сыворотки крови на эритроциты больного.

Изредка (в основном у лиц пожилого возраста) встречаются формы внутриклеточного гемолиза, вызванного холодовыми агглютининами к эритроцитам. Провокатором такого гемолиза обычно является резкое охлаждение. Заболевание приобретает хроническое течение. Больные, как правило, плохо переносят холод; возможно развитие гангрены пальцев после длительного пребывания на холоде. Специфическим признаком данного процесса является аутоагглютинация эритроцитов во время взятия крови при комнатной температуре, что может помешать определению уровня эритроцитов и скорости оседания эритроцитов. Кровь может агглютинировать в мазке, в пробирке. При подогревании агглютинация исчезает. В сыворотке крови больных при определении белковых фракций находят градиент моноклональных иммуноглобулинов, относящихся к холодовым антителам.

Диагноз аутоиммунной гемолитической анемии устанавливают на основании общих признаков гемолиза (повышение уровня билирубина в крови или появление гемосидерина в моче, повышение процента ретикулоцитов в крови и обнаружение аутоантител на поверхности эритроцитов с помощью пробы Кумбса, которая бывает положительной почти в 60 % случаев аутоиммунного гемолиза).

Более высокий процент положительных находок дает агрегатгемагглютинационная проба. С диагностической целью, но лишь в исключительных случаях, может быть проведена терапия стероидными гормонами, которые уменьшают или ликвидируют повышенный гемолиз в течение нескольких дней.

Лечение

Начинают терапию обычно с назначения 60 мг преднизолона (для взрослых) в день. При тяжелом гемолитическом процессе с бурно прогрессирующей анемией дозу преднизолона быстро увеличивают до 100–200 мг в день. Неэффективность стероидной терапии, выявляемая по нарастанию анемии, процента ретикулоцитов, может потребовать проведения спленэктомии уже в самом начале болезни.

Обычно вопрос о спленэктомии приходится решать после нескольких месяцев консервативного лечения. По жизненным показаниям и при неэффективности спленэктомии назначают иммунодепрессанты (циклофосфан, азатиоприн, метотрексат и др.).

При тяжелом анемическом синдроме переливают подобранную по непрямой пробе Кумбса кровь или отмытые (лучше замороженные) эритроциты.

Апластические (гипопластические) анемии

Это группа заболеваний, характеризующихся нарастающим уменьшением содержания форменных элементов в периферической крови и костном мозге, связанных с угнетением костномозгового кроветворения, ослаблением пролиферации и задержкой созревания костномозговых элементов и развитием панцитопении.

Этиология и патогенез

Различают апластические анемии с известной причиной и идиопатическую форму. В основе первых могут лежать токсическое воздействие некоторых медикаментов (например, левомицетина), химических веществ (например, бензола), аутоагрессия и появление антител к кроветворным клеткам в результате изменения их антигенной структуры под влиянием вирусной инфекции, медикаментов-гаптенов.

Причины идиопатической апластической анемии еще не ясны. Истинная апластическая анемия возникает при повреждении красного ростка костного мозга, она характеризуется повреждением всех трех ростков костного мозга, что приводит к появлению панмиэлофтиза (угнетение продукции всех форменных элементов).

Клиническая картина сводится к нарастающей анемии, тромбоцито- и лейкоцитопении. Панцитопения сопровождается инфекционными осложнениями, повышенной кровоточивостью. У больных регистрируется нормохромная анемия, в костном мозге снижено количество всех ростков клеток крови.

Лечение зависит от причины болезни. Рекомендуется переливание крови, применяется спленэктомия, показана трансплантация костного мозга.

Анемия постгеморрагическая острая

Это анемия, возникающая вследствие острой кровопотери в течение короткого срока. Минимальная кровопотеря, представляющая опасность для здоровья взрослого человека, – 500 мл. По объему кровопотери делят на 3 степени:

– до 15 % – легкая;

– до 50 % – тяжелая;

– 3-я степень – свыше 50 %, считается запредельной, при ней формируются необратимые изменения в системе гомеостаза.

На тяжесть клинической картины могут влиять следующие факторы:

– возраст больного (дети и пожилые люди переносят кровопотерю тяжело);

– скорость кровопотери (опасными являются артериальные кровотечения);

– место излияния крови;

– состояние человека до кровотечения.

Этиология и патогенез

Причинами кровопотери могут быть травмы, хирургическое вмешательство, кровотечение при язве желудка или двенадцатиперстной кишки, из расширенных вен пищевода при нарушении гемостаза, внематочной беременности, заболеваниях легких и т. п.

Патогенез складывается из явлений острой сосудистой недостаточности, обусловленной в первую очередь острым опустошением сосудистого русла, потерей плазмы; при массивной кровопотере наступает и гипоксия из-за потери эритроцитов, когда эта потеря уже не может быть компенсирована ускорением циркуляции за счет учащения сердечных сокращений.

Клиническая картина. У больных развиваются симптомы коллапса: сердцебиение, одышка, падение артериального и венозного давления, бледность кожных покровов и слизистых оболочек. Выраженность этих изменений не находится в четкой связи только со степенью кровопотери, так как нередко коллапс появляется и в ответ на боль, травму, вызвавшую кровопотерю. Существенный признак внутреннего кровотечения – внезапная сухость во рту. Тяжесть клинической картины определяется не только количеством потерянной крови, но скоростью кровопотери. Определенное значение имеет и источник кровопотери: кровотечение в желудочно-кишечный тракт может сопровождаться повышением температуры тела, картиной интоксикации, повышением уровня мочевины в крови (при нормальном уровне креатинина); полостные кровотечения могут даже при небольшом количестве излившейся крови вызывать симптомы сдавления органов и т. п.

Лечение начинают с остановки кровотечения и проведения противошоковых мероприятий. Быстрое снижение содержания гемоглобина ниже 80 г/л (8 г%), гематокрита – ниже 25 %, белков плазмы – ниже 50 г/л (5 г%) является основанием для трансфузионной терапии. При этом потерю эритроцитов достаточно восполнить на 1/3; первоочередная задача – восстановление объема циркулирующей крови путем переливания коллоидных растворов (альбумино-плацентарного или кровяного, свежезамороженной плазмы или протеина), полиглюкина или желатиноля.

При отсутствии полиглюкина и желатиноля можно перелить 1000 мл 10 %-ного раствора глюкозы, а затем 500 мл 5%-ного раствора. Реополиглюкин и его аналоги как дезагреганты (т. е. препараты, снижающие свертывающую способность крови) не должны применяться в условиях возможного возобновления (или продолжающегося) кровотечения.

Для возмещения потери эритроцитов используют эритроцитную массу. Показаниями к переливанию эритроцитов являются очевидная массивность кровопотери (более 1 л), сохранение бледности кожи и слизистых оболочек, тахикардии и одышки, несмотря на восстановление объема циркулирующей крови с помощью плазмозаменителей. Обычно рекомендуется производить переливание полиглюкина с эритроцитарной массой в соотношении 1: 2.

Ни в коем случае нельзя стремиться к восполнению кровопотери по эритроцитам «капля за каплю»; свежезамороженную плазму вместе с плазмозаменителями приходится вливать в большем объеме, чем было потеряно, а эритроциты – в существенно меньшем. Массивные трансфузии цельной крови или эритроцитов усиливают образование микростазов, обусловленное шоком, способствуют развитию ДВС-синдрома.

Небольшие кровопотери восполняют введением солевых растворов, альбумина. Цельную кровь переливают при отсутствии эритроцитной массы, а если нет консервированной крови, переливают свежецитратную кровь (теплую, только что заготовленную) или осуществляют прямое переливание (весьма нежелательное без крайней необходимости из-за наличия микросгустков в такой крови). При операционных кровопотерях менее 1 л переливание эритроцитной массы обычно не используют.

Лейкозы

Лейкоз – опухоль, состоящая из молодых недифференцированных кроветворных клеток, с обязательным началом в красном костном мозге. Разделение лейкозов на 2 основные группы – острые и хронические – определяется строением опухолевых клеток. По указаниям Всемирной организации здравоохранения введена новая классификация, которая предусматривает в названиях острых лейкозов генетических нарушений, выявляемых при цитогенетических исследованиях. На основании особенностей лейкемических клеток острые лейкозы делятся на 2 группы:

– острые лимфобластные лейкозы, происходящие из клеток-предшественниц лимфоидной дифференцировки;

– острые нелимфобластные лейкозы, происходящие из миелоидных клеток-предшественниц.

Этиология и патогенез

Причинами возникновения острых лейкозов и хронического миелолейкоза человека могут быть нарушения состава и структуры хромосомного аппарата, наследственно обусловленные или приобретенные под влиянием некоторых мутагенных факторов. Одним из них является ионизирующая радиация. Причиной развития лейкозов является также действие химических мутагенов. Доказано учащение острых лейкозов среди лиц, подвергавшихся воздействию бензола, а также среди больных, получавших цитостатические иммунодепрессанты (имуран, циклофосфан, лейкаран, сарколизин, мустарген и др.); частота острых лейкозов среди этого контингента больных повышается в сотни раз. Известны факты возникновения острого миелобластного лейкоза, острого эритромиелоза на фоне длительной химиотерапии хронического лимфолейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, миеломной болезни, лимфогранулематоза и других опухолей. Показана предрасполагающая к лейкозам роль наследственных дефектов в миелоидной и лимфатической тканях. Описаны наблюдения доминантного и рецессивного наследования хронического лимфолейкоза, отмечена низкая заболеваемость этим лейкозом в некоторых этнических группах и повышенная – в других. Чаще в этих случаях наследуется не сам лейкоз, а повышенная изменчивость – нестабильность хромосом, предрасполагающая родоначальные миелоидные или лимфатические клетки к лейкозной трансформации.

Применение хромосомного анализа позволило установить, что при любом лейкозе происходит расселение по организму клона опухолевых лейкозных клеток – потомков одной первоначально мутировавшей клетки. Нестабильность генотипа злокачественных клеток при лейкозах обусловливает появление в первоначальном опухолевом клоне новых клонов, среди которых в процессе жизнедеятельности организма, а также под воздействием лечебных средств «отбираются» наиболее автономные клоны.

Этим феноменом объясняются проградиентность течения лейкозов, их уход из-под контроля цитостатиков.

Лейкозы острые

По морфологическим (главным образом цитохимическим) критериям выделяют следующие основные формы острых лейкозов: миелобластный, промиелоцитарный, миеломонобластный, монобластный, эритромиелоз, эритромегабластный, монобластный лейкоз новорожденных, вторичные миелобластные, острый макрофагальный.

Клиническая картина

Для всех острых лейкозов характерны нарастающая «беспричинная» слабость, недомогание, иногда одышка, головокружение, обусловленные анемией. Повышение температуры тела, интоксикация – частые симптомы нелимфобластных острых лейкозов. Увеличение лимфатических узлов, печени и селезенки в развернутой стадии встречается не при всех острых лейкозах, но может развиваться независимо от формы острого лейкоза в терминальной стадии. Нередок геморрагический синдром, обусловленный прежде всего тромбоцитопенией: кровоточивость слизистых оболочек, петехиальная сыпь на коже, особенно голеней. В легких, миокарде и других тканях и органах могут появляться лейкозные бластные инфильтраты.

Диагностика острых лейкозов строится на данных цитологического исследования крови и костного мозга, обнаруживающих высокий процент бластных клеток. На ранних этапах их в крови обычно нет, но выражена цитопения. Поэтому при цитопении, даже касающейся одного ростка, необходима пункция костного мозга, которую можно делать амбулаторно. В костном мозге отмечается высокое (десятки процентов) содержание бластов при всех острых лейкозах, за исключением острого малопроцентного лейкоза, при котором в течение многих месяцев в крови и костном мозге процент бластных клеток может быть менее 15–20, причем в костном мозге при этой форме, как правило, процент бластов меньше, чем в крови. Форму острого лейкоза устанавливают с помощью гистохимических методов.

Наиболее частые формы острого лейкоза у взрослых – миелобластный и миеломонобластный лейкозы. На их долю приходится до 73 % всех лейкозов. В начале заболевания при этих формах печень и селезенка обычно нормальных размеров, лимфатические узлы не увеличены, вместе с тем нередки глубокая гранулоцитопения, анемия, тромбоцитопения. Нередко выражена интоксикация, повышена температура тела. Бластные клетки имеют структурные ядра с нежной сетью хроматина, нередко несколько мелких нуклеол; цитоплазма бластных клеток содержит азурофильную зернистость или тельца Ауэра, которые дают положительную реакцию на пероксидазу и липиды. При миеломонобластном лейкозе в цитоплазме выявляются не только эти вещества, но и α-нафтилэстераза, характерная для элементов моноцитарного ряда; α-нафтилэстераза подавляется фторидом натрия.

Острый лимфобластный лейкоз чаще встречается у детей. Как правило, с самого начала протекает с лимфаденопатией, увеличением селезенки, оссалгиями. В крови вначале может отмечаться лишь умеренная нормохромная анемия, лейкопения, но в костном мозге – тотальный бластоз. Бластные клетки имеют округлое ядро с нежной сетью хроматина и 1–2 нуклеолами, беззернистую узкую цитоплазму. При ШИК-реакции в цитоплазме выявляются глыбки гликогена, сосредоточенные в виде ожерелья вокруг ядра.

Острый промиелоцитарный лейкоз встречается довольно редко; до последнего времени он характеризовался быстротой течения. Ему присущи выраженная интоксикация, кровоточивость и гипофибриногенемия, обусловленные ДВС-синдромом. Лимфатические узлы, печень и селезенка обычно не увеличены. В гемограмме анемия, выраженная тромбоцитопения, в костном мозге большой процент атипических бластов. Бластные клетки различной величины и формы имеют цитоплазму, густо заполненную в одних клетках крупной фиолетово-бурой зернистостью, располагающейся и на ядре, в других – мелкой обильной азурофильной зернистостью; нередки тельца Ауэра. Зернистость содержит кислые сульфатированные мукополисахариды. Ядра этих лейкозных клеток в крови нередко имеют двудольчатую форму, еще чаще их форму бывает трудно различить из-за обилия зернистости в цитоплазме. Непосредственной причиной смерти больного чаще всего бывает кровоизлияние в мозг. Эта форма лейкоза встречается в 10 % случаев острых нелимфобластных лейкозов. Клиническая картина характеризуется геморрагическим синдромом на фоне тромбоцитопении до 100 × 10^9/л. Он обусловлен ДВС, высвобождением гепариноподобных веществ из лейкозных клеток.

Острый монобластный лейкоз встречается относительно редко. Типичное начало этой формы мало отличается от миелобластной, но более выражены интоксикация и повышение температуры тела до фебрильных цифр. Частый симптом – гиперплазия слизистой оболочки десен из-за лейкемических пролифератов в них. В крови вначале может быть относительно сохранен гранулоцитарный росток, наряду с бластными обнаруживается много зрелых, в большей или меньшей степени уродливых моноцитов. Бластные клетки имеют бобовидное структурное ядро с несколькими нуклеолами и серовато-голубую цитоплазму, иногда со скудной азурофильной зернистостью. Цитохимически выявляются положительная реакция на α-нафтилэстеразу, подавляемая фторидом натрия, слабоположительная реакция на пероксидазу и липиды. В сыворотке крови и моче этих больных высок уровень лизоцима.

Острый плазмобластный лейкоз характеризуется появлением в костном мозге и крови плазмобластов и плазмоцитов с чертами клеточного атипизма; кроме того, обнаруживается немало недифференцируемых бластов. Характерные цитохимические признаки этой формы острого лейкоза неизвестны; ее особенностью является обнаружение парапротеина в сыворотке. Нередко выражены экстрамедуллярные лейкемические очаги – увеличение лимфатических узлов, печени, селезенки, лейкемиды в коже, яичках.

Острый мегакариобластный лейкоз очень редок. Для него характерно присутствие в костном мозге и крови мегакариобластов (клеток с бластным, но гиперхромным ядром, узкой цитоплазмой с нитевидными выростами), а также недифференцированных бластов. Нередко в крови и костном мозге встречаются уродливые мегакариоциты и осколки их ядер. Характерен тромбоцитоз (от 1–l0 тыс. в мкл).

Острый эритромиелоз встречается сравнительно редко. Заболевание характеризуется гиперплазией клеток красного ряда без признаков резкого гемолиза. Клинические симптомы: прогрессирование нормо- или гиперхромной анемии без ретикулоцитоза (обычно до 2 %), нерезкая иктеричность из-за распада эритрокариоцитов, нарастающие лейкопения и тромбоцитопения. В костном мозге повышено содержание клеток красного ряда с наличием многоядерных эритробластов и недифференцированных бластных клеток. В начале заболевания картина крови алейкемичная, но по мере развития болезни наступает лейкемизация, в кровь выходят эритрокариоциты и бласты. Тромбоцитопения и лейкопения регистрируются в самом начале заболевания. В отличие от других форм острого лейкоза опухолевые клетки красного ряда нередко дифференцируются до стадии оксифильного нормоцита или до эритроцита. Острый эритромиелоз часто трансформируется в острый миелобластный.

Нейролейкемия является одним из частых осложнений острого лейкоза, реже – хронического миелолейкоза. Нейролейкемия – это лейкемическое поражение (инфильтрация) нервной системы. Особенно часто это осложнение встречается при остром лимфобластном лейкозе детей, реже – при других формах острого лейкоза. Возникновение нейролейкемии обусловлено метастазированием лейкозных клеток в оболочки головного и спинного мозга или в вещество мозга (прогностически это более тяжелый тип опухолевого роста).

Клиника нейролейкемии складывается из менингеального и гипертензионного синдромов. Отмечают стойкую головную боль, повторную рвоту, вялость, раздражительность, отек дисков зрительных нервов, нистагм, косоглазие и другие признаки поражения черепных нервов и менингеальные знаки. В спинномозговой жидкости высокий бластный цитоз. Обнаружение высокого цитоза и бластных клеток в спинномозговой жидкости – более ранний признак нейролейкемии, чем описанная клиническая картина. При внутримозговых метастазах – картина опухоли мозга без цитоза.

Лечение острых лейкозов

При остром лейкозе показана срочная госпитализация. В отдельных случаях при точном диагнозе возможно цитостатическое лечение в амбулаторных условиях.

Применяют патогенетическое лечение для достижения ремиссии с помощью комбинированного введения цитостатиков с целью ликвидации всех явных и предполагаемых лейкемических очагов, при этом возможна выраженная депрессия кроветворения. Ремиссией при остром лейкозе называют состояние, при котором в крови уровень тромбоцитов выше 100–104 в 1 мкл, лейкоцитов – выше 3000 мкл, в костном мозге бластов менее 5 %, а лимфоидных клеток менее 30 %, нет внекостно-мозговых лейкемических пролифератов. При остром лимфобластном лейкозе детей обязательным критерием полноты ремиссии является нормальный состав спинномозговой жидкости.

У детей, страдающих острым лимфобластным лейкозом, наиболее эффективна комбинация винкристина, назначаемого в дозе 1,4 мг/м^2 (не более 2 мг) 1 раз в неделю внутривенно, и преднизолона внутрь ежедневно в дозе 40 мг/м^2. С помощью этой терапии ремиссия достигается примерно у 95 % детей за 4–6 недель. Уже в период достижения ремиссии начинают профилактику нейролейкемии: первую спинномозговую пункцию следует делать на следующий день после установления диагноза острого лимфобластного лейкоза и при этом вводить интралюмбально метотрексат (аметоптерин) в дозе 12,5 мг/м^2. Спинномозговые пункции с введением метотрексата в указанной дозе повторяют каждые 2 недели до получения ремиссии. Сразу по достижении ремиссии проводят специальный профилактический курс, включающий облучение головы с двухлатеральных полей с захватом I и II шейных позвонков, но с защитой глаз, рта, всей области лицевого черепа, и одновременное 5-кратное (за 3 недели облучения) интралюмбальное введение метотрексата в той же дозе (12,5 мг/м^2). При диагностировании нейролейкемии во время люмбальной пункции профилактическое облучение головы отменяют, проводят терапию нейролейкемии с помощью интралюмбального введения двух цитостатических препаратов: метотрексата в дозе 10 мг/м^2 (максимум 10 мг) и цитозара (начальную дозу 5 мг/м^2 постепенно повышают до 30 мг/м^2).

В период ремиссии острого лимфобластного лейкоза у детей проводят непрерывную цитостатическую терапию 3 цитостатиками – 6-меркаптопурином (50 мг/м^2 в день) ежедневно, циклофосфаном (200 мг/м^2 1 раз в неделю), метотрексатом (20 мг/м^2 1 раз в неделю); лечение продолжают в течение 3,5–5 лет.

При остром лимфобластном лейкозе у взрослых и детей при неблагоприятных исходных показаниях (поздно начатое и прерванное лечение до поступления на терапию по программе, возраст старше 10–12 лет, исходный уровень лейкоцитов более 20 000 в 1 мкл) на первой неделе ремиссии, получаемой по программе, включающей винкристин, преднизолон и рубомицин, назначают одну из цитостатических комбинаций: СОАР, или CHOP, или POMP. Комбинация СОАР состоит из циклофосфана и цитозара, вводимых с 1-го по 4-й день курса внутривенно по 50 мг/м^2 3 раза в день шприцем; винкристина, вводимого в дозе 1,4 мг/м^2 внутривенно в 1-й день, и преднизолона, даваемого ежедневно с 1 по 4-й день в дозе 100 мг/м^2. Комбинация CHOP состоит из циклофосфана, вводимого внутривенно в дозе 750 мг/м^2 в 1-й день курса, адриамицина – 50 мг/м^2 внутривенно в 1-й день, винкристина – 1,4 мг/м^2 (максимум 2 мг) в 1-й день внутривенно и преднизолона, даваемого ежедневно с 1-го по 5-й день курса в дозе 100 мг/м^2 в день. Комбинация POMP рассчитана на пятидневный курс, включающий 6-меркаптопурин (пуринетол) по 300–500 мг/м^2 в день внутрь с 1-го по 5-й день, винкристин – 1,4 мг/м^2 внутривенно в 1-й день, метотрекат – по 7,5 мг/м^2 внутривенно ежедневно с 1-го по 5-й день и преднизолон, назначаемый внутрь ежедневно по 200 мг/м^2 в день. Один из этих курсов проводят в начале ремиссии для ее закрепления (консолидации). Затем (после выхода из цитопении – при подъеме уровня лейкоцитов до 3000 клеток в 1 мм^3) начинают терапию поддержания ремиссии; при остром лимфобластном лейкозе ее проводят непрерывно теми же 3 препаратами (6-меркаптопурин, метотрексат и циклофосфан), что и у детей 2–10 лет, но каждые 1,5 месяца вместо этой терапии, назначаемой внутрь в таблетках или, как циклофосфамид, в порошке, проводят поочередно курс СОАР, CHOP или POMP (на все время терапии поддерживания, т. е. на 5 лет, выбирают какие-либо 2 из этих 3 курсов для данного больного). Независимо от возраста больным с острым лимфобластным лейкозом проводят профилактику нейролейкемии 2 цитостатическими препаратами: метотрексатом (10 мг/м^2, максимум 10 мг) и цитозаром (в возрастающей дозе от 5 до 30 мг – всего 5 интралюмбальных введений) или облучением головы (в дозе 24 г за 15 сеансов) и метотрексатом, вводимым интралюмбально 5 раз одновременно с облучением в дозе 12,5 мг/м^2.

При острых нелимфобластных лейкозах основными препаратами, используемыми для достижения ремиссии, являются цитозар и рубомицин (или адриамицин). Они могут быть назначены в комбинации «7 + 3»: цитозар вводят 7 дней непрерывно в суточной дозе 200 мг/м^2 или 2 раза в день каждые 12 ч по 200 мг/м^2 в течение 2 ч внутривенно; рубомицин вводят внутривенно шприцем в дозе 45 мг/м^2 (30 мг/м^2 – лицам старше 60 лет) в 1, 2 и 3-й дни курса. К цитозару и рубомицину может быть добавлен 6-меркаптопурин, назначаемый каждые 12 ч в дозе 50 мг/м^2, при этом дозу цитозара уменьшают до 100 мг/м^2, вводимых каждые 12 ч. Цитозар вводится в течение 8 дней, 6-меркаптопурин – с 3-го по 9-й день. При достижении ремиссии закрепляющий курс – консолидация – может быть таким же, как и приведший к ремиссии.

Для поддержания ремиссии используют или ту же комбинацию цитозара и рубомицина (курс «7 + 3»), назначаемую каждый месяц с интервалом в 2,5 или 3 недели, либо пятидневное введение цитозара подкожно по 100 мг/м^2 каждые 12 ч в сочетании (в 1-й день курса) с одним из таких цитостатиков, как циклофосфан (750 мг/м^2) либо рубомицин (45 мг/м^2) или винкристин (1,4 мг/м^2 в 1-й день) и преднизолон (40 мг/м^2 с 1-го по 5-й день), либо метотрексат (30 мг/м^2). Поддерживающую терапию продолжают в течение 5 лет, как и при остром лимфобластном лейкозе. Всем больным проводят профилактику нейролейкемии.

Первую люмбальную пункцию с введением метотрексата в дозе 12,5 мг/м^2 (максимум 15 мг) производят при всех формах острого лейкоза во всех возрастных группах в первые дни после установления диагноза острого лейкоза. У взрослых основной курс профилактики нейролейкемии проводят после достижения ремиссии; у детей с острым лимфобластным лейкозом еще в период индукции ремиссии каждые 2 недели повторно вводят метотрексат в дозе 12,5 мг/м^2 (максимум 15 мг). В случае реакций перед введением назначают преднизолон внутривенно в дозе 120 мг.

Лейкозы хронические

Хронический миелолейкоз представляет собой опухоль, возникающую из стволовой клетки с вовлечением в процесс элементов всех видов гемопоэза.

При хроническом миелолейкозе опухолевым процессом поражается как гранулоцитарный, так и тромбоцитарный и эритроцитарный ростки костного мозга. Родоначальница опухоли – клетка – предшественница миелопоэза. Процесс может распространяться на печень, селезенку, а в терминальной стадии пораженной может оказаться любая ткань.

В клиническом течении хронического миелолейкоза выделяют развернутую и терминальную стадии. В начале развернутой стадии у больного отсутствуют жалобы, не увеличена или незначительно увеличена селезенка, состав периферической крови изменен. Развернутая стадия может продолжаться в среднем 4 года. При правильной терапии состояние больных остается удовлетворительным, они сохраняют трудоспособность, ведут обычный образ жизни при амбулаторном наблюдении и лечении. В терминальной стадии течение хронического миелолейкоза приобретает черты злокачественности: наблюдаются высокая лихорадка, быстро прогрессирующее истощение, боль в костях, резкая слабость, быстрое увеличение селезенки, печени, иногда увеличение лимфатических узлов. Для этой стадии характерны появление и быстрое нарастание признаков подавления нормальных ростков кроветворения – анемия, тромбоцитопения, осложняющаяся геморрагическим синдромом, гранулоцитопения, осложняющаяся инфекцией, некрозами слизистых оболочек. Длительность жизни больных в этой стадии чаще не превышает 6–12 месяцев.

В развернутой стадии диагноз можно установить путем анализа «немотивированной» природы нейтрофильного лейкоцитоза со сдвигом в формуле до миелоцитов и промиелоцитов, обнаружения существенно повышенного соотношения лейкоциты / эритроциты в костном мозге и «филадельфийской» хромосомы в гранулоцитах крови и клетках костного мозга. В трепанате костного мозга уже в этот период, как правило, наблюдается почти полное вытеснение жира миелоидной тканью. Важнейшим гематологическим признаком терминальной стадии хронического миелолейкоза является бластный криз – увеличение содержания бластных клеток в костном мозге и крови (сначала миелобластов, затем недифференцируемых бластов). Кариологически в терминальной стадии более чем в 80 % случаев определяется появление клонов кроветворных клеток, содержащих ненормальное число хромосом.

Лечение хронического миелолейкоза проводят с момента установления диагноза. В развернутой стадии эффективна терапия миелосаном в дозе 2–4 мг/сутки (при уровне лейкоцитов более 100 000 в 1 мм^3 назначают до 6 мг/сутки). Лечение проводят амбулаторно. При неэффективности миелосана назначают миелобромол (при значительной спленомегалии можно провести облучение селезенки). При переходе процесса в терминальную стадию используют комбинации цитостатических препаратов, применяемых обычно для лечения острых лейкозов: винкристин и преднизолон, ВАМП, цитозар и рубомицин. В начале терминальной стадии нередко эффективен миелобромол.

Хронический лимфолейкоз представляет собой доброкачественную опухоль иммунокомпетентной системы; основу опухоли составляют морфологически зрелые, но функционально неполноценные лимфоциты. Болеют исключительно взрослые. Начало болезни нередко определить не удается: среди полного здоровья и отсутствия у больного каких-либо неприятных субъективных ощущений в крови обнаруживают небольшой, но постепенно нарастающий лимфоцитоз. На ранних этапах число лейкоцитов может быть нормальным. Характерный признак болезни – увеличение лимфатических узлов. Иногда их увеличение обнаруживают одновременно с изменениями в крови, иногда позже. Увеличение селезенки – частый симптом; реже увеличивается печень. В крови наряду с увеличением числа лимфоцитов, присутствием единичных пролимфоцитов и иногда редких лимфобластов часто можно отметить характерные для хронического лимфолейкоза так называемые тени Гумпрехта – разрушенные при приготовлении мазка ядра лимфоцитов, в которых среди глыбок хроматина можно заметить нуклеолы. В развернутой стадии болезни содержание нейтрофилов, тромбоцитов и эритроцитов многие годы может оставаться на нормальном уровне. В костном мозге при хроническом лимфолейкозе находят высокий процент лимфоцитов.

Развитие заболевания нередко сопровождается снижением общего уровня γ-глобулинов. Угнетение гуморального иммунитета проявляется частыми инфекционными осложнениями, особенно пневмониями. Другое нередкое осложнение – цитопении, чаще анемии и тромбоцитопении. Это осложнение может быть связано с появлением аутоантител против эритроцитов и тромбоцитов или эритрокариоцитов и мегакариоцитов. Но это не единственный механизм цитопении при хроническом лимфолейкозе; возможно подавляющее действие лимфоцитов (в частности, Т-лимфоцитов) на клетки – предшественники эритропоэза или тромбоцитопоэза. Терминальная стадия хронического лимфолейкоза, проявляющаяся саркомным ростом или бластным кризом, наблюдается нечасто, особенно редок бластный криз.

Развитие лимфосаркомы в ряде случаев может сопровождаться сменой лимфоцитоза в крови нейтрофилезом.

Волосато-клеточный лейкоз – особая форма хронического лимфолейкоза, при котором лимфоциты имеют гомогенное ядро, напоминающее ядро бласта, ворсинчатые выросты цитоплазмы. Цитоплазма этих клеток содержит много кислой фосфатазы, устойчивой к действию тартроновой кислоты. Клиническая картина характеризуется увеличением селезенки, незначительным увеличением периферических лимфатических узлов и выраженной цитопенией. В 75 % случаев волосато-клеточного лейкоза, протекающего с увеличением селезенки, эффективной оказывается спленэктомия. Если цитопения не связана с увеличением селезенки или есть какие-либо иные органные изменения или лимфаденопатия, терапией выбора является применение альфа-интерферона (3–9 млн ЕД внутримышечно ежедневно в течение многих месяцев с учетом положительной динамики показателей крови, изменений в пораженных тканях).

Отдельную форму представляет собой хронический лимфолейкоз с поражением кожи – форма Сезари. Процесс начинается нередко с поражения кожи, кожного зуда, появления локальных лимфатических инфильтратов под эпидермисом, которые затем могут стать тотальными. Постепенно нарастают лимфоцитоз и процент уродливых лимфоцитов в крови. Это обычно крупные клетки с изрезанными контурами ядра петлистой структуры, но клетки могут быть и небольшими с бобовидным ядром. Доказана принадлежность этих лимфоцитов к Т-клеткам. Лимфаденопатия может быть смешанной природы: одни лимфатические узлы увеличены реактивно вследствие инфекции в коже, другие – в связи с их лейкемической инфильтрацией. Селезенка может увеличиться в процессе болезни. В лечении формы Сезари нередко дает эффект длительное применение малых доз хлорбутина (2–4 мг/сутки ежедневно в течение нескольких месяцев под контролем анализов крови, прежде всего уровня тромбоцитов – 1 раз в 2–3 недели), который снимает кожный зуд, уменьшает лейкозную инфильтрацию кожи.

Лечение хронического лимфолейкоза, проявляющегося ростом лейкоцитоза, умеренной лимфаденопатией, начинают с применения хлорбутина. При значительных размерах лимфатических узлов используют циклофосфан. Стероидную терапию назначают при аутоиммунных осложнениях, геморрагическом синдроме, а также неэффективности отдельных цитостатиков (в последнем случае иногда комбинируют хлорбутин или циклофосфан с преднизолоном). Длительное применение стероидов при хроническом лимфолейкозе противопоказано. При значительной плотности периферических лимфатических узлов, вовлечении в процесс лимфатических узлов брюшной полости с успехом используют комбинации препаратов типа ВАМП или сочетания циклофосфана, винкристина или винбластина и преднизолона (СОР или CVP). Облучают селезенку, лимфатические узлы, кожу. Одним из методов лечения аутоиммунной цитопении при хроническом лимфолейкозе является спленэктомия. Особое значение имеет лечение инфекционных осложнений. В последнее время стали применять лейкоцитоферез для лечения лимфолейкоза с высоким лейкоцитозом и цитопенией. Больные хроническим лимфолейкозом многие годы сохраняют хорошее самочувствие и трудоспособность.

Хронический моноцитарный лейкоз относится к редким формам лейкозов, характеризуется высоким моноцитозом в периферической крови (20–40 %) при нормальном или несколько повышенном числе лейкоцитов. Наряду со зрелыми моноцитами в крови имеются единичные промоноциты. В костном мозге процент моноцитов повышен незначительно, но в трепанате наблюдается гиперплазия костномозговой ткани с диффузным разрастанием моноцитарных элементов. В крови и моче высокое содержание лизоцима. У 50 % больных пальпируется селезенка. Длительное благополучное течение хронического моноцитарного лейкоза может смениться терминальной стадией, имеющей те же особенности, что и терминальная стадия хронического миелолейкоза. В развернутой стадии процесс не требует специального лечения, только при глубокой анемии необходимо периодическое переливание эритроцитной массы, которое можно проводить амбулаторно.

Внекостномозговые гемобластозы – гематосаркомы и лимфомы (лимфоцитомы)

Опухоли из кроветворных клеток, на начальных этапах не поражающие костный мозг, могут быть образованы бластными клетками (гематосаркомы) и зрелыми лимфоцитами (лимфомы, или лимфоцитомы). Нередко эти внекостномозговые опухоли независимо от степени их зрелости объединяют в понятие «гематосаркомы». По существу все эти опухоли имеют аналоги среди лейкозов. Чаще всего встречаются лимфоцитарные опухоли – лимфосаркомы и лимфоцитомы. Опухоли из миелобластов, монобластов встречаются значительно реже. Иногда клетки опухоли имеют гистохимические особенности как миелобластов, так и монобластов (как при миеломонобластном остром лейкозе); встречаются и недифференцируемые (т. е. гистохимически не определяемые) гематосаркомы. Все гематосаркомы и лимфоцитомы могут трансформироваться в соответствующий лейкоз: гематосаркомы – в острый, лимфоцитомы – в хронический лимфолейкоз.

Клиническая картина лимфоцитомы очень напоминает хронический лимфолейкоз, от которого лимфоцитому отличают выраженная лимфатическая пролиферация в органах при невысоком лейкоцитозе, очаговая пролиферация в костном мозге, лимфатических узлах и селезенке (важнейший признак, поскольку при хроническом лимфолейкозе пролиферация в этих органах носит диффузный характер). При лимфоцитомах средний срок жизни больных в 2–3 раза больше, чем при хроническом лимфолейкозе. Селезенка при лимфоцитоме обычно значительно увеличена (показана спленэктомия). Лимфоцитому легкого, желудка лечат обычно хирургическим путем. Консервативная терапия – как при хроническом лимфолейкозе.

Диагностика

Диагноз устанавливают при помощи гистологического и цитологического (с гистохимической идентификацией формы) исследований биопсированной опухоли. Локализация этих опухолей может быть разнообразной: лимфатические узлы, желудок, селезенка, кожа, легкие и т. п. Поскольку нередко диагноз опухоли устанавливают лишь после гистологического исследования удаленного новообразования, которое клинически определялось как рак, следует взять за правило: любую удаленную опухоль изучать цитологически, приготовив сразу после ее удаления отпечатки и мазки.

Гистологически лимфосаркома может характеризоваться как диффузным ростом клеток (с полностью нарушенным рисунком лимфоузла), так и нодулярным ростом, при котором сохраняется видимость фолликулов. По первичной локализации выделяют лимфосаркому лимфатических узлов (тип взрослый и детский), селезенки, желудка, легких, почек, кожи, тонкого кишечника и других (при генерализации опухоли границы между этими формами стираются), а также лимфосаркому Беркитта – Симмерса. Эта форма фолликулярной лимфосаркомы характеризуется длительной доброкачественной стадией, когда опухолевый процесс локализуется лишь в центре фолликула. Морфологическая диагностика различных форм лимфосарком нередко оказывается затруднительной ввиду большой изменчивости клеток в ходе опухолевой прогрессии.

Перспективным представляется иммунологический анализ. Бластные клетки при диффузной лимфосаркоме лимфатических узлов детей иммунологически характеризуются как Т-клетки, однако по мере развития опухоли выявляется гетерогенность опухолевых клеток, являющаяся, по-видимому, отражением различных стадий иммунологического созревания Т-клеток. Бластные клетки при лимфосаркоме Беркитта (вирусной природы) в отличие от вышеописанных имеют В-клеточную природу, что наряду с особенностями локализации опухолей (при лимфосаркоме Беркитта чаще поражаются лицевые кости черепа) способствует дифференциальному диагнозу. Опухолевые клетки при нодулярных лимфосаркомах, которые по морфологическим характеристикам бывают двух типов (мелкие лимфоидные клетки с рассеченным ядром, обозначаемые как плохо дифференцируемые клетки, и крупные с везикулярным ядром клетки, сходные с гистиоцитами), имеют иммунологическое сходство, представляя собой трансформированные В-лимфоциты с иммуноглобулиновыми детерминантами IgM или IgM и IgD одновременно. Иммунологическое фенотипирование позволяет дифференцировать лимфосаркомы со зрелоклеточными опухолями (лимфоцитами) и хроническим лимфолейкозом.

Клетки из лимфоцитомы (зрелоклеточная лимфоцитарная лимфома) морфологически представляют собой зрелые лимфоциты, а по спектру иммунологических маркеров соответствуют обычным В-лимфоцитам, однако отличаются от них значительно меньшей плотностью поверхностных иммуноглобулинов (примерно в 10 раз). У небольшой части больных с лимфоцитомой отмечается плазмоцитарная дифференциация клеток с обнаружением моноклонального IgМ в сыворотке крови.

Лечение лимфосарком проводят по программе СОРР (циклофосфан, винкристин, прокарбазин и преднизолон) или по радикальной программе облучения на γ-установках. С помощью этой терапии в последние годы получены хорошие результаты: около половины больных без рецидива переживают пятилетний срок. При лимфосаркомах желудка удаление опухоли также обеспечивает пятилетнее безрецидивное течение более чем у половины больных. Начатую в стационаре терапию по программе СОРР в дальнейшем проводят амбулаторно.

Поскольку внекостномозговые гемобластозы очень часто трансформируются в лейкоз (в результате метастазирования опухолевых клеток в костный мозг), больные должны находиться под наблюдением гематологов. Лимфосаркома детей, миелобластная, монобластная саркома независимо от возраста, как правило, переходят в соответствующий острый лейкоз. Таких больных лечат по схемам, соответствующим аналогичному острому лейкозу. В частности, у детей с лимфосаркомой после достижения ремиссии проводят курс профилактики нейролейкемии с облучением головы, в дальнейшем – обычно курс реиндукции, а затем – непрерывную длительную химиотерапию для поддержания ремиссии.

Парапротеинемические гемобластозы

Парапротеинемические гемобластозы – особая группа опухолей лимфатической системы, при которых опухолевые клетки (лимфоциты или плазматические) синтезируют иммуноглобулин. Поскольку эти лейкозы, как и другие, возникают из одной первоначально измененной клетки, вся масса опухолевых клеток производит какой-то один иммуноглобулин, который, даже оставаясь нормальным, оказывается для организма в целом бесполезным или вредным из-за своей крайней избыточности. Как правило, синтез остальных иммуноглобулинов снижен; постепенно нарастает иммунологическая несостоятельность организма. PIg (патологические иммуноглобулины) могут соответствовать разным вариантам нормальных иммуноглобулинов (при плазмоклеточных опухолях – IgG, IgA, IgD, IgE, при лимфобластомах – IgM), отличаясь от них строгой однотипностью тяжелых и легких цепей, либо представляют структурно аномальные молекулы (субъединицы IgM, изолированные фрагменты тяжелых цепей, свободные легкие цепи). Выявление парапротеина в крови и моче наряду с клиническими и цитологическими данными является решающим моментом в диагностике парапротеинемических гемобластозов.

К парапротеинемическим гемобластозам относятся миеломная болезнь, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей. Эти лейкозы своим клеточным субстратом имеют преимущественно зрелые элементы – плазмоциты, лимфоциты, поэтому должны относиться к группе хронических лейкозов.

Кроме того, способностью к синтезу однотипного, моноклонового (т. е. производимого клетками, происходящими из одной первоначально измененной клетки) иммуноглобулина обладают следующие опухоли кроветворной системы: острый плазмобластный лейкоз, редкие формы лимфосарком и редкие формы зрелоклеточных лимфатических внекостномозговых опухолей – лимфоцитом.

Миеломная болезнь (множественная миелома, плазмоцитома, болезнь Рустицкого – Калера)

Это самый частый парапротеинемический гемобластоз, иммунологический вариант заболевания обычно связан секретируемыми миеломой патологическими Ig.

Этиология и патогенез

Костный деструктивный процесс обусловлен остеолитическим влиянием на кость опухолевых лимфоцитарных предшественников миеломных клеток. Недостаточность продукции нормальных иммуноглобулинов вызвана угнетением нормального лимфоцитопоэза опухолевыми клетками. В основе почечной патологии лежит отложение в канальцах и клубочках имеющегося в избытке моноклонового иммуноглобулина или его дериватов. На этой основе развиваются склеротические процессы в почках с прогрессирующей их недостаточностью. Белковые отложения в тканях внутренних органов, суставов могут провоцировать развитие соответствующей патологии, в частности сердечной недостаточности, ревматоидоподобного синдрома и т. п. Угнетение продукции нормальных иммуноглобулинов ведет к недостаточной выработке антител, склонности к инфекциям. Избыток белковой продукции может приводить к появлению синдрома повышенной вязкости (резкий астенический синдром, нарушения кровообращения по микроциркуляторному типу, тромбозы, инфаркты внутренних органов, геморрагический синдром по типу васкулита).

Клиническая картина в начале болезни не имеет типичных черт. По мере прогрессирования процесса возникают боль в позвонках, корешковый синдром, боль в ребрах, обусловленные разрушением (гнездным или диффузным) костей растущей плазмоцитомой. Иногда ведущими становятся признаки, связанные с угнетением продукции костного мозга: анемия, гранулоцитопения с ее инфекционными осложнениями, тромбоцитопенический геморрагический синдром. В других случаях ведущими симптомами довольно быстро становятся нарастающая протеинурия, почечная недостаточность.

Диагностика

Для цитологической картины костномозгового пунктата характерно присутствие так называемых миеломных клеток, отличающихся большим многообразием структурных особенностей в зависимости от степени аплазии. Наиболее специфичны для миеломной болезни атипические клетки типа плазмобластов. Это большей частью крупные клетки (20–30 мкм) с базофильной цитоплазмой (темно-синего, голубого или светло-фиолетового цвета) и ядрами, содержащими одну или несколько нуклеол; встречаются клетки с множественными ядрами. В цитоплазме имеются вакуоли, которые могут заполнять ее целиком. От этих клеток наблюдаются переходы к менее крупным, но более зрелым формам и типичным плазматическим клеткам (всего менее 15 %). Выделяют солитарные плазмоциты, множественно-опухолевые, диффузные и диффузно-узловые формы. От степени распространенности процесса зависит и функциональное поражение ростков кроветворения.

В начальной стадии болезни изменения крови могут отсутствовать, но с генерализацией процесса развивается прогрессирующая анемия нормохромного типа. Другой классический симптом миеломной болезни – резкое и стабильное увеличение скорости оседания эритроцитов, достигающее иногда 80–90 мм/ч. Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула весьма варьируют; при развернутой картине заболевания, как правило, обнаруживают выраженную лейкопению (нейтропению), иногда в крови можно выявить миеломные клетки, особенно методом лейкоконцентрации.

Диагноз устанавливают на основании обнаружения высокого содержания плазматических (иногда атипичных) клеток в костном мозге (выше 15 %), появления моноклонового иммуноглобулина в сыворотке крови (нередко и в моче) в виде узкой полосы на электрофореграмме (М-градиент), снижения уровня нормальных иммуноглобулинов. Для выявления PIg используют метод электрофореза сыворотки и концентрированной мочи в агаровом геле и ацетатцеллюлозе и метод радиальной иммунодиффузии в геле с антисыворотками к иммуноглобулинам. Электрофорез позволяет выявить М-радиент (полосу моноклонального белка в зоне миграции γ-, α_2-глобулинов и снижение γ-фракции вне этой зоны). Исследование сыворотки методом радиальной иммунодиффузии позволяет определить класс PIg, выявить и оценить степень дефицита NIg. При миеломе Бенс-Джонса (болезни легких цепей) PIg выявляются только в моче, при несекретируемой миеломе – только внутри опухолевых клеток (методом иммунофлюоресценции с моноспецифическими антисыворотками против легких и тяжелых цепей Ig). Подозрительны следующие признаки: немотивированное нарастающее на протяжении ряда лет повышение скорости оседания эритроцитов (следствие избытка γ-глобулинов в крови), упорная протеинурия (не альбуминурия, а глобулинурия, устанавливаемая методом электрофореза мочи), проявление остеодеструктивных очагов, анемия, лейкоцито- и тромбоцитопения. Само по себе установление диагноза миеломной болезни не является показанием к цитостатической терапии; ее назначает специалист.

Лечение обычно начинают в стационаре, назначая цитостатики – циклофосфан или сарколизин вместе с преднизолоном и метандростенолом (неробол) или ретаболилом. Сарколин назначают по 10 мг/сутки через день или ежедневно, по 200–300 мг на курс. В течение всего курса дают преднизолон – 10–20 мг/сутки, ретаболил – по 50 мг внутривенно 1 раз в неделю (или неробол по 10–15 мг ежедневно). После завершения курса переходят к поддерживающей терапии сарколизином по 10 мг 1 раз в 5–10 дней. При почечной недостаточности сарколизин становится крайне опасным, так как он выводится почками, а нарушение его выведения ведет к резкому повышению концентрации цитостатика в крови с развитием глубокой панцитопении. Вместо сарколизина можно использовать циклофан по 400 мг через день внутрь, внутривенно или внутримышечно (на курс – 8–10 г). В течение всего курса преднизолон и неробол (или ретаболил) дают в той же дозе, что и в курсе с сарколизином. После окончания курса проводят поддерживающую терапию (по 400 мг циклофана в день 1 раз в 5–10 дней). Существуют и другие схемы лечения миеломной болезни, требующие участия специалиста. При снижении уровня лейкоцитов до 1000 в 1 мкл необходима отмена цитостатика. Локальные очаги поражения часто требуют лучевой терапии.

Макроглобулинемия Вальденстрема

Этиология и патогенез

Представляет собой костномозговую опухоль, состоящую из лимфоцитов или лимфоцитов и плазмоцитов и характеризующуюся высокой продукцией моноклонового макроглобулина – IgM. По гематологическим и клиническим признакам, особенно в начале болезни, процесс мало отличается от хронического лимфолейкоза.

Однако повышенная продукция крупнодисперсного белка ведет к развитию синдрома повышенной вязкости. В цитологических препаратах преобладают лимфоциты с плазматизированной (вакуолизированной) цитоплазмой, обнаруживаются плазматические клетки (иногда до 10–15 %).

Клиническая картина

Характерны множественные мелкие тромбозы, тромбоцитопения, геморрагический синдром.

Диагностика

Диагноз устанавливают на основании лимфоцитоза в крови, костном мозге, изолированного увеличения фракции IgM на иммуноэлектрофореграмме. Частый, но не обязательный симптом – увеличение лимфатических узлов, селезенки. Повышенная продукция макроглобулина часто приводит к развитию синдрома повышенной вязкости: резкая слабость, вялость, загруженность (вплоть до комы), возможны перемежающаяся глухота и парезы. Синдром недостаточности антител с развитием септических осложнений определяет прогноз болезни. Концентрация PIgM в сыворотке крови колеблется от 30 до 79 г/л, в моче обнаруживается белок Бен – Джонса.

Лечение

Осуществляют цитостатическую терапию хлорбутином, циклофаном в тех же дозах, что при хроническом лимфолейкозе. При синдроме повышенной вязкости проводят плазмаферез (удаление плазмы с заменой ее раствором альбумина и плазмозаменителей или нормальной плазмой).

Лимфогранулематоз

Лимфогранулематоз – злокачественное образование лимфоидной ткани, характеризующееся гранулематозным строением с наличием гнойных клеток Березовского – Штернберга, поражением лимфатических узлов и внутренних органов.

Этиология неизвестна.

В основе болезни лежит образование гранулем с развитием волокнистых структур в лимфатических узлах и органах. Характерной особенностью гранулем является наличие клеток Березовского – Штернберга. Эти клетки имеют большие размеры (до 50–80 мкм), многодольчатое ядро (наподобие ядра мегакариоцита), в котором базохроматин представлен интенсивно окрашенными скоплениями, отделенными друг от друга более светлыми участками оксихроматина. В ядре содержатся большие темно-синие нуклеолы неправильной формы с неровными краями. Цитоплазма обильная, барофильная, имеет вакуоли. Зернистость встречается редко.

Выделены 4 гистологических варианта лимфогранулематоза:

1) лимфогистиоцитарный (лимфоидное преобладание);

2) смешанно-клеточный;

3) нодулярный склероз;

4) лимфоидное истощение.

Для лимфогистиоцитарного варианта характерно наличие монотонной пролиферации лимфоцитов и гистиоцитов в сочетании с единичными «недиагностическими» клетками Березовского – Штернберга (ядра их мелкие, нуклеолы плохо просматриваются). Смешанно-клеточный классический вариант отличается пестрым клеточным составом (лимфоциты, плазмоциты, ретикулогистиоцитарные элементы, нейтрофилы, эозинофилы, диагностические клетки Березовского – Штернберга) и участками фиброза. Нодулярный склероз характеризуется образованием тяжей коллагена в «лакунарных» клетках Березовского – Штернберга. Вариант с лимфоидным истощением определяется по признаку резкого уменьшения количества лимфоидных элементов, диффузному фиброзу, пролиферации атипичных ретикулярных клеток и клеток Березовского – Штернберга. Эти гистологические варианты по существу являются фазами развития заболевания: по мере прогрессирования заболевания происходит исчезновение лимфоцитов из очага поражения.

Клиническая картина разнообразна. В одних случаях болезнь начинается с появлений интоксикации (таких как лихорадка, слабость, потливость, увеличение лимфатических узлов, повышение скорости оседания эритроцитов). Иногда начало болезни характеризуется лишь увеличением какой-либо одной группы (или одного) лимфатических узлов. Узлы плотноватые, эластичные, чаще не спаяны между собой. Иногда в них возникают некрозы, появляются свищи (посев из них нередко стерилен).

Частый симптом интоксикации – кожный зуд. При первичной локализации опухоли в лимфатических узлах брюшной полости возможна тяжелая интоксикация с гипертермией, проливным потом, лейкопенией с палочкоядерным сдвигом и повышением скорости оседания эритроцитов. Изредка отмечается первичная локализация лимфогранулематоза в желудке, легком, селезенке. Картина крови в типичных случаях характеризуется выраженной лимфопенией, нейтрофилезом с умеренным палочкоядерным сдвигом, увеличением скорости оседания эритроцитов. При тяжелой интоксикации возможна эозинофилия. При отсутствии интоксикации кровь может долгое время не изменяться, в отдельных случаях наблюдается небольшой лимфоцитоз.

Диагностика

Диагноз устанавливают на основании гистологического исследования биопсированного лимфатического узла (или органа при экстранодальной локализации опухоли); обнаруживают нарушение структуры узла, стертость его рисунка и наличие клеток Березовского – Штернберга (обязательный диагностический признак). Клиническая или только цитологическая по пунктату диагностика лимфогранулематоза не должна иметь места. В начале процесса, особенно если пораженный лимфатический узел вовлечен в банальный воспалительный процесс (при этом он может быть болезненным, быстро увеличивается на высоте инфекции и уменьшается на фоне антибактериальной терапии – лимфаденит опухолевого лимфатического узла), гистологическая трактовка биоптата может оказаться невозможной (поэтому на высоте инфекции биопсия лимфатического узла нежелательна). В этих случаях приходится прибегать к повторной биопсии увеличенных плотных лимфатических узлов (ни в коем случае не следует биопсировать мягкие, неувеличенные лимфатические узлы в расчете на «системность» процесса: эта опухоль не первично-множественная, а метастазирует, как и другие опухоли лимфатических узлов).

Лечение проводят по определенным схемам, что при отсутствии органных поражений позволяет добиться выздоровления у большинства больных. Основные программы лечения заключаются в назначении 2–4 курсов полихимиотерапии, затем в поэтапном облучении всех основных групп лимфатических узлов (как пораженных, так и неизмененных) по обе стороны диафрагмы, облучении селезенки или ее ложа (если нет признаков распространения опухоли за пределы лимфатических узлов, селезенку обычно удаляют) и последующем назначении полихимиотерапии. Суммарно до и после облучения проводят обычно 6 курсов полихимиотерапии. Для облучения используют источники высоких энергий, позволяющие достичь поглощенной дозы на очаг без тяжелого повреждения кожи. Область первоначального поражения желательно облучать более высокой дозой. Полихимиотерапия по эффективности почти не уступает лучевому лечению.

Назначают циклофосфан, винкристин, прокарбазин (натулан) и преднизолон в течение двух недель с последующим двухнедельным перерывом. Препараты назначают в следующем порядке: циклофосфан – 600 мг/м^2 внутривенно или мустарген – 6 мг/м^2 (все дозы для взрослых) в 1-й и 8-й день цикла, винкристин – 2 мг/м^2 внутривенно в 1-й и 8-й день цикла, прокарбазин (натулан) – 100 мт/м^2 в день внутрь ежедневно с 1-го по 14-й день цикла, преднизолон – 40 мг/м^2 в день, внутрь с 1-го по 14-й день цикла с отменой его в один день полностью.

Преднизолон назначают только в 1, 4, 8 и 12-м циклах. В остальных циклах лечение проводят без преднизолона. Желательно чередовать курсы химиотерапии, при которых мустарген сменяет циклофосфан, или проводить курсы с адреабластином, блеомицином, CCNV. При наличии соответствующих условий полихимиотерапию и облучение можно проводить в основном амбулаторно. Иногда (при выраженной тошноте и рвоте) приходится госпитализировать больных для внутривенного введения цитостатиков. При полиневрите, вызванном введением винкристина (чаще у стариков или при тяжелом поражении печени), препарат заменяют винбластином.

Существуют и другие схемы полихимиотерапии. Применение монохимиотерапии для начала лечения противопоказано.

Прогноз трудовой и прогноз в целом определяются не формальной распространенностью процесса, а результатами лечения. Сейчас выздоравливают до 60–80 % больных при программном лечении.

Профилактика болезни не разработана. Профилактика рецидивов – выполнение программы лечения и соблюдение необходимого режима. Возникновению рецидивов способствуют инсоляция, беременность, роды. Беременность допустима не ранее чем через 2 года от начала ремиссии.

Лейкемоидные реакции

Лейкемоидные реакции – увеличение количества лейкоцитов до 15–80 × 10^9/л как реакция на различные инфекционные раздражители с изменениями в крови и органах кроветворения, напоминающие лейкозы и другие опухоли кроветворной системы, но всегда имеющие реактивный характер и не трансформирующиеся в ту опухоль, на которую они похожи.

Этиология и патогенез

Могут быть вызваны различными инфекциями, интоксикациями, опухолями, метастазами опухолей в костный мозг. Механизм развития неодинаков при различных типах реакций: в одних случаях – выход в кровь незрелых клеточных элементов, в других – повышенная продукция клеток крови или ограничение выхода клеток в ткани либо наличие нескольких механизмов одновременно. Лейкемоидные реакции могут касаться изменений в крови, костном мозге, лимфатических узлах, селезенке. Особую группу реакций составляют изменения белковых фракций крови, имитирующие опухоли иммунокомпетентной системы – миеломную болезнь, макроглобулинемию Вальденстрема.

Лейкемоидные реакции гранулоцитарного типа, напоминающие хронический миелолейкоз или сублейкемический миелоз, сопровождают тяжелые инфекционные интоксикации. В крови отмечается нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом ядерной формулы до миелоцитов. В отличие от хронического миелолейкоза реактивный лейкоцитоз всегда имеет в своей основе тяжелый процесс, сопровождающийся повышением температуры тела, наличием воспалительных очагов, сепсиса. Именно с массивной гибелью микробных тел и попаданием в кровь эндотоксина связаны выброс в кровь гранулоцитарного резерва костного мозга, повышенная продукция гранулоцитов. В начале хронического миелолейкоза и при сублейкемическом миелозе, с которым можно спутать воспалительную картину крови, никакой интоксикации не наблюдается, соматически больной совершенно сохранен. В сомнительных случаях динамическое наблюдение позволит устранить диагностические затруднения: станет очевидным либо воспалительный процесс, либо неуклонный рост числа лейкоцитов послужит основанием для специального исследования костного мозга. Изредка нейтрофильный лейкоцитоз без существенного омоложения формулы наблюдается при раке, однако при хроническом миелолейкозе всегда имеет место «омоложение» формулы до миелоцитов и промиелоцитов.

Эозинофильные реакции сопровождаются повышением эозинофилов в крови (более 0,4 × 10^9/л у взрослых и 0,7 × 10^9/л у детей).

Таблица 56

Заболевания и состояния, сопровождающиеся эозинофилией

Высокая эозинофилия крови требует тщательного исследования: в первую очередь исключения медикаментозной сенсибилизации, инвазии паразитов. В редких случаях высокая эозинофилия может отражать реакцию на острый Т-клеточный лейкоз в алейкемической стадии (когда бластные клетки еще не вышли в кровь), рак (табл. 56). Поэтому немотивированная высокая эозинофилия требует всестороннего онкологического обследования, в том числе и пункции костного мозга. Уровень лейкоцитоза при высокой эозинофилии может достигать многих десятков тысяч в 1 мкл.

Эозинофилия всегда сочетается с высоким процентом эозинофилов в костном мозге. Изредка наблюдается стойкая бессимптомная эозинофилия у совершенно здоровых людей – «конституционная эозинофилия» (такой диагноз может быть поставлен лишь после квалифицированного специального обследования больного на носительство паразитов, исключения иных причин, о которых говорилось выше, и многолетнего наблюдения). Высокая эозинофилия может сопровождаться пристеночным фибропластическим эндокардитом («эозинофильный коллагеноз»); и то и другое является дебютом развития гематосаркомы.

Реактивные эритроцитозы довольно часто служат предметом дифференцировки с эритремией. Причинами эритроцитозов чаще всего являются заболевания легких с понижением оксигенации крови, врожденные пороки сердца, артериовенозные аневризмы. Высокий эритроцитоз, иногда с несколько повышенным содержанием тромбоцитов, наблюдается при гипернефроме (которая может сопровождаться повышенной выработкой эритропоэтина). Левосторонняя опухоль почки может быть ошибочно принята за увеличенную селезенку – характерный признак эритремии. В таких случаях необходимы ультразвуковое и компьютерное исследования. Кроме того, при пункции пальпируемого образования в пунктате обнаруживают раковые клетки, при эритремии – лимфоциты, молодые элементы гранулоцитов, эритрокасиоциты. Важнейшими критериями в дифференцировке эритремии с симптоматическими эритроцитозами являются картина трепаната костного мозга и определение массы крови. Некоторую роль в дифференцировке этих процессов играет оценка скорости оседания эритроцитов, которая резко замедлена при эритремии и не изменена, а иногда и ускорена при эритроцитозах, однако этот признак не абсолютно надежен.

Миелемия – наличие в крови клеток костного мозга – миелоцитов, промиелоцитов, эритрокариоцитов, реже – ядер мегакариоцитов. Эта картина в какой-то мере может напоминать острый эритромиелоз, от которого ее отличает отсутствие бластных клеток, в большом количестве присутствующих при этом лейкозе в крови (на ранних стадиях их там может и не быть) и в костном мозге. Миелемия встречается при милиарных метастазах рака в кости при остром гемолитическом кризе. При раковой миелемии пунктат костного мозга содержит обычно очень мало костномозговых клеток, а при тщательном исследовании мазка можно обнаружить скопления раковых клеток (при гемолизе пунктат очень богат клеточными элементами, преобладают эритрокариоциты).

Лейкемоидные реакции лимфатического типа чаще всего являются результатом вирусной инфекции. Наиболее распространенный реактивный лимфоцитоз – малосимптомный инфекционный лимфоцитоз. По картине крови его легко можно принять за хронический лимфолейкоз, но он встречается почти исключительно у детей, а у них не бывает хронического лимфолейкоза. Инфекционный лимфоцитоз продолжается обычно несколько дней, сопровождается легкими катаральными явлениями.

Для дифференцировки процесса с хроническим лимфолейкозом нет необходимости в пункции костного мозга – нужно лишь выждать несколько дней с окончательным суждением о диагнозе. Реактивный лимфоцитоз может возникать после спленэктомии.

Лейкемоидные реакции моноцитарного типа встречаются при туберкулезе, саркоидозе, макроглобулинемии Вальденстрема, хронических воспалительных процессах.

Реактивный моноцитоз отличается от хронического моноцитарного лейкоза наличием признаков какого-либо заболевания, в то время как хронический моноцитарный лейкоз в течение первых лет болезни практически бессимптомен. В сомнительных случаях при длительно наблюдаемом моноцитозе показана трепанобиопсия костного мозга, которая при хроническом моноцитарном лейкозе выявляет выраженную клеточную гиперплазию с почти полным вытеснением жира. При реактивном моноцитозе костный мозг нормален. Для макроглобулинемии Вальденстрема характерны лимфатическая гиперплазия в костном мозге (по пунктату), моноклоновое увеличение IgM в сыворотке крови.

В редких случаях инфекционный мононуклеоз у детей принимают за острый лейкоз. Это возможно лишь при анализе плохо приготовленных мазков крови: у детей нередко мононуклеары инфекционного мононуклеоза содержат нуклеолы. Но в правильно приготовленном мазке при мононуклеозе никогда нет обязательных для острого лейкоза бластных клеток. В сомнительных случаях всякая попытка лечить подозреваемый лейкоз преднизолоном или цитостатическими препаратами недопустима! Правильный диагноз устанавливают при повторных исследованиях крови, в которой при инфекционном мононуклеозе происходит закономерная морфологическая эволюция: широкоплазменные клетки становятся узкоплазменными, хроматин ядер приобретает менее гомогенную структуру. При остром лейкозе появившийся бластоз в крови быстро нарастает. Во всех подобных случаях обязательно сохранение мазков до окончательного установления диагноза.

Широкоплазменные (как при инфекционном мононуклеозе) клетки могут встречаться при лекарственном дерматите. Отсутствие бластного строения ядра (бластная клетка имеет нежноструктурную хроматиновую сеть с равномерностью окраски и калиора нитей; в толстом мазке бластные клетки приобретают черты зрелого лимфоцита) отличает эту реакцию от острого лейкоза.

К лейкемоидным реакциям костного мозга относят некоторые формы и стадии агранулоцитоза и особенно этапы выхода из него. Картина костного мозга в этих случаях напоминает острый лейкоз. В крови отмечается почти полное отсутствие зрелых гранулоцитов. Как правило, имеет место связанная с агранулоцитозом инфекция. Бластные клетки в крови при агранулоцитозе никогда не появляются. Продолжительность выхода из агранулоцитоза, когда в костном мозге может оказаться очень много промиелоцитов, или несколько ранее – большое количество клеток-предшественников, внешне напоминающих крупные лимфоциты, но имеющих гомогенное строение ядерного хроматина, составляет 2–3 дня.

В сомнительных случаях необходимо подождать несколько дней для окончательного суждения о диагнозе: при выходе из агранулоцитоза состав крови нормализуется и необходимости в повторной пункции костного мозга не будет, при остром лейкозе в крови сохранится гранулоцитопения, и для уточнения ее характера придется повторить пункцию костного мозга.

Изменения белковых фракций крови, напоминающие миеломную болезнь или болезнь Вальденстрема, могут встречаться при хроническом гепатите, хроническом нефрите, гипернефроме, паразитарных инвазиях и некоторых других состояниях. Изменениям сывороточных белков нередко сопутствует повышенный процент плазматических клеток в костном мозге. От миеломной болезни эти реактивные изменения отличаются следующими признаками:

1) отсутствие моноклоновости гамма-глобулина (если даже и определяется М-градиент, обычно отсутствует моноклоновость белка, определяемая с помощью иммуноэлектрофореза);

2) процент плазматических клеток в костном мозге менее 10–12 (для доказательной миеломной болезни их процент должен быть существенно выше).

В редких случаях хронического гепатита, хронического нефрита, аутоиммунной гемолитической анемии, генерализованного васкулита может иметь место и истинная моноклоновость того или иного иммуноглобулина. Если речь идет о моноклоновости IgM, то можно подозревать макроглобулинемию Вальденстрема, при моноклоновости других белков – миеломную болезнь. Последняя должна быть во всех случаях подтверждена нахождением в костном мозге высокого процента плазматических клеток. Болезнь Вальденстрема подтверждается высоким процентом лимфоцитов (реже – плазматических клеток или и тех и других) в костном мозге. И при том и при другом виде лейкоза обычно снижается уровень нормальных иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Серьезные подозрения на существование парапротеинемического гемобластоза может вызывать так называемая болезнь иммунных комплексов: генерализованный васкулит, проявляющийся преимущественно либо синдромом Шенлейна – Геноха, либо картиной нефрита, либо сочетанием множественных геморрагий в легочную ткань и нефрита (синдром Гудпасчера), либо распространенным васкулитом (капилляротоксикозом), поражающим все органы и системы, включая головной мозг. В основе этого процесса лежит появление комплекса антигена и иммуноглобулина или двух иммуноглобулинов, к которым присоединяется и комплемент (его уровень в крови в связи с этим резко падает); крупные иммунные комплексы выпадают в осадок в охлажденной сыворотке (криоглобулинемия); их циркуляция в крови ведет к повреждению эндотелия и развитию органной патологии. В иммунном комплексе двух иммуноглобулинов один из иммуноглобинов является антигеном (чаще G), другой – антителом (чаще М). При этом может быть истинная моноклоновость IgM.

Виновником комплексообразования обычно бывает антитело, способное к соединению не только с собственным, но и с донорским соответствующим иммуноглобулином. Источниками моноклонового IgM могут быть болезнь Вальденстрема, лимфосаркома, зрелоклеточная лимфоцитарная опухоль – лимфоцитома, лимфолейкоз, и эта продукция может быть не связанной с лимфоцитарной опухолью, а спровоцированной аутоагрессивным процессом (в частности, аутоиммунным гемолизом), раковой опухолью, паразитарной инвазией. Кроме того, причина появления иммунных комплексов может оставаться невыясненной (идиопатическая форма). Изредка криоглобулинемия бывает непродолжительным эпизодом в течение острых инфекций, в частности гепатита, тяжелой пневмонии и т. п. Поэтому сам по себе феномен криоглобулинемии, особенно при обнаружении моноклоновости одного из иммуноглобулинов, требует специализированного обследования больного для исключения всех перечисленных заболеваний, которые могут быть ее причиной.

Лимфаденит иммунобластный – реактивное разрастание лимфатических узлов (иногда и селезенки), обусловленное увеличением числа и размеров фолликулов за счет гиперплазии их центров размножения, клетки которых представлены молодыми крупными со светлыми ядрами лимфоцитами-иммунобластами. Следует отметить, что до последнего времени эти клетки патогистологи называли ретикулярными. Сейчас неопровержимо доказано, что они никакого отношения к стромальным, ретикулярным клеткам не имеют, что это лимфоциты, которые под влиянием антигенного стимулирования увеличиваются в размерах, иногда становятся двуядерными. Иммунобластный лимфаденит развивается при лекарственных дерматитах, является патогистологическим субстратом инфекционного мононуклеоза, возникает в ответ на интоксикацию (например, туберкулез), введение вакцин, сывороток; он может быть первым симптомом системной красной волчанки и иметь место при других коллагенозах. Иммунобластный лимфаденит напоминает модулярную форму лимфосарком, лимфогранулематоз.

Решающая роль в диагностике этого состояния принадлежит патогистологу, исследующему материал биопсии. Но для исключения непоправимой ошибки (при диагнозе саркомы начинают мощную цитостатическую терапию, которая уничтожит все следы лимфаденита, и ревизовать диагноз уже будет невозможно, а эта терапия далеко не безопасна, в частности она увеличивает риск заболеть лейкозом в сотни, а иногда и в тысячи раз) патологоанатом должен получить точнейшие сведения о больном. Сомнительная картина всегда должна истолковываться против опухоли. Иногда для уточнения диагноза приходится делать повторные биопсии.

Большую помощь в диагностике оказывают отпечаток и мазок с поверхности биопсированного лимфатического узла (это необходимо делать при всех биопсиях). При лимфосаркоме преобладающее большинство клеток (минимум 30 %) составляют однообразные бластные клетки. При иммунобластном лимфадените бластных клеток обычно менее 10 %, они разнообразны по степени зрелости ядра, базофилии цитоплазмы, обнаруживается много плазматических клеток. Патогистологическое заключение по исследованию лимфатического узла должно быть очень подробным, исключающим неопределенную диагностику. Патогистолог по имеющейся картине не всегда может поставить диагноз опухоли, и это должно быть точно отражено в заключении. Например, для диагностирования начальных форм доброкачественных лимфом (лимфоцитом) иногда приходится длительно наблюдать больного и исследовать лимфатические узлы повторно. Для диагностики начальных форм миеломной болезни, подозреваемой по обнаружению моноклонального иммуноглобулина, иногда требуются многолетние наблюдения и повторные пункции костного мозга. До уточнения диагноза противоопухолевая терапия противопоказана.

Мононуклеоз инфекционный (железистая лихорадка, моноцитарная ангина, болезнь Филатова – Пфейффера) – вирусное инфекционное заболевание, характеризующееся бласттрансформацией лимфоцитов, появлением этих своеобразных клеток в периферической крови, реактивным лимфаденитом, увеличением лимфатических узлов, селезенки. Возбудитель – вирус Эпштейна – Барра. В основе заболевания – бласттрансформация лимфоцитов, обусловленная специфической вирусной инфекцией.

Клиническая картина разнообразна. В легких случаях – нарушения самочувствия в связи с ринитом. Типичные симптомы: ангина («пылающий зев»), затруднение носового дыхания в первые дни болезни за счет отека слизистой оболочки, увеличение и болезненность заднешейных лимфатических узлов (нередко лимфатических узлов и других групп), увеличение селезенки. Картина крови: лейкоцитоз до 15–20 × 10^9 /л (реже – лейкопения), умеренная (иногда резкая) нейтропения, увеличение процента лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов.

Необходимым и достаточным для диагноза признаком заболевания является присутствие в крови специфических мононуклеаров (более 10–20 %) – клеток, имеющих ядро большого лимфоцита и широкую базофильную с фиолетовым оттенком цитоплазму с выраженным перинуклеарным просветлением (однако подобную картину может дать и иерсиниоз). Продолжительность болезни – несколько недель, но в некоторых случаях нормализация картины крови затягивается на месяцы. Наблюдаются и рецидивы – с более легким течением, иногда с интервалами в несколько лет после первого острого периода.

Осложнения: разрыв селезенки, обусловленный ее быстрым увеличением, острый гепатит, агранулоцитоз, аутоиммунный гемолиз, энцефалит. Обычно больные не нуждаются в специальной медикаментозной терапии, так как в течение нескольких дней основные симптомы исчезают, картина крови нормализуется.

При затяжном течении, тяжелом состоянии больного применяют патогенетическое лечение: преднизолон в дозе 20–30 мг в день или другие глюкокортикоиды.

Прогноз, как правило, благоприятный. Контагиозность невысока, поэтому изоляция больного необязательна. Опасны разрывы селезенки. Восстановление трудоспособности определяется появлением несомненных признаков уменьшения размеров органа, а также нормализацией температуры тела, исчезновением ангины. Если инфекционный мононуклеоз проявляет себя гепатитом, необходима госпитализация больного.

Лучевая болезнь

Острая лучевая болезнь

Лучевая болезнь является комплексом проявлений поражающего действия ионизированного излучения на организм. Ее клинические проявления зависят от вида облучения (местного или общего, однократного или повторного). Лучевая болезнь представляет собой завершающий этап в цепи процессов в организме, возникших в результате ионизирующего облучения тканей, клеток и жидких сред организма.

Этиология и патогенез

Острая лучевая болезнь представляет собой самостоятельное заболевание, развивающееся в результате гибели преимущественно делящихся клеток организма под влиянием кратковременного (до нескольких суток) воздействия на значительные области тела ионизирующей радиации. Причиной острой лучевой болезни могут быть как авария, так и тотальное облучение организма с лечебной целью – при трансплантации костного мозга, при лечении множественных опухолей.

В патогенезе острой лучевой болезни определяющую роль играет гибель клеток в непосредственных очагах поражения. Сколько-нибудь существенных первичных изменений в органах и системах, не подвергавшихся непосредственному лучевому воздействию, не наблюдается. Под влиянием ионизирующей радиации гибнут прежде всего делящиеся клетки, находящиеся в митотическом цикле, однако в отличие от эффекта большинства цитостатиков (за исключением миелосана, который действует на уровне стволовых клеток) погибают и покоящиеся клетки, гибнут и лимфоциты. Лимфопения является одним из ранних и важнейших признаков острого лучевого поражения. Фибробласты организма оказываются высокоустойчивыми к воздействию радиации. После облучения они начинают бурный рост, что в очагах значительных поражений способствует развитию тяжелого склероза. К важнейшим особенностям острой лучевой болезни относится строгая зависимость ее проявлений от поглощенной дозы ионизирующей радиации.

Клиническая картина острой лучевой болезни весьма разнообразна; она зависит от дозы облучения и сроков, прошедших после облучения. В своем развитии болезнь проходит несколько этапов. В первые часы после облучения появляется первичная реакция (рвота, лихорадка, головная боль непосредственно после облучения). Через несколько дней (тем раньше, чем выше доза облучения) развивается опустошение костного мозга, в крови – агранулоцитоз, тромбоцитопения. Появляются разнообразные инфекционные процессы, стоматит, геморрагии. Между первичной реакцией и разгаром болезни при дозах облучения менее 1 Гр отмечается период внешнего благополучия – латентный период. Деление острой лучевой болезни на периоды первичной реакции, латентный, разгара и восстановления неточное: чисто внешние проявления болезни не определяют истинного положения.

При близости пострадавшего к источнику излучения уменьшение дозы облучения, поглощенной на протяжении человеческого тела, оказывается весьма значительным. Часть тела, обращенная к источнику, облучается существенно больше, чем противоположная его сторона. Неравномерность облучения может быть обусловлена и присутствием радиоактивных частиц малых энергий, которые обладают небольшой проникающей способностью и вызывают преимущественно поражение кожи, подкожной клетчатки, слизистых оболочек, но не костного мозга и внутренних органов.

Целесообразно выделять 4 стадии острой лучевой болезни: легкую, средней тяжести, тяжелую и крайне тяжелую. К легкой относятся случаи относительно равномерного облучения в дозе от 0,5–1 Гр, к средней – от 2–4 Гр, к тяжелой – от 4–6 Гр, к крайне тяжелой – свыше 10 Гр (табл. 57). При облучении в дозе менее 1 Гр говорят о лучевой травме. В основе деления облучения по степени тяжести лежит четкий терапевтический принцип. Лучевая травма без развития болезни не требует специального врачебного наблюдения в стационаре. При легкой степени больных обычно госпитализируют, но специального лечения не проводят, и лишь в редких случаях, при дозах, приближающихся к 0,25 Гр, возможно развитие непродолжительного агранулоцитоза со всеми инфекционными осложнениями и последствиями, требующими антибактериальной терапии.

При средней тяжести агранулоцитоза глубокая тромбоцитопения наблюдаются практически у всех больных; необходимы лечение в хорошо оборудованном стационаре, изоляция, проведение мощной антибактериальной терапии в период депрессии кроветворения. При тяжелой степени наряду с поражением костного мозга наблюдается картина радиационного стоматита, радиационного поражения желудочно-кишечного тракта. Таких больных следует госпитализировать только в высокоспециализированный гематологический и хирургический стационар, где есть опыт ведения подобных больных.

При неравномерном облучении совсем не просто выделять степень тяжести болезни, ориентируясь лишь на дозовые нагрузки. Однако задача упрощается, если исходить из терапевтических критериев: лучевая травма без развития болезни – нужды в специальном наблюдении нет; легкая – госпитализация в основном для наблюдения; средняя – всем пострадавшим требуется лечение в обычном многопрофильном стационаре; тяжелая – требуется помощь специализированного стационара (в плане гематологических поражений либо глубоких кожных или кишечных поражений); крайне тяжелая – в современных условиях прогноз безнадежный. Дозу редко устанавливают физическим путем, как правило, это делают с помощью биологической дозиметрии. Разработанная в нашей стране специальная система биологической дозиметрии дозволяет в настоящее время не только безошибочно устанавливать сам факт переоблучения, но и надежно (в пределах описанных степеней тяжести острой лучевой болезни) определять поглощенные в конкретных участках человеческого тела дозы радиации. Это положение справедливо для случаев непосредственного, т. е. в течение ближайших после облучения суток, поступления пострадавшего для обследования.

Однако даже по прошествии нескольких лет после облучения можно не только подтвердить этот факт, но и установить примерную дозу облучения по хромосомному анализу лимфоцитов периферической крови и лимфоцитов костного мозга.

Таблица 57

Клинические формы и степени тяжести острой лучевой болезни в зависимости от облучения

Клиническая картина первичной реакции зависит от дозы облучения; она различна при разных степенях тяжести. Повторность рвоты определяется главным образом облучением области груди и живота. Облучение нижней половины тела, даже очень обширное и тяжелое, обычно не сопровождается существенными признаками первичной реакции. В течение ближайших часов после облучения у больных отмечается нейтрофильный лейкоцитоз без заметного омоложения формулы. Он, по-видимому, обусловлен мобилизацией в основном сосудистого гранулоцитарного резерва. Высота этого лейкоцитоза, в развитии которого может играть важную роль и эмоциональный компонент, не связана четко с дозой облучения. В течение первых 3 суток у больных отмечается снижение уровня лимфоцитов в крови, обусловленное, по-видимому, интерфазной гибелью этих клеток. Этот показатель через 48–72 ч после облучения имеет дозовую зависимость.

После окончания первичной реакции наблюдается постепенное падение уровня лейкоцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов в крови. Лимфоциты остаются близкими к уровню их первоначального падения.

Лейкоцитарная кривая и в основном сходные с ней кривые тромбоцитов и ретикулоцитов характеризуют закономерные, а не случайные изменения уровня этих клеток в крови (анализ крови делают ежедневно). Вслед за первоначальным подъемом уровня лейкоцитов развивается постепенное его снижение, связанное с расходованием костномозгового гранулоцитарного резерва, состоящего преимущественно из зрелых, устойчивых к воздействию радиации клеток – палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов. Время достижения минимальных уровней и сами эти уровни в первоначальном снижении лейкоцитов имеют дозовую зависимость. Таким образом, при неустановленности дозы облучения в первые дни болезни ее можно с достаточной для лечения точностью определить по прошествии 1–1,5 недели.

При дозах облучения выше 1 Гр на костный мозг первоначальное снижение сопровождается периодом агранулоцитоза, глубокой тромбоцитопении. При меньших дозах вслед за первичным падением будет отмечен некоторый подъем лейкоцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов. В отдельных случаях лейкоциты могут достигать нормального уровня. Затем вновь наступит лейко- и тромбоцитопения. Итак, агранулоцитоз и тромбоцитопения при облучении костного мозга в дозах более 1 Гр возникнут тем раньше, чем больше доза, но не раньше конца первой недели, в течение которой расходуется костномозговой гранулоцитарный резерв и «доживают» тромбоциты. Период агранулоцитоза и тромбоцитопении по своим клиническим проявлениям идентичен таковым при других формах цитостатической болезни.

При отсутствии переливаний крови геморрагический синдром при острой лучевой болезни человека не выражен, если период глубокой тромбоцитопении не превышает 1,5–2 недель. Глубина цитопении и тяжесть инфекционных осложнений с дозой облучения строго не связаны. Выход из агранулоцитоза наступает тем раньше, чем раньше он начался, т. е. чем выше доза.

Период агранулоцитоза завершается окончательным восстановлением уровня лейкоцитов и тромбоцитов. Рецидивов глубокой цитопении при острой лучевой болезни не отмечается. Выход из агранулоцитоза бывает обычно быстрым – в течение 1–3 дней. Нередко за 1–2 дня ему предшествует подъем уровня тромбоцитов. Если в период агранулоцитоза была высокая температура тела, то иногда ее падение на 1 день опережает подъем уровня лейкоцитов. К моменту выхода из агранулоцитоза возрастает и уровень ретикулоцитов, нередко существенно превышая нормальный – репаративный – ретикулоцитоз. Вместе с тем именно в это время (через 1–1,5 месяца) уровень эритроцитов достигает своего минимального значения.

Поражение других органов и систем при острой лучевой болезни отчасти напоминает гематологический синдром, хотя сроки развития их иные. При облучении слизистой оболочки рта в дозе выше 0,5 Гр развивается так называемый оральный синдром: отек слизистой оболочки рта в первые часы после облучения, кратковременный период ослабления отека и вновь его усиление начиная с 3–4-го дня; сухость во рту, нарушение слюноотделения, появление вязкой, провоцирующей рвоту слюны; развитие язв на слизистой оболочке рта. Все эти изменения обусловлены местным лучевым поражением, они первичны. Их возникновение обычно предшествует агранулоцитозу, который может усугублять инфицированность оральных поражений. Оральный синдром протекает волнообразно с постепенным ослаблением тяжести рецидивов, затягиваясь иногда на 1,5–2 месяца. Начиная со 2-й недели после поражения при дозах облучения менее 0,5 Гр отек слизистой оболочки рта сменяется появлением плотных белесых налетов на деснах – гиперкератозом, внешне напоминающим молочницу. В отличие от нее эти налеты не снимаются; в дифференцировке помогает и микроскопический анализ отпечатка с налета, не обнаруживающий мицелия гриба. Язвенный стоматит развивается при облучении слизистой оболочки рта в дозе выше 1,5 Гр. Его продолжительность около 1–1,5 месяца. Восстановление слизистой оболочки практически всегда полное; лишь при облучении слюнных желез в дозе выше 10 Гр возможно стойкое выключение саливации.

При дозах облучения выше 1 Гр области кишечника могут развиваться признаки лучевого энтерита. При облучении до 1–2 Гр отмечаются легкое вздутие живота на 3–4-й неделе после облучения, неучащенный кашицеобразный стул, повышение температуры тела до фебрильных цифр. Время появления этих признаков определяется дозой: чем выше доза, тем раньше появится кишечный синдром. При более высоких дозах развивается картина тяжелого энтерита: понос, гипертермия, боль в животе, его вздутие, плеск и урчание, болезненность в илеоцекальной области. Кишечный синдром может характеризоваться поражением толстой кишки (в частности, прямой с появлением характерных тенезмов), лучевым гастритом, лучевым эзофагитом. Время формирования лучевого гастрита и эзофагита приходится на начало второго месяца болезни, когда костномозговое поражение обычно уже ликвидировано.

Еще позже (через 3–4 месяца) развивается лучевой гепатит. Его клиническая характеристика отличается некоторыми особенностями: желтуха возникает без продрома, билирубинемия невысокая, повышен уровень аминотрансфераз (в пределах 200–250 ЕД), выражен кожный зуд. На протяжении нескольких месяцев процесс проходит много «волн» с постепенным уменьшением тяжести. «Волны» отличаются усилением зуда, некоторым подъемом уровня билирубина и выраженной активностью ферментов сыворотки крови. Непосредственный прогноз для печеночных поражений должен считаться хорошим, хотя никаких специфических лечебных средств пока не найдено (преднизолон ухудшает течение гепатита).

В дальнейшем процесс может прогрессировать и через много лет приводит больного к гибели от цирроза печени.

Типичное проявление острой лучевой болезни – поражение кожи и ее придатков.

Выпадение волос – один из самых ярких внешних признаков болезни, хотя он меньше всего влияет на ее течение.

Волосы разных участков тела обладают неодинаковой радиочувствительностью: наиболее резистентны волосы на ногах, наиболее чувствительны – на волосистой части головы, на лице, но брови относятся к группе весьма резистентных. Окончательное (без восстановления) выпадение волос на голове происходит при однократной дозе облучения выше 1 Гр.

Кожа имеет также неодинаковую радиочувствительность разных областей. Наиболее чувствительны области подмышечных впадин, паховых складок, локтевых сгибов, шеи. Существенно более резистентны зоны спины, разгибательных поверхностей верхних и нижних конечностей.

Поражение кожи – лучевой дерматит – проходит соответствующие фазы развития: первичная эритема, отек, вторичная эритема, развитие пузырей и язв, эпителизация. Между первичной эритемой, которая развивается при дозе облучения кожи выше 800 рад, и появлением вторичной эритемы проходит определенный срок, который тем короче, чем выше доза, – своеобразный латентный период для кожных поражений. Необходимо подчеркнуть, что сам по себе латентный период при поражении конкретных тканей совсем не должен совпадать с латентным периодом поражения других тканей.

Иными словами, такого периода, когда отмечается полное внешнее благополучие пострадавшего, не удается отметить при дозах облучения выше 0,5 Гр для равномерного облучения; он практически не наблюдается при неравномерных облучениях, когда костный мозг оказывается облученным большей дозой.

Вторичная эритема может закончиться шелушением кожи, легкой ее атрофией, пигментацией без нарушения целостности покровов, если доза облучения не превышает 1–2 Гр. При более высоких дозах появляются пузыри. При дозах свыше 2 Гр первичная эритема сменяется отеком кожи, который через неделю переходит в некроз либо на его фоне появляются пузыри, наполненные серозной жидкостью.

Прогноз кожных поражений не может считаться достаточно определенным: он зависит от тяжести не только собственно кожных изменений, но и от поражения сосудов кожи, крупных артериальных стволов. Пораженные сосуды претерпевают прогрессирующие склеротические изменения на протяжении многих лет, и ранее хорошо зажившие кожные лучевые язвы через длительный срок могут вызвать повторный некроз, привести к ампутации конечности и т. п. Вне поражения сосудов вторичная эритема заканчивается развитием пигментации на месте лучевого «ожога» часто с уплотнением подкожной клетчатки. В этом месте кожа обычно атрофична, легко ранима, склонна к образованию вторичных язв. На местах пузырей после их заживления образуются узловатые кожные рубцы с множественными ангиэктазиями на атрофичной коже. По-видимому, эти рубцы не склонны к раковому перерождению.

Диагностика острой лучевой болезни в настоящее время не представляет трудностей. Характерная картина первичной реакции, ее временные характеристики изменения уровней лимфоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов делают диагностику не только безошибочной, но и точной относительно степеней тяжести процесса. Хромосомный анализ клеток, костного мозга и лимфоцитов крови позволяет уточнить дозу и тяжесть поражения сразу после облучения и ретроспективно, через месяцы и годы после облучения. При облучении данной области костного мозга в дозе более 1,5–2 Гр частота клеток с хромосомными нарушениями практически равна 100 %, при дозе 1–1,5 – около 50 %.

Лечение острой лучевой болезни строго соответствует ее проявлениям. Лечение первичной реакции имеет симптоматический характер: рвоту купируют применением противорвотных лекарственных средств, введением гипертонических растворов (при неукротимой рвоте), при дегидратации необходимо введение плазмозаменителей.

Для профилактики экзогенных инфекций больных изолируют и создают им асептические условия (боксы, ультрафиолетовая стерилизация воздуха, применение бактерицидных растворов). Лечение бактериальных осложнений должно быть неотложным. До выявления возбудителя инфекции проводят так называемую эмпирическую терапию антибиотиками широкого спектра действия по одной из следующих схем:

1) пенициллин – 20 млн ЕД/сутки, стрептомицин – 1 г/сутки;

2) канамицин – 1 г/сутки, ампициллин —4 г/сутки;

3) цепорин – 3 г/сутки, гентамицин —160 мг/сутки;

4) рифадин (бенемицин) – 450 мг внутрь в сутки, линкомицин – 2 г/сутки.

Суточные дозы антибиотиков (кроме рифадина) вводят внутривенно 2–3 раза в сутки. При высеве возбудителя инфекции антибактериальная терапия становится направленной.

Лечение некротической энтеропатии: полный голод до ликвидации ее клинических проявлений (обычно около 1–1,5 недели), пить только воду (но не соки!); при необходимости длительного голодания – парентеральное питание; тщательный уход за слизистой оболочкой полости рта (полоскания); стерилизация кишечника (канамицин – 2 г, полимиксин М – до 1 г, ристомицин – 1,51; нистатин – по 10 млн—20 млн ЕД/сутки).

Для борьбы с тромбоцитопеническим геморрагическим синдромом необходимы трансфузии тромбоцитов, получаемых от одного донора. Следует еще раз предупредить о нецелесообразности переливания эритромассы при острой лучевой болезни, если нет для этого четких показаний в виде выраженной анемии и обусловленной ею дыхательной, сердечной недостаточности. Иными словами, при уровне гемоглобина выше 83 г/л (8,3 г%) без признаков острой кровопотери переливать эритромассу не надо, так как это может еще более усугубить лучевое поражение печени, усилить фибринолиз, спровоцировать тяжелую кровоточивость.

Прогноз

После ликвидации всех выраженных проявлений острой лучевой болезни (костномозгового, кишечного, орального синдромов, кожных поражений) больные выздоравливают. При легких и среднетяжелых поражениях выздоровление обычно полное, хотя на многие годы может сохраняться умеренная астения. После перенесенной тяжелой степени болезни выраженная астения сохраняется обычно долго.

Кроме того, таким больным угрожает развитие катаракты. Ее появление обусловлено дозой воздействия на глаза более 0,5 Гр. При больших дозах развиваются тяжелое поражение сетчатки, кровоизлияния на глазном дне, повышение внутриглазного давления, возможно, с последующей потерей зрения в пораженном глазу.

После острой лучевой болезни изменения в картине крови не строго постоянны: в одних случаях наблюдаются стабильная умеренная лейкопения и умеренная тромбоцитопения, в других случаях этого нет.

Повышенной склонности к инфекционным заболеваниям у таких больных не обнаруживается. Появление грубых изменений в крови – выраженной цитопении или, наоборот, лейкоцитоза – всегда свидетельствует о развитии нового патологического процесса (апластической анемии как самостоятельного заболевания, лейкоза и т. п.). Не подвержены каким-либо рецидивам изменения кишечника и полости рта.

Хроническая лучевая болезнь

Хроническая лучевая болезнь – заболевание, развивающееся под действием длительного ионизирующего облучения в относительно малых, но предельно допустимых дозах, которое характеризуется поражением органов и систем, волнообразным течением.

Этиология и патогенез

Хроническая лучевая болезнь представляет собой заболевание, вызванное повторными облучениями организма в малых дозах, суммарно не превышающих 1 Гр. Развитие болезни определяется не только суммарной дозой, но и ее мощностью, т. е. сроком облучения, в течение которого произошло поглощение дозы радиации в организме. В условиях хорошо организованной радиологической службы в настоящее время в нашей стране новых случаев хронической лучевой болезни нет. Плохой контроль за источниками радиации, нарушение персоналом техники безопасности в работе с рентгенотерапевтическими установками в прошлом приводили к появлению случаев хронической лучевой болезни.

Клиническая картина болезни определяется прежде всего астеническим синдромом и умеренными цитопеническими изменениями в крови. Сами по себе изменения в крови не являются источником опасности для больных, хотя снижают трудоспособность. Патогенез астенического синдрома остается неясным. Что касается цитопении, то в ее основе лежат, по-видимому, не только уменьшение плацдарма кроветворения, но и перераспределительные механизмы, так как у этих больных в ответ на инфекцию, введение преднизолона развивается отчетливый лейкоцитоз.

Патогенетического лечения хронической лучевой болезни нет. Симптоматическая терапия направлена на устранение или ослабление астенического синдрома.

Прогноз

Собственно хроническая лучевая болезнь не представляет опасности для жизни больных, ее симптомы не имеют склонности к прогрессированию, вместе с тем полного выздоровления, по-видимому, не наступает. Хроническая лучевая болезнь не является продолжением острой, хотя остаточные явления острой формы и напоминают отчасти форму хроническую.

При хронической лучевой болезни очень часто возникают опухоли – гемобластозы и рак. При хорошо поставленной диспансеризации, тщательном онкологическом осмотре 1 раз в год и исследовании крови 2 раза в год удается предупредить развитие запущенных форм рака, и продолжительность жизни таких больных приближается к нормальной. Наряду с острой и хронической лучевой болезнью можно выделить подострую форму, возникающую в результате многократных повторных облучений в средних дозах на протяжении нескольких месяцев, когда суммарная доза за сравнительно короткий срок достигает более 1–1,5 Гр.

По клинической картине это заболевание напоминает острую лучевую болезнь.

Лечение подострой формы не разработано, так как подобные случаи не встречаются в настоящее время. Основную роль играют, по-видимому, заместительная терапия компонентами крови при тяжелой аплазии и антибактериальная терапия при инфекционных болезнях.

Геморрагические диатезы и синдромы

Геморрагические диатезы и синдромы – формы патологии, характеризующиеся склонностью к кровоточивости (табл. 58).

Таблица 58

Классификация геморрагических диатезов

Общая этиология и патогенез

Различают наследственные (семейные) формы с многолетней, начинающейся с детского возраста кровоточивостью и приобретенные формы, в большинстве своем вторичные (симптоматические). Большая часть наследственных форм связана с аномалиями мегакариоцитов и тромбоцитов, дисфункцией последних либо с дефицитом или дефектом плазменных факторов свертывания крови, а также фактора Виллебранда, реже с неполноценностью мелких кровеносных сосудов (телеангиэктазия, болезнь Ослера – Рандю). Большинство приобретенных форм кровоточивости связаны с ДВС-синдромом, иммунными и иммунокомплексными поражениями сосудистой стенки (васкулит Шенлейна – Геноха, эритемы и др.) и тромбоцитов (большинство тромбоцитопений), с нарушениями нормального гемопозза (геморрагии при лейкозах, гипо- и апластических состояниях кроветворения, лучевой болезни), токсико-инфекционным поражением кровеносных сосудов (геморрагические лихорадки, сыпной тиф и др.), заболеваниями печени и обтурационной желтухой (ведущими к нарушению синтеза в гепатоцитах факторов свертывания крови), воздействием лекарственных препаратов, нарушающих гемостаз (антиагрегантов, антикоагулянтов, фибринолитиков) либо провоцирующих иммунные нарушения – тромбоцитопению (гаптеновая форма), васкулиты.

При многих перечисленных заболеваниях нарушения гемостаза носят смешанный характер и резко усиливаются в связи с вторичным развитием ДВС-синдрома, чаще всего в связи с инфекционно-септическими, иммунными, деструктивными или опухолевыми процессами.

По патогенезу различают следующие группы геморрагических диатезов:

1) обусловленные нарушениями свертываемости крови, стабилизации фибрина или повышенным фибринолизом, в том числе при лечении антикоагулянтами, стрептокиназой, урокиназой, препаратами дефибринирующего действия (арвином, рептилазой, дефибразой и др.);

2) обусловленные нарушением тромбоцитарно-сосудистого гемостаза (тромбоцитопений, тромбоцитопатии);

3) обусловленные нарушениями как коагуляционного, так и тромбоцитарного гемостаза – болезнь Виллебранда, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (тромбогеморрагический синдром, при парапротеинемиях, гемобластозах, лучевой болезни и др.);

4) обусловленные первичным поражением сосудистой стенки с возможным вторичным вовлечением в процесс коагуляционных и тромбоцитарных механизмов гемостаза (наследственная телеангиэктазия Ослера – Рандю, гемангиомы, геморрагический васкулит Шенлейна – Геноха, эритемы, геморрагические лихорадки, гиповитаминозы С и В и др.).

Патогенез приобретенных коагулопатий сложен, так как в большинстве случаев имеются несколько нарушений в свертывающей системе крови и их сочетание с изменениями в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза. Приобретенные коагулопатии носят вторичный характер, возникая на фоне какой-либо клинической ситуации:

1) у новорожденных (дефицит К-витаминозависимых факторов VII, Х, II и IX вследствие прекращения поступления витамина К через плаценту; ликвидируется после заселения кишечника ребенка нормальной микрофлорой, продуцирующей витамин К);

2) при тяжелых энтеропатиях (особенно у детей) и других видах мальабсорбции, лекарственных кишечных дисбактериозах (нарушение синтеза и всасывания витамина К, ведущее к К-витаминной недостаточности и дефициту факторов VII, Х, IХ, поскольку витамин К необходим для превращения предшественников этих факторов в окончательные формы);

3) при паренхиматозных поражениях печени (нарушение синтеза факторов VII, Х, II, IХ на более ранних его этапах, чем при К-витаминной недостаточности, а также факторов V, ХI, I и ингибиторов фибринолиза);

4) при первичном амилоидозе (дефицит фактора Х, иногда фактора VI), парапротеинемии, макро- и криоглобулинемии (блокирующее действие аномальных белков на факторы свертывания, нарушение полимеризации фибрина, а также обволакивание тромбоцитов с изменением агрегационных свойств, микроциркуляторные нарушения);

5) при всех состояниях, ведущих к развитию ДВС-синдрома (потребление фибриногена и других факторов свертывания, тромбоцитов, вторичная активация противосвертывающих механизмов). Реже встречаются близкие к ДВС-синдрому тромбогеморрагические заболевания, протекающие с выраженной лихорадкой, – тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (болезнь Мошкович) и гемолитико-уремический синдром;

6) при эмоциональных напряжениях и стрессе (первичное повышение фибринолитической активности, гипофибриногенемия). В особую группу включают различные формы так называемой невротической, или имитационной, кровоточивости, вызываемой вследствие расстройства психики путем механической травматизации ткани (нащипывание или насасывание синяков, травмирование слизистых оболочек и т. д.), тайным приемом лекарственных препаратов геморрагического действия (чаще всего антикоагулянтов непрямого действия – кумаринов, фенилина и др.) и т. д.;

7) при применении некоторых лекарственных средств (лекарственные коаулопатии) – при передозировке антикоагулянтов непрямого действия (дефицит витаминозависимых факторов II, VII, Х, IХ вследствие ингибиции витамина К, антагонистами которого являются данные лекарственные средства, с созданием К-витаминной недостаточности в клетках печени и нарушением синтеза указанных факторов свертывания); антикоагулянтов прямого действия – гепарина (блокада активированных факторов Х, ХI, тромбина), препаратов фибринолитического и дефибринирующего действия – фибринолизина, стрептокиназы, урокиназы, расщепление факторов V, VIII, I, нарушение трансформации фибриногена в фибрин, гипофибриногенемия, накопление в плазме продуктов фибринолиза, обладающих выраженным антикоагулянтным действием, и потребление плазминогена в процессе фибринолиза, что может явиться причиной развития тромбоэмболических осложнений);

8) при появлении в циркуляции иммунных ингибиторов (антител) факторов свертывания (иммунные коагулопатии) – фактора VIII (при гемофилии, во время беременности и родов, при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, узелковом периартериите, реакции на пенициллин), фактора V (иногда при лечении стрептомицином), фактора ХIII (при сепсисе, множественных переломах, ДВС-синдроме, при лечении изониазидом).

Общая диагностика геморрагических заболеваний и синдромов базируется на следующих основных критериях:

1) определение сроков возникновения, давности, длительности и особенностей течения заболевания (появление в раннем детском, юношеском возрасте либо у взрослых и пожилых людей, острое или постепенное развитие геморрагического синдрома, недавнее или многолетнее (хроническое, рецидивирующее) его течение и т. д.;

2) выявление по возможности семейного (наследственного) генеза кровоточивости (с уточнением типа наследования) либо приобретенного характера болезни; уточнение возможной связи развития геморрагического синдрома с предшествовавшими патологическими процессами, воздействиями (в том числе и лечебными – лекарственные препараты, прививки и др.) и фоновыми заболеваниями (болезни печени, лейкозы, инфекционно-септические процессы, травмы, шок и т. д.);

3) определение преимущественной локализации, тяжести и типа кровоточивости. Так, при болезни Ослера – Рандю преобладают и часто являются единственными упорные носовые кровотечения; при патологии тромбоцитов – синяковость, маточные и носовые кровотечения, при гемофилиях – глубокие гематомы и кровоизлияния в суставы.

Типы кровоточивости

Гематомный тип свойствен ряду наследственных нарушений свертываемости крови (гемофилии А и В, тяжелый дефицит фактора VII) и прибретенных коагулопатий – появлению в крови ингибиторов факторов VIII, IX, VIII + V, передозировке антикоагулянтов (забрюшинные гематомы). Характеризуется болезненными напряженными кровоизлияниями в подкожную клетчатку, мышцы, крупные суставы, в брюшину и забрюшинное пространство (со сдавлением нервов, разрушением хрящей, костной ткани, нарушением функций опорно-двигательного аппарата), в некоторых случаях – почечными и желудочно-кишечными кровотечениями, длительными анемизирующими кровотечениями из мест порезов, ран, после удаления зубов и хирургических вмешательств.

Капиллярный, или микроциркуляторный (петехиально-синячковый), тип свойствен тромбоцитопениям и тромбоцитопатиям, болезни Виллебранда, а также дефициту факторов протромбинового комплекса (VII, X, V и II), некоторым вариантам гипо- и дисфибриногенемий, умеренной передозировке антикоагулянтов. Часто сочетается с кровоточивостью слизистых оболочек, меноррагиями. Возможны тяжелые кровоизлияния в мозг.

Смешанный капиллярно-гематомный тип кровоточивости – петехиально-пятнистые кровоизлияния в сочетании с обширными плотными кровоизлияниями и гематомами. При наследственном генезе кровоточивости этот тип свойствен тяжелому дефициту факторов VII и XIII, тяжелым формам болезни Виллебранда, а из приобретенных – характерен для острых и подострых форм ДВС-синдрома, значительной передозировки антикоагулянтов.

При дифференциальной диагностике следует учитывать и большие различия в частоте и распространенности геморрагических диатезов, одни из которых исключительно редки, тогда как на другие приходится подавляющее большинство встречающихся в клинической практике случаев кровоточивости.

Геморрагические диатезы, обусловленные нарушениями в свертывающей системе крови

Среди наследственных форм подавляющее большинство случаев (более 95 %) приходится на дефицит компонентов фактора VIII (гемофилия А, болезнь Виллебранда) и фактора IX (гемофилия В), по 0,3–1,5 % – на дефицит факторов VII, X, V и XI. Крайне редки (единичные наблюдения) формы, связанные с наследственным дефицитом других факторов – XII (дефект Хагемана), II (гипопротромбинемия), I (гиподисфибриногенемия), XIII (дефицит фибринстабилизирующего фактора). Среди приобретенных форм, помимо ДВС-синдрома, преобладают коагулопатии, связанные с дефицитом или депрессией факторов протромбинового комплекса (II, VII, X, V), – болезни печени, обтурационная желтуха, кишечные дисбактериозы, передозировка антикоагулянтов, – антагонистов витамина К (кумарины, фенилин и др.), геморрагическая болезнь новорожденных; формы, связанные с появлением в крови иммунных ингибиторов факторов свертывания (чаще всего антител к фактору VIII); кровоточивость, обусловленная гепаринизацией, введением препаратов фибринолитического (стрептокиназы, урокиназы и др.) и дефибринирующего действий (арвина, анкрода, дефибразы, рептилазы, анцистрона-Н).

Гемофилии А и В

Гемофилии – рецессивно наследуемые, сцепленные с полом (Х-хромосомой) заболевания; болеют лица мужского пола, женщины являются носителями заболевания. Заболевание обусловлено дефицитом одного из факторов свертываемости VIII, IХ или ХI.

Этиология и патогенез

Генетические дефекты характеризуются недостаточным синтезом или аномалией фактора VIII (коагуляционная часть) – гемофилия А или фактора IX – гемофилия В. Временный (от нескольких недель до нескольких месяцев) приобретенный дефицит факторов VIII, реже – IX, сопровождающийся сильной кровоточивостью, наблюдается и у мужчин, и у женщин (особенно в послеродовом периоде, у лиц с иммунными заболеваниями) вследствие появления в крови в высоком титре антител к этим факторам.

Фактор VIII представляет собой сложный гликопротеиновый комплекс с молекулярной массой около 1 млн, состоящий из коагулянтной части – важного внутреннего механизма гемостаза, антигенной части (VIII-АГ), не обладающей прокоагулянтной активностью, и тесно связанного с ней фактора Виллебранда (VIII-ФВ), участвующего в тромбоцитарно-сосудистом гемостазе. Эти субъединицы находятся под разным генетическим контролем. Синтез коагулянтной части фактора VIII контролируется рецессивным геном Х-хромосомы, поэтому гемофилия А наследуется по рецессивному, сцепленному с полом типу.

Наряду с формами гемофилии, обусловленными количественным снижением фактора VIII (коагуляционного компонента) (большинство случаев), встречаются формы, при которых в плазме больных обнаруживается качественно измененный (функционально неактивный) антигемофильный глобулин. Он обладает антигенностью, может быть нейтрализован и таким образом выявлен антителами против фактора VIII (в гемагглютинационном тесте с использованием кроличьей антисыворотки, полученной путем иммунизации кролика очищенным фактором VIIIк (коагулянтной частью) человека. Первые формы гемофилии обозначают как антигенонегативные (А—), вторые – как антигенопозитивные (А+). Появление в крови больных иммунных ингибиторов VIIIк переводит гемофилию в так называемую ингибиторную форму, при которой становится неэффективной заместительная терапия гемопрепаратами, содержащими фактор VIII.

В основе кровоточивости лежит изолированное нарушение начального этапа внутреннего механизма свертывания крови, вследствие чего резко удлиняются общее время свертывания цельной крови (в том числе параметр R тромбоэластограммы) и показатели более чувствительных тестов – аутокоагуляционного (АКТ), активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ) и т. д. Протромбиновое время (индекс) и конечный этап свертывания, а также все параметры тромбоцитарного гемостаза (число тромбоцитов и все виды их агрегации) не нарушаются. Пробы на ломкость микрососудов (манжеточная и др.) остаются нормальными.

Кофакторная (компонентная) гемофилия – очень редкая форма. Тип наследования аутосомный. Низкая активность фактора VIII устраняется в тесте смешивания плазмы исследуемого с плазмой больного гемофилией А. Время кровотечения, адгезивность тромбоцитов, уровень в плазме фактора Виллебранда и его мультимерная структура не нарушены, что отличает кофакторную гемофилию от болезни Виллебранда.

Клиническая картина

Наблюдается гематомный тип кровоточивости с раннего детского возраста у лиц мужского пола, обильные и длительные кровотечения после любых, даже малых, травм и операций, включая экстракцию зубов, прикусы губ и языка и т. д. Характерны повторяющиеся кровоизлияния в крупные суставы конечностей (коленные, голеностопные и др.) с последующим развитием хронических артрозов с деформацией и ограничением подвижности суставов, атрофией мышц и контрактурами, инвалидизирующие больных, вынуждающие их пользоваться ортопедической коррекцией, костылями, инвалидными колясками. Возможны большие межмышечные, внутримышечные, поднадкостничные и забрюшинные гематомы, вызывающие иногда деструкцию подлежащей костной ткани (гемофилические псевдоопухоли), патологические переломы костей. Возможны упорные рецидивирующие желудочно-кишечные и почечные кровотечения. Тяжесть заболевания соответствует степени дефицита антигемофилических факторов: при крайне тяжелых формах их уровень ниже 1 %, при тяжелых – 1–2 %, средней тяжести – 3–5 %, легкой – больше 5 %. Однако при травмах и операциях угроза развития опасных для жизни кровотечений сохраняется и при легких формах гемофилии, и лишь поддержание уровня факторов VIII или IX выше 30–50 % обеспечивает надежный гемостаз.

Диагноз

Гемофилию предполагают у больных мужского пола с гематомным типом кровоточивости и гемартрозами, возникающими с раннего детства. Лабораторные признаки: удлинение общего времени свертывания крови при нормальных показателях протромбинового и тромбинового тестов. Для дифференциальной диагностики гемофилии А и В используют тест генерации тромбопластина, коррекционные пробы в аутокоагулограмме: при гемофилии А нарушение свертываемости устраняется добавлением в плазму больного донорской плазмы, предварительно адсорбированной сульфатом бария (при этом удаляется фактор IX, но сохраняется фактор VIII), но не устраняется нормальной сывороткой, продолжительность хранения которой 1–2 суток (содержит фактор IX, но лишена фактора VIII); при гемофилии В коррекцию дает старая сыворотка, но не ВаSO_4-плазма. При наличии в крови больного иммунного ингибитора антигемофилического фактора («ингибиторная» форма гемофилии) коррекцию не дают ни ВаSO_4-плазма, ни старая сыворотка, мало нарастает уровень дефицитного фактора в плазме больного после внутривенного введения его концентрата или донорской плазмы. Титр ингибитора определяют по способности разных разведений плазмы больного нарушать свертываемость свежей нормальной донорской плазмы. Адсорбция производится чаще сульфатом бария из оксалатной плазмы крови.

Лечение

Основной метод лечения – заместительная гемостатическая терапия криопреципитатом или концентратами фактора VIII (при гемофилии А) или фактора IX – препарат ППСБ (при гемофилии В). При отсутствии этих препаратов или неустановленной форме гемофилии – введение внутривенно струйно больших объемов свежей или свежезамороженной донорской плазмы, содержащей все необходимые факторы свертывания. При гемофилии А криопреципитат вводят в зависимости от тяжести геморрагии, травм или хирургического вмешательства в дозах от 10 до 30 ЕД/кг 1 раз в сутки, плазму – в дозах по 300–500 мл каждые 8 ч. При гемофилии В вводят концентраты фактора IX по 4–8 доз в сутки (под прикрытием 1,5 тыс. ЕД гепарина на каждую дозу) либо донорскую плазму (до 3–4 дней хранения) по 10–20 мл/кг в сутки ежедневно или через день. При анемизации прибегают также к трансфузиям свежей (1–2 дней хранения) одногруппной донорской крови или эритроцитной массы. Трансфузии крови и плазмы от матери больному ребенку нецелесообразны: у носительниц гемофилии уровень антигемофильных факторов существенно снижен.

Показания к заместительной терапии: кровотечения, острые гемартрозы и гематомы, острые болевые синдромы неясного генеза (часто связаны с кровоизлияниями в органы), прикрытие хирургических вмешательств (от удаления зубов до полостных операций). Причины неудач: разведение и медленное (капельное) введение концентратов факторов или плазмы, дробное введение их малыми дозами, одновременные вливания кровезаменителей (5 %-ный раствор глюкозы, полиглюкин, гемодез и т. д.), снижающих путем разведения концентрацию антигемофильных факторов в крови больного. При «ингибиторных» формах сочетают плазмаферез (удаление антител к факторам свертывания) с введениями очень больших количеств концентратов факторов и преднизолона.

Лечение гемартрозов

В остром периоде проводится возможно более ранняя заместительная гемостатическая терапия в течение 5–10 дней, при больших кровоизлияниях – пункция сустава с аспирацией крови и введением в его полость гидрокортизона или преднизолона (при строгом соблюдении асептики). Иммобилизация пораженной конечности на 3–4 дня, затем – ранняя лечебная физкультура под прикрытием криопреципитата; физиотерапевтическое лечение, в холодном периоде – грязелечение (в первые дни под прикрытием криопреципитата). При всех кровотечениях, кроме почечных, показан прием внутрь аминокапроновой кислоты по 4–12 г в сутки (в 6 приемов). Локальная гемостатическая терапия: аппликация на кровоточащую поверхность тромбина с гемостатической губкой и аминокапроновой кислотой. Викасол и препараты кальция неэффективны и не показаны. Остеоартрозы, контрактуры, патологические переломы, псевдоопухоли требуют восстановительного хирургического и ортопедического лечения в специализированных отделениях. При артралгиях противопоказано назначение нестероидных противовоспалительных препаратов, резко усиливающих кровоточивость.

Профилактика

Осуществляют медико-генетическое консультирование, определение пола плода и наличия в его клетках гемофилической Х-хромосомы.

Профилактика гемартрозов и других геморрагий: диспансеризация больных, рекомендации определенного образа жизни, устраняющего возможность травм, раннее использование допустимых видов лечебной физкультуры (плавание, атравматичные тренажеры). Организуют раннее введение антигемофилических препаратов на дому (выездные специализированные бригады, обучение родителей в школе медицинских сестер); рентгенотерапию пораженных суставов, хирургическую и изотопную синовэктомию. В наиболее тяжелых случаях показано систематическое (2–3 раза в месяц) профилактическое введение концентрата факторов VIII или IX.

Болезнь Виллебранда

Болезнь Виллебранда – один из наиболее частых наследственных геморрагических диатезов, связанный с дефицитом в крови или аномалиями гликопротеина, являющегося одним из компонентов фактора VIII.

Этиология и патогенез

Аутосомно наследуемый дефицит или аномальная структура синтезируемого в эндотелии сосудов макромолекулярного компонента фактора VIII. В ее основе лежит нарушение синтеза (или реже функциональная неполноценность молекулы) компонента фактора VIII, обозначаемого как фактор Виллебранда (VIII-ФВ). Фактор VIII-ФВ необходим для нормальной функции тромбоцитов. Кроме того, он способен стимулировать синтез коагулянтной части фактора VIII, поскольку переливание плазмы больных гемофилией (с резко сниженным содержанием фактора VIII, но нормальным уровнем фактора VIII-ФВ) лицам с болезнью Виллебранда вызывает постепенное нарастание содержания VIII в плазме, причем коррекционный эффект намного превосходит количество вводимого фактора VIII.

Нарушается взаимодействие стенок сосудов с тромбоцитами, вследствие чего повышается ломкость микрососудов (положительные пробы на ломкость капилляров), при большинстве форм резко возрастает время кровотечения, снижаются адгезивность тромбоцитов к субэндотелию и их агглютинация под влиянием ристомицина. Одновременно в большей или меньшей степени снижается коагуляционная активность фактора VIII, что сближает болезнь Виллебранда с легкими формами гемофилии А (отсюда старое название болезни – ангиогемофилия).

Клиническая картина

У женщин с профузными меноррагиями болезнь часто протекает намного тяжелее, чем у мужчин. Тип кровоточивости в тяжелых случаях смешанный, в более легких – микроциркуляторный. При незначительной травматизации возникают геморрагии в кожу и подкожную клетчатку, носовые и маточные кровотечения, часто ошибочно расцениваемые как дисфункциональные, реже – желудочно-кишечные, внутричерепные. Гемартрозы редки и поражают лишь единичные суставы, не ведут к глубоким нарушениям функции опорно-двигательного аппарата. Наиболее мучительны изнуряющие и анемизирующие меноррагии, из-за которых иногда приходится прибегать к экстирпации матки. Во время беременности фактор Виллебранда при одних формах нормализуется и роды протекают нормально, при других – остается сниженным, и роды осложняются при отсутствии адекватной терапии опасными для жизни кровотечениями. Возможно сочетание болезни Виллебранда с различными мезенхимально-сосудистыми дисплазиями – телеангиэктазией (форма Квика), артериовенозными шунтами, пролабированием створок клапанов сердца, слабостью связочного аппарата и т. д.

Диагностика

Диагноз устанавливают по типичной форме пожизненной кровоточивости и выявлению в разных сочетаниях следующих признаков: положительных проб на ломкость капилляров; удлинения времени кровотечения, особенно в пробах с наложением манжеты (+40 мм рт. ст.) по Айви, Борхгревинку или Шитиковой, при нормальном содержании тромбоцитов в крови, нормальной их величине; снижения адгезивности тромбоцитов к стеклу и коллагену, снижения агглютинации их под влиянием ристомицина и одновременного нарушения начального этапа свертываемости крови (в аутокоагуляционном тесте, при исследовании активированного парциального тромбопластинового времени).

При большинстве форм снижены активность фактора Виллебранда в плазме и (или) тромбоцитах, а также уровень связанного с ним антигена. Коагуляционная активность фактора VIII при одних формах снижена, при других – нормальна. После трансфузии свежей донорской плазмы или введений криопреципитата активность фактора VIII при болезни Виллебранда возрастает в большей степени и на более длительный срок, чем при гемофилии А. Ряд форм болезни Виллебранда связан с неправильным распределением этого фактора между плазмой и тромбоцитами (например, в тромбоцитах их мало, в плазме – много или наоборот) и нарушением его мультимерной структуры. Из-за этого разнообразия патогенетических форм каждый из перечисленных лабораторных признаков может отсутствовать, что затрудняет диагностику отдельных вариантов данного заболевания. Однако типичные формы диагностируют достаточно надежно.

Лечение

При кровотечениях и хирургических вмешательствах необходимо введение криопреципитата и струйно свежезамороженной плазмы. Дозы и частота их введения могут быть в 2–3 раза меньше, чем при гемофилии А. С первого и до последнего дня менструального цикла, а также при носовых и желудочно-кишечных кровотечениях назначают внутрь аминокапроновую кислоту (8–12 г/сутки) либо осуществляют гормональный гемостаз.

Профилактика

Следует избегать браков между больными (в том числе между родственниками) в связи с возможностью рождения детей с тяжелой гомозиготной формой болезни.

Гемофилия С

Дефицит фактора XI (гемофилия С) – редкое аутосомно наследуемое заболевание (чаще встречается у евреев), характеризующееся слабым нарушением внутреннего механизма начального этапа свертывания крови, отсутствием или незначительной выраженностью геморрагии.

Клиническая картина

Чаще всего болезнь протекает бессимптомно и случайно выявляется при исследовании свертывающей системы крови. Спонтанная кровоточивость отсутствует или незначительна. Травмы и операции в ряде случаев (не всегда даже у одного и того же больного) осложняются кровотечениями.

Диагностика основана на выявлении нарушения начального этапа свертывания крови (в аутокоагулограмме, АПТВ) при нормальном протромбиновом и тромбиновом времени. В коррекционных тестах нарушение исправляют добавлением как нормальной Ва304-плазмы, так и нормальной сыворотки (отличие от легчайших форм гемофилии А и В).

Лечение

В большинстве случаев лечения не требуется. При операциях и родах, осложненных кровотечениями, необходимы струйные трансфузии свежезамороженной плазмы.

Профилактика такая же, как при болезни Виллебранда.

Диспротромбии

Диспротромбии – геморрагические диатезы, обусловленные наследственным дефицитом факторов протромбинового комплекса – VII (гипопроконвертинемия), Х (болезнь Стюарта – Прауэра), II (гипопротромбинемия) и V (гипоакцелеринемия). Дефицит перечисленных факторов часто встречается как приобретенный дефект системы гемостаза, но редко (факторы VII, X, V) или крайне редко (фактор II) как наследственный дефект.

Наследственные диспротромбии. При легких формах – микроциркуляторный, при более тяжелых – смешанный тип кровоточивости. Гемартрозы редки (преимущественно при дефиците фактора VII).

При всех формах значительно удлинено протромбиновое время (снижен протромбиновый индекс) при нормальном тромбиновом времени. Внутренний механизм свертывания (аутокоагулограмма, активированное парциальное тромбопластиновое время) нарушен при дефиците факторов X, V и II, но остается нормальным при дефиците фактора VII. Разграничение дефицита факторов X, V и II проводят с помощью корригирующих проб, тестов со змеиными ядами путем количественного определения каждого из факторов.

Приобретенные формы дефицита факторов протромбинового комплекса чаще всего обусловлены приемом антикоагулянтов непрямого действия (кумаринов – пелентана, синкумарина и других, фенилина), К-витаминной недостаточностью при обтурационной желтухе и кишечном дисбактериозе, тяжелыми заболеваниями печени, системным амилоидозом, чрезмерной депрессией этих факторов (ниже 20 % нормы) на 3–7-й день после рождения (геморрагическая болезнь новорожденных). Следует, однако, учитывать, что в указанных ситуациях кровоточивость часто возникает и вследствие одновременного развития ДВС-синдрома.

Комплексный приобретенный дефицит К-витамин зависимых факторов первоначально проявляется петехиально-синячковой кровоточивостью (в частности, геморрагиями в местах инъекций, носовыми и десенными кровотечениями, гематурией), затем более обширными кровоподтеками и гематомами в области спины, в забрюшинном пространстве, геморрагиями в брюшину и стенку кишок, нередко имитирующими острый живот, меленой, иногда кровоизлияниями в мозг.

Диагноз устанавливают по наличию геморрагического синдрома и характерных нарушений гемостаза – резкого снижения протромбинового индекса и свертываемости в общих коагуляционных тестах (аутокоагулограмма, АПТВ) при нормальных тромбиновом времени, уровне фибриногена, отрицательных паракоагуляционных тестах, нормальном содержании в крови тромбоцитов. Учитывают предшествующие заболевания и воздействия, в том числе возможность отравления кумаринами (лекарственные формы, крысиный яд и др.).

При наследственном дефиците факторов протромбинового комплекса требуется заместительная терапия (введение свежезамороженной плазмы, препарата ППСБ внутривенно). При приобретенных формах показаны такая же терапия и введение водорастворимых препаратов витамина К (викасола) по 20–40 мг внутривенно повторно до купирования кровоточивости и нормализации протромбинового времени.

Дисфибриногенемии – наследственные молекулярные аномалии фибриногена, характеризующиеся либо замедлением свертывания этого белка под влиянием тромбина и тромбиноподобных ферментов, либо неправильной его полимеризацией, либо изменением чувствительности к фибринолизину (плазмину). Кровоточивость (как правило, легкая петехиально-синячковая) выявляется лишь при некоторых формах, тогда как при большинстве форм нет угрозы кровотечений или имеется наклонность к тромбозам.

Лечение в большинстве случаев не показано; при острых обстоятельствах (большие операции, множественные тромбозы) плазмаферез с заменой таким же объемом свежезамороженной или нативной донорской плазмы (по 0,8–1 тыс. мл в день в течение 2–3 дней).

Геморрагические диатезы, обусловленные патологией тромбоцитов (тромбоцитопении и тромбоцитопатии)

Тромбоцитопеническая пурпура

Тромбоцитопеническая пурпура (идиопатическая, приобретенная) – сборная группа заболеваний, объединяемая по принципу единого патогенеза тромбоцитопении; укорочения жизни тромбоцитов, вызванного наличием антител к тромбоцитам или иным механизмом их лизиса. Различают аутоиммунную и гаптеновую иммунную тромбоцитопению. В свою очередь, аутоиммунная тромбоцитопения может быть как идиопатической, первичной, так и вторичной. В происхождении гаптеновых (иммунных) форм тромбоцитопении ведущее значение имеют медикаменты и инфекции.

Клиническая картина

Нарушен тромбоцитарно-сосудистый гемостаз. Характерны синяки и геморрагии различной величины и формы на коже; кровотечения из носа, десен, матки, иногда из почек, желудочно-кишечного тракта.

Кровотечения возникают спонтанно; появлению синяков способствуют ушибы. Спленомегалия отсутствует. Заболевание осложняется хронической железодефицитной анемией различной тяжести. Течение заболевания может быть легким, средней тяжести и тяжелым.

Диагностика

Диагностика тромбоцитопенической пурпуры предполагается при наличии геморрагии на коже в сочетании с носовыми и маточными кровотечениями.

Лабораторная диагностика: тромбоцитопения в анализах периферической крови, удлинение времени кровотечения по Дьюку, Айви или Борхгревинку – Ваалеру, положительные пробы на ломкость капилляров, повышенное или нормальное содержание мегакариоцитов в костном мозге.

Клинически диагноз аутоиммунной тромбоцитопении предполагают на основании отсутствия семейного анамнеза и других признаков наследственного дефицита тромбоцитов, а также положительного результата стероидной терапии.

Лечение

Консервативное лечение – назначение преднизолона в начальной дозе 1 мг/кг в сутки. При недостаточном эффекте дозу увеличивают в 2–4 раза (на 5–7 дней). Продолжительность лечения – 1–4 месяца в зависимости от эффекта и его стойкости. О результатах терапии свидетельствует прекращение геморрагии в течение первых дней. Отсутствие эффекта (нормализации уровня тромбоцитов в крови через 6–8 недель лечения преднизолоном) или его кратковременность (быстрый рецидив тромбоцитопении после отмены стероидов) служит показанием к спленэктомии.

Абсолютные показания к спленэктомии – тяжелый тромбоцитопенический геморрагический синдром, не поддающийся консервативной терапии, появление мелких множественных геморрагий на лице, языке, кровотечений, начинающаяся геморрагия в мозг, а также тромбоцитопения средней тяжести, но часто рецидивирующая и требующая постоянного назначения глюкокортикоидов.

Терапию иммунных тромбоцитопений химиотерапевтическими препаратами-иммунодепрессантами (азатиоприном, циклофосфаном, винкристином и др.) изолированно или в комплексе с преднизолоном назначают только при неэффективности стероидной терапии и спленэктомии в условиях специализированного стационара и лишь по жизненным показаниям. Гемостаз осуществляют путем тампонады (когда возможно), местного или внутривенного применения аминокапроновой кислоты, назначения андроксона, этамзилата (дицинона) и других симптоматических средств. Маточные кровотечения купируют приемом аминокапроновой кислоты (внутрь по 8–12 г в день), местранола или инфекундина.

Прогноз различен. При иммунологической редукции мегакариоцитарного ростка, а также при неэффективной спленэктомии прогноз ухудшается.

Больные подлежат обязательной диспансеризации. Частоту посещений врача определяют тяжесть заболевания и программа лечения на данный момент.

Спленогенные тромбоцитопении

Спленогенные тромбоцитопении – тромбоцитопении, обусловленные спленомегалией и гиперспленизмом. Спленомегалии любого генеза могут сопровождаться повышенной секвестрацией и деструкцией тромбоцитов.

Диагноз основан на обнаружении тромбоцитопении при увеличенной селезенке и нормальном (или даже реактивно увеличенном) числе мегакариоцитов в костном мозге.

Лечение патогенетическое – спленэктомия.

Симптоматические тромбоцитопении

Симптоматические тромбоцитопении, обусловленные нарушением тромбоцитообразования, встречаются при неопластических, апластических и других заболеваниях костного мозга (таких как острые и хронические лейкозы, аплазии кроветворения различного генеза, миелофиброз, остеомиелосклероз, миелокарциноматоз, болезнь Педжета и некоторые другие заболевания костей).

Диагноз ставят при выявлении заболевания кроветворной системы с тромбоцитопенией, нарушении мегакариоцито- и тромбоцитообразования по данным морфологического исследования костного мозга.

Лечение направлено на основное заболевание.

Тромбоцитопатии

Тромбоцитопатии – заболевания, причиной которых является врожденная (чаще всего наследственная) или приобретенная качественная неполноценность тромбоцитов. При ряде тромбоцитопатий возможна непостоянная вторичная тромбоцитопения (обычно умеренная), обусловленная укорочением продолжительности жизни дефектных тромбоцитов.

Тромбастения (болезнь Гланцманна) – наследственное заболевание, передаваемое по аутосомно-доминантному или неполному рецессивному типу, поражающее лиц обоего пола.

Происходит первичный дефект коллагена и АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов при сохранении реакции освобождения из тромбоцитов пластиночных компонентов: серотонина, АДФ, факторов III и IV и других при воздействии коллагеном.

Дезагрегационные тромбоцитопатии – нарушение одной или нескольких агрегационных функций пластинок. В группу включают формы с нарушением реакции освобождения тромбоцитарных факторов и без него, а также с нарушением накопления в этих клетках АТФ, АДФ и серотонина. Наследственно обусловленное или приобретенное снижение всех или отдельных адгезивно-агрегационных свойств. Свойством провоцировать скрытую дисфункцию пластинок или вызывать ее обладает ряд лекарственных препаратов: ацетилсалициловая кислота, бутадион (фенилбутазон), индометацин (метиндол) и др.

Геморрагические диатезы, обусловленные патологией сосудов

Наследственная телеангиэктазия (геморрагический ангиоматоз, болезнь Ослера – Рандю)

Этиология и патогенез

Это наследственное заболевание, передаваемое по аутосомно-доминантному типу. Характеризуется истончением и недостаточным развитием на отдельных участках сосудистого русла субэндотелиального каркаса мелких сосудов, неполноценностью эндотелия. В детском или юношеском возрасте образуются тонкостенные, легко кровоточащие и травмируемые малые ангиомы; в ряде случаев формируются артериовенозные шунты в легких и других органах, прочие признаки неполноценности мезенхимы – растяжимость кожи (резиновая кожа), слабость связочного аппарата (привычные вывихи, пролабирование створок клапанов сердца). Возможно сочетание с болезнью Виллебранда.

Клиническая картина

Преобладают рецидивирующие кровотечения из телеангиэктазий, расположенных чаще всего в носу. Реже кровоточат телеангиэктазы на кайме губ, слизистых оболочках ротовой полости, глотки, желудка.

Число телеангиэктазий и кровотечений нарастает в период полового созревания и в возрасте до 20–30 лет. При наличии артериовенозных шунтов возникают одышка, цианоз, гипоксический эритроцитоз; рентгенологически в легких обнаруживают единичные округлые или неправильной формы тени, нередко ошибочно принимаемые за опухоли.

Возможно сочетание с пролабированием створок клапанов сердца (шумы, аритмия), гипермобильностью суставов, вывихами и другими мезенхимальными нарушениями (геморрагические мезенхимальные дисплазии по З. С. Баркагану) и с дефицитом фактора Виллебранда (синдром Квика). Заболевание может осложниться циррозом печени.

Диагностика основана на обнаружении типичных телеангиэктазий, рецидивирующих кровотечений из них, семейного характера заболевания (возможны и спорадические случаи). Существенных нарушений системы гемостаза нет (кроме случаев сочетания с дефицитом фактора Виллебранда). При частых и обильных кровотечениях развивается постгеморрагическая анемия; при артериовенозных шунтах – эритроцитоз, повышенное содержание гемоглобина в крови.

Лечение

В периоды кровотечений используют средства местной и общей гемостатической терапии – орошения тромбином с 5 %-ным раствором аминокапроновой кислоты, тампонада носа масляными тампонами, прижигания и др.

Более эффективна криотерапия. В иных случаях приходится прибегать к хирургическому лечению (иссечение ангиом, пластика перегородки носа, перевязка артерий). Используют баротерапию, прижигания с помощью лазера. Все эти мероприятия часто дают лишь временный эффект.

Введения викасола не показаны. При сопутствующем дефиците фактора Виллебранда показаны трансфузии нативной плазмы, введение криопреципитата. При анемизации – гемотрансфузии, введение препаратов железа.

Прогноз в большинстве случаев относительно благоприятный, но встречаются формы с неконтролируемыми кровотечениями.

Профилактика

Следует избегать травматизации слизистых оболочек в местах расположения ангиом.

Геморрагический васкулит

Геморрагический васкулит (анафилактоидная пурпура, иммунный микротромбоваскулит, болезнь Шенлейна – Геноха) – кровоточивость, обусловленная поражением сосудов малого калибра иммунными комплексами и компонентами системы комплемента.

Системное поражение капилляров, артериол, венул

Этиология и патогенез

Заболевание возникает обычно у детей и подростков, реже – у взрослых обоего пола, после перенесенной инфекции – стрептококковой ангины или обострения тонзиллита, фарингита, а также после введения вакцин и сывороток, в связи с лекарственной непереносимостью, охлаждением и другими неблагоприятными воздействиями внешней среды. Наиболее вероятен иммунный генез – повреждение сосудов циркулирующими иммунными комплексами, приводящими к повреждению эндотелия, микротромбозам и геморрагиям.

Клиническая картина

Заболевание проявляется триадой: мелкоточечные, иногда сливающиеся геморрагические высыпания на коже (пурпура), артралгии (или артрит), преимущественно крупных суставов, и абдоминальный синдром.

Начальные кожные высыпания располагаются на разгибательных поверхностях конечностей, иногда на туловище, заканчиваются остаточной пигментацией, иногда остающейся длительное время. Чаще поражаются нижние конечности.

Мигрирующие симметричные полиартриты, обычно крупных суставов, наблюдаются более чем у 2/3 больных, сопровождаясь болями различного характера – от кратковременной ломоты до острейших, приводящих больных к обездвиженности.

Артрит нередко сопровождается геморрагиями над пораженными суставами или внутрисуставным кровоизлиянием.

Абдоминальный синдром (брюшная пурпура) характеризуется внезапно развивающейся кишечной коликой. Боли обычно локализуются вокруг пупка, но нередко и в других отделах живота (в правой подвздошной области, правом подреберье, эпигастрии), симулируя аппендицит, холецистит, панкреатит. Боли усиливаются при пальпации.

Одновременно у больных наблюдается типичная картина абдоминального синдрома – бледность кожных покровов, осунувшееся лицо, запавшие глаза, заостренные черты лица, сухой язык, признаки раздражения брюшины. Больные обычно лежат на боку, прижав ноги к животу, мечутся.

Одновременно с коликой появляются кровавая рвота, жидкий стул, нередко с прожилками крови. Все разнообразие брюшной пурпуры можно представить в следующих вариантах: типичная колика, абдоминальный синдром, симулирующий аппендицит или прободение кишок, абдоминальный синдром с инвагинацией.

Этот перечень вариантов определяет тактику совместного наблюдения терапевтами и хирургами, необходимость своевременного при показаниях (прободение кишечника, инвагинация) оперативного вмешательства.

Нередко в патологический процесс вовлекаются почки в виде гематурического гломерулонефрита за счет поражения капилляров клубочков. Однако при исходе гломерулонефрита в хронический почечная патология может быть разнообразной – от мочевого синдрома до диффузного гломерулонефрита гипертонического или смешанного типа; редко – по типу нефротического синдрома. При общем благоприятном течении нефрита возможны исходы в хронический прогрессирующий нефрит с почечной недостаточностью.

Другие клинические признаки (поражение центральной нервной системы, геморрагические пневмонии, миокардиты и серозиты) наблюдаются редко и распознаются при специальных исследованиях.

Лабораторные данные малохарактерны – обычно наблюдается лейкоцитоз, наиболее выраженный при абдоминальном синдроме, со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, вплоть до юных. Скорость оседания эритроцитов обычно повышена, особенно при абдоминальном синдроме и полиартритах.

При остром течении заболевание начинается внезапно и течет бурно, с многосимптомной клиникой болезни, часто осложняясь нефритом. При хроническом течении большей частью речь идет о рецидивирующем кожно-суставном синдроме (ортостатическая пурпура пожилых).

Диагноз при наличии характерной триады или только геморрагических высыпаний на коже затруднений не вызывает.

Однако синдром геморрагического васкулита может наблюдаться при инфекционном эндокардите, различных васкулитах, диффузных болезнях соединительной ткани и др. У пожилых лиц необходимо исключить макроглобулинемическую пурпуру Вальденстрема.

Лечение

Назначают антигистаминные и противовоспалительные препараты в общепринятых дозировках. В острый период болезни необходим строгий постельный режим. В тяжелых случаях назначают гепарин (10–15 тыс. БД) 2 раза подкожно в область живота до ликвидации признаков гиперкоагуляции и свежих высыпаний; при тяжелом кишечном синдроме – голод, парентеральное питание, плазмаферез.

При хроническом течении могут быть рекомендованы аминохинолиновые препараты, большие дозы аскорбиновой кислоты (до 3 г/сутки), рутин, средние дозы глюкокортикоидов (20–40 мг/сутки). При наличии очаговой инфекции показана санация – консервативная или хирургическая.

Некоторым больным с хроническим рецидивирующим течением может быть рекомендована климатотерапия (юг Украины, Южный берег Крыма, Северный Кавказ).

Тромбофилии гематогенные

Тромбофилии гематогенные – состояния, характеризующиеся склонностью к развитию рецидивирующих тромбозов кровеносных сосудов (преимущественно вен) разной локализации вследствие нарушений состава и свойств крови.

Патогенетическими механизмами внутрисосудистого тромбообразования являются:

1) повреждения сосудистой стенки, способствующие агрегации тромбоцитов и прогрессивной активации плазменных факторов свертывания, из-за механического влияния гидродинамических факторов при уменьшении сердечного выброса, коллапсе, дилатации измененных сосудов (аневризма, варикозное расширение вен, стеноз, бифуркация), иммунные (комплексы АГ – АТ, вазоактивные компоненты комплемента, антитела к базальной мембране) и др. (атероматоз, высокомолекулярные белковые агрегаты при моноклональных парапротеинемиях);

2) повреждение тканей и клеточный распад (гемолиз, лейкоцитолиз) с резорбцией тканевого тромбопластина, клеточных протеаз, пептидаз, эстераз; изменение реологии крови – повышение внутрисосудистой агрегации эритроцитов и тромбоцитов и нарушение биофизических свойств пристеночного слоя плазмы (синдром повышения вязкости крови) при эритремии, тромбоцитемии, парапротеинемии, макро- и криоглобулинемии; попадание чужеродных протеаз (змеиные яды), обладающих прямым действием на протромбин или фибриноген, нейроэндокринные нарушения регуляции свертывания и противосвертывания (стресс) и комбинация указанных механизмов;

3) дефицит или аномалии основных физиологических антикоагулянтов – антитромбина III, белков С и S; дефицит или аномалии факторов свертывания крови и компонентов фибринолитической и калликреинкининовой систем (дефицит фактора XII, плазменного прекалликреина, высокомолекулярного кининогена, активатора плазминогена, ряд молекулярных аномалий фибриногена и др.).

Все эти нарушения могут быть наследственными, т. е. генетически обусловленными, и приобретенными (симптоматическими).

Клиническая картина

Выраженность тромбофилий, частота и тяжесть тромбоэмболии зависят от степени гематологических нарушений и сопутствующих (фоновых) состояний, патологических процессов и воздействий. Так, при полицитемии выраженность тромботического процесса зависит от степени полиглобулии и сгущения крови (нарастания уровня гемоглобина и гематокрита), а также выраженности гипертромбоцитоза. При дефиците антитромбина III, белков С и S степень выраженности тромбоэмболического синдрома целиком зависит от величины снижения соответствующих антикоагулянтов в плазме больного и нередко провоцируется большими физическими нагрузками, травмами, внутривенными манипуляциями, хирургическим вмешательством, беременностью.

В частности, выделяют следующие степени тромбофилий при дефиците антитромбина III:

1) тяжелые формы с рецидивирующими спонтанными тромбоэмболиями и инфарктами органов, начинающимися с молодого (до 20–35 лет) возраста – при уровне антитромбина III ниже 40 %;

2) пограничные формы с редкими спонтанными тромбозами, но закономерным развитием тромбоэмболии (в молодом и среднем возрасте) после травм, операций, больших физических напряжений, в родах и при стрессовых ситуациях (уровень антитромбина III – 40–65 %);

3) потенциальная форма – спонтанные тромбозы отсутствуют, но они легко возникают после внутривенных манипуляций (больные не переносят проколов вен), при продолжительной неподвижности (гиподинамия, сидячая работа), при ожирении и всех перечисленных в предыдущем пункте провоцирующих факторах (уровень антитромбина III находится в пределах 65–75 %).

Следует учитывать, что прием противозачаточных гормональных препаратов, снижающих дополнительно уровень антитромбина III, длительное лечение гепарином, прием ингибиторов фибринолиза также могут провоцировать тромбозы на фоне сравнительно небольшого исходного дефицита этого антикоагулянта или других тромбофилических состояний. Такие тромбофилии часто клинически дебютируют при развитии рака (легкого, почек и других локализаций), являясь иногда ранним признаком еще не выявленной опухоли (синдром Труссо).

Клинически все тромбофилии характеризуются рецидивирующими множественными тромбозами разной локализации, тромбоэмболиями в бассейне легочной артерии, инфарктами органов, развивающимися, как правило, у больных сравнительно молодого возраста.

Диагноз основывается на выявлении склонности к тромбозам в сравнительно молодом возрасте, частой политопности процесса, непереносимости внутривенных манипуляций, выявлении семейной предрасположенности к тромбозам («тромбоэмболические семьи») и на характерных лабораторных признаках того или иного вида тромбофилии.

Лечение должно быть патогенетически обоснованным, поскольку использование только общепринятых способов терапии тромбозов часто оказывается недостаточно эффективным. При формах, связанных с изменениями реологических свойств и клеточного состава крови, наряду с антикоагулянтами и дезагрегантами (ацетилсалициловой кислотой, курантилом) используют кровопускания (пиявки), методы гемодилюции – эритроцито- и тромбоцитоферез, реополиглюкин, специфическое лечение полицитемии и тромбоцитемии.

При дефиците факторов свертывания и антикоагулянтов (антитромбима III и др.) эффективны струйные заменные переливания значительных количеств свежезамороженной или свежей плазмы (по 300–600–900 мл/сутки) в сочетании с гепаринизацией и применением дезагрегантов (без трансфузий плазмы или при капельном ее введении гепарин при дефиците антитромбина III неэффективен).

Замещения криоплазмой используют также при дефиците компонентов фибринолитической и калликреинкининовой систем, а также при некоторых гиперагрегационных тромбофилиях (при тромботической тромбоцитопенической пурпуре, или болезни Мошковича, жизнь больных может быть спасена только быстрыми заменными переливаниями плазмы, т. е. сочетанием массивного плазмафереза со струйно-капельными введениями свежезамороженной плазмы).

В остальном используют традиционные способы лечения тромбозов – антикоагулянты, тромболитики и другие лекарственные средства.

Профилактика

Выявление лиц с тромбофилией и семей с наклонностью к тромбозам, своевременное определение вида тромбофилии, массовый их скрининг позволяют эффективно предупреждать и лечить тромбоэмболии.

Устранение провоцирующих и способствующих проявлению болезни факторов (борьба с гипокинезией, ожирением, чрезмерными физическими нагрузками, охлаждением, отказ от внутривенных манипуляций и приема гормональных противозачаточных препаратов), своевременное подключение к традиционной антитромботической терапии и профилактике коррекции реологических свойств крови, заместительной криоплазменной терапии и плазма- или цитоферез позволяют значительно облегчить течение тромбофилии, обеспечить предупреждение или быстрое купирование тромбоэмболичесого процесса.

При многих формах показано длительное (до 1 года и более) применение анаболических гормонов пролонгированного действия – станазолола, ретаболила и других, под влиянием которых увеличивается синтез в эндотелии антитромбина III и активатора фибринолиза, ослабляются трофические изменения в тканях конечностей.

Прогноз зависит от формы и тяжести тромбофилии, эффективности лечения основных и фоновых форм патологии (полицитемии и др.), степени дефицита основных антикоагулянтов и активаторов фибринолиза, нарушений антиагрегационной активности сосудистой стенки и крови.

При тяжелых формах больные часто гибнут или инвалидизируются в молодом и среднем возрасте от тромбоэмболии и инфарктов органов. Своевременное распознавание сути заболевания и проведение заместительной терапии и гемокоррекции значительно улучшают прогноз.

Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром)

ДВС-синдром, или тромбогеморрагический синдром, – процесс, характеризующийся рассеянным внутрисосудистым свертыванием и агрегацией клеток крови, истощением компонентов свертывающей и фибринолитической систем, блокадой микроциркуляции и выраженной наклонностью к кровоточивости и тромбозам.

Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) относится к числу наиболее важных общепатологических явлений, так как возникает при самых разных заболеваниях и патологических состояниях:

1) сепсисе и вирусемии;

2) злокачественных новообразованиях;

3) всех видах шока;

4) травматических хирургических вмешательствах;

5) акушерской патологии;

6) обширных ожогах;

7) обморожениях;

8) переломах костей;

9) синдроме раздавливания;

10) деструктивных поражениях паренхиматозных органов;

11) остром внутрисосудистом гемолизе и цитозе лейкоцитов;

12) гемобластозах;

13) системной красной волчанке;

14) узловом периартериите;

15) тромботической тромбоцитопенической пурпуре;

16) геморрагическом васкулите;

17) уремическо-гемолитическом синдроме;

18) укусах ядовитых змей;

19) массивных трансфузиях и т. д.

Подострый ДВС-синдром возникает при более легком течении всех перечисленных выше заболеваний, при поздних токсикозах беременности, внутриутробной гибели плода, лейкозах, подострых формах геморрагического васкулита.

Хронический ДВС-синдром возникает при злокачественных новообразованиях, хронических лейкозах и многих других хронических заболеваниях.

Для всех форм ДВС-синдрома характерна последовательная смена фаз гиперкоагуляции и гипокоагуляции. Фаза гиперкоагуляции может быть короткой и быстро завершаться распространенным внутрисосудистым свертыванием крови с блокадой рыхлыми массами фибрина микроциркуляции в органах и гиперкоагуляционным шоком.

В других случаях она развивается медленно, скрытно и не всегда вовремя распознается. Во второй фазе (гипокоагуляции) часто возникают геморрагии, почему весь синдром иногда называют тромбогеморрагическим.

Начальная лабораторная диагностика осуществляется с помощью простейших лабораторных тестов (общего времени свертывания крови, протромбинового и тромбинового времени, содержания фибриногена), однако гиперкоагуляция лучше определяется стандартизированными тестами – по укорочению парциального тромбопластинового (коалин-кефалинового) времени, ускорению времени достижения максимальной свертывающей активности (менее 10 мин) в аутокоагуляционном тесте, освобождению в плазму крови тромбоцитарных факторов, «паракоагуляционными» пробами, выявляющими фибрин-мономерные комплексы (этаноловый, протаминсульфатный тесты).

При переходе во вторую фазу (переход от гипер- к гипокоагуляции со сдвигами параметров коагулограммы) отмечаются прогрессирующая тромбоцитопения, снижение уровня фибриногена в плазме крови, удлинение тромбинового и протромбинового времени, повышение содержания в крови ПДФ, антигепаринового фактора тромбоцитов, появление феномена фрагментации эритроцитов. В более поздний период второй фазы может развиться глубокая гипокоагуляция вплоть до полной несвертываемости крови (как спонтанной, так и при добавлении тромбина) вследствие «истощения» гемостатических механизмов – потребления, блокады и протеолиза факторов свертывания крови, тромбоцитопении, потребления и нарушения агрегационной функции оставшихся в кровотоке тромбоцитов, повреждения и блокады микроциркуляции фибрином и продуктами фибринолиза (ПДФ), гипоксии и локального ацидоза.

III фаза характеризуется глубокой гипокоагуляцией вплоть до полной несвертываемости крови.

IV стадия характеризуется обратным развитием ДВС-синдрома.

Важной закономерностью течения ДВС-синдрома является то, что при нем истощается не только свертывающая система крови и тромбоцитарный гемостаз, но и противосвертывающие механизмы, что проявляется в быстром снижении уровня антитромбина III, а также в уменьшении содержания в плазме крови плазминогена, которое постепенно наступает вслед за первоначальной активацией фибринолизина. В силу этого собственные (бедные плазминогеном) сгустки устраняются из сосудов плохо (в основном за счет лейкоцитарного протеолиза и неферментативного фибринолиза), тогда как вводимые извне сгустки, богатые плазминогеном, быстро лизируются, так как кровь наводнена активаторами фибринолиза.

Таким образом, при ДВС-синдроме повреждены все 3 звена системы гемостаза – сосудистое, тромбоцитарное и коагуляционное, причем значение каждого из них может быть неодинаково: в одних случаях первостепенную роль играют тромбоцитарно-микроциркуляторные нарушения (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, подострый и хронический нефротический гломерулонефриты, ишемическая болезнь сердца), в других – коагуляционные сдвиги (акушерский тромбогеморрагический синдром, укусы ядовитых змей), в третьих – нарушения всех звеньев вместе.

ДВС-синдром может иметь острое, подострое, затяжное и рецидивирующее течение, последний вариант характеризуется многократным повторением фаз гипер- и гипокоагуляции. При диагностике (и лечении) необходимо учитывать преимущественный патогенетический механизм развития ДВС-синдрома, клиническую картину (кровоточивость и множественные геморрагии, сочетание их с блокадой микроциркуляции, нарушением функции почек, легких и др.) и данные комплексного лабораторного обследования.

Лечение проводится комплексно. В первую очередь быстро ликвидируются причины ДВС-синдрома, проводятся противошоковые мероприятия. Лечение проводится обычно в отделениях реанимации. Проводится дезагрегационная и гепаринотерапия, вводится свежезамороженная плазма с применением криопреципитата, концентратов антитромбина III, протеина С и концентрата тромбоцитов при тромбоцитопении.

Коронавирусная инфекция COVID-19

Подробно ознакомиться с особенностями диагностики, лечения и профилактики коронавирусной инфекции можно по документу, утвержденному Минздравом: «Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), утвержденные Министерством здравоохранения, версия 15 от 22.02.2022».

Коронавирусную инфекцию COVID-19 вызывают высоко патогенные вирусы группы SARS-CoV. Вирус SARS-CoV-2 при температуре 20–25 °C сохраняет жизнеспособность на объектах окружающей среды до 3 суток в высушенном виде, до 7 суток в жидкой среде.

Для проявления вируса характерны клинические симптомы ОРВИ: повышение температуры тела, сухой или с незначительным количеством мокроты кашель, одышка, утомляемость, заложенность в грудной клетке. Могут проявляться насморк, боль в горле, снижение обоняния и вкуса, признаки конъюнктивита.

Лабораторная диагностика

Этиологическая диагностика

Этиологическая лабораторная диагностика определяет этиологию заболевания, выявляет возбудителя, позволяет прогнозировать течение и исход заболевания и оценить эффективность терапии. Методы этиологической диагностики подразделяются на прямые и непрямые. К прямым методам относятся ПРЦ-методы. Иммунохимические методы могут применяться как в качестве прямых, так и непрямых методов.

Выявление РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Данный метод сочетает в себе применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изотермальной амплификации (LAMP).

Основной вид биоматериала – мазок из носоглотки и ротоглотки. Мазки со слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки следует собрать в одну пробирку, чтобы увеличить концентрацию вируса. При отрицательном результате на фоне признаков заболевания берут мокроту или промывные воды бронхов, полученные при фибробронхоскопии, назофаригнеальный, эндотрахеальный аспират. Дополнительным биологическим материалом могут выступать биопсийный или аутопсийный материал легких, сыворотка, цельная кровь, кал.

Выявление SARS-CoV-2 иммунохимическими методами. Данная группа методов применяется для выявления антигенов SARS-CoV-2 и антител к вирусу. К данной группе относятся методы ИФА (иммуноферментный анализ), ИХЛ (иммунохемилюминесценция), иммунохроматография. Методы отличаются большей или меньшей степенью эффективности в зависимости от стадии заболевания, состояния иммунной системы пациента, от особенностей применяемых приборов.

Для диагностики COVID-19 рекомендуется проводить раздельное тестирование на антитела класса IgM/IgA и IgG, мониторинт появления антител в динамике через 5–7 дней (в неясных случаях).

Иммунохроматография позволяет осуществлять экспресс-тесты, результаты которых готовы через 10–30 мин. Специфичность и чувствительность экспресс-тестов может быть ниже, чем тестов на основе МАНК.

Выявление коронавирусной инфекции непрямыми методами. К непрямым методам относится выявление иммуноглобулинов классов А, M, G (IgА, IgM и IgG) к SARS-CoV-2 (в том числе к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S).

Таблица 59

Интерпретация результатов исследования иммунохимическими методами и методами амплификации нуклеиновых кислот*

*Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), утвержденные Министерством здравоохранения, версия 15 от 22.02.2022.

Общая лабораторная диагностика

В зависимости от степени тяжести заболевания определяются объем, сроки и частота лабораторных исследований. При легком течении заболевания дополнительные лабораторные исследования не требуются. При тяжелом течении в случае госпитализации выполняется ряд исследований.

1. Общий анализ крови с определением уровня эритроцитов, гемоглобина, гематокрита, лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарной формулы.

2. Биохимический анализ крови на мочевину, креатинин, электролиты, глюкозу, аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу, билирубин, лактат, альбумин, лактатдегидрогеназа. Дополнительно могут потребоваться показания тропонина (маркер повреждения миокарда), ферритина (белок острой воспалительной фазы). Отклонения могут свидетельствовать на дисфункцию органов, декомпенсацию сопутствующих заболеваний, развитие осложнений.

3. С-реактивный белок (СРБ). Основной маркер активности процесса в легких.

4. Гормональное исследование на прокальцитонин, мозговой натрий-уретический пептид. Повышение прокальцитонина – показатель появления бактериальной инфекции, свидетельствует о тяжести течения заболевания.

5. Коагулограмма: АЧТВ, протромбиновое время, протромбиновое отношение или процент протромбина по Квинку, фибриноген, D-димер количественным методом.

Гематологические маркеры при COVID-19. С целью выявить группу риска по COVID-19 применяются гематологические маркеры, такие как количество лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, отношение количества нейтрофилов к лейкоцитам, число тромбоцитов и эозинофилов.

Наличием лимфопении характеризуется 80 % больных коронавирусной инфекцией в тяжелой форме, 25 % пациентов с заболеванием средней тяжести.

Особенности картины крови при тяжелом течении COVID-19:

– снижение лимфоцитов;

– повышение лейкоцитов;

– большое значение отношения нейтрофилов к лимфоцитам;

– снижение числа моноцитов, эозинофилов, базофилов.

Свидетельством тяжести заболевания считается пониженное содержание Т-хелперов и Т-супрессоров. Исследования показали, что чем ниже их содержание в крови, тем более тяжело протекает болезнь. При тяжелом течении COVID-19 возможно снижение уровня регуляторных Т-клеток и количества лейкоцитов в крови. У 66 % пациентов обнаружено снижение уровня эозинофилов, больше половины пациентов имели эозинопению. Снижение эозинофилов может расцениваться как показатель неблагоприятного прогноза, повышение – как признак улучшения состояния.

Отношение нейтрофилов к лимфоцитам может использоваться в качестве маркера воспаления, позволяющего прогнозировать летальный исход при наличии сердечно-сосудистых патологий. Также данный показатель задействуется при определении сепсиса. Повышение значения отношения нейтрофилов к лимфоцитам может расцениваться как неблагоприятный фактор развития COVID-19.

Важный признак – содержание тромбоцитов. У зараженных коронавирусной инфекцией отмечалось низкое количество тромбоцитов. Прогнозы на выздоровление ухудшаются при резком снижении тромбоцитов.

Повышенная/пониженная активность клеточных ферментов крови. Выявлен повышенный уровень трансаминаз. Повышение уровней аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) связано с тяжелым течением заболевания и ухудшением прогнозов. Уровень креатинфосфокиназы (КФК) повышается при развитии воспалительной реакции в мышечной ткани. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) повышается при остром повреждении внутренних органов и систем: сердца, эритроцитов, скелетных мышц, печени, почек, легких.

Изменение уровня электролитов Na, K, Ca в крови. При стационарном лечении у пациентов отмечается снижение данных элементов в крови. У ряда пациентов с тяжелой формой заболевания выявлена гипокалиемия.

Изменения белков. Более чем у половины пациентов отмечается повышение С-реактивного белка с первых дней заболевания. С целью ранней диагностики присоединения бактериальной инфекции применяется определение прокальцитонина (ПКТ). Повышенный уровень ПКТ свидетельствует о присоединении бактериальной флоры и необходимости приема антибактериальных препаратов.

Маркером цитокинового шторма считается интерлейкин-6. Избыточное образование интерлейкина приводит к усилению проницаемости сосудов, повреждению тканей и пр.

Ферритин представляет собой основной медиатор иммунной дисрегуляции при тяжелом течении коронавирусной инфекции. Повышение уровня ферритина характерно для тяжелого течения заболевания.

D-димеры – маркер процессов фибринолиза и тромбообразования. Повышение уровня выше референтного значения, составляющего до 500 нг/мл, характеризуется тромбозами, тромбоэмболиями, обширными гематомами и пр.

Оспа обезьян

Оспа обезьян представляет собой редкое вирусное заболевание зоонозной природы, т. е. передающееся от животных человеку. Вирус оспы обезьян относится к роду ортопоксвирусов, как и «черная» оспа, но характеризуется более низкой смертностью. Риск тяжелого течения заболевания возрастает у детей, беременных женщин, лиц с угнетенной иммунной системой.

Оспа обезьян передается человеку от мелких грызунов и приматов посредством прямого контакта и укусов животных. От человека к человеку вирус передается при тесном контакте, преимущественно воздушно-капельным путем, через биологические жидкости и контакт с зараженным материалом в случае нарушения целостности кожного покрова.

Инкубационный период заболевания – 6–16 дней, реже – до 21 дня. Инвазивный период 0–5 дней характеризуется лихорадочным состоянием, повышением температуры более 38,5 °C, сильной головной болью, болью в спине и пояснице, миалгией, сильной астенией. В ряде случаев у пациентов выявляется тяжелая лимфаденопатия.

Появление высыпаний на коже отмечается через 1–3 дня после лихорадочной фазы. Высыпания появляются сначала на лице, ладонях и ступнях, после чего распространяются на другие части тела. Отмечается наличие гриппоподобных симптомов с поражением органов дыхания.

Диагностика осуществляется путем бакпосева, метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), электронной микроскопии, иммуногистохимии.

В специализированных лабораториях возможно выявление вируса в образцах тканей больного вирусологическим методом. Метод электронной микроскопии позволяет получить четкое изображение, но визуально возбудители оспы обезьян не отличаются от вирусов герпеса. ПЦР-детекция возможна с отпечатков элементов сыпи. Для успешного проведения серологической диагностики (ИФА) необходима своевременная доставка образцов крови в лабораторию при низкой температуре.

Характерные показания лабораторных исследований:

1. Общеклинический анализ крови: лейкоцитоз, нейтрофилез, сдвиг лейкоцитарной формулы влево, ускорение СОЭ.

2. Биохимический анализ: умеренное повышение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), C-реактивного белка (СРБ), гипоальбуминемия, гипопротеинемия.

3. Общий анализ мочи: незначительная протеинурия, увеличение плотности мочевого осадка.

Глава 17

Основные показатели лабораторных анализов и диагностирование заболеваний

Лабораторные исследования необходимы для подтверждения либо опровержения какого-то диагноза и помогают в дифференциальной диагностике при постановке диагноза. Наиболее широкое распространение получили исследования крови, мочи, кала. В ряде случаев задействуются анализы прочих жидкостей организма, таких как спинномозговая жидкость, лимфа, слизь из верхних дыхательных путей, а также выделения из половых органов.

Среди основных видов анализов, которые используются в диагностике наиболее распространенных заболеваний, можно выделить общие анализы крови и мочи, биохимический анализ крови, анализ кала.

Исследование крови

Исследование крови позволяет получить информацию о наличии в организме заболевания, инфекционного либо наследственного, а также острого или хронического.

Ряд показателей общего анализа крови приводит к необходимости проведения дополнительных анализов, требуемых для дифференциальной диагностики.

Специфические исследования крови помогают уйти от общего подтверждения воспалительного или инфекционного процесса к локализации очага воспаления (инфекции) или структурных изменений в органах и системах. Исследование крови является доминантным для постановки диагноза.

Общий анализ

Общий, или клинический, анализ крови показывает количество и скорость оседания эритроцитов, содержание гемоглобина, количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу и пр. В зависимости от повышенного или пониженного содержания того или иного элемента крови возможно предположить наличие отдельных заболеваний.

Эритроциты. Повышенное содержание: лейкоз, хронические болезни легких, врожденные пороки сердца, сердечная недостаточность. Значительное повышение количества эритроцитов могут быть признаком эритремии (заболевания крови). Повышение количества эритроцитов также характерно для острых отравлений, ацидозов, потерь жидкости. Пониженное содержание: анемия.

Для диагностирования заболевания может быть назначен биохимический анализ крови. В частности, при хронической сердечной недостаточности обычно выявляется снижение уровня калия, натрия и магния в крови, повышение уровня билирубина, аминотрансфераз, холестерина.

Свидетельством наличия анемии считается отличное от нормы значение цветового показателя крови, представляющего собой степень насыщения эритроцитов гемоглобином. Анемии могут быть гипохромными (цветовой показатель менее 0,85) или гиперхромными (цветовой показатель превышает 1,15). Но встречаются и нормохромные анемии, при которых цветовой показатель находится в пределах нормы.

Повышение количества эритроцитов и понижение количества красных кровяных телец может быть признаком наличия онкологических заболеваний, в частности, злокачественных опухолей почки, печени, поликистоза печени, миомы матки, опухоли надпочечников, аденомы, гемангиомы. При подозрении заболеваний данного спектра назначают дополнительные виды диагностики: анализ крови на онкомаркеры, биопсию, компьютерную или магнитно-резонансную томографию.

Повышенный уровень эритроцитов в крови характерен для ряда заболеваний почек, таких как стеноз почечных артерий, гидронефроз, киста почки, отторжение почечного трансплантата. При подозрении на данную группу заболеваний назначаются дополнительные методы исследования. Клинический анализ мочи способствует выявлению в моче белка, глюкозы, бактерий, форменных элементов крови (лейкоцитов, эритроцитов) и прочих включений, которых не должно быть в моче в состоянии нормы. Свидетельство повреждения почечной ткани, а также поражения мочевого пузыря или мочеиспускательного канала – выявление значительного количества эритроцитов в моче. Также при подозрении на заболевания почек могут быть назначены УЗИ почек, рентгенологическое исследование почек и мочевыводящих путей, почечная артериография, компьютерная томография почек.

Повышение эритроцитов у женщин может свидетельствовать о ряде заболеваний. Андробластома и арренобластома (маскулинизирующие опухоли яичников), симптомы: аменорея, уменьшение размера молочных желез, ноющая боль в животе. Аденома гипофиза: повышение уровня эритроцитов может сопровождаться снижением остроты зрения, головными болями, локализованными в лобной и височной областях. Полицитемия, эритремия (болезнь Вакеза, или опухоль костного мозга) – повышение уровня эритроцитов сопровождается повышением уровней лейкоцитов и тромбоцитов.

Ретикулоциты. Превышение нормальных значений характерно для анемий и малярии. Снижение или отсутствие ретикулоцитов – неблагоприятный признак, свидетельствующий о неспособности костного мозга производить эритроциты.

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Повышение СОЭ выступает одним из показателей наличия воспалительного процесса в острой или хронической форме (остеомиелит, туберкулез, пневмония, сифилис), отравления, травм, переломов костей, инфаркта миокарда, анемии, заболеваний почек, рака. Снижение СОЭ характерно для голодания, снижения мышечной массы, приема кортикостероидов.

СОЭ не относится к специфическим показателям, поскольку не указывает на конкретную патологию, а является показателем наличия патологического процесса. При ряде опухолевых заболеваний, таких как лейкоз, рак груди, яичников, шейки матки СОЭ может быть повышена до 60–75 мм/ч. Аналогичные значения СОЭ выявляются при ревматических заболеваниях (острая ревматическая лихорадка, системная красная волчанка, ревматоидный артрит и др.). При повышении скорости оседания эритроцитов более 100 мм/ч возможно распространение метастазов по организму.

При повышенном СОЭ может быть назначено комплексное обследование.

Гемоглобин. Низкий гемоглобин характерен для анемии. Снижение уровня гемоглобина в крови может проявиться в результате значительной кровопотери, нехватки железа, при заболеваниях крови и различных хронических заболеваниях. Повышенный гемоглобин характерен для различных заболеваний крови, особенно в сочетании с увеличением числа эритроцитов. Гемоглобин повышается при врожденных пороках сердца, легочно-сердечной недостаточности, в результате значительной физической нагрузки.

Лейкоциты. Повышенное количество лейкоцитов: вирусные, грибковые, бактериальные инфекции (ангина, сепсис, воспаление легких, менингит, абсцесс, аппендицит, перитонит, полиартрит, пиелонефрит), подагра, инфаркт миокарда, легких, почек, селезенки, острые и хронические анемии, злокачественные опухоли. Пониженное количество лейкоцитов: вирусные и бактериальные инфекции (брюшной тиф, грипп, вирусный гепатит, сепсис, корь, краснуха, малярия, эпидемический паротит, СПИД), ревматоидный артрит, лучевая болезнь, почечная недостаточность, заболевания костного мозга, анафилактический шок, отдельные формы лейкоза, истощение, анемия. Одновременное повышение уровня эритроцитов и лейкоцитов: стресс (незначительное повышение показателей), полицитемия – опухоль костного мозга в хроническом течении, обезвоживание организма в сочетании с бактериальной инфекцией.

Тромбоциты. Как увеличение, так и снижение количества тромбоцитов может быть показателем различных заболеваний.

Увеличение количества тромбоцитов:

– воспалительные процессы (туберкулез, острый ревматизм, язвенный колит);

– острая кровопотеря;

– гемолитическая анемия;

– ряд редких заболеваний.

Снижение количества тромбоцитов:

– наследственные заболевания;

– тяжелая железодефицитная анемия;

– ряд вирусных и бактериальных инфекций;

– заболевания печени;

– заболевания щитовидной железы;

– системная красная волчанка.

Снижение количества тромбоцитов менее чем до 180 тыс. на 1 мкл – опасный показатель, любая травма может привести к значительной кровопотере из-за медленной остановки крови.

Повышение тромбоцитов и эритроцитов чаще всего отмечается при стрессе. Также подобная картина характерна для полицитемии – доброкачественной опухоли костного мозга.

Биохимический анализ

Тест на биохимию дает информацию по содержанию в крови углеводов, ферментов (АЛТ, АСТ, щелочная фосфатаза), пигментных веществ (билирубин), белков, липидов, азотистых соединений, сывороточного железа, электролитов, С-реактивного белка. С помощью данного анализа выявляются наличие и активность воспалительных процессов, продуцирование гормонов и ферментов, функционирование внутренних органов, наличие предрасположенности к ряду заболеваний (сахарному диабету, атеросклерозу, стенокардии) и пр. Биохимический анализ крови показан при наличии заболеваний женской репродуктивной системы, желудочно-кишечного тракта и печени, эндокринной, сердечно-сосудистой системы, при риске онкологии, патологиях опорно-двигательного аппарата.

Биохимический анализ может быть проведен в расширенном или минимальном спектрах показателей, а также с целью оценки работы определенного органа или системы организма.

Общий белок и фракции белка. Пониженное содержание белка: паренхиматозные гепатиты, заболевания желудочно-кишечного тракта (энтероколиты, панкреатиты), опухоли различной локализации, заболевания печени (гепатиты, циррозы, опухоли, метастазы в печень), отравления, сахарный диабет, асцит, плеврит, пониженное содержание белка в пище, воспалительные процессы, хронические кровотечения, потери белка с мочой, интоксикация, лихорадка, усиленный распад белка. При понижении концентрации белка ниже 50 г/л возможно появление отеков тканей. Повышенное содержание белка: редкое явление, характерное для ряда инфекционных заболеваний, макроглобулинемии Вальденстрема, миеломной болезни, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гепатита, лимфогрануломатоза, цирроза. Снижение белка может быть выявлено в связи с физиологическими причинами: потерей воды при рвоте, поносе, кишечной непроходимости, при ожогах, несахарном диабете, нефрите. Повышенный альбумин: обезвоживание, обширные ожоги, прием высоких доз витамина А. Повышение альбумина не считается важным диагностическим признаком. Сниженный альбумин: нефриты, заболевания печени (острая атрофия печени, токсический гепатит, цирроз), амилоидоз, травмы, ожоги, кровотечения, застойная сердечная недостаточность, заболевания ЖКТ, опухоли, сепсис. Повышение концентрации α1-антитрипсина (ингибитора сериновых протеиназ): воспалительные процессы, онкологические заболевания. Понижение концентрации α1-антитрипсина: обструктивные заболевания легких, прогрессирующий цирроз в молодом возрасте. Повышение α1-кислого гликопротеина в 3–4 раза наблюдается при острых и хронических воспалительных процессах, а также после операций, данный параметр также применяется в наблюдении за динамикой развития воспалительного процесса и при контроле онкологии (увеличение концентрации белка – показатель рецидива опухоли). Повышение концентрации α2-макроглобулина: цирроз печени, болезни почек, сахарный диабет. Снижение концентрации α2-макроглобулина: острые воспалительные процессы, ревматизм, полиартрит, онкология. Повышение концентрации гаптоглобина: острые воспалительные процессы. Снижение концентрации гаптоглобина: гемолитические анемии. Исчезновение гаптоглобина возможно при переливании несовместимой крови. Повышение концентрации трансферрина (сидерофилина) проявляется редко, преимущественно при разрушении эритроцитов (малярия, гемолитические анемии и пр.). Снижение насыщения трансферрина железом ниже 1/3 характерно при дефиците железа, риске развития железодефицитной анемии. Повышение количества иммуноглобулинов: вирусные и бактериальные инфекции, воспалительные процессы и разрушение тканей. Снижение количества иммуноглобулинов: физиологическое (дети 3–6 лет), врожденное (наследственные иммунодефициты), вторичное (аллергии, хронические воспалительные процессы, злокачественные опухоли).

Глюкоза. Повышение концентрации выше 6 ммоль/л: гипергликемия (физиологическая или патологическая). Физиологическая гипергликемия возникает после приема пищи или при стрессе. Патологическая гипергликемия характерна для ряда заболеваний: нейроэндокринные расстройства (ожирение, поликистоз яичников, болезнь Иценко-Кушинга и пр.), сахарный диабет, заболевания гипофиза, опухоли надпочечников, усиленная функция щитовидной железы, цирроз печени, инфекционный гепатит. Снижение концентрации ниже 3,3 ммоль/л: гипогликемия (физиологическая, патологическая). Физиологическая развивается при несбалансированной диете, менструации, сильных физических нагрузках, обезвоживании и пр. Патологическая гипогликемия: алкоголизм, почечная, печеночная, сердечная недостаточность, сепсис, истощение, гормональные нарушения (истощение кортизола, глюкагона, адреналина), передозировка сахаропонижающих препаратов, опухоль поджелудочной железы, врожденные аномалии (гиперсекреция инсулина, аутоиммунная гипогликемия и пр.).

Билирубин. Повышение концентрации: желтухи различного происхождения (заболевания печени и желчевыводящих путей, гемолитические анемии). Повышение концентрации до 23–27 мкмоль/л: скрытая желтуха, выше 27 мкмоль/л: проявление характерной желтой окраски кожи, склер глаз и слизистых. Понижение концентрации: прием витамина С, теофиллина, фенобарбитала.

Мочевина. Снижение концентрации: низкобелковая диета, повышенный распад белка, высокие потребности в белке (беременность, кормление грудью), увеличение жидкости в организме, наследственные заболевания (целиакия), тяжелые поражения печени (некроз, последняя стадия цирроза, отравление (солями тяжелых металлов, мышьяком, фосфором). Повышение концентрации: почечная недостаточность (хроническая и острая формы), гломерулонефрит, пиелонефрит, анурия, опухоли и камни в мочеточниках, сахарный диабет, перитонит, желудочно-кишечные кровотечения, кишечная непроходимость, сердечная недостаточность, дизентерия, инфаркт миокарда, гепатиты, циррозы. Наиболее высокая концентрация мочевины в крови характерна для патологий почек, потому данный анализ применяется преимущественно в качестве диагностического теста при патологии почек.

Креатинин. Повышение концентрации: патологические процессы в почках и мышечной системе, острые и хронические нефриты, нефрозы, нефросклероз, тиреотоксикоз, повреждения мышц, прием ряда лекарственных препаратов (ибупрофен, резерпин, тетрациклин и пр.).

Мочевая кислота. Повышение концентрации: подагра, заболевания крови (лейкоз, лимфома, В_12-дефицитная анемия), гепатиты, заболевания желчевыводящих путей, инфекционные заболевания (туберкулез, пневмония), сахарный диабет, экзема, псориаз, заболевания почек, алкоголизм. Снижение концентрации: наследственные заболевания (болезнь Вильсона-Коновалова, анемия Фанкони).

Холестерин. Повышение концентрации: диабет, ожирение, артериальная гипертензия, инфаркт миокарда, ишемия, алкоголизм, желчекаменная болезнь. Понижение концентрации: заболевания печени, гипертиреоз, заболевания ЖКТ (характеризующиеся затруднением всасываемости липидов), обструктивное заболевание легких в хронической форме, ревматоидные артриты.

Калий. Повышение уровня: острая и хроническая почечная недостаточность, тяжелые заболевания почек.

Исследование мочи

Анализ мочи представляет собой одно из стандартных исследований и позволяет выявить наличие воспалительных процессов как в мочевыделительной системе, так и в организме в целом. Именно с мочой выводится большинство токсических веществ крови. Путем исследования концентрации элементов, содержащихся в моче, возможно диагностировать состояние почек, сердечно-сосудистой и иммунной системы.

Общий анализ

Амилаза (диастаза). В норме 1–17 Ед/ч. Повышенный уровень: диагностика панкреатита. Значительное повышение (более 8000 Ед/ч): острый панкреатит, обострение хронического панкреатита.

Бактерии. Наличие бактерий в моче: уретрит, цистит, простатит, пиелонефрит, вульвовагинит, несоблюдение правил гигиены. Наличие бактерий и значительного количества лейкоцитов в моче: инфекция мочевыводящих путей.

Белок. Наличие белка в моче: повреждения почек, воспалительные процессы в мочеточниках, уретре, мочевом пузыре, аллергические реакции, лейкозы, эпилепсия, сердечная недостаточность.

Билирубин. Наличие билирубина в моче: гепатит, цирроз печени, печеночная недостаточность, желчекаменная болезнь, болезнь Виллебранда, разрушение эритроцитов крови (малярия, серповидноклеточная анемия и пр.).

Гемоглобин. Наличие гемоглобина в моче: малярия, гемолитическая болезнь, обширный инфаркт миокарда, отравление (фенолом, грибами, сульфаниламидными препаратами).

Глюкоза. Наличие глюкозы в моче свыше 0,8 ммоль/л: сахарный диабет (уровень глюкозы до 10,0 ммоль/л, необходимо обращение к эндокринологу), нефротический синдром, острый панкреатит, почечный диабет, синдром Кушинга.

Грибы. Наличие грибков в моче: грибковые поражения мочевыводящих путей (цистит, уретрит, простатит), грибковые поражения наружных половых органов (вульвовагинит, баланопостит), иммунодефицитные состояния, продолжительный прием антибиотиков.

Кетоновые тела (ацетон, ацетоуксусная кислота, оксимасляная кислота). Наличие кетоновых тел в моче: нарушение обменных процессов, сахарный диабет, острый панкреатит, алкогольная интоксикация, последствие травм ЦНС, тиреотоксикоз, болезнь Иценко-Кушинга.

Кислотность. Понижение кислотности: нарушение кислотно-основного баланса крови (дыхательный или метаболический алкалоз), хроническая почечная недостаточность, почечный канальцевый ацидоз, повышенный уровень калия крови, повышенный уровень гормонов паращитовидной железы, уреаплазмоз, рак почек, мочевого пузыря. Повышение кислотности: снижение уровня калия крови, обезвоживание (кроме рвоты), голодание, сахарный диабет, повышенная температура.

Лейкоциты. В норме наличие в моче не более 3-х в поле зрения. Повышение уровня: заболевания почек (пиелонефрит в хронической или острой форме, туберкулез почек, мочекаменная болезнь, рак почки), заболевания мочеточников (инфекционное воспаление, мочекаменная болезнь), поражение мочевого пузыря (рак мочевого пузыря, цистит), поражение простаты (простатит, рак простаты), поражения уретры (мочекаменная болезнь, уретрит), инфекции наружных половых органов. При выявлении повышенного содержания лейкоцитов в крови уролог может предложить дополнительные исследования, такие как общий анализ крови, УЗИ почек, анализ мочи по Нечипоренко, трехстаканная проба.

Прозрачность. Мутная моча: воспалительные заболевания почек.

Соли. Наличие солей в моче: обезвоживание организма, подагра, мочекислый диатез, хроническая почечная недостаточность, острый и хронический нефрит.

Удельная плотность. Повышение плотности более 1030 г/л: сахарный диабет, гломерулонефрит, нефротический синдром, потеря жидкости, токсикоз беременных, пиелонефрит, цистит. Снижение плотности менее 1010 г/л: несахарный диабет, почечная недостаточность. При изменении плотности мочи для постановки диагноза может быть дополнительно назначена проба Зимницкого. Данный анализ поможет выставить точный диагноз.

Цвет. Темный цвет (крепкого черного чая): заболевания печени (гепатит, печеночная недостаточность, цирроз), желчекаменная болезнь, разрушение эритроцитов. Темно-желтый: обезвоживание организма, сердечная недостаточность. Бледный, бесцветный: сахарный диабет, несахарный диабет, патология почек. Красный: наличие крови в моче (мочекаменная болезнь, рак мочевого пузыря, инфаркт почки, пиелонефрит). Красно-коричневый мутный: острый гломерулонефрит, камни в почках, инфаркт почки, туберкулез почек и мочевыводящих путей. Красно-коричневый: прием метронидазола, сульфаниламидных препаратов. Черный: болезнь Макиафава Микелли, алкаптонурия.

Цилиндры. Наличие зернистых цилиндров (эритроциты и клетки почечных канальцев): гломерулонефрит, пиелонефрит, отравление свинцом, вирусные инфекции. Наличие гиалиновых цилиндров (клетки почечных канальцев, белок): пиелонефрит, гломерулонефрит в хронической или острой форме, гипертоническая болезнь. Наличие восковидных цилиндров (гиалиновые или зернистые цилиндры, длительно находившиеся в просвете канальца): хроническая почечная недостаточность, нефротический синдром, амилоидоз почек. Наличие эритроцитарных цилиндров: острый гломерулонефрит, инфаркт почки, тромбоз почечных вен, злокачественная гипертензия. Наличие эпителиальных цилиндров (образованных при отторжении эпителия почечного канальца): острый канальцевый некроз, вирусная инфекция в острой форме.

Эпителий. В норме допустимо наличие до 10 клеток эпителия в поле зрения. Наличие эпителия почек: поражение почек (нефроз, острый нефрит). Наличие переходного эпителия мочеточников и мочевого пузыря: воспаление мочеточников, цистит.

Эритроциты. В норме наличие в моче 1–3 в поле зрения. Повышение уровня: острый гломерулонефрит, нефротический синдром, инфаркт почки, мочекаменная болезнь, рак почки, мочевого пузыря, простаты.

Исследование кала

Исследование кала позволяет выявить и диагностировать заболевания пищеварительной системы, определить особенности функционирования печени, желудка, поджелудочной железы, тонкого и толстого кишечника.

Общий анализ

Билирубин. Наличие в кале: дисбактериоз кишечника, повышенная моторика кишечника.

Жирные кислоты. Наличие в кале: панкреатиты, нарушения выработки желчи и поступления желчи в тонкую кишку, болезни печени и желчных путей, бродильная диспепсия.

Запах. Зловонный: гиперсекреция толстого кишечника, панкреатит, холецистит с холедохолитиазом. Гнилостный: гнилостная диспепсия, нарушение переваривания в желудке, колит, моторные нарушения кишечника. Кислый: бродильная диспепсия.

Консистенция. Высокая плотность: запоры, стеноз толстой кишки, спазм толстой кишки. Кашицеобразный кал: усиленная перистальтика кишечника, усиленная секреция в кишечнике, бродильная диспепсия, колиты с диареей. Мазевидный кал: нарушение секреции поджелудочной железы, желчекаменная болезнь, холецистит. Жидкий кал: диспепсия, нарушение всасываемости или избыточная секреция жидкости в толстом кишечнике. Пенистый: бродильная диспепсия.

Крахмал. Наличие в кале: панкреатиты, бродильная диспепсия, ацидный или гипоацидный гастрит, ускоренная эвакуация содержимого кишечника.

Кровь. Наличие в кале: геморрой, трещины заднего прохода, проктит, язвенный колит, инфекции ЖКТ, полипы прямой кишки, язва желудка или 12-перстной кишки, расширение вен пищевода (при циррозе), опухоли ЖКТ.

Лейкоциты. Наличие в кале: инфекции ЖКТ, трещины прямой кишки, колит, энтерит, энтероколит, язвенный колит.

Мышечные волокна. Повышенное количество: гипоацидный гастрит, анацидный гастрит, ахилия, диспепсия, панкреатит в острой или хронической форме.

Растворимый белок. Наличие в кале: воспалительные процессы ЖКТ (колиты, гастриты, панкреатиты, энтериты), язвенный колит, кровотечения из ЖКТ, гнилостная диспепсия, избыточная секреция толстого кишечника.

Слизь. Допустима в незначительных количествах. Повышенное количество: кишечная инфекция, синдром раздраженного кишечника, геморрой, полипы в кишечнике, целиакия, мусковисцидоз, дивертикулит. Слизь без кала: нехватка жидкости в организме, кишечные паразиты, длительные запоры, непроходимость кишечника.

Стеркобилин. Повышенное количество: гемолитическая анемия, усиленное отделение желчи. Пониженное количество: обтурационная желтуха, желчекаменная болезнь, острый или хронический панкреатит, острый вирусный гепатит, хронический гепатит.

Триглицериды (нейтральные жиры). Наличие в кале: панкреатиты, нарушения выработки желчи и поступления желчи в тонкую кишку, нарушение всасывания в кишечнике.

Цвет. Черный: употребление смородины, черники, препаратов висмута, кровотечения из верхних отделов ЖКТ. Темно-коричневый: нарушение переваривания в желудке, колиты, запоры, гнилостные диспепсии. Светло-коричневый: усиленная перистальтика кишечника. Красноватый: язвенные колиты. Зеленый: повышенная перистальтика кишечника. Зеленовато-черный: прием препаратов железа. Светло-желтый: панкреатит, диспепсии. Серовато-белый: холедохолитиаз, острый панкреатит, гепатит.

Приложение

Полезная информация

Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), утвержденные Министерством здравоохранения, версия 15 от 22.02.2022.

Номенклатурная классификация медицинских изделий по видам, утверждена Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 6 июня 2012 г. № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий».

Приказ МЗ РФ № 64 от 21 февраля 2000 г. «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований».

Приказ МЗ РФ от 18 мая 2021 года № 464н «Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований».

Виды и структуры лабораторий

Важное место среди диагностических служб занимает клиническая лабораторная диагностика, поставляющая практическому врачу около 80 % объема объективной диагностической информации, необходимой для своевременного принятия правильного клинического решения и контроля эффективности проводимого лечения.

Характерным для современной медицины является возрастание роли лабораторной диагностики в практической работе врача.

Клинико-диагностические лаборатории подразделяются на 2 большие группы:

1) лаборатории общего типа;

2) специализированные лаборатории.

Структура лабораторной службы в основном соответствует потребностям учреждений здравоохранения в лабораторной диагностике и мониторинге за терапией больных, обеспечивая повседневные запросы лечащих врачей в наиболее распространенных исследованиях (КДЛ общего типа), экстренном их выполнении в ургентной практике (экспресс-лаборатории), а также серийное производство наиболее сложных исследований.

Этим занимаются специализированные лаборатории (гематологические, цитологические, биохимические, иммунологические).

Для повышения эффективности диагностического процесса в лабораторной практике широко используются готовые формы наборов реактивов и биоматериалов, а также автоматизированные средства анализа и компьютерные системы управления, включая обработку результатов исследований и связь лаборатории с клиническими подразделениями.

Осуществляются предусмотренные законодательными и нормативными актами меры по лицензированию лечебно-профилактических учреждений и их клинико-диагностических лабораторий и сертификации специалистов.

В последние годы началась подготовка специалистов новых квалификаций со средним профессиональным образованием – медицинских лабораторных техников и медицинских технологов.

Проблемы современной клинической диагностики

Вместе с тем в службе клинической лабораторной диагностики имеется и требует безотлагательного решения целый комплекс проблем, связанных с дальнейшим развитием сети лабораторий, укреплением их материально-технической базы, рациональным использованием и совершенствованием подготовки кадров, организационно-методическим обеспечением их деятельности.

В настоящее время клиническая лабораторная диагностика характеризуется следующими чертами:

– проникновением в характер и механизмы патологического процесса на основе знаний в различных областях медицинской науки;

– применением различных методик для выявления расстройств, возникающих при появлении заболеваний;

– необходимостью в достоверной лабораторной информации для диагностики болезней и для применения ее в период лечения.

Клиническая лабораторная диагностика дает возможность решать сложные проблемы в диагностике и лечении заболеваний, особенно в области иммунологии, диагностики инфекционных заболеваний, токсикологии, наркомании и других областей медицины.

К лабораторным методам исследования, применяемым в практике, относятся:

– общеклинические исследования (мочи, кала, желудочного и дуоденального содержимого, ликвора, экссудатов, транссудатов, других биологических жидкостей);

– гематологические исследования;

– цитологические исследования;

– биохимические исследования;

– иммунологические методы исследования;

– микробиологические исследования;

– исследование гомеостаза.

Все эти методы в настоящее время применяются с использованием дорогостоящего современного оборудования и диагностических тест-систем.

Структура клинико-диагностической лаборатории (КДЛ)

Клинико-диагностическая лаборатория общего типа является диагностическим подразделением лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ) и создается на правах отделения. Централизованные КДЛ создаются по указанию соответствующих территориальных органов управления здравоохранением для выполнения как различных видов исследований, так и одного их вида: биохимических, иммунологических, цитологических, микробиологических и других исследований (специализированные лаборатории).

Организационная структура и порядок финансирования централизованных КДЛ устанавливаются органом управления здравоохранением с учетом выполняемых ими задач и в соответствии с договором об участии лабораторий в осуществлении территориальных медицинских программ.

Также КДЛ независимо от подчиненности и формы собственности должна иметь сертификат на избранный вид деятельности.

Руководство лабораторией осуществляет заведующий, назначаемый и освобождаемый от должности руководителем учреждения здравоохранения в установленном порядке.

Деятельность лаборатории регламентируется соответствующими нормативными документами. Лаборатория размещается в специально оборудованных помещениях, полностью соответствующих требованиям правил по устройству, эксплуатации и технике безопасности.

Основные задачи КДЛ

1. Проведение клинических лабораторных исследований в соответствии с профилем лечебного учреждения (общеклинических, гематологических, иммунологических, цитологических, биохимических, микробиологических и других, имеющих высокую аналитическую и диагностическую надежность) в объеме согласно заявленной номенклатуре исследований при аккредитации КДЛ в соответствии с лицензией лечебного учреждения. Объем выполняемых исследований не должен быть ниже минимального объема, рекомендуемого для лечебного учреждения данной мощности.

2. Внедрение прогрессивных форм работы, новых методов исследований, имеющих высокую аналитическую точность и диагностическую надежность.

3. Повышение качества лабораторных исследований путем систематического проведения внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований и участия в программе Федеральной системы внешней оценки качества.

4. Оказание консультативной помощи врачам лечебных отделений в выборе наиболее диагностически информативных лабораторных тестов и трактовке данных лабораторного обследования больных.

5. Обеспечение клинического персонала, занимающегося сбором биологического материала, детальными инструкциями о правилах взятия, хранения и транспортировки биоматериала, обеспечивающими стабильность образцов и надежность результатов. Ответственность за точное соблюдение этих правил клиническим персоналом несут руководители клинических подразделений.

6. Повышение квалификации персонала лаборатории.

7. Проведение мероприятий по охране труда персонала, соблюдение техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемиологического режима в клинико-диагностической лаборатории.

8. Ведение учетно-отчетной документации в соответствии с утвержденными формами.

В соответствии с указанными задачами КДЛ осуществляет:

1) освоение и внедрение в практику методов клинической лабораторной диагностики, соответствующих профилю и уровню лечебно-профилактического учреждения;

2) проведение клинических лабораторных исследований и выдачу по их результатам заключений.

КДЛ имеет право:

1) проводить на договорной основе лабораторные исследования для других ЛПУ;

2) участвовать в других системах внешней оценки качества клинических лабораторных исследований;

3) принимать участие в научных разработках, проводимых с использованием полученных в лаборатории данных (результаты исследований, полученные в лаборатории, являются ее интеллектуальной собственностью и не могут быть использованы без ее согласия).

Международная система единиц (СИ)

В соответствии с Государственным стандартом обязательным является применение Международной системы единиц (СИ). Единицей объема в медицине является литр (л, 1 л = 0,001 м^3). Единицей количества вещества является моль – количество вещества в граммах, число которых равно молекулярной массе этого вещества. Большинство веществ в крови выражается в миллимолях на литр (ммоль/л). Для пересчета старых величин, выраженных в миллиграмм-процентах в единицы СИ, применяется следующая формула:

мг% × 10 ммоль/л = молекулярная масса вещества.

Единица эквивалент на литр заменяется на моль/л путем деления концентрации в эквивалентах на литр на валентность элемента.

Таблица пересчета единиц, подлежащих замене, применяемых в лабораторной диагностике (Л. А. Данилова)

Расшифровка обозначений в таблице:

Мr – относительная молекулярная масса;

Коэфициент пересчета единиц, подлежащих замене, превращает их в рекомендуемые.

Коэффициенты выбраны с таким расчетом, чтобы числовые значения находились в пределах 0,1…….1000.

Приказ МЗ РФ № 64 от 21 февраля 2000 г. «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований»

Список сокращений

РА – реакция агглютинации

ЛА – латекс-агглютинация

КОА – коагглютинация

РСК – реакция связывания комплемента

РНГА – реакция непрямой гемагглютинации

РАГА – реакция аггрегатгемагглютинации

РНаг – реакция нейтрализации антигена

РНат – реакция нейтрализации антител

ВИЭМ – встречный иммуноэлектрофорез

РИА – радиоиммунный анализ

РП – реакция преципитации

РПГА – реакция пассивной гемагглютинации

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

ИФА – иммуноферментный анализ

IgA – иммуноглобулин A

IgM – иммуноглобулин M

IgG – иммуноглобулин G

PCR или ПЦР – полимеразная цепная реакция

Content

Анализы: полный медицинский справочник: ключевые лабораторные исследования в одной книге

Глава 1 Исследование крови

Взятие крови

Общий анализ крови

Гемоглобин

Эритроциты

Лейкоциты

Лимфоциты

Тромбоциты

Гематологические анализаторы

Изменения картины крови при патологии

Исследование физико-химических свойств крови

Исследование коагуляции

Исследование фибринолиза

Анализаторы свертывания крови

Иммунологические реакции

Иммуногематологические анализаторы

Глава 2 Биохимические методы исследования в клинической лабораторной диагностике

Техническое оснащение биохимических методов исследования в клинико-диагностических лабораториях

Характеристика абсорбциометрических приборов

Средства подготовки проб

Методы исследования показателей белкового обмена

Методы исследования мочевины сыворотки крови

Методы исследования креатинина сыворотки крови

Методы исследования мочевой кислоты сыворотки крови

Методы исследования пигментного обмена

Методы исследования показателей липидного обмена

Методы исследования углеводного обмена

Методы исследования активности ферментов

Биохимические анализаторы

Глава 3 Исследование водно-солевого обмена

Натрий

Калий

Кальций

Фосфор и фосфорсодержащие вещества

Магний

Хлориды

Микроэлементы

Железо

Медь

Йод

Глава 4 Исследование гормонального статуса

Железы внутренней секреции и гормоны

Современные методы исследования гормонального статуса

Глава 5 Исследование желудочного содержимого

Зондовые методы исследования

Беззондовые методы исследования

Исследование кислотообразующей функции

Нормальные показатели секреции желудочного сока

Исследование ферментообразующей функции желудка

Микроскопическое исследование желудочного содержимого

Исследование на элементы злокачественного новообразования

Изменения желудочного содержимого при патологии

Глава 6 Исследование содержимого двенадцатиперстной кишки

Дуоденальное зондирование

Комплексное гастродуоденальное зондирование с холецистографией (по В. Е. Медведеву)

Физические свойства желчи

Химическое исследование желчи

Микроскопическое исследование

Глава 7 Исследование мочи

Физические свойства мочи

Химическое исследование мочи

Микроскопическое исследование осадка мочи

Бактериологическое и бактериоскопическое исследования мочи

Анализаторы мочи

Глава 8 Исследование кала

Подготовка больного к исследованию

Физические свойства

Макроскопическое исследование

Микроскопическое исследование

Химическое исследование кала

Бактериологические исследования

Особенности кала детей грудного возраста

Исследование кала на простейшие

Исследование кала на гельминты

Глава 9 Исследование выделений половых органов

Исследование эякулята

Исследование секрета предстательной железы

Исследование выделений из влагалища и шейки матки

Исследование с целью определения функционального состояния яичников

Исследование отделяемого молочных желез

Глава 10 Исследование мокроты

Сбор и обезвреживание материала

Физические свойства мокроты

Макроскопическое исследование мокроты

Микроскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Изучение грибковой флоры в мокроте

Химическое исследование

Глава 11 Исследование спинномозговой жидкости

Правила получения ликвора

Макроскопическое исследование

Микроскопическое исследование

Морфология клеточных элементов в спинномозговой жидкости

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Химическое исследование

Определение крови в спинномозговой жидкости

Биохимические методы исследования

Микробиологическое исследование

Глава 12 Исследование экссудатов и транссудатов

Виды пунктатов

Пункция плевральной полости

Физико-химические свойства полостных жидкостей

Микроскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование

Дифференциальная диагностика полостных жидкостей

Характеристика ферментативного экссудата при остром панкреатите

Гнойные экссудаты

Глава 13 Исследование костного мозга

Развитие, cтроение, кровоснабжение и иннервация костного мозга

Методы исследования костного мозга

Морфология клеток костного мозга

Глава 14 Исследование лимфатических узлов

Развитие, строение, кровоснабжение и иннервация лимфатических узлов

Методы исследования лимфатических узлов

Изменения лимфатических узлов при патологии

Глава 15 Современные методы лабораторной диагностики

Виды лабораторных исследований

Глава 16 Характеристики заболеваний, сопровождающихся нарушением в составе крови

Анемии

Лейкозы

Внекостномозговые гемобластозы – гематосаркомы и лимфомы (лимфоцитомы)

Парапротеинемические гемобластозы

Лимфогранулематоз

Лейкемоидные реакции

Лучевая болезнь

Геморрагические диатезы и синдромы

Тромбофилии гематогенные

Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром)

Коронавирусная инфекция COVID-19

Оспа обезьян

Глава 17 Основные показатели лабораторных анализов и диагностирование заболеваний

Исследование крови

Исследование мочи

Исследование кала

Приложение

Полезная информация

Виды и структуры лабораторий

Проблемы современной клинической диагностики

Структура клинико-диагностической лаборатории (КДЛ)

Международная система единиц (СИ)

Список сокращений